TUGAS TERSTRUKTUR KIMIA ANALISIS INSTRUMEN

KROMATOGRAFI PLANAR

(Kromatografi Lapis Tipis)

Disusun Oleh :

Yolita Satya G.U (G1F011010)

Riri Fauziyya (G1F011028)

Aisyah Putriani (G1F011050)

Intan Hanifiani (G1F011068)

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN

JURUSAN FARMASI

PURWOKERTO

2013

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi

dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau

cair) dan fase gerak (cair atau gas) (Patnaik 2004). Teknik pemisahan ini memanfaatkan

interaksi komponen dengan fase diam dan fase gerak serta sifat fisik dan sifat kimia

komponen. Berdasarkan fase gerak dan fase diam yang digunakan, kromatografi dibedakan

menjadi liquid-solid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud padat dan

fase gerak berwujud cair), gas-solid chromatography (kromatografi dengan fase diam

berwujud padat dan fase gerak berwujud gas), liquid-liquid chromatography (kromatografi

dengan fase diam berwujud cair dan fase gerak berwujud cair), dan gas-liquid

chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud padat dan fase gerak berwujud

gas) (Patnaik,2004).

Berdasarkan interaksi komponen dengan fase diam dan fase gerak, kromatografi

dibedakan menjadi kromatografi adsorpsi (kromatografi dengan teknik penyerapan

komponen oleh adsorben tertentu), kromatografi partisi (kromatografi dengan partisi terjadi

antara fase gerak dan fase diam), kromatografi pertukaran ion (kromatografi yang dapat

memisahkan senyawa dengan afinitas ion yang berbeda dengan resin penukar ion), dan

kromatografi permeasi atau filtrasi (kromatografi berdasarkan perbedaan bobot molekul)

(Skoog et al 2002).

Berdasarkan bentuk ruang penyangganya, kromatografi dibedakan menjadi

kromatografi planar (kromatografi dengan fase diam terletak pada permukaan datar) yang

meliputi kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis serta kromatografi kolom

(kromatografi dengan fase diam tertahan pada sebuah kolom) yang meliputi kromatografi

manual, high performance liquid chromatography, dan kromatografi gas (Patnaik,2004).

Pada makalah ini kami membahas mengenai kromatografi lapis tipis. Prinsip dari

aplikasi tersebut adalah dengan meneteskan sampel pada plat KLT di garis startnya berulang-

ulang. Setelah kering, kertas dimasukkan dalam pelarut jenuh dan dibiarkan bergerak menuju

garis finish. Kromatografi lapis tipis menggunakan lempeng tipis/ plastik yang dilapisi

adsorben sebagai penyangga. Kromatografi kertas menggunakan kertas sebagai penyangga

(Rouessac 2007).

Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah untuk mengetahui bagaimana prinsip kerja

dari kromatografi planar, senyawa apa saja yang dapat dianalisis, instrument yang digunakan,

cara kerja instrument, dan bagaimana aplikasinya dalam bidang farmasi.

B. Rumusan Masalah

1. Apakah pengertian dari KLT?

2. Apakah prinsip dari kromatografi lapis tipis?

3. Apa saja faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan pada KLT?

4. Apakah fase diam dan fase gerak pada kromatografi lapis tipis?

5. Apa saja senyawa yang dapat dianalisis dengan kromatografi lapis tipis?

6. Instrument apa saja yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis?

7. Bagaimana cara kerja dari instrument tersebut?

8. Bagaimana cara kerja kromatografi lapis tipis?

9. Bagaimana aplikasi kromatografi lapis tipis dalam bidang farmasi?

BAB II

ISI

2.1 Pengertian Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon. Penggunaan Kromatografi Lapis tipis antara lain

1. Untuk penentuan jumlah komponen dalam campuran. 2. Untuk penentuan identitas antara dua campuran. 3. Untuk memonitor perkembangan reaksi. 4. Untuk penentuan keefektifan pemurnian. 5. Untuk penentuan kondisi yang sesuai untuk pemisahan pada kromatografi kolom. 6. Untuk memonitor kromatografi kolom

(Hendayana, 2010).

KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki system pelarut dan system penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Roy,1991).

