TUTORIAL IMUNOLOGI KLINIK

DETEKSI SALMONELLA TYPHI DENGAN METODE

IMUNOKROMATOGRAFI

Baharuddin, Uleng Bahrun, Ruland DN. Pakasi

Bagian Ilmu Patologi Klinik FK-UNHAS/RSUP. Dr. Wahidin Sudirohusodo Makassar

PENDAHULUAN

Demam tifoid adalah penyakit infeksi akut yang disebabkan Salmonella typhi

Demam 7 hari atau lebih, gejala saluran pencernaan dan gangguan pada sistem saraf pusat (sakit kepala, kejang dan gangguan kesadaran) serta kadang-kadang disertai komplikasi perdarahan dan perforasi usus

Demam tifoid merupakan penyakit infeksi yang dapat dijumpai secara luas di daerah tropis dan subtropis

Daerah dengan kualitas sumber air yang tidak memadai dengan standar higiene dan sanitasi yang rendah

PENDAHULUAN

PENDAHULUAN

Salmonella typhi merupakan bakteri gram negatif yang motil, bersifat aerob, tidak membentuk spora

Manusia merupakan satu-satunya sumber penularan alami S. typhi

cara menelan makanan/minuman yang terkontaminasi atau kontak langsung jari tangan yang terkontaminasi tinja, urine, sekret saluran napas atau dengan pus penderita yang terinfeksi

PENDAHULUAN

Masa inkubasi demam tifoid berlangsung selama 7-14 hari bergantung jumlah dan strain kuman yang tertelan mulai gejala klinis

Pada awalnya suhu meningkat secara bertahap, lebih tinggi pada sore dan malam hari

PENDAHULUAN

Pada saat awal demam penderita biasanya mengalami gejala yang mirip sindroma flu (Flu like Syndrome) yaitu sakit kepala, malaise, nyeri menelan, anoreksia, nyeri perut, nyeri otot dan nyeri sendi

Diare atau konstipasi, epistaksis, mual, muntah, batuk, kejang dan gangguan kesadaran

Gambar 1. Respon Antibodi IgM dan IgG

PENDAHULUAN

Diagnosis demam tifoid sulit ditegakkan secara klinis Sering dikacaukan dengan demam yang disebabkan oleh infeksi akut lainnya

Umumnya gejalanya tidak khas

PENDAHULUAN

Diagnosa :

Tes serologis deteksi kenaikan titer antibodi terhadap antigen S. typhi dan adanya antigen spesifik dari S.typhi

Tes biakan deteksi kuman S. typhi dari spesimen klinik

Tes Polymerase Chain Reaction (PCR) deteksi DNA spesifik S. typhi

PENDAHULUAN

Diagnosis pasti isolasi S. typhi yaitu dengan melakukan biakan dari spesimen klinik seperti darah, sum sum tulang, urin dan tinja

Waktu yang lama dan biaya relatif mahal sehingga dirancang suatu rapid test untuk serodiagnosis demam tifoid

PENDAHULUAN

Pada tutorial ini akan dibahas tentang diagnosis demam tifoid dengan metode imunochromatografi menggunakan Typhidot Rapid IgG/IgM (Reszon Diagnostics International Sdn. Bhd.)

TUJUAN

Tujuan pemeriksaan ini adalah untuk mengetahui adanya antibodi Salmonella typhi pada sampel darah manusiadengan metode imunokromatografi

METODE

A. Pra Analitik

1. Persiapan pasien Tidak ada persiapan khusus

2. Persiapan sampel Sampel yang digunakan adalah

serum atau plasma yang diambil dari vena atau whole blood dari darah kapiler

METODE

3. Alat dan Bahan

a. Alat 1. Typhidot Rapid IgG/IgM cassette 2. Pipet volumetrik 3. Tip pipet dispossible 4. Timer

  b. Bahan 1. Sampel serum, plasma atau darah

kapiler 2. Larutan buffer

B. ANALITIK

1.PrinsipTes Bila pada sampel terdapat antibodi S. typhi IgM dan

IgG maka antibodi tersebut akan bermigrasi menuju garis konyugat dan berikatan dengan antigen S. typhi IgM dan IgG berlabel colloidal gold membentuk kompleks antigen-antibodi. Kompleks antigen-antibodi ini akan menuju ke garis tes dan berikatan dengan antibodi spesifik terhadap S. typhi IgM pada garis pertama dan berikatan dengan antibodi S. typhi IgG pada garis kedua. Penambahan buffer akan menimbulkan warna merah muda keunguan pada kedua garis tes dan sisa dari antigen berlabel colloidal gold yang tidak terikat akan diteruskan menuju garis kontrol untuk berikatan dengan antibodi yang terdapat pada garis kontrol. Adanya warna yang terbentuk menandakan tes positif terhadap antibodi S. typhi IgM dan IgG

ANALITIK

2. Cara Kerja a. Test cassette dan larutan buffer

dikeluarkan dan dibiarkan sampai suhunya sama dengan suhu ruangan. Kalau terdapat endapan botol dikocok dulu

b. Alat dikeluarkan dari kemasan dan diberi label identitas sampel

ANALITIK

2. Cara Kerja c. Sampel serum/plasma sebanyak

30 µl atau sampel whole blood sebanyak 40 µl dimasukkan ke sumur sampel, pastikan bahwa tidak ada gelembung udara. Biarkan selama 15 detik

d. Satu tetes buffer ditambahkan ke dalam sumur sampel

e. Baca hasil setelah 15 menit

PASCA ANALITIK

Pembacaan Hasil :

