Tentir Praktikum Biomol

download Tentir Praktikum Biomol

of 23

Transcript of Tentir Praktikum Biomol

  • 1

    Tentir Praktikum Biomol

    Bacalah dengan (menyebut) nama Tuhan-mu yang menciptakan. Dia telah menciptakan

    manusia dari segumpal darah. Bacalah, dan Tuhanmulah Yang Maha Mulia. Yang mnegajarkan

    (manusia) dengan pena. Dia mengajarkan manusia apa yang tidak diketahuinya. (QS. Al Alaq:

    1-5)

    Tentir ini bertujuan untuk mempermudah kalian belajar, semuanya diambil dari penuntun

    praktikum dan beberapa dari sumber lain.

    ISI: Halaman

    1. Identifikasi Karbohidrat, Protein, Lemak ...............................................................2

    2. Isolasi dan pemisahan protein.................................................................................10

    3. Pengaruh suhu dan pH terhadap enzim .................................................................12

    4. Isolasi DNA ................................................................................................................15

    5. PCR .............................................................................................................................18

    6. STR .............................................................................................................................21

    Selamat belajar..

  • 2

    Identifikasi Karbohidrat, Protein, Lemak

    1. Karbohidrat

    Uji karbohidrat yang dilakukan pada praktikum kali ini adalah uji Benedict, uji Molisch, uji

    Selliwanoff dna uji Iodium.

    a. Uji Benedict

    Uji ini bertujuan untuk mengetahui sifat reduksi karbohidrat. Prinsipnya adalah larutan

    tembaga yang beraski basa akan direduki oleh gula yang mempunyai gugus aldehida atau

    keton bebas dan akan terbentuk endapan kupro-oksida yang berwarna merah. Larutan

    Benedict mengandung kupri sulfat, natrium karbonat dan natrium sitrat.

    Uji benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat) pereduksi.

    Gula pereduksi meliputi semua jenis monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa

    dan maltosa.

    Sukrosa (gula pasir) tidak terdeteksi oleh pereaksi Benedict. Sukrosa mengandung dua

    monosakrida (fruktosa dan glukosa) yang terikat melalui ikatan glikosidic sedemikian rupa

    sehingga tidak mengandung gugus aldehid bebas dan alpha hidroksi keton. Sukrosa juga

    tidak bersifat pereduksi.

    Cara Kerja:

    Masukkan 1 ml larutan Benedict ke dalam tabung reaksi tambahkan 1,5 mL larutan

    yang akan diperiksa masukkan ke dalam penangas air mendidih selama 3 menit, dinginkan

    perlahan periksa warna endapan.

    Hasil positif: endapan berwarna hijau, kuning atau merah.

  • 3

    b. Uji Molisch

    Uji Molisch merupakan tes umum karbohidrat. Prinsipnya adalah karbohidrat dengan

    asam sulfat pekat menghasilkan suatu senyawa furfural. Senyawa tersebut dengan pereaksi

    alfa naftol menghasilkan senyawa yang berwarna ungu. Hasil negatif merupakan suatu bukti

    bahwa tidak ada karbohidrat.

    Dasar uji ini adalah heksosa atau pentosa mengalami dehidrasi oleh asam sulfat pekat

    menjadi hidroksimetilfurfural atau furfural dan kondensasi aldehida yang terbentuk ini

    dengan -naftol membentuk senyawa yang berwarna khusus untuk polisakarida dan

    disakarida.

    Cara kerja:

    2 mL larutan karbohidrat yang akan diperiksa dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

    diberikan 3 tetes pereaksi Molisch kocok pegang tabung dalam keadaan miring, alirkan

    dengan hati-hati 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung pereaksi.

    Hasil positif: adanya cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan cairan.

  • 4

    c. Uji Selliwanoff

    Uji Selliwanoff merupakan uji yang digunakan untuk membedakan karbohidrat yang

    mempunyai gugus keton dan aldehida. Prinsipnya adalah karbohidrat atau turunannnya (4-

    hidroksi metil furfural) dengan resorsinol menghasilkan senyawa yang berwarna merah.

    Uji Selliwanoff dipakai untuk menunjukkan adanya ketoheksosa, misalnya fruktosa.