2.2 Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Prinsip KLT adalah pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi, yang ditentukan oleh fase diam (absorban) dan fase gerak (eluen), komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya, hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Berdasarkan jenis kepolaran, Thin Layer Chromatography (TLC) system, atau disebut sebagai kromatografi lapis tipis dibedakan menjadi dua, yaitu normal phase (NP) dan reversed phase (RP).

Normal PhaseFase diam yang digunakan bersifat polar, misal gel silika, dan untuk fase geraknya adalah pelarut organik atau campuran pelarut organik yang bersifat kurang polar dari fase diamnya. Pada umumnya digunakan campuran antara kloroform dan metanol dengan berbagai perbandingan dimana komponen kloroform diberikan porsi yang lebih besar sebagai contoh (CHCl3:MeOH = 65:35,70:30,75:25).

Reversed PhaseFase diam yang digunakan adalah silika yang berikatan dengan senyawa organik, misalnya asal alifatik rantai panjang seperti C-18 dan fase geraknya adalah campuran air dan pelarut organik yang lebih polar dari fase diamnya. Pada RP sistem solvent yang digunakan memiliki sifat kepolaran yang tinggi, dalam hal ini campuran antara metanol dan air merupakan perpaduan yang sering digunakan dengan berbagai perbandingan misalnya Mr OH:air = 30:40, 50:50, atau 30:20. Angka perbandingan ini disesuaikan dengan karakteristik senyawa yang sedang diuji (Hendayana, 2010).

Pada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis,terjadi hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam denagn gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fase geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh tiga faktor,yaitu : kepolaran fase diam,kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.

2.3 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Pemisahan KLT

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan olen Egan Stahl dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Ada beberpa faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapisan tipis yang juga mempengaruhi harga Rf adalah:

1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan2. Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya

Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan zat terlarut

3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerapPada prakteknya tebal lapisan tidak dapat dilihatpengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.

4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fasa bergerak.Kemurnian dari pelarutyang digunakan sebagai fasa bergerak dalam kromatografi lapisan tipis adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.

5. Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.6. Teknik Percobaan

Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metode aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).

7. Jumlah cuplikan yang digunakanPenetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda denga kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak

kesetimbangan lainnya,hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.

8. SuhuPemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap,hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fasa.

9. KesetimbanganTernyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas,hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran ,akan terjadi pengembanagn dengan permukaan pelarut yang berbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi dan keadaan ini harus dicegah.

(Peter,2005)

2.4 Fase Diam dan Fase Gerak

Kromatografi lapis tipis atau biasa disingkat KLT merupakan salah satu bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Pada KLT fase diamnya berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik. Fase geraknya yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara ascending atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara descending. Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 mikrometer. Penjerap yang paling banyak digunakan adalah silika dan serbuk selulosa. Fase gerak pada KLT yang paling sederhana terdiri dari 2 campuran pelarut organic karena daya elusi dua campuran pelarut tersebut mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal (Gandjar, 2009).

a. Penjerap (Fase Diam)

Penjerap yang paling sering digunakan pada Kromatografi Lapis Tipis adalah silika gel dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi – desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada Kromatografi Lapis Tipis adalah partisi dan adsorbsi (Gandjar, 2009).

Jarak migrasi senyawa pada plat silika gel tergantung pada polaritasnya. Senyawa yang paling polar bergerak naik dengan jarak paling dekat dari titik awal penotolan, sedangkan senyawa dengan polaritas paling kecil bergerak paling jauh dari titik awal penotolan tersebut. Silika gel merupakan penjerap polar yang paling sering digunakan, meskipun demikian silika gel juga banyak dijumpai dalam bentuk yang termodifikasi (Watson, 2009).Untuk membantu visualisasi maka selama proses pembuatan plat Kromatografi Lapis Tipis ditambahkan zat yang berfluorosensi. Secara umum plat Kromatografi Lapis Tipis yang telah didesain dengan penambahan zat yang berfluorosensi dapat diamati dibawah sinar ultraviolet. Sebagian besar analit akan tampil sebagai bercak yang berwarna gelap dengan dasar yang dapat berfluorosensi. Sebelum digunakan plat Kromatografi Lapis Tipis biasanya diaktifkan dengan pemanasan pada suhu diatas 100OC selama kurang lebih setengah jam atau lebih, guna untuk

menghilangkan molekul air yang terjerap pada plat Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Plat Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang telah kering biasanya disimpan dalam desikator untuk menjaga agar tetap kering dan bersih (Miller, 2005).

