TOKSISITAS AKUT BUAH SIRIH HUTAN (Piper aduncum)

TERHADAP LARVA UDANG (Artemia salina) DAN

EMBRIO IKAN ZEBRA (Danio rerio)

ANDHIKA GUSTI HERIYANTO

DEPARTEMEN KIMA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Toksisitas Akut Buah

Sirih Hutan (Piper aduncum) terhadap Larva Udang (Artemia salina) dan Embrio

Ikan Zebra (Danio rerio) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi

pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi

mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan

maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan

dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2014

Andhika Gusti Heriyanto

NIM G44090085

ABSTRAK

ANDHIKA GUSTI HERIYANTO. Toksisitas Akut Buah Sirih Hutan (Piper

aduncum) terhadap Larva Udang (Artemia salina) dan Embrio Ikan Zebra (Danio

rerio). Dibimbing oleh GUSTINI SYAHBIRIN dan KUSDIANTORO

MOHAMAD.

Piper aduncum, yang dikenal sebagai tanaman sirih hutan di Indonesia, telah

digunakan oleh masyarakat Indonesia sebagai obat tradisional. Penelitian ini

bertujuan menguji toksisitas minyak atsiri dan ekstrak n-heksana buah sirih hutan

terhadap larva udang (Artemia salina) dan embrio ikan zebra (Danio rerio). Ekstrak

n-heksana menghasilkan toksisitas yang lebih tinggi, dengan nilai konsentrasi letal

50% (LC50) sebesar 20 ppm terhadap larva udang dan 16 ppm terhadap embrio ikan

zebra pada 96 jam pascafertilisasi. Pemberian ekstrak n-heksana dan minyak atsiri

menunjukkan malformasi mayor pada kantung kuning telur, jantung, dan sirkulasi

darah embrio ikan zebra berdasarkan uji in vivo yang dilakukan. Berdasarkan hasil

analisis kromatografi gas-spektrometri massa, komponen utama dalam minyak

atsiri dan ekstrak n-heksana adalah dilapiol (1-alil-2,3-dimetoksi-4,5-

(metilenadioksi)benzena).

Kata kunci: dilapiol, Piper aduncum, toksisitas akut

ABSTRACT

ANDHIKA GUSTI HERIYANTO. Acute Toxicity of Sirih Hutan (Piper aduncum)

Fruit against Brine Shrimp (Artemia salina) and Zebrafish (Danio rerio) Embryo.

Supervised by GUSTINI SYAHBIRIN and KUSDIANTORO MOHAMAD.

Piper aduncum, known as sirih hutan in Indonesia, is an herb traditionally

used in Indonesian community. This study is to evaluate the toxicity of essential oil

and n-hexane extract of P. aduncum fruit against brine shrimp (Artemia salina) and

zebrafish (Danio rerio) embryo. The n-hexane extract showed higher toxicity, with

50% lethal concentration (LC50) of 20 ppm against A. salina and 16 ppm against D.

rerio embryo for 96 hours post fertilization. The in vivo test indicated that the n-

hexane extract and the essential oil caused major malformation on yolk sac, heart,

and blood circulation in D. rerio embryo. Based on gas chromatography-mass

spectrometry analysis, the main component in the essential oil and n-hexane extract

was dillapiole (1-allyl-2,3-dimethoxy-4,5-(methylenedioxy)benzene).

Key words: acute toxicity, dillapiole, Piper aduncum

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Kimia

TOKSISITAS AKUT BUAH SIRIH HUTAN (Piper aduncum)

TERHADAP LARVA UDANG (Artemia salina) DAN

EMBRIO IKAN ZEBRA (Danio rerio)

ANDHIKA GUSTI HERIYANTO

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

Judul Skripsi : Toksisitas Akut Buah Sirih Hutan (Piper aduncum) terhadap Larva

Udang (Artemia salina) dan Embrio Ikan Zebra (Danio rerio)

Nama : Andhika Gusti Heriyanto

NIM : G44090085

Disetujui oleh

Dr Gustini Syahbirin, MS

Pembimbing I

drh Kusdiantoro Mohamad, MSi, PAVet

Pembimbing II

Diketahui oleh

Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS

Ketua Departemen

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan

karunia-Nya sehingga karya ilmiah yang berjudul “Toksisitas Akut Buah Sirih

Hutan (Piper aduncum) terhadap Larva Udang (Artemia salina) dan Embrio Ikan

Zebra (Danio rerio)” berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini dilaksanakan dari

bulan Oktober 2013 hingga April 2014 di Laboratorium Kimia Organik,

Departemen Kimia, FMIPA dan Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi,

Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, IPB.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Gustini Syahbirin, MS dan drh

Kusdiantoro Mohamad, MSi, PAVet selaku pembimbing yang telah memberikan

arahan, saran, nasihat, dan semangat selama penelitian. Di samping itu,

penghargaan penulis sampaikan kepada Bapak Budi Arifin SSi, MSi atas dukungan

dan segala bantuan sebagai Komisi Pendidikan, Bapak Sabur atas nasihat dan

pengalaman laboratoriumnya, Kak Wahyu Hendana dan Astari (KIM 44) atas

bantuan informasi terkait ikan zebra, Bapak Jaswanto yang membantu analisis GC-

MS, dan seluruh staf Laboratorium Kimia Organik dan Embriologi atas segala

bantuan dan dukungannya. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua

orang tua dan keluarga penulis atas doa, kasih sayang, bantuan moral dan materi

untuk kelancaran kuliah dan tugas akhir. Rasa terima kasih juga disampaikan untuk

Padjri, Sigit, DC boys, Ajeng Herpianti, Wahyu, Ichsan, rekan penelitian Mella

Yanti, Yugo, dan Kurnia atas semangat dan kebersamaannya. Tidak lupa pula,

kepada teman-teman Kimia 46 atas doa, motivasi, bantuan, kebersamaan, dan

segala dukungan yang telah diberikan, serta berbagai pihak yang telah ikut

berkontribusi dalam penulisan karya ilmiah ini. Semoga Allah SWT membalas

kebaikan semua. Amin.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2014

Andhika Gusti Heriyanto

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vii

DAFTAR GAMBAR vii

DAFTAR LAMPIRAN vii

PENDAHULUAN 1

BAHAN DAN METODE 2

Alat dan Bahan 2

Metode Penelitian 2

HASIL DAN PEMBAHASAN 5

Hasil Determinasi Tumbuhan, Kadar Air, Minyak, dan Rendemen

Ekstrak 5

Fitokimia Ekstrak n-Heksana 6

Identitas Komponen Minyak Atsiri dan Ekstrak n-Heksana berdasarkan

Kromatogram GC-MS 6

Toksisitas terhadap Larva Udang 8

Toksisitas terhadap Embrio Ikan Zebra 9

Efek Teratogenik pada Embrio Ikan Zebra 11

SIMPULAN DAN SARAN 14

DAFTAR PUSTAKA 14

LAMPIRAN 18

RIWAYAT HIDUP 34

DAFTAR TABEL

1 Fitokimia ekstrak n-heksana 6

2 Nilai LC50 minyak atsiri dan ekstrak n-heksana terhadap embrio ikan zebra 9

3 Persentase embrio yang hidup normal, hidup abnormal, mati, dan menetas

pada perlakuan dengan minyak atsiri 10

4 Persentase embrio yang hidup normal, hidup abnormal, mati, dan menetas

pada perlakuan dengan ekstrak n-heksana 10

5 Efek teratogenik pada embrio ikan zebra akibat paparan minyak atsiri dan

ekstrak n-heksana 12

DAFTAR GAMBAR

1 Kromatogram GC-MS minyak atsiri 7

2 Kromatogram GC-MS ekstrak n-heksana 7

3 Senyawa dominan dalam minyak atsiri dan ekstrak n-heksana buah sirih

hutan 8

4 Morfologi embrio ikan zebra normal pada kontrol dan beberapa abnormalitas

pada perlakuan 13

DAFTAR LAMPIRAN

1 Diagram alir penelitian 18

2 Hasil determinasi tanaman sirih hutan 19

3 Kadar air serbuk dan rendemen buah sirih hutan 20

4 Hasil GC-MS minyak atsiri dan ekstrak n-heksana 21

5 Spektrum MS senyawa dilapiol 23

6 Hasil uji BSLT dan analisis probit 25

7 Hasil uji ZFET dan analisis probit 28

8 Analisis Anova dan uji lanjut Duncan 31

1

PENDAHULUAN

Pencarian obat dari bahan alami masih terus dilakukan sampai saat ini, baik

yang bersumber dari daratan maupun perairan. Salah satu tumbuhan yang

berpotensi sebagai obat adalah genus Piper dari famili Piperaceae. Tumbuhan

Piperaceae sebagian besar tersebar di daerah tropis dan subtropis, terutama banyak

terdapat di zona tropis Amerika (700 spesies), diikuti oleh Asia Selatan dan Oseania

(300 spesies) (Diaz et al. 2012). Genus Piper secara luas digunakan sebagai obat

tradisional di Amerika Latin dan India Barat untuk menyembuhkan luka,

mengurangi pembengkakan dan iritasi kulit, serta mengobati gejala leishmaniasis

kulit (Estevez et al. 2007). Salah satu jenisnya adalah sirih hutan (Piper aduncum)

yang memiliki berbagai aktivitas biologis.

Sirih hutan merupakan salah satu jenis tumbuhan dari famili Piperaceae yang

telah tersebar luas di berbagai daerah di Indonesia dan dikenal dengan beberapa

nama daerah seperti sedah (Jawa), ranul (Lampung), base (Bali), bida (Maluku),

nahi (Bima), dan seuseureuhan atau gedebong (Sunda). Secara tradisional,

tumbuhan ini digunakan oleh masyarakat Indonesia untuk mengatasi sakit perut,

penyembuh luka, demam, sakit gigi, rematik, kencing nanah (gonore), dan penolak

serangga (Jamal et al. 2003). Minyak atsiri sirih hutan memiliki aktivitas sebagai

molusida, insektisida, dan antibakteri (Pohlit et al. 2006). Sirih hutan banyak

diaplikasikan sebagai insektisida nabati. Bernard et al. (1995) melaporkan bahwa

perlakuan ekstrak etanol daun sirih hutan 0.4% dapat menghambat perkembangan

larva Ostrinia nubilis hingga 90%, sementara pada konsentrasi 0.1 ppm

menyebabkan kematian larva nyamuk Aedes atropalpus sebesar 92%. Selain itu,

perlakuan dengan ekstrak n-heksana buah sirih hutan dapat mengakibatkan

kematian larva Crocidolomia pavonana sampai 95.6% dengan konsentrasi letal

50% (LC50) 365 ppm (Hasyim 2011).