    Pereaksi Selliwanoff adalah resorsinol dalam asam klorida encer. Dua tahap reaksi terjadi

    dalam pendidihan ini, yaitu dehidrasi fruktosa oleh HCL yang ada dalam pereaksi Selliwanoff

    membentuk hidroksimetilfurfural dan kondensasi hidroksimetilfurfural yang terbentuk

    dengan resorsinol membentuk senyawa berwarna merah.

    Sukrosa memberikan hasil positif pada uji ini karena sukrosa mengalami hidrolisis

    menjadi glukosa dan fruktosa. Fruktosa memberikan warna merah.

    Cara kerja:

    Masukkan 2 mL larutan karbohidrat yang akan diperiksa ke dalam tabung reaksi

    tambahkan 2 mL pereaksi Selliwanoff campurkan dan panaskan dalam penangas air

    mendidih selama 60 detik.

    Hasil positif: larutan berwarna merah

  • 5

    d. Uji iodium

    Uji Iodium bertujuan untuk mengidentifikasi polisakarida. Reagent yang digunakan

    adalah larutan iodine yang merupakan I2 terlarut dalam potassium iodide. Reaksi antara

    polisakarida dengan iodin membentuk rantai poliiodida. Polisakarida umumnya membentuk

    rantai heliks (melingkar), sehingga dapat berikatan dengan iodin, sedangkan karbohidrat

    berantai pendek seperti disakarida dan monosakaraida tidak membentuk struktur heliks

    sehingga tidak dapat berikatan dengan iodin. Amilum dengan iodine dapat membentuk

    kompleks biru, amilopektin dengan iodin akan memberi warna merah ungu sedangkan

    dengan glikogen dan dekstrin akan membentuk warna merah coklat.

    2. Protein

    a. Uji Biuret

    Uji Biuret adalah uji untuk mengidentifikasi adanya protein (merupakan tes umum

    tehadap protein). Uji Biuret adalah uji umum untuk protein (ikatan peptida), tetapi tidak

    dapat menunjukkan asam amino bebas. Prinsipnya adalah protein dengan tembaga

    hidroksida membentuk kompleks berwarna ungu.

    Cara kerja:

    2 mL larutan albumin dicampur dengan 2 ml NaOh tambahkan 5 tetes larutan CuSO4

    kocok.

    Hasil positif: terbentuk kompleks berwarna ungu

  • 6

    b. Uji Millon

    Uji Millon merupakan uji untuk menentukan gugus mono hidroksi benzen dalam sampel.

    Prinsipnya adalah reaksi ini bergantung adanya derivat mono hidroksi benzen seperti tirosin

    dan fenol. Reaksi ini akan terganggu jika ada ion klorida atau amonium.

    Pereaksi Millon terdiri atasa larutan merkuro nitrat dan merkuri nitrat dalam asam nitrat.

    Protein dengan pereaksi Millon akan membentuk endapan putih. Jika dipanaskan, warnanya

    berubah menjadi merah.

    Cara kerja:

    Dalam tabung reaksi, campurkan 2 mL albumin dnegan 3 tetes reagen Millon

    panaskan 5 menit.

    Hasil positif: adanya endapan merah

    c. Uji Xantoproteat

    Uji Xantoproteat adalah uji untuk mengidentifikasi adanya asam amino yang

    mengandung cincin benzena, seperti fenilalanin, tirosin, dan triptofan.

    Pada uji Xantoproteat ini, larutan asam nitrat pekat (HNO3) ditambahkan dengan hati-

    hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah

    menjadi kuning apabila dipanaskan kemudian menjadi warna jingga bila dibuat alkalis (basa)

    dengan larutan NaOH. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi atau reaksi substitusi atom H pada

    benzena yang terdapat pada molekul protein oleh gugus nitro. Inti benzena dapat ternitrasi

    oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena.

  • 7

    Cara Kerja:

    Masukkan 2 mL larutan yang akan diperiksa tambahkan asam HNO3 pekat sebanyak 1

    mL perhatikan adanya endapan putih yang terbentuk panaskan 1 menit sampai

    endapan larut kembali

    Hasil positif: larutan berwarna kuning

    d. Pengaruh alkohol terhadap protein

    Uji ini bertujuan untuk melihat pengaruh alkohol terhadap protein. Prinsipnya adalah

    protein dapat membentuk presipitat dengan alkohol. Dengan penambahan air, beberapa

    protein akan jernih kembali (menunjukkan sifat reversibilitas protein). Penambahan alkohol

    dapat mendenaturasi protein, karena sifat alkohol yang dapat menarik mantel air pada

    protein.