b. Fase Gerak

Fase gerak pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dipilih dari pustaka, sistem yang paling sederhana adalah dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Pada saat pemilihan fase gerak, maka fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan teknik pemisahan yang sangat sensitif. Daya elusi dari fase gerak yang dipilih harus dapat memberikan harga Rf analit diantara 0,2 – 0,8 guna untuk memaksimalkan pemisahan. Untuk pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT), maka polaritas fase gerak akan menentukan nilai Rf dari analit (Gandjar, 2009).

Semakin polar suatu pelarut atau campuran pelarut maka akan semakin jauh pelarut tersebut menggerakkan senyawa polar naik dari titik awal penotolan. Jika senyawa non polar yang sedang dianalisis, maka tidak akan ada peningkatan yang nyata dalam jarak migrasi dengan peningkatan polaritas pada fase gerak (Watson, 2009).

2.5 Senyawa yang Dianalisis

KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil (Utami, 2013).

Menurut Nollet (2004) dalam karya ilmiah Aziz Eko H (2008:9) diantara berbagai jenis teknik kromatografi, kromatografi lapis tipis (KLT) adalah yang paling cocok untuk analisis obat di laboratorium farmasi. Kromatografi Lapis Tipis digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa seperti ion-ion organik, kompleks senyawa-senyawa organik dengan anorganik, dan senyawa-senyawa organik baik yang terdapat di alam dan senyawa-senyawa organik sintetik. Kromatografi lapis tipis (KLT) telah banyak digunakan pada analisis pewarna sintetik seperti Rhodamin B (Utami, 2013).

2.6 Instrumen dan Cara Kerja

Instrumen atau alat yang digunakan dalam suatu metode analisis dapat digunakan untuk menganalisis suatu unsur atau senyawa. Secara umum, instrumen tersebut haruslah memenuhi beberapa syarat yaitu cepat,akurat,dan sensitif. Pada kromatografi planar dibagi menjadi dua yaitu instrumen utama dan instrumen pendukung.

Instrumen Utama

Pada kromatografi lapis tipis fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang di dukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat pelastik.Unsur yang dipandang penting pada lempeng: Format, penunjang, lapisan, dan

pengikat: lempeng. Precoated TLC dengan penunjang suatu gelas tersedia dalam format yang banyak, yang berukuran 20cm × 20 cm bisanya dipandang sebagai standar untuk TLC awal. Pelat Gelas sangat kuat dan dapatdikembangkan secara vertikal dan horizontal tanpa bergoyang, kemudian pemastian ketetapan gerakan dari fase gerak pada lempeng. Mereka benar inert ketika digunakan dengan semua larutan pengembang dan derivating agent dan sebab itu dapat diaplikasikan secara universal. Pemisahan optimum (migration) jarak pada lempeng TLC adalah 12–15 cm. Jika hanya sedikit sampel yang akan dipisahkan pada waktu lempengnya sama, format yang lebih kecil seperti 10 cm × 20 cm atau 5 cm × 20 cm (20 cm dalam pengembangan secara langsung), yang juga memungkinkan perpindahan jarak optimum, terjadi. Jika efisiensi pemisahan optimum sesungguhnya kurang penting (sebagai contoh, jika sample mangandung hanya satu atau sangat banyak komponen), Jarak pengembangan dapat dikurangi sampai kira-kira 8 cm dan lempeng format 20 cm × 10 cm (atau lempeng fraksional sekecil 2.5 cm × 10 cm) mungkin kurang.