Sirih hutan kaya akan senyawa metabolit sekunder, di antaranya golongan

alkaloid, terpenoid, flavonoid, benzenoid, turunan asam karboksilat,

fenilpropanoid, terpena, neolignan, tanin, kromena, dan flavon (Parmar et al. 1997;

Braga et al. 2007). Sudrajat et al. (2011) menyatakan bahwa ekstrak kasar etanol

daun dan batang sirih hutan mengandung senyawa saponin, steroid, dan alkaloid.

Parmar et al. (1997) juga melaporkan bahwa daun sirih hutan mengandung

senyawa-senyawa golongan flavonoid, yaitu asebogenin, adunktin A‒E,

metillindaretin, dan piperadunsin A‒C. Metillindaretin memperlihatkan sifat

sitotoksik melawan sel karsinoma nasofaring dengan nilai dosis efektif 50% (ED50)

6 μg/mL. Adunktin B‒D dan metillindaretin juga aktif sebagai antibakteri terhadap

Micrococcus luteus (Orjala et al. 1993). Ekstrak kasar petroleum eter daun sirih

hutan mengandung seskuiterpena, yaitu viridiflorol, kubebol, spatulenol, dan

kariofilenol II yang memperlihatkan aktivitas molusida yang tinggi terhadap

Biomphalaria glabrata (Orjala et al. 1993).

Uji toksisitas merupakan hal terpenting dalam mengembangkan dan

memproduksi obat herbal. Suatu produk herbal dapat dinyatakan aman jika sudah

dibuktikan secara ilmiah keamanannya melalui serangkaian uji, antara lain uji

toksisitas akut, uji toksisitas sub-akut, uji toksisitas kronik, dan uji teratogenik. Uji

toksisitas memberikan informasi tentang bahaya kesehatan akibat paparan bahan

tertentu pada tubuh. Menurut Peraturan Menteri Kesehatan RI No.

2

761/MENKES/SK/IX/1992, uji toksisitas akut merupakan prasyarat formal

keamanan calon fitofarmaka (obat) untuk pemakaian pada manusia (Depkes RI

1992). Pada penelitian ini dilakukan uji toksisitas akut pada hewan uji larva udang

dan embrio ikan zebra.

Uji letalitas larva udang (BSLT) merupakan salah satu metode pendahuluan

untuk mengetahui daya sitotoksik suatu ekstrak atau senyawa. Metode ini

menggunakan larva udang (Artemia salina) sebagai bioindikator. Hasil uji

toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi positif dengan daya

sitotoksik senyawa antikanker. Larva udang merupakan agen biota laut yang sangat

kecil dan mempunyai kepekaan yang cukup tinggi terhadap toksikan (Carballo et

al. 2002). Uji toksisitas embrio ikan zebra (ZFET) merupakan metode yang sedang

berkembang pesat di dunia saat ini sebagai uji untuk penelitian toksikologi. Hasil

uji toksisitas pada embrio ikan zebra telah terbukti berkorelasi positif dengan hasil

uji toksisitas pada mamalia (Ma et al. 2007). Pengujian senyawa antikanker secara

in vivo pada embrio ikan zebra juga telah dilakukan oleh Berghmans et al. (2005),

Moore et al. (2006), Nicoli dan Presta (2007), dan Hsu et al. (2007). Penelitian

secara khusus mengenai toksisitas minyak atsiri dan ekstrak n-heksana buah sirih

hutan dengan metode BSLT dan ZFET belum pernah dilakukan. Hal tersebut yang

mendasari dilakukannya penelitian ini untuk menguji toksisitas akut minyak atsiri

dan ekstrak n-heksana buah sirih hutan.

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah buah sirih hutan, akuades, dimetil

sulfoksida (DMSO), n-heksana, Na2SO4 anhidrat, HCl pekat, n-amil alkohol,

pereaksi Liebermann-Buchard, pereaksi Meyer, pereaksi Dragendorf, pereaksi

Wagner, serbuk Mg, kloroform-amoniak, FeCl3 1%, NaOH 10%, H2SO4 2 M, larva

udang, embrio ikan zebra, air tawar, dan air laut. Alat yang digunakan ialah

peralatan kaca, oven, radas distilasi, GC-MS, aerator, 96-well plate, dan mikroskop

terbalik (Olympus, Jepang).

Metode Penelitian

Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu determinasi tumbuhan sirih

hutan, penyiapan sampel, ekstraksi maserasi, uji fitokimia, isolasi minyak atsiri,

identifikasi komponen aktif dengan kromatografi gas-spektrometer massa (GC-

MS), serta uji toksisitas dengan larva udang dan embrio ikan zebra. Bagan alir

penelitian ditunjukkan pada Lampiran 1.

Determinasi Tumbuhan

Buah sirih hutan diperoleh dari areal kampus Institut Pertanian Bogor (IPB)

Dramaga, tepatnya di posisi koordinat (6o33′43.78″S, 106o43′32.87″E). Tumbuhan

3

ini kemudian dideterminasi di Herbarium Laboratorium Biologi, LIPI, Cibinong,

Bogor.

Penentuan Kadar Air (AOAC 2006)

Cawan porselen dikeringkan di dalam oven dengan suhu 105 oC selama 30

menit. Kemudian cawan didinginkan dalam eksikator dan ditimbang bobot

kosongnya. Sampel sebanyak 3 g dimasukkan ke dalam cawan tersebut dan

dipanaskan di dalam oven bersuhu 105 oC selama 3 jam. Setelah itu, cawan

didinginkan dalam eksikator dan ditimbang sampai diperoleh bobot konstan. Kadar

air ditentukan sebanyak 3 kali ulangan (triplo).

Kadar air (%) =A - B

A ×100%

A: Bobot sampel sebelum dikeringkan (g)

B: Bobot sampel setelah dikeringkan (g)

Preparasi dan Ekstraksi

Buah sirih hutan dibersihkan dan dipotong kecil-kecil (±2 cm), kemudian

dikeringudarakan. Setelah kering, buah tersebut dihaluskan hingga diperoleh

serbuk. Sampel serbuk sebanyak 500.25 g diekstraksi dengan cara maserasi

menggunakan pelarut n-heksana (1:10 b/v). Hasil perendaman disaring untuk

memisahkan filtrat dan residunya. Filtrat kemudian dipekatkan dengan

menggunakan penguap putar sehingga didapatkan ekstrak pekat n-heksana. Ekstrak

pekat tersebut dapat langsung digunakan atau disimpan dalam lemari es (≤ 4 oC)

hingga saat digunakan.

Uji Fitokimia (Harborne 1987)

Uji alkaloid dilakukan dengan cara mengekstraksi 0.1 g ekstrak dengan

sedikit kloroform, lalu ditambahkan 10 mL kloroform-amoniak dan disaring. Filtrat

yang diperoleh ditetesi dengan H2SO4 2 M dan dikocok hingga terbentuk 2 lapisan.

Lapisan asam (tidak berwarna) dipisahkan ke dalam 3 tabung reaksi, masing-

masing ditambahkan beberapa tetes pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorf. Uji

positif alkaloid berturut-turut ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih

kekuningan, endapan cokelat, dan endapan jingga.

Uji fenol dan flavonoid dilakukan dengan cara menambahkan 0.1 g ekstrak

dengan 1 mL kloroform dan 1 mL air, kemudian dikocok dan didiamkan hingga

terbentuk 2 lapisan. Uji fenol positif apabila terbentuk warna hijau, biru, atau ungu

pada lapisan atas setelah ditambahkan FeCl3 1%. Uji flavonoid positif apabila

terbentuk warna kuning atau jingga pada lapisan atas setelah ditambahkan 0.1 g

serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL n-amil alkohol.

Uji saponin dilakukan dengan cara menambahkan 0.1 g ekstrak dengan 10

mL akuades panas, kemudian dipanaskan selama 5 menit. Filtrat sebanyak 10 mL

dikocok selama 10 menit dalam keadaan tertutup. Ekstrak yang mengandung

saponin akan membentuk buih yang stabil selama 10 menit.

Uji tanin dilakukan dengan cara melarutkan 0.1 g ekstrak dengan 10 mL

akuades panas dan dididihkan selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat ditambahkan 10

mL FeCl3 1%. Uji positif ditandai dengan munculnya warna biru tua atau hijau

kehitaman.

4

Uji triterpenoid dan steroid dilakukan dengan cara melarutkan 0.1 g ekstrak

dengan 25 mL etanol (50 oC), lalu disaring. Ke dalam filtrat ditambahkan 3 tetes

anhidrida asetat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan dikocok

perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya

warna merah atau ungu untuk triterpenoid serta hijau atau biru untuk steroid.

Isolasi Minyak Atsiri dengan Distilasi

Buah segar sirih hutan didistilasi air selama ±4 jam. Minyak atsiri dan air

tidak saling melarutkan, maka minyak distilat dapat dipisahkan dari lapisan air

berdasarkan perbedaan bobot jenis dan kemudian dikeringkan dengan Na2SO4

anhidrat.

% Minyak atsiri =Bobot akhir minyak

Bobot awal terkoreksi (bahan)× 100%

Identifikasi Komponen dengan GC-MS

Analisis GC-MS dilakukan di Pusat Laboratorium Forensik (Puslabfor),

Mabes Polri, Jakarta. Sampel diinjeksikan ke dalam GC-MS Agilent 5975C TAD

dengan kolom kapiler HP-5MS berukuran 30 m × 0.25 mm × 0.25 µm dan gas

pembawa helium dengan laju alir 1.0 mL/menit. Suhu maksimum kolom 325 oC,

suhu oven 100 oC (5 menit) hingga 290 oC pada laju 15 oC/menit, dan waktu proses

37.667 menit. Suhu injektor split 290 oC dengan laju alir 104 mL/menit, tekanan

34.575 psi, volume injeksi 1 µL, energi ionisasi 69.922 eV, dan kisaran bobot

molekul 35‒800 m/z. Identifikasi senyawa dilakukan dengan membandingkan

puncak spektrum massa dengan pangkalan data Wiley 7N dan Wiley 9N.

