1  

TUGAS KULIAH FISIOLOGI MOLEKULAR 

                     

 KHAIRUL ANAM P051090031/BTK 

       

BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA 

INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2010 

2  

TUGAS FISIOLOGI MOLEKULER KHAIRUL ANAM (P051090031/BTK)

1. Apa yang anda ketahui tentang kematian sel terprogram? Dimana dan kapan proses tersebut terjadi selama siklus hidup tumbuhan?

Kematian sel terprogram (programmed cell death/ PCD) merupakan kematian sel yang

dikendalikan oleh organisme sebagai bagian dari proses pertumbuhan dan perkembangan,

termasuk di dalamnya mekanisme inisiasi dan eksekusi.

Dua contoh dari PCD antara lain kematian sel akibat senesen dan akibat respon

hipersensitivitas. Sense merupakan proses kematian terprogram yang sangat lambat dari suatu

jaringan pada akhir dari waktu hidupnya. Sedangkan akibat dari hipersensitivitas, PCD

berlangsung lebih cepat untuk mempertahankan diri dari penyakit yang diakibatkan patogen.

3  

Selama siklus hidup tumbuhan, kematian sel terprogram terjadi pada saat:

• Pembentukan gamet, termasuk pembentukan megaspora di bunga (1).

• Perkembangan embrio, misalnya degenerasi suspensor pada bunga (2).

• Degenerasi jaringan pada biji dan buah. Misalnya kematian terprogram pada endosperm (3).

• Perkembangan jaringan dan organ tanaman. Misalnya: pada perkembangan trikoma (4),

pembentukan elemen trakeari (tracheary element/ TE) (5), dan pada tudung akar (6).

• Senesen pada daun (7).

• Tanaman merespon sinyal lingkungan pada pembentukan aerenkim (8),

• Tanaman merepon sinyal pathogen yang merupakan respon hipersensitivitas untuk dapat

resisten terhadap penyakit (9).

4  

2. Jelaskan tiga tahapan senesen pada daun? Apa yang terjadi pada tingkat fisiologis dan molekular dari tiap tahapan?

Tahapan Proses pada Senesen daun:

1. Fase inisiasi

Penandaan permulaan metabolisme baru. Pada daun senesen terjadi beberapa

metabolisme baru seperti, katabolisme klorofil, sintesis amida, kegiatan transport,

pembentukan glukosa dari lipid melalui glukoneogenesis dan sintesis protein de novo.

Katabolisme atau metabolisme pigmen klorofil terjadi melalui jalur kompleks enzim yang

5  

melibatkan beberapa kompartemen di dalam sel dan gejala yang paling mudah diamati

adalah hilangnya warna hiaju daun dari waktu ke waktu.

Perubahan keadaan menjadi redox. Terjadi perubahan keadaan redox dimana pada daun

dewasa terjadi transfer elektron untuk membentuk NADPH dimana NADPH melepas

elektron ke asam askorbat dengan mereduksi glutathione (GSH), sedangkan pada daun

senesen, produksi NADPH berkurang, menyebabkan meningkatnya rasio glutathione

teroksidasi menjadi GSH dan dehidro askorbat menjadi askorbat.

Pada tingkat molekuler, terjadi aktivasi jalur transduksi sinyal oleh berbagai stimulus

tersebut (hormonal, lingkungan, perkembangan, dan patologis) mengakibatkan fase inisiasi

yang mencakup aktivasi dan inaktivasi dari berbagai macam gen untuk menginduksi

terjadinya senesen.

2. Fase reorganisasi

Aktivasi Jalur penyelamatan. Nitrogen dan sulfur organik dikeluarkan oleh daun senesen

daimana glutamine dan asparagin diekspor dari daun yang mengalami senesen.

Perubahan metabolime dari autotrof menjadi heterotrof. Kebutuhan energi untuk

metabolisme, mobilisasi dan proses lainnya menyebabkan meningkatnya energi yang

diambil dari proses heterotrof dimana asam amini sebagai sumber karbon.

Detoksifikasi. Terjadinya metabolisme pembentukan asam salisilat dan phenol yang

dibentuk secara tidak langsung melalui metabolisme fenilpropanoid.

Rediferensiasi organel yang reversible. Merupakan fase transisi di mana terjadi

pengendalian rediferensiasi dari struktur sel dan pengaturan kembali posisi material.