Lempeng Thin-layer chromatography (TLC) untuk diadsorbsi, partisi, dan teknik ion exchange enam pilihan media dengan gelas, polyester, dan dasar aluminum. Lapisan adsorbent silicabased dalam Sigma-Aldrich lempeng TLC dipadukan dengan suatu pengikat polymeric;lempeng silica gel yang lebih murni dipadukan pada suatu pengikat gypsum (CaSO4/polimer).Atau dengan mengunakan lempeng silika gel yang biasa di gunakan :

Spesifikasi dari masing-masing sorbent :

Silika gel :untuk pemisahan polarisasi lamah sampai kuat High purity silika gel :asam washed untuk pemisahan dari aflatoxins Sellulosa :untuk kromatografi partisi Sellulosa PEI :untuk pemisahan dari anion lemah (amino acids) Aluminum oxida :alumina dasar,untuk pemisahan hormon and antibiotika Chiral silika :untuk pemisahan dari isomer optis aktif melalui pertukaran ligan

Bahan penjerap (Sorbent)

Prinsip kromatografi Tipe penggunaan

Aluminum oxide kromatografi adsorpsikarena interaksi

kutub

Alkaloid, steroid, terpen,alifatik, aromatik

Selulosa tidak dimodifikasi

Partisi kromatografikarena interaksi kutub

Asam amino dan asam karboksilat serta karbohidrat

Selulosa asetat Tergantung pada kadar Anthraquinon, antioksidan,

asetil transisi dari normal

fase ke fase terbalikkromatografi

polisiklik aromatik, asamkarboksilat, nitrophenol, pemanis

Selulosa pertukaran ion Pertukaran anion Asam amino, peptida, enzim,nucleic acids constituents

(Nukleotida, nukleosida), dllFase campuran antara 

selulosa DEAE danselulosa

SDM

Pertukaran ion Mono-dan oligonukleotida dalam asam nukleat hydrolyzates

Pertukaran ion Ionex Pertukaran anion dan kation

asam amino, asam nukleat hydrolyzates,gula amino, antibiotik,anorganik fosfat, kation

Kieselguhr Umumnya untukpemisahan fase terbalik

Aflatoksin, herbisida,Tetrasiklin

Partisi poliamida Kromatografi karena interaksi

kutub(misalnya Ikatan hidrogen)

Senyawa fenolik dan polifenolik alam

Silika murni, tidak dimodifikasi

Standar dan nano silikagel

Kromatografi fase normal

Yang paling sering aplikasidari semua fase diam KLT

Kemurnian tinggi silikagel 60

aflatoxin

Silika gel G, diresapidengan amonium sulfat

Surfaktan, lipid

Silika gel 60, diabsorbsidengan kafein untukPA

Hpenentuan

Transfer kompleks Polisiklik AromatikHidrokarbon(PAH) acc. untuk spesifikasiair minum Jerma

n (TVO)

Dimodifikasi secara kimia lapisan:CHIRalpl

ate

Pemisahan enantiomer Asam amino kiral, asamhidroksikarboksilatdan senyawa lainnya

yang dapat membentukkhelatkompleks dengan Cu (II) ion

Lapisan Modifikasi Ciano

Fase CN Normal danterbalik

Pestisida, fenol, pengawet,steroid

Modifikasi DIOL Steroid , hormon

Amino-modified layer NH2

Pertukaran anion, kromatografi fase

normal dan terbalik

Nukleotida, pestisida, fenol,turunan purin, steroid,vitamin,

asam, sulfonat, asamkarboksilat,xanthin

RP-2, RP-8, RP-18 Senyawa nonpolar (lipid,aromatic)

Silika gel 60 silanized Polar zat (bahan aktiffarmasi, baik asam maupun basa)

RP-18 W/UV254 Kromatografi fase normal dan terbalik

Aminophenol, barbiturat,pengawet, nukleobasa, PAH,

steroid, tetrasiklin, ftalat

LiChrospher ® Si 60 Kromatografi fasenormal

Aminophenol, barbiturat,pengawet, nukleobasa, PAH,

steroid, tetrasiklin, ftalat

Campuran aluminium oksida / asetilasiselulosa

Fase normal dan terbalik

Polisiklik AromatikHidrokarbon (PAH)

Selulosa / silika gel Fase normal dan terbalik

Bahan pengawet

Kieselguhr / silika gel Kromatografi fase normal, penurunan daya

absorbsi

Karbohidrat, antioksidan,steroid, senyawapengembang fotografi

Fase diam KLT produk baru :

Bahan penjerap (Sorbent) Prinsip kromatografi Tipe penggunaanAdamant® (Macherey-

Nagel)Lux® (Merck)