Uji Toksisitas Akut Metode BSLT (Meyer et al. 1982)

Penetasan Telur A. salina. Telur A. salina diperoleh dari toko ikan Terang

di daerah Jembatan Merah, Bogor. Telur ditetaskan dalam wadah berisi air laut yang

telah disaring dan diaerasi. Penetasan dilakukan selama 48 jam dengan kondisi

cukup cahaya. Larva yang menetas selanjutnya digunakan untuk pengujian.

Uji Toksisitas. Larutan induk ekstrak dibuat dalam konsentrasi 2000 ppm.

Ekstrak ditambahkan DMSO apabila sulit larut dalam air laut. Uji toksisitas

dilakukan pada larutan kontrol (0 ppm) serta larutan uji 50, 250, 500, 750, dan 1000

ppm yang dibuat dari larutan induk 2000 ppm. Sebanyak 400 µL air laut, 10 ekor

larva udang dalam 600 µL air laut, dan 1 mL ekstrak dimasukkan ke dalam vial.

Selanjutnya, vial ditutup dengan kertas aluminium dan diinkubasi selama 24 jam.

Ulangan dilakukan sebanyak 4 kali. Setelah 24 jam, larva A. salina yang mati

diamati dan dihitung. Data yang diperoleh dianalisis dengan metode probit

menggunakan perangkat lunak Minitab 16 untuk mengetahui LC50 dengan selang

kepercayaan 95%.

5

Uji Toksisitas Akut Metode ZFET (Ali dan Legler 2011; OECD 2013) Penyiapan Embrio Ikan Zebra. Telur ikan zebra diperoleh dari peternak

ikan lokal di daerah Pakansari, Cibinong, Kabupaten Bogor. Telur yang didapat

diseleksi dengan kriteria fertil, kondisi telur yang baik, bebas dari jamur, dan tahap

perkembangan embrio yang seragam.

Uji Toksisitas. Larutan induk ekstrak dibuat dalam konsentrasi 2000 ppm.

Ekstrak ditambahkan DMSO apabila sulit larut dalam air laut. Uji toksisitas

dilakukan pada larutan kontrol (0 ppm) serta larutan uji 50, 250, 500, 750, dan 1000

ppm yang dibuat dari larutan standar 2000 ppm. Embrio dimasukkan ke dalam 96-

well plate dan tiap sumur diisi sebanyak 1 embrio. Ulangan dilakukan sebanyak 3

kali. Nilai LC50 ditentukan dengan metode probit menggunakan perangkat lunak

Minitab 16 dengan selang kepercayaan 95%. Embrio ikan zebra yang telah terpapar

oleh ekstrak aktif selama 24, 48, 72, 96, dan 120 jam pascafertilisasi (jpf) diamati

morfologinya, yaitu pigmentasi, sumbu tubuh, kepala, mata, otolit, somit, sirip,

sirkulasi darah, jantung, kantung kuning telur, dan ekor dengan menggunakan

mikroskop terbalik di Laboratorium Embriologi, Fakultas Kedokteran Hewan,

Institut Pertanian Bogor. Analisis ragam Anova 1-arah dilanjutkan dengan uji

Duncan dilakukan dengan perangkat lunak SPSS 20, pada data hasil pengujian.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Determinasi Tumbuhan, Kadar Air, Minyak, dan Rendemen Ekstrak

Buah yang digunakan terbukti merupakan sirih hutan (Piper aduncum)

berdasarkan hasil determinasi (Lampiran 2). Kadar air digunakan untuk mengoreksi

rendemen, menentukan bobot buah yang diperlukan, dan mengindikasikan

ketahanan sampel selama proses penyimpanan. Sampel memiliki ketahanan simpan

yang baik jika kadar airnya kurang dari 10% (Winarno 1992). Berdasarkan hasil

analisis, kadar air dalam sampel kering buah sirih hutan sebesar 5.75% (Lampiran

3) sehingga kemungkinan mikroorganisme untuk tumbuh selama penyimpanan

sangat kecil.

Serbuk buah kering sebanyak 500.25 g dimaserasi menggunakan n-heksana.

Pelarut ini dipilih sebagai pengekstrak karena menurut Hasyim (2011), ekstrak n-

heksana buah sirih hutan lebih toksik terhadap larva C. pavonana instar II

dibandingkan dengan ekstrak etil asetat dan metanol. Rendemen ekstrak n-heksana

diperoleh sebesar 10.15% dengan 10 kali ekstraksi, berupa minyak yang berwarna

kuning kehitaman. Metode ekstraksi maserasi digunakan karena kandungan

senyawa dalam sampel belum diketahui ketahanannya terhadap panas. Minyak

atsiri diperoleh dari 891.55 g buah sirih hutan segar dengan rendemen 1.03%,

berwarna kuning cerah dengan aroma yang khas.

6

Fitokimia Ekstrak n-Heksana

Hasil uji fitokimia (Tabel 1) menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana buah

sirih hutan mengandung senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid, fenolik,

flavonoid, saponin, tanin, dan steroid. Sudrajat (2010) melaporkan bahwa ekstrak

n-heksana daun dan batang sirih hutan dari Samarinda hanya mengandung senyawa

dari golongan steroid. Ekstrak n-heksana daun sirih hutan yang berasal dari Peru

mengandung senyawa dari golongan fenolik dan flavonoid (Arroyo et al. 2013).

Tabel 1 Fitokimia ekstrak n-heksana

Golongan Hasil

Penelitian

Literatur

Sudrajat 2010 Arroyo et al. 2013

(Samarinda) (Peru)

Alkaloid + - -

Fenolik + - +

Flavonoid + - +

Saponin + - -

Tanin + - -

Triterpenoid - - -

Steroid + + -

Perbedaan senyawa metabolit sekunder dari suatu tumbuhan dapat

disebabkan oleh keragaman sifat genetika dan umur tumbuhan. Kondisi tanah dan

vegetasi di sekitar lokasi tumbuhan sumber, serta kondisi musim saat pengambilan

bahan tumbuhan juga berpengaruh (Kaufman et al. 2006).

Identitas Komponen Minyak Atsiri dan Ekstrak n-Heksana berdasarkan

Kromatogram GC-MS

Kromatogram GC-MS minyak atsiri dan ekstrak n-heksana buah sirih hutan

menunjukkan beberapa puncak dengan waktu retensi yang berbeda (Lampiran 4).

Terdapat 30 senyawa yang teridentifikasi dari minyak atsiri dan 27 senyawa dari

ekstrak n-heksana dengan % kemiripan lebih dari 90%. Terdapat 6 senyawa

dominan (% area >0.50%) dalam minyak atsiri, yaitu γ-terpinena, piperiton,

kariofilena, germakrena-D, 1,3-benzodioksol, dan dilapiol, sedangkan dari ekstrak

n-heksana diperoleh 5 senyawa dominan (% area >0.50%), yaitu kariofilena,

pentadekana, 1,3-benzodioksol, dilapiol, dan apiol. Senyawa dilapiol memiliki %

area paling besar dalam minyak atsiri dan ekstrak n-heksana sirih hutan, berturut-

turut 84.13 dan 83.59%. Dilapiol yang terdapat dalam minyak atsiri terdeteksi pada

waktu retensi 14.371 menit (Gambar 1) dan dalam ekstrak n-heksana terdeteksi

pada waktu retensi 14.445 menit (Gambar 2). Menurut Maia et al. (1998), di antara

tumbuhan Piperaceae, sirih hutan menghasilkan minyak atsiri dengan rendemen

yang tinggi, dengan dilapiol sebagai komponen utamanya. Lampiran 5

menunjukkan spektrum massa senyawa tersebut dan analisis pola fragmentasinya.

Rali et al. (2007) melaporkan bahwa tumbuhan sirih hutan yang berasal dari

Malaysia, Fiji, dan Kuba mengandung dilapiol masing-masing sebesar 64.5, 58, dan

82.2%. Maia et al. (1998) juga melaporkan kandungan dilapiol dari tumbuhan sirih

7

hutan yang berasal dari wilayah Amazon berkisar 31.5‒97.3%, sedangkan minyak

atsiri buah sirih hutan yang berasal dari Kutai (Kalimantan Timur) memiliki 63

komponen kimia dengan apiol (51.03%) sebagai komponen utamanya dan tidak

terdeteksi adanya senyawa dilapiol (Jamal et al. 2003). Struktur senyawa dominan

yang terkandung dalam minyak atsiri dan ekstrak n-heksana ditunjukkan pada

Gambar 3.

Gambar 1 Kromatogram GC-MS minyak atsiri

Gambar 2 Kromatogram GC-MS ekstrak n-heksana

8

Gambar 3 Senyawa dominan dalam minyak atsiri dan ekstrak n-heksana buah sirih

hutan

Toksisitas terhadap Larva Udang

Uji BSLT menggunakan hewan uji A. salina merupakan uji pendahuluan

yang sederhana untuk mengetahui sitotoksisitas akut suatu senyawa, dengan cara

menentukan nilai LC50 dari komponen aktif suatu simplisia atau ekstrak tanaman

(Frank 1995). Nilai LC50 ditentukan dengan menggunakan metode analisis probit

pada selang kepercayaan 95%. Nilai probit digunakan dalam toksikologi untuk

menentukan toksisitas relatif bahan kimia terhadap organisme hidup dengan

respons berupa kematian organisme tersebut. Apabila nilai LC50 hasil pengujian di

bawah 1000 ppm, maka ekstrak yang diujikan memiliki sifat toksik dan berpotensi

sebagai antikanker (Meyer et al. 1982).