    Cara kerja:

    2 mL larutan albumin dicampur dengan 3 mL alkohol tambahkan 5 mL air

    3. Lipid

    a. Uji Hubl

    Uji ini bertujuan untuk mengetahui ikatan tak jenuh dalam suatu lipid. Prinsipnya adalah

    senyawa tak jenuh seperti lipid dapat mengalami reaksi adisi (pengurangan jumlah ikatan

    rangkap dalam senyawa). Untuk menentukan adanya ikatan rangkap, sampel direaksikan

    dengan larutan Hubl. Berkurangnya warna merah larutan Hubl, menunjukkan adanya ikatan

    rangkap.

    Cara Kerja:

    2 mL minyak ditambahkan klorofom dan 2 tetes larutan Hubl kocok.

    *kloroform berfungsi untuk melarutkan minyak

    b. Uji kelarutan lipid

    Pada uji kelarutan lipid, hampir semua jenis lipid, yaitu lemak dan minyak tidak larut

    dalam pelarut polar seperti air, namun larut dalam pelarut non polar seperti kloroform, dan

  • 8

    eter. Pada natrium karbonat, minyak mengalami reaksi emulsi/penyabunan. Asam oleat dan

    gliserol larut dalam air maupun alkohol. Hal ini disebabkan karena pada gliserol dan asam

    oleat mempunyai kepala polar berupa gugus -OH yang dapat berikatan hidrogen dengan

    molekul air ataupun alkohol. Lemak hewan dan minyak kelapa tengik dapat terdispersi

    menjadi misel yang megubah asam-asam lemak penyusunnya menjadi sabun.

    c. Uji keasaman lipid

    Uji ini bertujuan untuk sifat asam basa minyak kelapa. Prinsipnya adalah minyak murni

    umumnya bersifat netral, sedangkan minyak yang sudah tengik bersifat asam. Hal ini

    disebabkan karena minyak mengalami hidrolisis dan oksidasi menghasilkan, aldehida, keton,

    dan asam asam lemak bebas. Proses ketengikan pada lemak atau minyak dapat dipercepat

    oleh adanya : cahaya, kelembaban, pemanasan, aksimikroba, dan katalis logam tertentu,

    seperti Fe, Ni, atau Mn. Sebaliknya, zatzat yang dapat menghambat terjadinya proses

    ketengikan disebut antioksidan, misalnya: tokoferol (vitamin E), asam askorbat (vitamin C),

    polifenol, hidroquinon, dan flavonoid.

    d. Uji Liebermann Burchard

    Uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi adanya kolesterol dalam suatu senyawa. Reaksi

    Liebermann Burchard bergantung pada dehidrasi kolesterol dan oksidasi dengan asam sulfur

    untuk membentuk asam sulfonik kolestaheksan. Untuk menyempurnakan dehidrasi, reagen

    harus anhidros.

    Pada reaksi Liebermann-Burchard larutan akan berubah warna dengan segera menjadi

    merah dengan cepat akan menjadi biru-violet (Kolekalsiterol kolesterol) dan untuk

    selanjutnya akan menjadi hijau (ergokalsiferol).

    Cara Kerja:

    Sedikit kolesterol dilarutkan dalam kloroform hingga larut seluruhnya Tambahkan 10

    tetes asam asetat anhidrid dan 2 tetes asam sulfat pekat kocok perlahan-lahan dan

    biarkan beberapa menit Perhatikan perubahan warna yang terjadi.

  • 9

    Hasil positif: Kolesterol dilarutkan dalam kloroform warnanya akan menjadi kecoklatan.

    Setelah ditambahkan 10 tetes asam asetat anhidrid dan 2 tetes asam sulfat pekat warnanya akan

    berubah menjadi biru kehijauan.