3. Fase terminal/ akhir

Terjadi akumulasi antibiotic ketika terjadinya daun senesen dimana berfungsi untuk

mencegah masuknya pathogen yang secara oportunis memanfaatkan daun senesen

sebagai rute infeksi.

Terjadinya pelepasan radikal bebas, eliminasi sisa hasil metabolisme dan hilangnya

integritas dan viabilitas sel secara irreversible dimana terjadi autofage dan pembesaran

vakuola di sitoplasma dimana membran tidak pecah atau pembentukan autofage vakuola.

Integritas dari membran subseluler dan pengaturan kompartemen dari jalur-jalur biokimia

tetap dipertahankan hingga terjadinya kematian sel.

6  

3. Jelaskan teknologi antisen etilen untuk mengatur pemasakan tomat.

Day after pollination 

Ethylene

 evolutio

n 

Antisense     Air              Ethylene 

Kontrol 

 50     53    56     59     70 

 57     59    63     67     70 

7  

• Etilen adalah hormon yang berfungsi sebagai penginduksi senesen. Etilen sendiri berperan

dalam menginduksi senesen yang terjadi pada pemasakan buah tomat. Inhibitor kimia pada

biosintesis etilen diyakini dapat menghambat proses pemasakan buah. Asam 1-amino

siklopropane -1 - karboksilat (ACC) synthase dan ACC oksidase adalah dua enzim yang

mengkatalisis tahap akhir pada proses biosintesis etilen.

• Dalam percobaan dinyatakan bahwa dalam pemasakan buah tomat secara normal dibutuhkan

dua hal yaitu etilen dan faktor yang bergantung pada umur buah. Buah tomat tipe liar sebagai

kontrol yang diberi perlakuan disimpan dalam ruangan yang pertama hanya terdiri dari udara

dan dan kedua udara yang mengandung etilen dimana hasil dari percobaan tersebut terjadi

pemasakan buah pada waktu yang sama pada kedua perlakuan.

• Dalam pengembangan tanaman tomat, ekspresi gen ACC synthase pada orientasi antisense

menyebabkan enzim ACC sinthase yang diproduksi tidak dapat menghasilkan etilen secara

normal sehingga buah tomat kekurangan etilen yang diperlukan untuk proses pematangan.

Ketika buah tomat dipetik dan dibiarkan pada udara maka buah tomat ini tidak akan mengalami

proses pematangan. Namun, jika ditambah etilen dari luar, maka akan terjadi pematangan buah

tomat.

• Teknologi antisen ini kemudian dimanfaatkan untuk menentukan pemasakan buah tomat.

Tanaman tomat yang telah dimanipulasi sehingga enzim ACC sintase-nya ditranskripsi pada

orientasi antisen tidak akan masak meskipun dipetik dan diinkubasikan di udara. Pemasakan

buah tomat dapat diatur dengan cara penambahan etilen dari luar. Dengan demikian, waktu

masak buah tomat bisa ditentukan. Misalnya, buah tomat yang akan didistribusikan pasca

panen, belum ditambah etilen sehingga tidak akan masak dan membusuk. Setelah dipersiapkan

untuk dijual, buah tomat tersebut diberi perlakuan etilen sehingga masak dan dapat dijual.

8  

4. Jelaskan basis genetic interaksi pathogen-tumbuhan (model satu gen untuk satu gen)!

Pada gambar sebelah kiri, untuk dapat menjadi resisten (inkompatibel) pasangan komplemen

dari gen yang dominan, satu pada inang dan satu pada pathogen, keduanya diperlukan.

Perubahan atau hilangnya gen resistensi pada tanaman (R berubah menjadi r) atau gen

avirulensi dari pathogen (Avr berubah menjadi avr) mengakibatkan kerentanan terhadap

penyakit (kompatibel).

Pada gambar sebelah kanan, interaksi yang terjadi melibatkan kompatibilitas yang tergantung

pada toksin. Gen Tox pada patogen wild type diperlukan untuk sintesis toksin yang penting

untuk pathogenesis; tox adalah resesif yang sesuai, yaitu alel yang tidak mempunyai fungsi.

Alel dominan dari inang yaitu gen R diperlukan sebagai gen resisten dari sebagai dasar dari

protein detoksifikasi. Resisten juga dapat muncul ketika inang mengekspresikan bentuk

insensitive toxin dari target toxin. Penyakit hanya ditimbulkan ketika tanaman tidak dapat

mendetoksifikasi toxin yang diproduksi oleh patogen.