Nilai LC50 yang diperoleh menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana lebih

toksik daripada minyak atsiri. Minyak atsiri dan ekstrak n-heksana memiliki nilai

LC50 masing-masing 51.45 dan 20.21 ppm (Lampiran 6). Ekstrak n-heksana selain

mengandung lemak, juga mengandung sebagian besar komponen organik nonpolar

(Lampiran 4). Hasil uji fitokimia ekstrak ini menunjukkan kandungan senyawa

bioaktif dari golongan alkaloid, fenolik, flavonoid, saponin, tanin, dan steroid. Sifat

toksik senyawaan metabolit sekunder tersebut diduga menyebabkan ekstrak n-

heksana mempunyai nilai LC50 lebih kecil dan lebih toksik dibandingkan dengan

minyak atsiri. Nilai LC50 ekstrak n-heksana buah sirih hutan hasil penelitian ini

tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Sudrajat et al. (2011) yang melaporkan

bahwa ekstrak kasar n-heksana batang dan daun sirih hutan asal Samarinda

berturut-turut sebesar 11.8 dan 19.5 ppm.

Hasil uji BSLT memiliki korelasi yang positif dengan toksisitas dan

sitotoksisitas pada sel leukemia dan sel tumor (Colegate dan Molyneux 2008).

γ-Terpinena Piperiton

n 1,3-Benzodioksol Germakrena-D

Apiol Dilapiol Kariofilena

9

Menurut National Cancer Institute (NCI) Amerika, nilai standar efektivitas

komponen bioaktif untuk melawan sel kanker adalah ≤30 ppm (Albuntana et al.

2011).……….

Toksisitas terhadap Embrio Ikan Zebra

Ikan zebra (D. rerio) lazim digunakan dalam penelitian ekotoksikologi karena

kesesuaian sifat biologis dan reproduksinya (selang generasi pendek, selang

pemijahan singkat, dan telur transparan) (Meinelt et al. 1999). Saat ini telah

dikembangkan uji toksisitas pada embrio ikan zebra untuk penemuan obat-obatan

terbaru dari senyawa bahan alam, termasuk uji toksisitas akut (Kari et al. 2007). Uji

toksisitas akut dengan menggunakan embrio ikan zebra merupakan uji lanjutan

terhadap ekstrak buah sirih hutan untuk melihat potensinya sebagai antikanker. Jika

ekstrak yang diberikan bersifat toksik, maka perkembangan embrio akan terhambat

dan dapat menyebabkan kematian.

Nilai LC50 minyak atsiri dan ekstrak n-heksana ditunjukkan pada Tabel 2.

Nilai LC50 ditentukan pada waktu 48 dan 96 jam pascafertilisasi (jpf) (Lampiran 7).

Baik minyak atsiri maupun ekstrak n-heksana memiliki nilai LC50 kurang dari 1000

ppm, yang mengindikasikan keduanya bersifat toksik berdasarkan uji ZFET. Hasil

yang diperoleh sebanding dengan hasil uji BSLT untuk ekstrak n-heksana, tetapi

untuk minyak atsiri, nilai LC50 hasil uji ZFET jauh lebih besar. Hal ini mungkin

disebabkan oleh sifat atsiri minyak, sehingga lama waktu uji yang mencapai 4 hari

dapat menyebabkan komponen di dalam minyak atsiri menjadi tidak stabil. Selain

itu, ikan zebra merupakan organisme yang lebih kompleks daripada larva udang,

sehingga memiliki ketahanan tubuh yang lebih baik terhadap senyawa toksik yang

diujikan. Meskipun demikian, dalam uji dengan embrio ikan zebra, nilai LC50

ekstrak n-heksana tetap lebih rendah.

Tabel 2 Nilai LC50 minyak atsiri dan ekstrak n-heksana terhadap embrio ikan zebra

Sampel Waktu pengamatan (jpf) LC50

Minyak atsiri 48 154.08

96 143.09

n-Heksana 48 16.81

96 16.10

Hasil analisis Anova dan uji lanjut Duncan memberikan informasi bahwa

konsentrasi minyak atsiri berpengaruh pada hidup normal dan hidup abnormal

embrio (p < 0.05) pada 48 dan 96 jpf, tetapi tidak berpengaruh pada parameter mati

dan menetas (Tabel 3). Konsentrasi sebesar 80 dan 100 ppm baru menimbulkan

perbedaan yang nyata dengan kontrol untuk persentase embrio yang hidup normal

pada 48 jpf, sedangkan persentase embrio yang hidup abnormal telah berbeda nyata

dengan kontrol pada konsentrasi 20, 40, dan 80 ppm. Pada 96 jpf, hanya konsentrasi

60 ppm yang tidak berbeda nyata dengan kontrol untuk persentase hidup normal

embrio. Sebaliknya, perbedaan nyata dengan kontrol untuk hidup abnormal embrio

pada 96 jpf hanya terjadi pada konsentrasi minyak atsiri 80 ppm.

10

Tabel 3 Persentase embrio yang hidup normal, hidup abnormal, mati, dan menetas

pada perlakuan dengan minyak atsiri

Perlakuan Hidup Normal

(%)

Hidup Abnormal

(%) Mati (%) Menetas (%)

Kontrol 48 jpf 100.00 ± 0.00a 0.00 ± 0.00a 0.00 ± 0.00a 80.00 ± 20.00a

20 ppm 73.33 ± 11.55ab 26.67 ± 11.55c 0.00 ± 0.00a 80.00 ± 20.00a

40 ppm 73.33 ± 11.55ab 26.67 ± 11.55c 0.00 ± 0.00a 86.67 ± 11.55a

60 ppm 80.00 ± 34.64ab 6.67 ± 11.55ab 13.33 ± 23.09a 86.67 ± 23.09a

80 ppm 60.00 ± 0.00b 20.00 ± 0.00bc 20.00 ± 0.00a 73.33 ± 11.55a

100 ppm 60.00 ± 20.00b 13.33 ± 11.55abc 26.67 ± 30.55a 66.67 ± 23.09a

Rerata 74.44 ± 20.36 15.56 ± 12.94 10.00 ± 17.15 78.89 ± 17.45

Kontrol 96 jpf 100.00 ± 0.00a 0.00 ± 0.00a 0.00 ± 0.00a 100.00 ± 0.00a

20 ppm 60.00 ± 20.00b 26.67 ± 11.55ab 13.33 ± 23.09a 86.67 ± 23.09a

40 ppm 66.67 ± 11.55b 26.67 ± 23.09ab 6.67 ± 11.55a 93.33± 11.55a

60 ppm 73.33 ± 30.55ab 13.33 ± 11.55ab 13.33 ± 23.09a 86.67 ± 23.09a

80 ppm 46.67 ± 11.55b 33.33 ± 11.55b 20.00 ± 0.00a 80.00 ± 0.00a

100 ppm 53.33 ± 11.55b 20.00 ± 20.00ab 26.67 ± 30.55a 73.33 ± 30.55a

Rerata 66.67 ± 22.75 20.00 ± 16.80 13.33 ± 18.15 86.67 ± 18.15

Keterangan: huruf tikatas yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan yang nyata

(p < 0.05).

Semua konsentrasi ekstrak n-heksana yang diujikan memberikan pengaruh

terhadap hidup normal, mati, dan menetas embrio (p < 0.05) pada 48 dan 96 jpf

(Tabel 4). Hasil analisis Anova dan uji lanjut Duncan menunjukkan perbedaan yang

nyata dengan kontrol pada ketiga parameter tersebut, tetapi tidak didapat pengaruh

pada hidup abnormal embrio.

Tabel 4 Persentase embrio yang hidup normal, hidup abnormal, mati, dan menetas

pada perlakuan dengan ekstrak n-heksana

Perlakuan Hidup Normal

(%)

Hidup Abnormal

(%) Mati (%) Menetas (%)

Kontrol 48 jpf 100.00 ± 0.00a 0.00 ± 0.00a 0.00 ± 0.00a 100.00 ± 0.00a

10 ppm 53.33 ± 30.55b 6.67 ± 11.55a 40.00 ± 20.00b 40.00 ± 20.00b

20 ppm 40.00 ± 00.00b 20.00 ± 20.00a 40.00 ± 20.00b 60.00 ± 20.00b

30 ppm 0.00 ± 0.00c 6.67 ± 11.55a 93.33 ± 11.55c 6.67 ± 11.55c

40 ppm 0.00 ± 0.00c 0.00 ± 0.00a 100.00 ± 0.00c 0.00 ± 0.00c

50 ppm 0.00 ± 0.00c 0.00 ± 0.00a 100.00 ± 0.00c 0.00 ± 0.00c

Rerata 32.22 ± 39.49 5.56 ± 11.49 62.22 ± 40.52 34.44 ± 39.29

Kontrol 96 jpf 100.00 ± 0.00a 0.00 ± 0.00a 0.00 ± 0.00a 100.00 ± 0.00a

10 ppm 40.00 ± 20.00b 20.00 ± 20.00a 40.00 ± 20.00b 60.00 ± 20.00b

20 ppm 3.33 ± 11.57b 20.00 ± 20.00a 46.67 ± 23.09b 60.00 ± 20.00b

30 ppm 0.00 ± 0.00c 6.67 ± 11.55a 93.33 ± 11.55c 6.67 ± 11.55c

40 ppm 0.00 ± 0.00c 0.00 ± 0.00a 100.00 ± 0.00c 0.00 ± 0.00c

50 ppm 0.00 ± 0.00c 0.00 ± 0.00a 100.00 ± 0.00c 0.00 ± 0.00c

Rerata 28.89 ± 37.71 7.78 ± 13.96 63.33 ± 40.15 37.78 ± 40.52

Keterangan: huruf tikatas yang berbeda pada kolom yang sama menyatakan perbedaan yang nyata

(p < 0.05).