  • 10

    Isolasi dan Pemisahan Protein

    Protein adalah molekul organik yang terbanyak di dalam sel. Lebih dari 50% berat kering sel

    terdiri atas protein. Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino, yang

    terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein apapun dan berasal dari mahluk hidup

    tersusun dari 20 macam asam amino. Kedua puluh asam amino tersebut mempunyai ciri-ciri

    umum yaitu:

    Semua mempunyai konfigurasi L

    Mempunyai 1 gugus COOH dan 1 gugus NH2 yang terikat ke atom C

    Molekul protein, melalui ikatan hidrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk

    mantel air. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi encer sangat meningkatkan

    kelarutan suatu protein (salting in). Sifat ini, yaitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid

    yang dipermudah oleh mantel air dan elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan

    protein. Penghilangan mantel air dapat membantu dalam pengendapan protein. Penghilang

    mantel air dapat dilakukan dengan penambahan garam berkonsentrasi tinggi dan etanol

    absolut.

    a. Pengendapan protein dengan larutan garam konsentrasi tinggi (Salting out)

    Tujuan dari uji ini adalah menunjukkan bahwa protein dapat dipisahkan satu dari yang

    lain dengan menggunakan larutan garam divalen konsentrasi tinggi.

    Untuk larut dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air dengan

    cara membentuk ikatan hidrogen sehingga molekul tersebut tersebar merata di antara

    molekul-molekul air. Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi

    molekul protein, sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap.

    Larutan garam berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam

    berkonsentrasi tinggi akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan semakin

    berkurang.

    Pengendapan ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein, sedangkan molekul

    protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan tersebut bersifat

    reversibel.

  • 11

    Larutan garam divalent lebih efisien dalam mengendapkan protein karena di dalam air

    garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 3 ion, yaitu yang masing-masing berinteraksi

    sempurna dengan air.

    (NH4)2SO4 setengah jenuh dapat mengendapkan globulin

    (NH4)2SO4 jenuh dapat mengendapkan albumin

    NaCl hanya bisa mengendapkan globulin dalam keadaan jenuh, tetapi tidak dapat

    mengendapkan albumin.

    Cara kerja:

    2 mL serum dicampurkan dengan larutan amonium sulfat setengah jenuh saring

    periksa ada endapan atau tidak periksa endapan dan filtrat dengan uji biuret. Lakukan

    langkah yang sama dengan konsentrasi amonium sulfat jenuh.

    b. Pemisahan protein dengan etanol absolut

    Etanol absolut bersifat sangat kuat menarik air (higroskopis). Penambahan etanol

    absolut pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan

    molekul protein melalui ikatan hidrogen ditarik oleh etanol. Akibatnya molekul-molekul

    beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. Bila agregat partikel protein tersebut

    dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama endapan yang terbentuk tidak

    dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi irreversibel.

    Cara kerja:

    2 mL serum dicampurkan dengan etanol absolut kocok saring periksa filtrat dan

    endapan dengan uji biuret. Lakukan dengan cara yang sama pada larutan albumin.

  • 12

    Pengaruh suhu dan pH terhadap Enzim

    Enzim adalah sekelompok protein yang berfungsi sebagai katalisator untuk berbagai

    reaksi kimia dalam sistem biologik. Enzim terdistribusi di tempat-tempat tertentu di dalam

    sel, seperti enzim yang berperan dalam sintesis dan reparasi DNA terletak di dalam inti sel.

    Suatu enzim dapat mengatalisis satu atau beberapa reaksi saja. Meskipun jumlah enzim

    ada ribuan yang berseumber dari mahluk hidup, reaksi-reakis yang dikatalisis oleh enzim

    dapat digolongkan ke dalam 6 macam reaksi saja. Berdasarkan itu, para ahli telah

    menggolongkan enzim ke dalam 6 golongan, yaitu:

    Oksidoreduktase mengkatalisis reaksi-reaksi oksidasi reduksi

    Transferase mengkatalisis reaksi pemindahan berbagai gugus seperti amina,

    karboksil, karbonil, metil, asil, glikosil atau fosforil

    Hidrolase mengkatalisis pemutusan ikatan kovalen sambil mengikat air

    Liase mengkatalisis reaksi pemecahan ikatan kovalen tanpa mengikat air

    Isomerase mengkatalisis proses isomerisasi

    Ligase (sintetase) mengkatalisis pembentukan ikatan kovalen

    Seperti molekul protein lainnya, sifat biologis enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai

    faktor fisiko-kimia. Enzim bekerja pada kondisi tertentu yang relatif ketat. Faktor yang

    mempengaruhi kerja enzim antara lain:

    Suhu

    pH

    oksidasi oleh udara atau senyawa lain

    Penyinaran sinar ultraviolet

    Sinar X, , , dan

    a. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim

    Suhu yang sangat rendah akan menyebabkan terhentinya kerja enzim secara reversibel,

    karena dalam keadaan tersebut tidak terjadi benturan antara partikel E (enzim) dan S

    (substrat). Akibatnya kompleks E-S yang sangat penting dalam reaksi enzimatik tidak

    terbentuk, sehingga P (produk) juga tidak terbentuk. Bila suhu dinaikkan sedikit demi

  • 13

    sedikit, benturan E dan S untuk membentuk kompleks E-S akan makin gencar, sehingga P

    yang terbentuk semakin banyak. Keadaan ini terjadi sampai pada suhu tertentu, yaitu suhu

    optimum.

    Suhu yang lebih tinggi dari suhu optimum menyebabkan enzim terdenaturasi. Akibatnya

    meskipun benturan E dengan S lebih gencar lagi, kompleks ES tidak terbentuk karena enzim

    terdenaturasi. Akibatnya pembentukan P berkurang. Denaturasi enzim dapat terjadi

    irreversibel terutama bila suhu lingkungan jauh melampaui suhu optimum.

    Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncaknya pada suhu optimum. Enzim dalam

    tubuh manusia mempunyai suhu optimum sekitar 37C. sebagian besar enzim menjadi tidak

    aktif pada pemanasan sampai 60C karena terjadi denaturasi.

    Cara kerja:

    Larutan pati sebanyak 1 mL diinkubasi selama 5 menit pada suhu 0C campurkan air liur

    yang sudah diencerkan 1000 x sebanyak 200 mL inkubasi selama 1 menit campurkan

    larutan iodium sebanyak 1 mL dan air suling 8 mL baca serapan pada panjang gelombang

    680 nm dengan spektrofotometri. Lakukan cara yang sama untuk suhu 25C, suhu ruang,

    37C, 60C, dan 100C.

    Larutan iodium digunakan sebagai penanda untuk adanya larutan pati. Jika enzim

    bekerja maksimal, maka pati akan semakin berkurang dan larutan berwarna ungu lebih

    muda dibandingkan pada larutan yang kerja enzimnya tidak maksimal.

  • 14

    b. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim

    Enzim bekerja pada kisaran pH tertentu dan menunjukkan kerja maksimum pada pH

    optimum. Di luar pH optimum aktivitas enzim dapat terganggu.

    Jika dilakukan pengukuran aktivitas enzim pada beberapa macam pH yang berlainan,

    sebagian besar enzim di dalam tubuh menunjukkan aktivitas maksimum antara pH 5,0

    sampai 9,0. Kecepatan reaksi enzimatik mencapai puncaknya pada pH optimum. Ada enzim

    yang mempunyai pH optimum yang sangat rendah, seperti pepsin yang mempunyai pH

    optimum 2. Pada pH yang jauh di luar pH optimum, enzim akan terdenaturasi. Selain itu pada

    keadaan ini baik enzim maupun substrat dapat mengalami perbuahan muatan listrik yang

    mengakibatkan enzim tidak dapat berikatan dengan substrat.

    Cara kerja:

    Larutan pati sebanyak 1 mL (yang sudah dilarutkan dalam pH 1) diinkubasi selama 5 menit

    pada suhu 37C campurkan air liur yang sudah diencerkan 1000 x sebanyak 200 mL

    inkubasi selama 1 menit campurkan larutan iodium sebanyak 1 mL dan air suling 8 mL

    baca serapan pada panjang gelombang 680 nm dengan spektrofotometri. Lakukan cara

    yang sama untuk larutan pati yang sudah dilarutkan dalam pH 3, 5, 7, 9 dan 11.

  • 15

    Isolasi DNA

    DNA merupakan polideoksiribonukleotida yang mengandung banyak

    monodeoksiribonukleotida yang dihubungkan secara kovalen melalui ikatan 3 5

    fosfodiester. Satu nukleotida terdiri atas 3 bagian yaitu:

    a. Cincin purin atau pirimidin, yaitu basa nitrogen yang terikat pada molekul atom C nomor 1

    suatu molekul gula (ribosa atau deoksiribosa) melalui ikatan N-glukosidik.

    b. Molekul gula dengan 5 atom C (pentosa). Pada ribonucleic acid (RNA) gulanya adalah

    ribosa, sedangkan pada DNA gulanya adalah deoksiribosa.

    c. Gugus fosfat yang terikat pada atam C nomor 5 melalui ikatan fosfoester.

    DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA suatu organisme, baik

    dnegan metode PCR (polymerase chain reaction) atau mnggunakan enzim endonuklease

    restriksi (DNA fingerprinting). Sampel yang dapat digunakan untuk isolasi DNA adalah semua

    bahan bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang,

    liur dan lain-lain. Hasil pemeriksaan dari PCR dan DNA fingerprinting dapat digunakan untuk:

    Diagnosis penyakit infeksi akibat virus atau bakteri

    Mendeteksi adanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan atau penyakit

    herediter

    Menentukan jenis kelamin prenatal

    Sebagai alat bantu dalam bidang kedokteran kehakiman

    Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang tidak

    mengandung DNA genom harus dilisiskan dengan bantuan bahan pengawet DNA, yaitu

  • 16

    deterjen anionik yang dapat melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga

    dapat mengurangi aktivitas DNAse yang terdapat di dalam sel. Bila perlu, dapat ditambahkan

    RNAse untuk menyingkirkan kontaminasi RNA.

    Selanjutnya dengan presipitasi garam, DNA genom dipisahkan dari protein plasma dan

    inti. Akhirnya, DNA genom diisolasi dengan presipitasi dengan alkohol dan pelarutan kembali

    endapan yang terbentuk dengan larutan dapar yang mengandung suatu bahan pengawet

    DNA. Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan utuh.

    Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein, mengendapkan

    DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan menilai

    kemurnian DNA.

    Cara kerja:

    1) Sebanyak 450 L cell lysis solution dimasukkan ke dalam tabung microcentrifuge steril.

    2) Ditambahkan 150 L darah dan tabung diputar bolak-balik 5-6 kali untuk homogenesi.

    3) Campuran di atas diinkubasi selama 10 menit dalam suhu ruang.

    4) Campuran kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang

    selama 1 menit.

    5) Supernatant dibuang tanpa menggangu pellet.

    6) Kemudian ditambahkan 150 L nuclei lysis solution ke pellet.

    7) RNase solution ditambahkan sebanyak 0,75 L dan dicampurkan dengan cara

    membolak-balik tabung.

    8) Campuran diinkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit, lalu didinginkan pada suhu ruang.

    9) Protein precipitation solution ditambahkan sebanyak 50 L ke dalam lisate dan di-vortex

    selama 20 detik.

    10) Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit pada suhu

    ruang.

    11) Supernatan dipindahkan ke dalam tabung microcentrifuge bersih yang sudah berisi 500

    L isopropanol.

    12) Tabung dibolak-balik secara perlahan sampai terlihat benang-benang putih halus (DNA).

    13) Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu ruang selama 2 menit.

  • 17

    14) Supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 200 L alkohol 70% dingin.

    15) Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2-3 menit pada suhu ruang,

    sampai DNA berubah menjadi transparan.

    16) Supernatan dibuang dan dikeringkan pada suhu ruang 5-10 menit.

    17) DNA dilarutkan dengan 50 L rehydration solution.

    18) DNA disimpan pada suhu -20 C.

  • 18

    Polymerase Chain Reaction

    Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai polymerase chain reaction (PCR),

    merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro.

    Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis, seorang peneliti

    di perusahaan CETUS Corporation. Kelompok CETUS pada tahun 1985 menemukan bahwa

    DNA yang dicampur dengan deoksiribonukleotida trifosfat atau dNTP (yang terdiri dari ATP,

    CTP, TTP dan GTP), enzim polimerase DNA dan sepasang primer jika dipanaskan, didinginkan

    lalu dipanaskan lagi akan memperbanyak diri dua kali lipat. Jika siklus ini diulang sebanyak n

    kali, maka DNA akan memperbanyak diri 2n kali lipat. PCR merupakan cara yang sensitif,

    selektif dan sangat cepat untuk memperbanyak sekuens DNA yang diinginkan. Sensitivitas

    tersebut membuatnya dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Empat

    komponen utama pada proses PCR adalah:

    1. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan

    2. Oligonuleotida primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek (15-25 basa

    nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA

    3. Deoksiribonuleotida trifosfat (dNTP), terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan

    4. Enzim DNA polimerase yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA.

    Komplemen lain yang juga penting adalah senyawa buffer.