Peningkatan jumlahindikator fluoresensi

Universal

UTLC (Merck) Ultra thin monolithicsilica gel

Steroid, azepams, asamamino,ftalat dan fenol

ProteoChrom® (Merck) a) HPTLC silica gel 60 F254s, 20 × 10 cm glass

plateb) HPTLC cellulose,

10 × 10 cm aluminium sheet

Asam amino, peptida

Asam amino, peptideKLT 2-D

HPTLC Premium Purity Plate

(Merck)

Dibungkus khususfoil berlapis plastik

Semua aplikasi farmakope

(Peter,2005)

Chamber / Ruang PengembangPada dasarnya chamber atau tempat untuk pengembangan dari kromatografi planar

tidak terlalu spesifik untuk masing-masing jenis kromatografi, yang membedakan chamber yang digunakan adalah ukuran dari chamber, dimana ukuran dapat disesuaikan dengan kebutuhan. Bahan dari chamber pisa dari kaca atau bahkan dari plastik yang kedap air, biasanya bentuknya bisa bulat seperti toples atau kotak seperti gambar di bawah ini :

Instrumen Pendukung

a. Sprayer

Sprayer atu penyemprot bercak noda dari spot yang dihasilkan tidak terlalu bervariasi dari metode planar kromatografi mulai dari alat yang sederhana atau alat yang sudah kompleks dapat digunakan dengan baik pada penampakan noda dari spot yang sudah diperoleh dengan sebelumnya memasukan suatu pereaksi penderivatisasi agar spot memendarkan cahaya, berikut gambar dari sprayer mulai dari yang sederhana sampai dengan keluaran terbaru,

b. Scaner

Scaner merupakan suatu alat yang dimaksudkan untuk memperjelas suatu spot pada saat mengamati, bisanya pada alat ini disertai dengan lampu baik itu lampu UV atau yang lainya yang dapat memendarkan cahaya dari spot-spot analit setelah disemprot dengan larutan penampak noda (derivating agent), berikut beberapa gambar alat scaner :

UV Scaner 254 nm dan 366 nm

c. Detektor

Detektor yang bisa di gunakan pada analisis kromatografi planar adalah adalah detektor photon, diamana sifat dari analit dapat dibuat atau di derivatisasi dengan senyawa yang membuat senyawa tersebut berflourisensi dan dapat di deteksi atau di scanning dengan detektor yang sesuai. Detektor yang umum digunakan dalah detektor UV atau flourisensi detektor berikut gambar dari beberapa detektor yang terkait erat dengan kromatografi planar: beberpa UV detektor yang bisa digunakan dalam deteksi spot hasil kromatogram dari planar kromatografi :

1. Silicon Photodiodes2. Germanium Photodiodes3. InGaAs Photodiodes4. Extended InGaAs Photodiodes

Prinsip kerjanya secara umum adalah lempeng yang terdapat spot didalamnya dikenai sinar dan nanti akan berflourisensi kemudian flourisensinya akan ditangkap oleh detektor kemudian intensitasnya akan terukur dan akan sebanding dengan kadarnya.

UV- detektor 254 nm dan 366 nm

d. Alat Penderivatisasi

Alat ini dilmaksudkan untuk membuat senyawa yang terdapat pada spot dapat terdeteksi yaitu dengan cara derivatisasi selain dengan cara disemprotkan dengan sprayer bisanya alat ini di gunakan untuk fosforscent dan ini mengandung fosforscent anorganik yaitu spot yang terbentuk di celupkan pada media yang mengandung zat penderivasi.

e. Spray CabinetAlat ini untuk sebagai ruang untuk menyemprot spot dengan zat penampak noda/zat

Penderivatisasi.

f. Lempeng heaterAlat ini untuk memanaskan lempeng sebelum dipakai atau untuk mengaktifkan

dengan cara menguapkan uap air yang dikandungnya selain dengan menggunakan oven biasa:

Alat ini dapat di gunakan jika kita akan membuat sendiri lapisan penyerap yang akan dilapiskan pada penunjang kaca atau plastik atau alumunium.

g. Pipet sampel/drods/Penetes SampelAdalah suatu kapiler dengan ukuran tertentu yang berguna untuk meneteskan sampel

pada lempeng atau fase diam, berikut dapat dilihat alah satunya.

h. Pipet sampel/drods/Penetes SampelAdalah suatu kapiler dengan ukuran tertentu yang berguna untuk meneteskan sampel

pada lempeng atau fase diam, berikut dapat dilihat salah satunya,Banyak tahapan pada prosedur Kromatografi Lapis Tipis yang telah dapat

diinstrumentasikan, dengan tujuan mengurangi pekerjaan , menghasilkan data yang mempunyai tingkat reprodusibilitas dan kuantitasi , serta dapat ditangani dengan sistem data yang modern (Miller, 2005).