11

Efek Teratogenik pada Embrio Ikan Zebra

Ikan zebra telah digunakan secara luas dalam bidang biologi, teratologi, dan

genetika molekular. Saat ini ikan zebra juga telah dipakai dalam bidang toksikologi

dan dikembangkan untuk studi penapisan obat baru. Ikan zebra sangat ideal untuk

studi proses perkembangan embrio karena embriogenesisnya sangat mirip dengan

vertebrata tingkat tinggi, termasuk manusia (Chakraborty et al. 2009; Brannen et

al. 2010). Ikan zebra memiliki beberapa karakteristik yang menyebabkan spesies

ini cocok sebagai model dalam bidang toksikologi, di antaranya 1) embrio memiliki

lapisan korion yang transparan sehingga sel, jaringan, dan organ dalam tubuh dapat

diamati dengan jelas; 2) betina dewasa dapat menghasilkan 200‒250 embrio dalam

sekali pemijahan; 3) proses embriogenesis cepat; 4) memiliki kesamaan gen dengan

manusia sampai 75%; 5) organ dalam memiliki kesamaan dengan mamalia pada

sistem kardiovaskular, syaraf, dan pencernaan; 6) embrio dapat bertahan di dalam

multiwell selama beberapa hari tanpa diberi tambahan asupan nutrisi; 7) tidak

membutuhkan biaya yang besar dalam pemeliharaannya; serta 8) dapat dijadikan

model untuk penyakit kanker, diabetes, epilepsi, dan inflamasi (Berghmans et al.

2005; Hill et al. 2005; Moore et al. 2006; Hsu et al. 2007; Chakraborty et al. 2009).

Hasil pengamatan, menunjukkan bahwa baik minyak atsiri maupun ekstrak

n-heksana memberikan efek teratogenik pada organ dan jaringan embrio ikan zebra

(Tabel 5). Malformasi mayor (≥ 50%) teridentifikasi pada kantung kuning telur,

jantung, dan sirkulasi darah, sedangkan malformasi minor (< 50%) teridentifikasi

pada sumbu tubuh, somit, sirip pektoral, mulut, dan gelembung renang. Tidak

teridentifikasi efek teratogenik pada otak, ekor, mata, rahang, otolit, dan pigmentasi

embrio. Hasil pengamatan embrio kontrol dan beberapa abnormalitas yang teramati

setelah perlakuan dapat dilihat pada Gambar 4.

Organ yang paling besar terkena efek teratogenik dari kedua perlakuan adalah

kantung kuning telur. Perlakuan minyak atsiri dan ekstrak n-heksana memberikan

efek teratogenik pada kantung kuning telur embrio masing-masing sebesar 76 dan

88%. Kantung kuning telur merupakan membran yang berfungsi menyediakan

nutrisi bagi embrio. Pembesaran kantung kuning telur merupakan salah satu

indikasi nutrisi tidak terserap sempurna oleh embrio. Hal tersebut akan

menyebabkan kekurangan nutrisi pada embrio dan dapat mengakibatkan kematian

embrio (Bie 2001).

Jantung merupakan organ yang pertama kali terbentuk pada ikan zebra dan

memiliki kemiripan dengan embriogenesis pada manusia. Perkembangan jantung

24 jpf pada ikan zebra sebanding dengan usia 3 minggu intrauterin pada manusia

(Denvir et al. 2008). Kelainan yang banyak ditemukan pada organ jantung embrio

ikan zebra ialah edema perikardial. Masuknya senyawa aktif dari minyak atsiri dan

ekstrak n-heksana ke dalam kantung perikardial kemungkinan mengiritasi sel

sehingga membengkak.

Edema merupakan kondisi meningkatnya jumlah cairan dalam jaringan akibat

peningkatan tekanan hidrostatik, sehingga memaksa cairan masuk ke dalam ruang

interstisial tubuh. Edema dapat menyebabkan pembengkakan pada jaringan yang

mengalami peradangan karena terjadi akumulasi cairan.

12

Tabel 5 Efek teratogenik pada embrio ikan zebra akibat paparan minyak atsiri dan

ekstrak n-heksana

Bagian/Organ Tubuh Minyak atsiri n-Heksana

∑a [%]b ∑ [%]

Sumbu tubuh 7 9.72 9 34.62

Otak 0 0 0 0

Ekor 0 0 0 0

Sirkulasi darah 43 59.72** 15 57.69**

Mata 0 0 0 0

Jantung 46 68.89** 20 76.92**

Rahang 0 0 0 0

Otolit 0 0 0 0

Pigmentasi 0 0 0 0

Somit 0 0 1 3.85

Kantung kuning telur 55 76.39** 23 88.46**

Sirip pektoral* 13 18.06 7 26.92

Mulut* 7 9.72 2 7.69

Gelembung renang* 11 15.28 5 19.23 aJumlah embrio yang terkena efek teratogenik dalam semua percobaan bJumlah embrio yang terkena efek teratogenik/jumlah embrio abnormal pada seluruh konsentrasi

dan waktu perlakuan

*Hanya pada 120 jam pascafertilisasi

**Malformasi mayor (≥ 50%)

Satu embrio dapat memiliki lebih dari satu malformasi.

Akumulasi perlakuan minyak atsiri dan ekstrak n-heksana akan mengganggu kerja

organel-organel sel, termasuk mitokondria sebagai lokasi respirasi aerob.

Pembentukan ATP akan diperlambat atau berhenti, sehingga terjadi kegagalan

selaput aktif pompa natrium, penimbunan natrium intrasel, dan difusi kalium ke

luar, yang bila terus berlanjut akan mematikan sel. Sel yang membengkak terus-

menerus akan mengalami lisis pada dinding sel sehingga seluruh organel sel keluar

atau disebut juga nekrosis (Kumar et al. 1997). Anggraeni et al. (2014) melaporkan,

pemaparan genistein (fitoestrogen) pada embrio ikan zebra menurunkan frekuensi

denyut jantung dan menyebabkan edema perikardial. Genistein yang merupakan

inhibitor tirosina kinase juga dapat memengaruhi aktivitas berbagai kanal ion baik

melalui proses fosforilasi maupun ikatan langsung (Kim et al. 2009). Menurut Chen

(2013), setiap senyawa memiliki proses tertentu yang dapat menyebabkan edema

perikardial pada embrio ikan zebra.

Perlakuan minyak atsiri dan ekstrak n-heksana pada embrio ikan zebra

menyebabkan sirkulasi darah berhenti selama proses embriogenesis. Hal tersebut

mengindikasikan bahwa minyak atsiri dan ekstrak n-heksana dapat menghambat

laju aliran darah pada sel kanker. Dengan demikian, asupan nutrisi bagi sel akan

berkurang, dan sel akan mati dalam waktu yang sangat singkat. Efek tersebut

diharapkan dapat membunuh sel kanker di dalam tubuh manusia.

13

Gambar 4 Morfologi embrio ikan zebra normal pada kontrol dan beberapa

abnormalitas pada perlakuan: kontrol 24 jpf (A), kontrol 48 jpf (B),

kontrol 72 jpf (C), kontrol 96 jpf (D), kontrol 120 jpf (E), perlakuan

24 jpf (MA, 100 ppm) (F), perlakuan 48 jpf (MA, 80 ppm) (G),

perlakuan 72 jpf (MA, 20 ppm) (H), perlakuan 96 jpf (nH, 20 ppm)

(I), perlakuan 120 jpf (nH, 30 ppm) (J). MA: minyak atsri, nH: ekstrak

n-heksana, ek: edema kantung kuning telur, kd: koagulasi darah, ep:

edema perikardial, st: sumbu tumbuh melengkung, jpf: jam

pascafertilisasi, bar = 300 µm.

Minyak atsiri maupun ekstrak n-heksana buah sirih hutan diduga bersifat anti-

angiogenesis berdasarkan hasil penelitian. Namun, diperlukan dilakukan penelitian

lebih lanjut untuk mengetahui kinerja spesifik anti-angiogenesis tersebut.

Serbedzija et al. (2000) melaporkan senyawa SU5416 (inhibitor angiogenesis)

sebesar 2 µM dapat menghambat vaskulogenesis dan angiogenesis pada embrio

ikan zebra.

Efek teratogenik pada embrio ikan zebra mungkin disebabkan oleh senyawa

dominan pada minyak atsiri dan ekstrak n-heksana buah sirih hutan yaitu dilapiol.

14

Namun, dimungkinkan pula adanya efek sinergis dilapiol dengan senyawa lain.

Dilapiol memiliki gugus metilenadioksifenil dalam strukturnya yang merupakan

ciri berbagai senyawa sinergis yang dapat menghambat aktivitas enzim sitokrom

P450 (Scott et al. 2008). Beberapa penelitian telah menjelaskan aktivitas biologis

senyawa dilapiol. Bernard et al. (1990) melaporkan bahwa dilapiol dapat

menghambat aktivitas enzim sitokrom P450 dalam sediaan mikrosom sel-sel

saluran pencernaan ulat Ostrinia nubialis, sehingga enzim pemetabolisme senyawa

asing tersebut tidak dapat menguraikan bahan aktif insektisida yang dicampurkan.

Dilapiol memberikan efek sitotoksik pada sel kanker payudara MDA-MB-231 yang

melibatkan induksi apoptosis melalui jalur mitokondria. Hal ini karena sifat

farmakokinetik yang baik dari dilapiol, terutama karena sifat hidrofobiknya,

sehingga dapat memfasilitasi difusi melalui membran sel tumor (Ferreira et al.

2014).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Hasil uji fitokimia ekstrak n-heksana buah sirih hutan menunjukkan

kandungan senyawa alkaloid, fenolik, flavonoid, saponin, tanin, dan steroid. Hasil

GC-MS menunjukkan dilapiol (1-alil-2,3-dimetoksi-4,5-(metilenadioksi)benzena)

sebagai senyawa yang dominan. Minyak atsiri maupun ekstrak n-heksana buah sirih

hutan bersifat toksik terhadap larva udang dan embrio ikan zebra, tetapi ekstrak n-

heksana lebih aktif. Malformasi mayor kantung kuning telur, jantung, dan sirkulasi

darah embrio ikan zebra, teramati pada kedua perlakuan dan diduga minyak atsiri

dan ekstrak n-heksana bersifat anti-angiogenesis.

Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk memfraksionasi ekstrak n-

heksana buah sirih hutan, menganalisis kinerja spesifik antikanker, dan

mengelusidasi struktur senyawa yang diisolasi.

DAFTAR PUSTAKA

[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2006. Official Method of

Analysis of The Association of Official Analytical of Chemist. Arlington (US):

AOAC Int.