    Proses PCR merupakan suatu siklus yang berulang, meliputi denaturasi, annealing adalah

    langkah pengenalan primer ke pita DNA yang sesuai dan ekstensi oleh enzim DNA

    polimerase.

    Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai

    sekuens yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5-fosfat, dan

    oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuens pada ujung 3-OH rantai DNA cetakan

    yang lain. Primer adalah fragmen DNA untai tunggal yang sengaja dibuat dan merupakan

    komplemen dari bagian ujung DNA yang akan diperbanyak, sehingga dapat diibaratkan

    sebagai patok pembatas bagian DNA yang akan diperbanyak.

    Setelah primer disintesis dan menempel (anneal) pada DNA cetakan, kemudian dilakukan

    sintesis DNA baru. Molekul primer digunakan untuk menempelkan nukleotida pertama pada

  • 19

    untaian DNA baru. Untaian DNA yang baru disintesis dengan menggunakan DNA cetakan

    (DNA induk) sebagai acuan sehingga DNA baru bersifat komplementer dengan cetakannya.

    Jika pada untaian DNA cetakan ada nukleotida A misalnya, maka akan diikatkan nukleotida T

    pada ujung 3-OH primer, sedang jika pada cetakan ada nukleotida C maka akan diikatkan

    nukleotida G. Demikian selanjutnya akan dilakukan pengikatan nukleotidanukleotida pada

    ujung 3- OH yang komplementer dengan cetakannya sehingga terjadi pemanjangan untaian

    DNA baru.

    Tahapan PCR:

    1. Denaturasi DNA meningkatkan temperatur hingga kurang lebih 94C selama 1 menit

    sehingga terjadi pemisahan dari kedua untai DNA dupleks.

    2. Annealing/hibridisasi suhu reaksi diturunkan menjadi 50C hingga 62C selama 1 menit

    agar oligonukleotida dapat menempel pada DNA

    3. Pemanjangan rantai (ekstensi) memanaskan kembali komponen reaksi pada suhu

    72C selama 1 menit sehingga primer dapat diperpanjang oleh enzim DNA polimerase

    hingga mencapai seluruh panjnag dari DNA sasaran.

    Ketiga tahap ini diulang sebanya 25 hingga 35 kali.

  • 20

    Cara kerja:

    1) Tabung PCR 0,2 mL disiapkan untuk setiap sampel dan dimasukkan dalam pemegang

    (holder) mini sentrifuge, diposisikan pada pecahan es batu halus, agar suhu terjaga

    dingin.

    2) Ke dalam setiap tabung dimasukkan 1,25 L Primer Forward secara tepat di dasar

    tabung.

    3) Ditambahkan 6,25 L GoTaq Green Master Mix di atas Primer Forward pada tiap tabung.

    4) Sampel DNA sebanyak 2 L dimasukkan ke tiap tabung di atas GoTaq Green Master Mix.

    5) Di atas sampel DNA dimasukkan 16,5 L campuran buffer pH 8 + MgCl2 + air + Primer

    Reverse.

    6) Mesin PCR serta laptop yang sudah membuka software disiapkan.

    7) Segera dimasukkan sampel pada PCR 36-well serta dipasang pengaman tutup tabung

    dan ditempatkan kembali ke dalam wadah pecahan es batu.

    8) PCR dijalankan sebanyak 40 siklus dengan suhu denaturasi 950C, suhu annealing dan

    ektensi 68,50C.

  • 21

    Short Tandem Repeat

    STR adalah bagian DNA manusia yang pendekpendek berupa 2-6 basa nitrogen yang

    berulang dan bersifat sangat variatif (polimorfik), sehingga sangat cocok digunakan untuk

    identifikasi personal dan kasus paternitas. STR merupakan DNA inti, sehingga diturunkan

    dari kedua orang tua kepada anaknya menurut hukum mendel. STR mirip dengan VNTR dan

    prinsip-prinsip umum untuk menggunakan mereka adalah sama. STR yang divisualisasikan

    menggunakan teknik inovatif yang ditemukan pada tahun 1986 yang disebut Polymerase

    Chain Reaction (PCR), memungkinkan amplifikasi DNA untuk pertama kalinya. Secara singkat

    PCR memungkinkan DNA dari suatu daerah terpilih diamplifikasi hingga miliar kali lipat,

    dengan ketentuan bahwa setidaknya ada beberapa bagian dari urutan nukleotida yang

    dikenal.