2.7 Prosedur Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Penotolan Sampel

Untuk tujuan kuantitasi, tidak hanya harus menjaga area sampel yang kecil, tetapi volume sampel yang diaplikasikan kepada plat harus diketahui secara akurat. Penotol sampel secara mekanik dapat diperoleh secara komersil dan dapat menotolkan sejumlah tertentu sampel secara akurat pada posisi yang telah ditentukan (Miller, 2005). Setiap selesai penotolan kemudian dikeringkan dengan hairdryer.

Pengembangan

Pengembangan pelarut biasanya dilakukan dengan cara menaik (ascending), yang mana ujung lempeng dicelupkan ke dalam pelarut pengembang. Untuk menghasilkan reprodusibilitas kromatografi yang baik, wadah fase gerak harus dijenuhkan dengan uap fase gerak (Rohman, 2009).Plat dicelupkan dalam fase gerak yang dipilih kira – kira 0,5 cm. Bejana diusahakan jangan sampai bocor. Untuk meyakinkan bahwa bejana kromatografi telah jenuh, maka dinding dalam bejana dapat dilapisi dengan lembaran kertas saring yang ujungnya direndam dalam fase gerak (Sastrohamidjojo, 1985).

Deteksi Bercak

Bercak pemisahan pada Kromatografi Lapis Tipis umumya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dilakukan secara kimia maupun fisika. Cara kimia yang biasanya digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak akan tampak secara jelas. Cara fisika yang digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan fluorosensi dibawah sinar ultraviolet, bila senyawa yang dianalisis dapat berfluorosensi, maka akan membuat bercak terlihat lebih jelas. Jika senyawa tidak dapat berfluorosensi maka fase diam yang akan ditambahkan zat yang dapat berfluorosensi, dengan demikian bercak akan kelihatan gelap karena menyerap sinar ultraviolet sedangkan latar belakangnya akan terlihat berflourosensi.Cara kimiawi mendeteksi bercak anatara lainnya:

1. Menyemprot lempeng Kromatografi Lapis Tipis dengan reagen yang kromogenik yang akan bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang – kadang dipanaskan terlebih dahulu untuk mempercepat reaksi pembentukan warna dan meningkatkan intensitas warna bercak.

2. Mengamati lempeng di bawah lampu ultra violet yang dipasang panjang gelombang 254 dan 366 nm untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluoresensi terang pada dasar yang berfluoresensi seragam.

3. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklat-coklatan.

4. Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.

5. Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer, suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan dari pernukaan lempeng ketika disinari dengan lampu ultraviolet atau lampu sinar tampak. Solut – solut yang mampu menyerap radiasi sinar akan dicatat sebagai puncak (peak) dalam pencatat (recorder) (Gandjar, 2009).

2.8 Aplikasi kromatografi lapis tipis dalam bidang farmasi

Penerapan kromatografi kertas banyak digunakan dalam berbagai bidang. Aplikasi kromatografi kertas dalam industri antara lain dugunakan untuk identifikasi zat rhodamin B pada makanan, untuk analisis zat warna sintetik terlarang untuk makanan yang berada dipasaran (Azizahwati, 2007). Begum, 2012 juga teah menggunakan kromatografi kertas untuk menganalisis kualitatif fenil alanin sebagai studi awal pengembangan metode deteksi penyakit Phenylketonuria.