Albuntana A, Yasman, Wardhana W. 2011. Uji toksisitas ekstrak empat jenis

teripang suku Holothuriidae dari Pulau Penjaliran Timur, Kepulauan Seribu,

Jakarta menggunakan BSLT. J Ilmu Teknol Kelautan Trop. 3:65-72.

15

Ali TES, Legler J. 2011. Developmental toxicity of nonylphenol in zebrafish

(Danio rerio) embryos. Indian J Mar Sci. 40(4):509-515.

Anggraeni D, Aurora H, Lyrawati D. 2014. Efek waktu paparan genistein terhadap

pembentukan jantung embrio zebrafish. J Kedokteran Brawijaya. 28(1):22-

25.

Arroyo J, Bonilla P, Exebio LM, Ronceros G, Tomas G, Huaman J, Raez E, Quino

M, Calzado JR. 2013. Gastroprotective and antisecretory effect of a

phytochemical made from matico leaves (Piper aduncum). Rev Peru Med Exp

Salud Publica. 30(4):608-615.

Berghmans S, Jette C, Langenau D, Hsu K, Stewart R, Look T, Kanki JP. 2005.

Making waves in cancer research: new model in the zebrafish. Biotechniques.

39(2):227-237.

Bernard CB, Arnason JT, Philogene BJR, Lam J, Waddell T. 1990. In vivo effect

of mixtures of allelochemicals on the life cycle of the European corn borer,

Ostrina nubialis. Entomol Exp Appl. 57:17-22.

Bernard CB, Krishnamurty HG, Chauret D, Durst T, Philogene BJR, Sanchez-

Vindas P, Hasbun C, Poveda L, San Roman L, Arnason JT. 1995. Insecticidal

defenses of Piperaceae from the neotropics. J Chem Ecol. 21(6):801-814.

Bie GVD. 2001. Embryology: Early Development from a Phenomenological Point

of View. Driebergen (NL): Louis Bolk Institute.

Braga FG, Bouzada MLM, Fabri RL, Matos M, Moreira FO, Scio E, Coimbra ES.

2007. Antileishmanial and antifungal activity of plants used in traditional

medicine in Brazil. J Ethnopharmacol. 111:396-402.

Brannen KC, Panzica–Kelly JM, Danberry TL, Augustine-Rauch KA. 2010.

Development of a zebrafish embryo teratogenecity assay and quantitative

prediction model. Birth Defects Res Part B: Dev Reprod Toxicol. 89:66-77.

Carballo JL, Hernandez-Inda ZL, Perez P, Garcia-Gravalos MD. 2002. A

comparison between two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in

marine natural products. BMC Biotechnol. 2(17):1-5.

Chakraborty C, Hsu CH, Wen ZH, Lin CS, Agoramoorthy G. 2009. Zebrafish: a

complete animal model for in vivo drug discovery and development. Curr

Drug Metabolism. 10(2):116-124.

Chen J. 2013. Impaired cardiovascular function caused by different stressors elicits

a common pathological and transcriptional responses in zebrafish embryos.

Zebrafish. 10(3):389-400.

Colegate SM, Molyneux RJ. 2008. Bioactive Natural Products: Detection,

Isolation, and Structural Determination. California (US): CRC Pr.

Denvir MA, Tucker CS, Mullias JJ. 2008. Systolic and diastolic ventricular function

in zebrafish embryos: influence of norepinephrine, MS-222, and temperature.

Biomed Central. 21:1-8.

[Depkes RI] Departemen Kesehatan RI. 1992. Pedoman Fitofarmaka. Jakarta (ID):

Departemen Kesehatan RI.

Diaz LE, Munoz DR, Prieto RE, Cuervo SA, Gonzalez DL, Guzman JD, Bhakta S.

2012. Antioxidant, antitubercular and cytotoxic activities of Piper imperiale.

Molecules. 17(4):4142-4147.

Estevez Y, Castillo D, Pisango MT, Arevalo J, Rojas R, Alban J, Deharo E, Bourdy

G, Sauvain M. 2007. Evaluation of the leishmanicidal activity of plants used

by Peruvian Chayahuita ethnic group. J Ethnopharmacol. 114:254-259.

16

Ferreira AK, de-Sa-Junior PL, Pasqualoto KF, de Azevedo RA, Camara DA, Costa

AS, Fiqueiredo CR, Matsuo AL, Massaoka MH, Auada AV et al. 2014.

Cytotoxic effects of dillapiole on MDA-MB-231 cells involve the induction

of apoptosis through the mitochondrial pathway by inducing an oxidative

stress while altering the cystoskeleton network. Biochimie. 99:195-207.

Frank CL. 1995. Toksikologi Dasar. Edi, penerjemah. Jakarta (ID): UI Pr.

Terjemahan dari: Basic of Toxicology.

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah;

Sofia M, editor. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung. Terjemahan dari:

Phytochemical Methods.

Hasyim DM. 2011. Potensi buah sirih hutan (Piper aduncum) sebagai insektisida

botani terhadap larva Crocidolomia pavonana [tesis]. Bogor (ID): Institut

Pertanian Bogor.

Hill AJ, Teraoka H, Heideman W, and Peterson RE. 2005. Zebrafish as a model

vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol Sci. 86:6-19.

Hsu CH, Wen ZH, Lin CS, Chakraborty C. 2007. The zebrafish model: use in

studying cellular mechanism for a spectrum of clinical disease entities. Curr

Neurovascular Res. 4:111-120.

Jamal Y, Agusta A, Praptiwi. 2003. Komposisi kimia dan efek antibakteri minyak

atsiri buah gedebong (Piper aduncum L.). Maj Farm Indones. 14:284-289.

Kari G, Rodeck U, Dicker AP. 2007. Zebrafish: an emerging model system for

human disease and drug discovery. Clin Pharmacol Therapeutics. 82:70-80.

Kaufman PB, Kirakosyan A, McKenzie M, Dayanandan P, Hoyt JE, Li C. 2006.

The uses of plant natural products by humans and risks associated with their

use. Di dalam: Cseke LJ, Kirakosyan A, Kaufman PB, Warber SL, Duke JA,

Brielman HL, editor. Natural Products from Plants. Boca Raton (US): CRC

Pr. hlm 441-473.

Kim DJ, Seok SH, Baek MW, Lee HY, Na YR, Park SH, Lee HK, Dutta NK,

Kawakami K, Park JH. 2009. Developmental toxicity and brain aromatase

induction by high genistein concentrations in zebrafish embryos. Toxicol

Mechanisms and Methods. 19(3):251-256.

Kumar V, Cotran RS, Robbins SL. 1997. Basic Pathology. 6th Edition. Philadelphia

(US): WB Saunders.

Ma C, Pang C, Seng WL, Zhang C, Willet C, Mc Grath P. 2007. Zebrafish, an in

vivo model for drug screening. Drug Discovery. 6:38-45.

Maia JGS, Zohhbi MGB, Andrade EHA, Santos AS, da Silva MHL, Luz AIR,

Bastos CN. 1998. Constituents of the essential oil of Piper aduncum L.

growing wild in the Amazon region. Flavour Fragr J. 13:269-272.

Meinelt T, Schulz C, Wirth M, Kurzinger H, Steinberg T. 1999. Dietary fatty acid

composition influences the fertilization of zebrafish (Danio rerio). J Appl

Ichthyol. 15:19-23.

Meyer BN, Ferrigni NR, Putman JE, Jacobson LB, Nichol DE, McLaughlin JL.

1982. Brine shrimps: a convenient general bioassay for active plant

constituent. Planta Med. 45:31-34.

Moore JL, Rush LM, Breneman C, Mohideen MAPK, Cheng KCL. 2006. Zebrafish

genomic instability mutants and cancer susceptibility. Genetics. 10:1-33.

Nicoli S, Presta M. 2007. The zebrafish/tumor xenografit angiogenesis assay.

Nature Protocols. 2:2918-2923.

17

[OECD] The Organization for Economic Co-operation and Development. 2013.

OECD Guidelines for The Testing of Chemicals No. 236. Fish Embryo Acute

Toxicity (FET) Test. Paris (FR): OECD.

Orjala J, Erdelmeier CAJ, Wright AD, Rali T, Sitcher O. 1993. Five new prenylated

hydroxybenzoic acid derivatives with antimicrobial and moluscicidal activity

from Piper aduncum leaves. Planta Med. 59(6):546-551.

Parmar VS, Jain SC, Bisht KS, Jain R, Taneja P, Jha A, Tyagi OD, Prasad AK,

Wengel J, Olsen CE et al. 1997. Phytochemistry of the genus Piper.

Phytochemistry. 46:597-673.

Pohlit AM, Pinto ACS, Mause R. 2006. Piper aduncum L: pluripotente plant and

important phytochemical substance source. Revista Fitos. 2:7-18.

Rali T, Wossa SW, Leach DN, Waterman PG. 2007. Volatile chemical constituents

of Piper aduncum L. and Piper gibbilimbum C. DC (Piperaceae) from Papua

New Guinea. Molecules. 12:389-394.

Scott IM, Jensen HR, Philogene BJR, Arnason JT. 2008. A review of Piper spp.

(Piperaceae): phytochemistry, insecticidal activity, and mode of action.

Phytochem Rev. 7:65-75.

Serbedzija GN, Flynn E, Willett CE. 2000. Zebrafish angiogenesis: a new model

for drug screening. Angiogenesis. 3:353-359.

Sudrajat. 2010. Bioprospeksi tumbuhan sirih hutan (Piper aduncum L.) sebagai

sumber bahan baku obat larvasida nyamuk Aedes aegypti. Bioprospek.

7(2):35-40.

Sudrajat, Susanto D, Mintargo D. 2011. Bioekologi dan potensi senyawa bioaktif

sirih hutan (Piper aduncum L.) sebagai sumber bahan baku larvasida nyamuk

Aedes aegypti. Mulawarman Scientifie. 10:63-74.

Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta (ID): Gramedia.