9  

5. Jelaskan tiga tahapan urutan aktifasi system pertahanan tanaman terhadap pathogen.

10  

Urutan aktivasi sistem pertahanan tanaman terhadap patogen:

1. Respon cepat dari sel yang terserang patogen

• Sel yang diserang oleh patogen secara langsung merespon dengan cepat dengan

menginduksi respon pertahanan maupun terjadinya kematian sel (respon

hipersensitivitas) ketika sel sudah tidak dapat mempertahankan diri.

• Serangan patogen mengakibatkan pembentukan senyawaan oksigen yang reaktif

(reactive oxygen species/ ROS), pembukaan kanal ion, sintesis oksida nitrat, serta

fosforilasi.defosforilasi protein yang pada akhirnya menginduksi gen untuk

mengekspresikan protein-protein yang berperan dalam pertahanan atau pemacuan

kematian sel.

2. Respon jaringan lokal dan aktivasi gen

• Adanya komunikasi antar sel yang diperantarai oleh berbagai jalur transduksi sinyal

(cross-talk), mengakibatkan sel-sel di sekitar sel yang terserang patogen secara

langsung merespon untuk mempertahankan diri. Sel-sel lokal akan merubah aktivasi

jalur metabolit sekunder.

• Pada kelompok sel ini, inisiasi peningkatan pertahanan terjadi dengan jalan

pembentukan molekul pemicu sinyal tambahan seperti: ROS yang lain, peroksida lipid,

asam benzoate (BA), asam salisilat (SA), asam jasmonat (JA), dan etilen. Molekul-

molekul tersebut akan menginduksi ekspresi (aktivasi) gen-gen yang terkait dengan

pertahanan terhadap patogen (mensintesis pathogenesis related-protein/ PR) serta

memodifikasi protein dan enzim yang terlibat dalam pertahanan.

• Etilen akan memacu sel untuk menghentikan siklus sel dan memacu senesen.

• Perubahan status redoks atau kerusakan seluler yang bersamaan akan mengaktivasi

mekanisme untuk pertahanan sel, termasuk fortifikasi dinding sel dengan lignin, PGIP8,

dan HRGP8).

3. Respon secara sistemik dan aktivasi gen

• Komunikasi antar sel yang meluas, akan memacu respon sistemik pada tanaman.

Sintesis molekul-molekul seperti BA, SA, dan JA akan mengaktivasi gen yang terkait

dengan pertahanan terhadap patogen seperti β-glukanase, kitinase, peroksidase,

maupun sintesis PR yang lain. Enzim-enzim tersebut akan menyerang/membunuh

patogen sehingga sel dapat mempertahankan diri.

11  

6. Jelaskan cara identifikasi gen R pada tanaman dengan pendekatan map-based cloning!

12  

Identifikasi sebuah gen R dengan cloning yang berdasarkan pada peta gen (map-based-

cloning) dilakukan dengan tahapan sebagai berikut:

1. Dilakukan identifikasi dua marker genetik yang mengapit (flanking genetic marker) gen R

(genetic marker 1 dan genetic marker 2). Menemukan tanda genetic pada satu kromosom

dengan gen target

2. Pada tahap berikutnya dilakukan identifikasi dua marker genetic yang mengapit lebih dekat

pada gen R (M3 dan M4) sehingga jarak M3-M4 lebih pendek dari M1-M2. Menentukan

tanda genetic yang sangat dekat dengan gen target

3. Pada tahap selanjutnya, daerah yang mengapit (flanking region) gen R diperpendek lagi

dengan memanfaatkan YAC (yeast artificial chromosome) dan BAC (bacterial artificial

chromosome). Dibuat beberapa klon yang berisi fragmen-fragmen dari untai M3-M4

kemudian dilakukan identifikasi YAC atau BAC yang mengandung fragmen yang berisi gen

R sehingga dapat diperkirakan marker pengapit (flanking marker) yang paling dekat dengan

gen R (E3L-E2L). tanda genetic harus mengapit

4. Fragmen hasil analisis pada tahap 3 (E3L-E2L) tersebut dianalisis lagi untuk mendapatkan

jarak marker pengapit yang sedekat mungkin dengan gen R. Hal ini dilakukan dengan

membuat beberapa klon cosmid (COS1, COS2, COS3, COS4).

5. Untuk mengidentifikasi cosmid yang menyandi gen R, maka dilakukan transformasi setiap

jenis cosmid pada tanaman yang resisten terhadap penyakit. Kemudian dilakukan seleksi

terhadap tanaman yang dapat resisten terhadap penyakit (mengandung COS1 atau COS2).