Penerapan kromatografi lapis tipis yaitu digunakan untuk menentukan pengotor dalam bahan baku farmasi dan produk-produk yang sudah diformulasi. Sering digunakan sebagai pemeriksa identitas dasar terhadap bahan baku farmasi dan kemungkinan bermanfaat dalam validasi pembersihan, yang merupakan bagian dari pembuatan obat. (Watson, 2009)

KLT digunakan secara luas untuk analisis solut-solut organik terutama dalam bidang biokimia, farmasi, klinis, forensik, baik untuk analisis kualitatif dengan cara membandingkan nilai Rf solut dengan nilai Rf senyawa baku atau untuk analisis kualitatif. Penggunaan umum KLT adalah untuk : menentukan banyaknya komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya suatu reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai untuk kromatografi kolom, serta untuk memantau kromatografi kolom, melakukan screening sampel untuk obat ( Gandjar, 2009 ).

1. Penggunaan KLT untuk analisis obatKLT biasanya merupakan metode pilihan pertama jika seseorang ingin

memisahkan suatu campuan. Hal ini disebabkan karena KLT merupakan metode yang sederhana dan cepat. KLT digunakan secara luas untuk analisis obat. Berikut adalah penggunaan KLT untuk analisis beberapa sediaan farmasi (sumber : Adamovics, 1997) :

Obat (sediaan) Fase diam Fase gerak DeteksiAsetaminofen (serbuk)

Silika gel Heksan-aseton (75:25) UV

Allopurinol (serbuk)

Silika NH4OH-MeOH (1,5:100) KMnO4 yang diasamkan

Amoksisilin (tabet, kapsul, suspensi)

Silika Metanol-piridin-kloroform-air (90:10:80:10)

Ninhidrin

Vitamin C Silika Metanol-aseton-air (20:40:3)

UV

Vitamin A Silika Sikloheksan-eter (4:1) Asam

fosfomolibdatAtropin sulfat (injeksi)

Silika Kloroform-dietilamin (9:1) Iodoplatinat

Kaptopril (serbuk) Silika Benzen-asam asetat (75:25) Uap iodiumKlorfeniramin (eliksir)

Silika Etil asetat-metanol-asam asetat 1 M (5:3:20)

Dragendroff

Klorpromazin (tablet)

Silika Sikloheksan-aseton-dietilamin (8:1:1)

UV 254 nm

Kodein (serbuk) Silika Amonium hidroksida-sikloheksan-etanol (6:30:72)

Dragendroff

Dekstrometorpan (serbuk)

Silika Amonium hidroksida-metilen klorid (9:1)

UV 254 nm

Diazepam (serbuk) Silika Reptan-etil asetat (1:1) UV 254 nmDigitoksin Silika Sikloheksan-asam asetat-

aseton (49:49:2)Kloramin T

Vitamin D2 Silika Kloroform-metanol (9:1) Disemprot dg bromokresol ungu 1%

Haloperidol (serbuk/larutan)

Silika Metanol-kloroform-amonium hidroksida 13,5 M (8:92:1)

Dragendoff

Indometasin (serbuk)

Silika yang dilapisi dengan bufer fosfat

Eter-petroleum ringan (2:8) UV 254 nm

Lorazepam (serbuk) Silika Kloroform-metanol (10:1) UV 254 nmParasetamol (serbuk)

Silika Kloroform-aseton-toluen (65:25:10)

UV 254 nm

Prometazin (serbuk) Silika Diisopropil eter-etil asetat-asam asetat (30:15:5)

Kalium permanganat

Propanolol (serbuk) Silika Toluen-metanol (9:1) Asam anisaldehidTeofilin (kapsul dg guaifensin)

Selulosa Metanol-air UV 254 nm

Klortetrasiklin hidroklorid (serbuk)

Kieselguhr dg gliserol, EDTA

Kloroform-asetan-etil asetat (2:1:1)

Uap amonia atau UV 350 nm

2. Pada Bidang BioteknologiDalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat

besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga

bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama (Adamovics, 1997).

3. Pada Bidang KlinikTeknik kromatogafi ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi

fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat. Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam membantu mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan kehidupan manusia secara umum (Adamovics, 1997).

4. Pada Bidang ForensikAplikasi kromatografi pada bidang forensik pun sangat membantu, terutama

dilihat dari segi keamanan. Kini kromatrografi menjadi hal yang sangat penting dalam menganalisis berbagai bahan-bahan kimia yang terkandung dalam bahan peledak. Hal ini didorong karena dengan semakin cepat diketahuinya bahan-bahan dasar apa saja bahan peledak, maka akan makin mempercepat diambilnya tindakan oleh bagian keamanan untuk mengatasi daerah-daerah yang terkena ledakan serta antisipasi meluasnya efek radiasi yang kemungkinan akan mengena tubuh manusia di sekitar lokasi ledakan. Lebih jauh lagi, efek negatifnya terhadap lingkungan juga bisa segera diketahui (Adamovics, 1997).