18

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Sampel

Segar Kering

Minyak Atsiri Ekstrak

Kasar

GC-MS BSLT & ZFET Uji Fitokimia

Uji

Toksisitas Identifikasi

Distilasi Maserasi

GC-MS

Identifikasi

19

Lampiran 2 Hasil determinasi tanaman sirih hutan

20

Lampiran 3 Kadar air serbuk dan rendemen buah sirih hutan

Ulangan

Bobot

cawan

kosong (g)

Bobot

awal

sampel (g)

Bobot cawan

+ sampel

akhir (g)

Bobot

akhir

sampel (g)

Kadar air (%)

1 33.2429 3.0030 36.0732 2.8303 5.75

2 32.5941 3.0073 35.4294 2.8353 5.72

3 35.3813 3.0020 38.2101 2.8288 5.77

Rerata 5.75

Contoh perhitungan:

Ulangan 1

Bobot akhir sampel = bobot (cawan + sampel) – bobot cawan kosong

= (36.0732 – 33.2429) g = 2.8303 g

Kadar air (%) = bobot awal sampel – bobot akhir sampel

bobot awal sampel × 100%

= 3.0030 g− 2.8303 g

3.0030 g × 100%

= 5.81%

Rerata = (5.75+5.72+5.77)%

3= 5.75%

Rendemen (%) = bobot ekstrak (g)

bobot contoh awal (g) × (1‒kadar air) × 100%

= 47.84

500.25 × (1 - 0.0575) × 100%

= 10.15%

21

Lampiran 4 Hasil GC-MS minyak atsiri dan ekstrak n-heksana

No Senyawa

Minyak atsiri Ekstrak n-heksana

Waktu

retensi

(menit)

Area

(%) Kemiripan

Waktu

retensi

(menit)

Area

(%) Kemiripan

1 α-Tujena 3.276 0.06 91 - - -

2 α-Pinena 3.473 0.31 96 - - -

3 Kamfena 3.798 0.02 95 - - -

4 2-β-Pinena 4.388 0.38 95 - - -

5 Felandrena 4.977 0.26 97 - - -

6 Limonena 5.610 0.23 98 - - -

7 Sabinena 5.670 0.24 94 - - -

8 β-Osimena 5.926 0.16 97 - - -

9 (+)-2-Karena 6.063 0.04 97 - - -

10 γ-Terpinena 6.328 0.54 96 7.519 0.04 96

11 (+)-4-Karena 6.790 0.28 98 - - -

12 α-Terpinena - - - 6.835 0.07 98

13 Simena 7.003 0.34 94 - - -

14 β-Felandrena 7.046 0.36 94 - - -

15 α-Terpinolena 8.004 0.17 98 8.109 0.03 93

16 Kamfor 8.320 0.01 94 - - -

17 4-Terpineol 9.446 0.47 98 9.447 0.29 97

18 Piperiton 10.166 0.83 96 - - -

19 α-Kubebena 11.449 0.03 98 - - -

20 α-Kopaena 11.996 0.44 99 11.999 0.41 99

21 Kariofilena 12.364 0.65 99 12.512 0.91 99

22 β-Kopaena - - - 12.580 0.08 98

23 α-Humulena 12.731 0.32 98 12.845 0.41 99

24 α-Amorfena 12.902 0.17 99 - - -

25 Pentadekana - - - 12.992 2.05 97

26 Germakrena-D 13.090 0.54 99 13.093 0.24 99

27 β-Selinena - - - 13.170 0.09 99

28 (‒)-Isoledena 13.210 0.22 95 - - -

29 Naftalena - - - 13.281 0.03 99

30 1,3-Benzodioksol 13.295 3.33 98 13.375 2.71 98

31 Elemisin 13.552 0.18 97 13.538 0.26 99

32 Nerolidol 13.646 0.06 91 - - -

33 Kariofilena oksida 14.073 0.10 93 14.059 0.25 93

34 Dilapiol 14.371 84.13 95 14.445 83.59 95

35 Apiol 14.680 0.40 97 14.717 0.65 98

36 Heptadesil

trifloroasetat

- - - 15.35 0.03 91

37 Neopitadiena - - - 15.7 0.14 99

22

lanjutan Lampiran 4

No Senyawa

Minyak atsiri Ekstrak n-heksana

Waktu

retensi

(menit)

Area

(%) Kemiripan

Waktu

retensi

(menit)

Area

(%) Kemiripan

38 Asam

heksadekanoat

- - - 16.547 0.1 96

39 Dokosena - - - 16.718 0.03 98

40 Eikosana - - - 17.384 0.08 92

41 (Z,Z)-9,12-Asam

oktadekadienoat

- - - 17.735 0.27 96

42 Nonadekana - - - 17.957 0.29 95

43 Triakontana - - - 27.805 0.08 95

44 α-Tokoferol - - - 29.301 0.09 96

45 β-Sitosterol - - - 35.362 0.29 96

Keterangan: (-) tidak terdeteksi

23

Lampiran 5 Spektrum MS senyawa dilapiol

Analisis fragmentasi senyawa dilapiol

m/z Struktur senyawa Fragmen yang hilang

222

-

207

195

177

24

lanjutan lampiran 5

m/z Struktur senyawa Fragmen yang hilang

149

121

77

25

Lampiran 6 Hasil uji BSLT dan analisis probit

Minyak Atsiri Konsentrasi

(ppm)

Jumlah larva

awal (ekor)

Jumlah larva

mati (ekor)

0

10 0

10 0

10 0

10 0

50

10 6

10 5

10 4

10 5

250

10 9

10 9

10 8

10 10

500

10 10

10 10

10 10

10 10

750

10 10

10 10

10 10

10 10

1000

10 10

10 10

10 10

10 10

n-Heksana Konsentrasi

(ppm)

Jumlah larva

awal (ekor)

Jumlah larva

mati (ekor)

0

10 0

10 0

10 0

10 0

10

10 2

10 3

10 3

10 2

25

10 6

10 8

10 5

10 7

50

10 9

10 10

10 9

10 10

75

10 10

10 10

10 10

10 10

100

10 10

10 10

10 10

10 10

Probit Analysis: Kematian, n versus Konsentrasi Minyak Atsiri Distribution: Normal

Response Information

Variable Value Count

Kematian Event 176

Non-event 24

n Total 200

Estimation Method: Maximum Likelihood

Regression Table

Standard

Variable Coef Error Z P

Constant -0.340524 0.247090 -1.38 0.168

Konsentrasi 0.0066184 0.0015175 4.36 0.000

Natural

26

lanjutan Lampiran 6

Response 0

Log-Likelihood = -40.798

Goodness-of-Fit Tests

Method Chi-Square DF P

Pearson 0.076946 3 0.994

Deviance 0.136591 3 0.987

Tolerance Distribution

Parameter Estimates

Standard 95.0% Normal CI

Parameter Estimate Error Lower Upper

Mean 51.4513 29.3190 -6.01287 108.915

StDev 151.095 34.6433 96.4014 236.818

Table of Percentiles

Standard 95.0% Fiducial CI

Percent Percentile Error Lower Upper

1 -300.047 100.268 -652.287 -162.659

2 -258.859 91.1283 -578.085 -133.639

3 -232.726 85.3640 -531.075 -115.158

4 -213.068 81.0494 -495.755 -101.212

5 -197.077 77.5561 -467.058 -89.8356

6 -183.466 74.5958 -442.658 -80.1258

7 -171.533 72.0113 -421.287 -71.5897

8 -160.847 69.7070 -402.171 -63.9267

9 -151.129 67.6203 -384.805 -56.9394

10 -142.184 65.7076 -368.835 -50.4908

20 -75.7131 51.8277 -250.855 -1.88888

30 -27.7828 42.4031 -167.007 34.3819

40 13.1719 35.0793 -96.9497 66.9608

50 51.4513 29.3190 -33.9556 99.8985

60 89.7306 25.3518 24.6252 137.249

70 130.685 24.1093 79.3370 185.174

80 178.616 27.0795 131.344 253.285

90 245.087 36.6595 189.580 361.632

91 254.032 38.2303 196.760 376.870

92 263.750 39.9861 204.449 393.535

93 274.435 41.9685 212.791 411.972

94 286.369 44.2380 221.987 432.683

95 299.980 46.8871 232.343 456.436

96 315.970 50.0690 244.364 484.490

97 335.629 54.0649 258.964 519.156

98 361.761 59.4901 278.137 565.474

99 402.950 68.2335 307.958 638.874

Probit Analysis: Jumlah larva mati, n versus Konsentrasi n-Heksana Distribution: Normal