6. Setelah didapat fragmen dengan flanking region yang cukup pendek (yaitu dalam hal ini

sekuen yang overlap antara COS1 dengan COS2), dilakukan sekuensing untuk dapat

memprediksikan sekuen dari gen R serta menentukan kemungkinan protein yang dapat

dihasilkan (mengidentifikasi kandidat open reading frame dari gen R).

13  

7. Bagaimana osmotic adjustment pada sel dapat menyebabkan tanaman toleran terhadap kekeringan.

Ψw= Ψs + Ψp + Ψg + Ψm

Ψw = potensial air; Ψs = jumlah zat yang terlarut (solute); Ψp = tekanan hidrostatik yang

diberikan dinding sel; Ψg = tekanan gravitasi; Ψm = tekanan matriks

Apabila potensial air lebih besar daripada potensial air di dalam sitoplasma (Ψw eksternal > Ψw

internal) maka sel akan mengalami turgid, sedangkan apabila potensial air lebih kecil daripada

potensial air di dalam sitoplasma (Ψw eksternal < Ψw internal) maka sel akan mengalami

plasmolisis.

Kekeringan adalah dimana potensial air yang berada diluar lebih rendah dibandingkan

dengan potensial air di dalam sitoplasma sehingga menyebabkan air di dalam sitoplasma keluar

sel sehingga sel mengalami plasmolisis, tanaman menjadi layu. Hal ini tidak terjadi apabila ada

osmotic adjustment dimana osmotic adjustment adalah penyesuaian potensial air di dalam

sitoplasma agar tidak lebih tinggi dengan potensial air di luar sitoplasma. Hal-hal yang

mempengaruhi potensial air adalah jumlah zat yang terlarut, tekanan hidrostatik yang diberikan

dinding sel, tekanan gravitasi, tekanan matriks. Osmotic adjustment sendiri dipengaruhi oleh

senyawa osmo regulator yang salah satunya adalah compatible solute. Compatible solute bisa

merupakan senyawa asam amino yaitu proline; senyawa sulfat tersier seperti dimetil

sulfoniopropionate; senyawa ammonium kuartener yaitu glycine betaine, β – alanine betaine,

14  

proline betaine, choline –O- sulfate; serta senyawa polyhydric alcohol yaitu pinitol dan mannitol.

Compatible solute ini mempengaruhi nilai potensial dindingsel dan solute sehingga berpengaruh

juga terhadap besarnya nilai potensial air di dalam sitoplasma. Dengan adanya compatible

solute tersebut diharapkan Ψw eksternal > Ψw internal.

15  

8. Jelaskan mekanisme fisiologis dan molekular yang terjadi pada akar ketika terendam air dan terjadi kekurangan oksigen. Kaitkan dengan aktifitas gen ADH.

Mekanisme fisiologis yang terjadi apabila akar terendam air adalah perubahan mekanisme

respirasi sel untuk memperoleh ATP yang dipengaruhi ada tidaknya oksigen. Ada tiga status

oksigen pada saat akar terendam air, yaitu 1. normoxic (aerobic) memungkinkan masih

terjadinya pembentukan ATP secara normal yaitu meliputi glikolisis, siklus krebs, transport

elektron; 2. hypoxic, respirasi masih normal, akan tetapi ATP yang dihasilkan rendah; anoxic

(anaerobic) respirasi secara normal berhenti, terjadi fermentasi, ATP tergantung pada proses

glikolisis. Pada kondisi kekurangan oksigen baik dalam kondisi anoxia dan hypoxia, maka

glukosa yang diubah menjadi piruvat pada tahap glikolisis difermentasi menjadi etanol, dengan

perantara acetaldehyde, yang dikatalis oleh enzim alcohol dehidrogenase (ADH) dan laktat

yang dikatalis oleh enzim laktat dehydrogenase.

16  

Pada kondisi anoxia, laktat yang terbentuk tidak dikeluarkan langsung dari sitoplasma sehingga

laktat terakumulasi di dalam sel yang mengakibatkan akar mati karena asidosis sitoplasma.

Sedangkan pada kondisi hypoxia, karena masih adanya oksigen, laktat keluar melalui kanal

asam organik sehingga dapat memperpanjang umur sel dibandingkan dengan kondisi anoxia.