Positif : tampak garis merah muda pada garis kontrol ( C ) dan garis T

Negatif : tampak garis merah muda hanya pada kontrol ( C )

Invalid : tidak terdapat garis merah pada garis kontrol ( C ) dan T atau hanya terdapat garis merah hanya pada garis T

Valid : tampak garis merah muda pada gariskontrol ( C )

Gambar 3. Interpretasi

TERIMA KASIH

Keuntungan meliputi:

• awal dan spesifik diagnosis demam tifoid• cepat, sederhana dan dapat diandalkan• tidak ada peralatan khusus yang diperlukan• Hasil yang mudah untuk menafsirkan• Volume sampel minimal yang digunakan

KETERBATASAN :

1. Tes adalah uji kualitatif dan kuantitatif bukan untukpenentuan tingkat konsentrasi antibodi. IntensitasBand tidak memiliki korelasi linear dengan titer antibodi darispesimen.2. Hasil yang diperoleh hanya boleh ditafsirkan dalam hubungannya denganlainnya diagnostik hasil dan informasi klinis.

Salmonella typhi mempunyai 3 macam antigen, yaitu : 1. Antigen O (Antigen somatik), yaitu terletak pada lapisan luar dari tubuh kuman. Bagian ini mempunyai struktur kimia lipopolisakarida atau disebut juga endotoksin. Antigen ini tahan terhadap panas dan alkohol tetapi tidak tahan terhadap formaldehid. 2. Antigen H (Antigen Flagella), yang terletak pada flagella, fimbriae atau pili dari kuman. Antigen ini mempunyai struktur kimia suatu protein dan tahan terhadap formaldehid tetapi tidak tahan terhadap panas dan alkohol. 3. Antigen Vi yang terletak pada kapsul (envelope) dari kuman yang dapat melindungi kuman terhadap fagositosis. Ketiga macam antigen tersebut di atas di dalam tubuh penderita akan menimbulkan pula pembentukan 3 macam antibodi yang lazim disebut aglutinin.

PatogenesaSalmonella typhi dan Salmonella paratyphi masuk kedalam tubuh manusia melalui makanan yang terkontaminasi kuman. Sebagian kuman dimusnahkan oleh asam lambung dan sebagian lagi masuk ke usus halus dan berkembang biak. Bila respon imunitas humoral mukosa IgA usus kurang baik maka kuman akan menembus sel-sel epitel terutama sel M dan selanjutnya ke lamina propia. Di lamina propia kuman berkembang biak dan difagosit oleh sel-sel fagosit terutama oleh makrofag. Kuman dapat hidup dan berkembang biak di dalam makrofag dan selanjutnya dibawa ke plaque Peyeri ileum distal dan kemudian ke kelenjar getah bening mesenterika. Selanjutnya melalui duktus torasikus kuman yang terdapat di dalam makrofag ini masuk ke dalam sirkulasi darah (mengakibatkan bakterimia pertama yang asimtomatik) dan menyebar ke seluruh organ retikuloendotelial tubuh terutama hati dan limpa. Di organ-organ ini kuman meninggalkan sel-sel fagosit dan kemudian berkembang biak di luar sel atau ruang sinusoid dan selanjutnya masuk ke dalam sirkulasi darah lagi yang mengakibatkan bakterimia yang kedua kalinya dengan disertai tanda-tanda dan gejala penyakit infeksi sistemik, seperti demam, malaise, mialgia, sakit kepala dan sakit perut.

Gambar. Salmonella sp

Gambar. Respons imun pada mukosa gastrointestinal terhadap infeksi Salmonella.Bakteri akan melalui aliran darah ke limpa yang akan menghasilkan respons imunspesifik.

Gambar. Bagian dari LPS pada Salmonella

Imunokromatografi Lateral flow test Membacanya cukup dgn mata saja Tidak membutuhkan substrat Penggunaan colloidal gold waktu inkubasi

pendek (<15 menit)

Kerugian : Nitrocelulose membrane tdk stabil pada

suhu ↑

Keuntungan : Prosedur cepat (<15 menit) dan praktis Nilai diagnostik baik Stabil untuk jangka panjang Relatif tidak mahal

Prinsip Dasar ICT

A. Melacak Analit (Ag)a. Reaksi langsung (Double Antibody

Sandwich)/Asai Imunometrik untuk melacak analit yang besar dan memiliki > 1 epitop (LH,hCG dan HIV)

b. Reaksi kompetitif/Hambatan kompetitif (competitive Inhibition) untuk melacak molekul kecil dengan epitop tunggal

B. Melacak Ab Indirect Assay

Serum/ Plasma sampleAdd 30μl serum to the sample well. Makesure that there are no air bubbles. Add 1drop of buffer after 15 seconds. Sample willstart wicking up. Read result within 15minutes.Whole Blood sampleAdd 40μl of whole blood into the samplewell. Make sure that there are no airbubbles. Add 1 drop of buffer after 15seconds. Sample will start wicking up.Read result within 15 minutes.

Hasil Typhidot IgM menunjukkan infeksiakut sedangkan jika IgG dan IgM faseakut dan fase pertengahan

Di daerah endemis terjadi peningkatanIgG sehingga jika positif tidak dapatmembedakan antara akut ataukonvalescen