Response Information

Variable Value Count

Jumlah larva mati Event 154

Non-event 46

27

lanjutan Lampiran 6

n Total 200

Estimation Method: Maximum Likelihood

Regression Table

Standard

Variable Coef Error Z P

Constant -1.20055 0.262588 -4.57 0.000

Konsentrasi 0.0594067 0.0098762 6.02 0.000

Natural

Response 0

Log-Likelihood = -56.595

Goodness-of-Fit Tests

Method Chi-Square DF P

Pearson 0.510499 3 0.917

Deviance 0.525843 3 0.913

Tolerance Distribution

Parameter Estimates

Standard 95.0% Normal CI

Parameter Estimate Error Lower Upper

Mean 20.2090 2.31672 15.6683 24.7497

StDev 16.8331 2.79844 12.1522 23.3170

Table of Percentiles

Standard 95.0% Fiducial CI

Percent Percentile Error Lower Upper

1 -18.9507 7.30319 -39.8401 -7.97730

2 -14.3620 6.58265 -33.1172 -4.43267

3 -11.4506 6.13079 -28.8624 -2.17311

4 -9.26050 5.79431 -25.6685 -0.466471

5 -7.47901 5.52319 -23.0757 0.926938

6 -5.96268 5.29453 -20.8731 2.11721

7 -4.63316 5.09587 -18.9456 3.16451

8 -3.44273 4.91961 -17.2229 4.10553

9 -2.36008 4.76078 -15.6592 4.96434

10 -1.36350 4.61596 -14.2227 5.75767

20 6.04189 3.59662 -3.66447 11.7695

30 11.3817 2.96314 3.73600 16.3172

40 15.9444 2.54525 9.79237 20.4701

50 20.2090 2.31672 15.0898 24.7150

60 24.4736 2.29376 19.9142 29.4330

70 29.0363 2.50225 24.5380 35.0184

80 34.3761 2.98210 29.4188 42.0858

90 41.7815 3.89245 35.6585 52.4161

91 42.7781 4.02800 36.4708 53.8336

92 43.8607 4.17771 37.3483 55.3787

93 45.0511 4.34499 38.3076 57.0830

94 46.3807 4.53473 39.3731 58.9924

95 47.8970 4.75442 40.5815 61.1769

96 49.6785 5.01643 41.9933 63.7512

97 51.8686 5.34343 43.7191 66.9260

98 54.7800 5.78499 45.9993 71.1602

99 59.3687 6.49323 49.5685 77.8584

28

Lampiran 7 Hasil uji ZFET dan analisis probit

Minyak atsiri

Konsentrasi

(ppm) Ulangan

48 jpf 96 jpf

Jumlah

embrio

awal

Jumlah

embrio

mati

Jumlah

embrio

awal

Jumlah

embrio

mati

0

1 5 0 5 0

2 5 0 5 0

3 5 0 5 0

20

1 5 0 5 0

2 5 0 5 0

3 5 0 5 2

40

1 5 0 5 0

2 5 0 5 1

3 5 0 5 0

60

1 5 0 5 0

2 5 2 5 2

3 5 0 5 0

80

1 5 1 5 1

2 5 1 5 1

3 5 1 5 1

100

1 5 3 5 3

2 5 1 5 1

3 5 0 5 0

n-Heksana

Konsentrasi

(ppm) Ulangan

48 jpf 96 jpf

Jumlah

embrio

awal

Jumlah

embrio

mati

Jumlah

embrio

awal

Jumlah

embrio

mati

0

1 5 0 5 0

2 5 0 5 0

3 5 0 5 0

10

1 5 3 5 3

2 5 2 5 2

3 5 1 5 1

20

1 5 2 5 3

2 5 1 5 1

3 5 3 5 3

30

1 5 5 5 5

2 5 4 5 4

3 5 5 5 5

40

1 5 5 5 5

2 5 5 5 5

3 5 5 5 5

50

1 5 5 5 5

2 5 5 5 5

3 5 5 5 5

29

lanjutan Lampiran 7

Contoh analisis probit ekstrak n-heksana pada 96 jpf Probit Analysis: Kematian, n versus Konsentrasi, Pengamatan Distribution: Normal

Response Information

Variable Value Count

Kematian Event 290

Non-event 110

n Total 400

Factor Information

Factor Levels Values

Pengamatan 5 24, 48, 72, 96, 120

Estimation Method: Maximum Likelihood

Regression Table

Standard

Variable Coef Error Z P

Constant -1.83741 0.262103 -7.01 0.000

Konsentrasi 0.0814677 0.0081413 10.01 0.000

Pengamatan

48 0.468218 0.255731 1.83 0.067

72 0.525501 0.257259 2.04 0.041

96 0.525501 0.257259 2.04 0.041

Natural

Response 0

Test for equal slopes: Chi-Square = 3.74112 DF = 4 P-Value = 0.442

Log-Likelihood = -150.861

Multiple degree of freedom test

Term Chi-Square DF P

Pengamatan 6.72127 4 0.151

Goodness-of-Fit Tests

Method Chi-Square DF P

Pearson 25.1561 19 0.155

Deviance 25.8840 19 0.133

Pengamatan = 96

Tolerance Distribution

Parameter Estimates

Standard 95.0% Normal CI

Parameter Estimate Error Lower Upper

Mean 16.1034 2.36414 11.4698 20.7370

StDev 12.2748 1.22666 10.0914 14.9306

30

lanjutan Lampiran 7

Table of Percentiles

Standard 95.0% Fiducial CI

Percent Percentile Error Lower Upper

1 -12.4521 4.02959 -21.9269 -5.60607

2 -9.10596 3.76131 -17.8967 -2.67706

3 -6.98297 3.59684 -15.3512 -0.807188

4 -5.38593 3.47652 -13.4432 0.606286

5 -4.08686 3.38105 -11.8960 1.76086

6 -2.98114 3.30163 -10.5828 2.74731

7 -2.01165 3.23351 -9.43437 3.61526

8 -1.14358 3.17378 -8.40868 4.39497

9 -0.354107 3.12056 -7.47809 5.10631

10 0.372604 3.07254 -6.62345 5.76308

20 5.77266 2.74978 -0.341923 10.7125

30 9.66648 2.56275 4.09417 14.3747

40 12.9936 2.44102 7.80634 17.5823

50 16.1034 2.36414 11.1998 20.6566

60 19.2132 2.32657 14.5117 23.8123

70 22.5403 2.33200 17.9602 27.2835

80 26.4341 2.39763 21.8731 31.4690

90 31.8342 2.58464 27.1009 37.4721

91 32.5609 2.61729 27.7890 38.2954

92 33.3504 2.65456 28.5328 39.1935

93 34.2184 2.69761 29.3465 40.1852

94 35.1879 2.74812 30.2502 41.2978

95 36.2936 2.80871 31.2749 42.5728

96 37.5927 2.88368 32.4710 44.0785

97 39.1898 2.98102 33.9309 45.9401

98 41.3127 3.11836 35.8555 48.4309

99 44.6588 3.35070 38.8568 52.3888

31

Lampiran 8 Analisis Anova dan uji lanjut Duncan

Contoh analisis pada perlakuan n-heksana 96 jpf

Descriptives

N Mean Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence Interval

for Mean Min Max

Lower

Bound

Upper

Bound

Mati

kontrol 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

10 ppm 3 40.00 20.00 11.55 -9.68 89.68 20 60

20 ppm 3 46.67 23.09 13.33 -10.70 104.04 20 60

30 ppm 3 93.33 11.55 6.67 64.65 122.02 80 100

40 ppm 3 100.00 .00 .00 100.00 100.00 100 100

50 ppm 3 100.00 .00 .00 100.00 100.00 100 100

Total 18 63.33 40.15 9.46 43.37 83.30 0 100

Hidup_Normal

kontrol 3 100.00 .00 .00 100.00 100.00 100 100

10 ppm 3 40.00 20.00 11.55 -9.68 89.68 20 60

20 ppm 3 33.33 11.55 6.67 4.65 62.02 20 40

30 ppm 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

40 ppm 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

50 ppm 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

Total 18 28.89 37.71 8.89 10.13 47.64 0 100

Hidup_Abnormal

kontrol 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

10 ppm 3 20.00 20.00 11.55 -29.68 69.68 0 40

20 ppm 3 20.00 20.00 11.55 -29.68 69.68 0 40

30 ppm 3 6.67 11.55 6.67 -22.02 35.35 0 20

40 ppm 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

50 ppm 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

Total 18 7.78 13.96 3.29 .84 14.72 0 40

Menetas

kontrol 3 100.00 .00 .00 100.00 100.00 100 100

10 ppm 3 60.00 20.00 11.55 10.32 109.68 40 80

20 ppm 3 60.00 20.00 11.55 10.32 109.68 40 80

30 ppm 3 6.67 11.55

6.67 -22.02 35.35 0 20

40 ppm 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

50 ppm 3 .00 .00 .00 .00 .00 0 0

Total 18 37.78 40.52 9.55 17.63 57.93 0 100

32

lanjutan Lampiran 8

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Mati

Between Groups 25266.667 5 5053.333 28.425 .000

Within Groups 2133.333 12 177.778

Total 27400.000 17

Hidup_Normal

Between Groups 23111.111 5 4622.222 52.000 .000

Within Groups 1066.667 12 88.889

Total 24177.778 17

Hidup_Abnormal

Between Groups 1444.444 5 288.889 1.857 .176

Within Groups 1866.667 12 155.556

Total 3311.111 17

Menetas

Between Groups 26044.444 5 5208.889 33.486 .000

Within Groups 1866.667 12 155.556

Total 27911.111 17

Mati

Duncan

Perlakuan N Subset for alpha = 0.05

1 2 3

kontrol 3 .00 10 ppm 3 40.00 20 ppm 3 46.67 30 ppm 3 93.33

40 ppm 3 100.00

50 ppm 3 100.00

Sig. 1.000 .552 .571

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

Hidup_Normal

Duncan

Perlakuan N Subset for alpha = 0.05

1 2 3

30 ppm 3 .00 40 ppm 3 .00 50 ppm 3 .00 20 ppm 3 33.33 10 ppm 3 40.00 kontrol 3 100.00

Sig. 1.000 .403 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

33

lanjutan Lampiran 8

Menetas

Duncan

Perlakuan N Subset for alpha = 0.05

1 2 3

40 ppm 3 .00

50 ppm 3 .00

30 ppm 3 6.67

10 ppm 3 60.00

20 ppm 3 60.00

kontrol 3 100.00

Sig. .545 1.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.

34

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor, 6 Januari 1992 dari pasangan Sawung Hermanto

dan Yani Suhartati. Penulis merupakan anak pertama dari 3 bersaudara. Tahun

2009, penulis lulus dari SMA Negeri 3 Bogor dan pada tahun yang sama diterima

di Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut

Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Ujian Talenta Masuk IPB (UTMI).

Selama menempuh pendidikan, penulis aktif dalam beberapa kegiatan

kemahasiswaan. Selama periode 2009‒2011, penulis aktif sebagai ketua divisi

perkusi ADC (Art Dormitory Club) dan anggota UKM MAX (Music Agriculture

Expression) IPB divisi musik. Tahun 2010‒2013 penulis aktif sebagai anggota

perkusi Kimia IPB (Cawan Petry) dan VARARA (komunitas perkusi IPB). Pada

tahun 2010, penulis berhasil mendapatkan Juara 1 IPB Art Contest (IAC) dalam

kompetisi cipta lagu kategori band. Penulis juga aktif di kegiatan organisasi sebagai

staf Departemen Pengembangan Kimia dan Seni (PKS) Imasika IPB periode

2010/2011. Penulis dipercaya sebagai ketua acara Hyperchem (program Imasika)

pada tahun 2011. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan

kegiatan praktik lapangan di PT Pradja Pharin (Prafa), Citeureup pada bulan Juli-

Agustus 2012 dengan judul Validasi Metode Analisis Kadar Asetaminofen dan

Guaifenesin dalam Tablet Stop Cold® dengan HPLC.