Mekanisme molecular yang terjadi ketika akar terendam air dalam kondisi anoxia diperoleh

bahwa ekspresi gen ADH lebih banyak dibandingkan akar yang terendam dalam kondisi

aerobic.

17  

Pada kondisi anoxia, gen Adh1 pada sel akar akan di induksi untuk melakukan transkripsi

akibat peningkatan acetaldehyde. Hasil dari transkripsi akan ditranslasikan secara efisien oleh

ribosom sehingga sel akar memproduksi banyak sekali protein ADH1, dimana mRNA hasil

transkripsi gen lainnya hanya sedikit ditranslasikan. Dibandingkan dengan sel akar dalam

kondisi aerob, ekspresi gen Adh1 pada kondisi ini tidak sebanyak pada kondisi anoxia.

Kondisi akar terendam air pun juga dipengaruhi oleh jenis tanaman. Ada tanaman yang dapat

hidup di air, seperti padi, gulma; ada tanaman yang toleran terhadap rendaman, seperti barley,

gandum, jagung; dan ada tanaman yang sensitive terhadap rendaman, seperti kedelai, tomat,

kapri.

18  

9. Tanaman yang toleran Al dapat mensekresi malat dalam jumlah yang lebih tinggi dari tanaman peka Al. Bagaimana hal ini dapat diterangkan.

Tanaman, khususnya pada tanaman yang peka terhadap Al, bisa mengalami keracunan

alumunium sehingga membatasi pertumbuhan tanaman. Keracunan alumunium ini disebabkan

antara lain karena faktor lingkungan tanah sekitar tanaman mengandung lebih dari 7 %

alumunium pada pH tanah yang rendah (pH tinggi Al tidak bersifat toksik karena membentuk

senyawa Al(OH)4.

Tanaman yang peka terhadap Al akan mengeluarkan asam organik yang bisa berupa asam

malat untuk mengatasi cekaman Al dengan cara mengkhelat Al agar supaya Al tersebut tidak

toksik terhadap tanaman.

Asam malat dapat disekresikan oleh tanaman melalui kanal asam organik di akar oleh karena,

1. Ion Al berikatan dengan kanal asam organik menginduksi kanal asam organik sehingga

mengeluarkan asam malat

2. Ion Al berikatan dengan membran plasma menginduksi kanal asam organik sehingga

mengeluarkan asam malat

3. Ion Al di angkut ke dalam sitoplasma melalui kanal tertentu pada spesies tertentu dan

menginduksi kanal asam organik sehingga mengeluarkan asam malat

19  

10. Bagaimana rekayasa terhadap lintasan fiksasi CO2 dapat dilakukan agar laju fotosintesis dapat ditingkatkan.

Agar laju fotosintesis dapat ditingkatkan, maka rekayasa terhadap lintasan fiksasi CO2

dilakukan dengan merekayasa enzim pem-fiksasi CO2 yaitu ribulosa 1,5-bisfosfat

karboksilase/oksigenase (RuBisCO). RuBisCO merupakan enzim penentu laju fotosintesis pada

tanaman. Rekayasa RuBisCO yang ideal memiliki karakteristik: laju turn-over yang lebih tinggi,

memiliki afinitas CO2 yang lebih tinggi, dan Srel (Srel : rasio spesifisitas dari reaksi karboksilasi

dengan reaksi oksigenase) yang lebih tinggi. Strategi rekayasa RuBisCO yang lain di antaranya

merekayasa agar RuBisCO dapat tetap memfiksasi CO2 meskipun pada kondisi kekeringan

ketika celah stomata berkurang. Selain itu, terdapat enzim RuBisCO yang superior pada

tanaman tertentu.

Rekayasa genetik RuBisCO dapat dilakukan di antaranya dengan cara:

1. Melakukan berbagai mutasi gen RuBIsCO (yaitu gen rbcL) untuk mendapatkan enzim yang

lebih ideal, kemudian mengganti gen asli tanaman dengan gen yang telah dimutasi tersebut.

Selain memutasi, peningkatan kinerja RuBisCO dapat dilakukan dengan mengganti gen

penyandi RuBisCO asli dari tanaman dengan gen RuBisCO yang superior.

2. Melakukan kloning pada gen penyandi sub unit besar maupun sub unit kecil dari RuBisCO

yang superior pada Srel dan Km nya untuk fiksasi CO2, dan mentransfeksikannya pada lokus

rbcL dari DNA kloroplas pada tanaman target.