Aplikasi nyata yang telah dilakukan diantaranya adalah analisis Rhodamin B dalam jajanan pasar dengan metode kromatografi lapis tipis oleh Wahyu Utami. Sumarto, 2011 juga melakukan penelitian terkait penentuan senyawa bioaktif ekstrak daging siput (Terebralia sulcata) dengan kromatografi lapis tipis (KLT)

2.9 Keuntungan KLT

Beberapa keuntungan lain kromatografi planar atau KLT adalah :

a. Kromatorafi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisisb. b.Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna,

fluoresensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet

c. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi

d. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak (Gandjar, 2007).

BAB III

Penutup

Kesimpulan Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu anlisis kualitatif dari suatu

sampel yang ingin dideteksi berdasarkan kepolaran. Kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis silika atau alumina yang

seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam Pada fase diam KLT menggunakan silika gel dan fase gerak menggunakan

pelarut organik. Prinsip kerja kromatografi lapis tipis adalah suatu pelarut yang bersifat polar,

cenderung melepaskan ikatan pelarut non polardengan alumina (sel silika).

DAFTAR PUSTAKA

Adamovics, J.A., 1997, Chromatographic Analysis of Phamaceuticals, 2nd Edition, Marcel Dekker, New York.

Azizahwati, Maryati Kurniadi, Heidi Hidayati. 2007. ANALISIS ZAT WARNA SINTETIK TERLARANG UNTUK MAKANAN YANG BEREDAR DI PASARAN, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. IV, No. 1, April 2007, 7 – 25, ISSN : 1693-9883)

Begum Fauziyah, 2012. ANALISIS KUALITATIF FENILALANIN SECARA CHROMATOGRAPHY KERTAS DAN CHROMATOGRAPHY LAPISTIPIS (Studi Awal Pengembangan Metode Deteksi Penyakit Phenylketonuria), SAINSTIS. VOLUME 1, NOMOR 2, JANUARI – JUNI 2012 ISSN: 2089-0699

Gandjar, I.G dan Abdul Rohman, 2009, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill Comp.

Hendayana, Sumar, 2010, Kimia Pemisahan, Penerbit Rosda, Bandung.

Miller, J.N., and J.C. Miller (2005). Statistics and Chemometrics for Analytical

Chemistry, 5th Edition. Pearson Education, Ltd. page 116.

Patnaik Pradyot. 2004. Dean’s Analytical Chemistry Handbook. Second Edition. New York:

McGraw-Hill Comp.

Peter E. Wall,2005,Thin Layer Chromatography.Cambridge : The Royal Society of

Chemistry

Rouessac Francis, Annick Rouessac. 2007. Chemical Analysis: Modern Instrumentation

Methods and Techniques. Second Edition. West Sussex: John Wiley & Sons, Ltd.

Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung.

Skoog Douglas et al. 2002. Fundamentals of Analytical Chemistry. Eight Edition. Canada:

Thomson Learning.

Sumarto, Desmelati, Dahlia, Bustari Hasan, dan M. Azwar. 2011. PENENTUAN SENYAWA BIOAKTIF EKSTRAK DAGING SIPUT BAKAU (Terebralia sulcata) DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT). Berkala Perikanan Terubuk, Juli 2011, hlm 85 – 96 Vol. 39. No.2 ISSN 0126 - 4265

Utami, N.R, 2013, “Uji Sensitivitas Kertas Saring untuk Identifikasi Pewarna Rhodamin B pada Makanan Jajanan”, Unnes Journal of Public Health 3 (2).

Wahyu Utami dan Andi Suhendi . 2009. ANALISIS RHODAMIN B DALAM JAJANAN PASAR DENGAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS Jurnal Penelitian Sains & Teknologi, Vol. 10, No. 2, 2009: 148 – 155

Watson, David G. 2009. Analisis Farmasi: Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan Prktisi Kimia Farmasi, edisi 2. Jakarta. Penerbit Buku Kedokteran EGC.