    Daerah DNA dengan unit berulang antara 2-6 pasang basa disebut mikrosatelit, urutan

    pengulangan sederhana, atau short tandem repeats (STR). Teknologi STR digunakan untuk

    mengevaluasi wilayah tertentu (lokus) dalam DNA inti. Variabilitas dalam regio STR dapat

    digunakan untuk membedakan satu profil DNA dari yang lain. Pada tahun 1996, pemeriksaan

    terhadap 13 lokus STR (yang dikenal sebagai Combined DNA Index System 13 atau CODIS 13)

    dianjurkan oleh FBI digunakan pada kasus forensik untuk penyelesaian kasus korban tidak

    dikenal (identifikasi personal), kasus paternitas maupun pelacakan sumber bahan biologis.

    STR memilki keistimewaan karena memiliki variasi alel yang banyak, mudah digandakan di

    laboratorium dan cepat analisisnya. Melakukan pemeriksaan dengan CODIS 13, identifikasi

    individu dapat disimpulkan dengan ketepatan mendekati 100%.

    Penggunaan PCR dalam analisis STR memungkinkan jumlah yang sangat kecil dari DNA,

    seperti yang ditemukan pada secangkir prangko, puntung rokok, atau kopi, dapat diperkuat

    untuk menghasilkan sejumlah besar DNA yang cukup untuk dianalisis. Secara singkat PCR

    memungkinkan DNA dari suatu daerah terpilih diamplifikasi hingga miliar kali lipat, dengan

    ketentuan bahwa setidaknya ada beberapa bagian dari urutan nukleotida yang dikenal.

    Dalam pelaksanaan STR, dibutuhkan suatu elektroforesis. Elektroforesis DNA adalah

    suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannnya, dengan

  • 22

    menggunakan metode listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel

    yang akan dipisahkan. Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk,

    ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Teknik elektroforesis dapat digunakan

    untuk analisis DNA, RNA maupun protein. Untuk asam nukleat, jarak yang ditempuh molekul

    itu ketika diberi arus berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya.

    Setelah DNA dimasukkan ke dalam lubang sampel, arus listrik dialirkan. Kutub yang sejajar

    dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan kutub lainnya positif. Bila

    berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi

    ke elektroda negatif dan demikian pula sebaliknya. Oleh karena DNA bermuatan negatif

    maka molekulmolekul DNA akan bergerak ke arah kutub positif. Posisi molekul yang

    memisah pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi ataupun

    dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

    Teknik elektroforesis DNA pun berkembang sehingga analisis molekul DNA tidak hanya

    dilakukan dengan prinsip elektroforesis linear. Beberapa teknik baru dikembangkan,

    misalnya teknik Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE), Orthogonal Field Alternation Gel

    Electrophoresis (OFAGE), Transverse Alternating Field Electrophoresis (TAGE) dan lain-lain.

    Disamping itu, untuk keperluan tertentu, misalnya untuk penetuan urutan basa DNA (DNA

    sequencing), elektroforesis DNA dilakukan dengan menggunakan gel yang berbeda yaitu gel

    poliakrilamid atau Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Sistem ini menunjukkan tiga

    keunggulan daripada gel agarosa:

    1. Kekuatan pemisahannya sangat besar sehingga dapat memisahkan satu pasang basa

    dalam 500 pasang basa.

    2. Sistem ini dapat menampung jumlah sampel lebih besar daripada agarosa.

    3. DNA yang diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni sehingga dapat

    digunakan untuk keperluan percobaan mikroinjeksi embrio tikus.

    Cara kerja:

    a. Elektroforesis

    1) Marker disiapkan dengan mencampur 5 L marker + 1 L loading dye, kemudian

    disentrifugasi selama 20 detik.

  • 23

    2) Gel poliakrilamida (PAGE) disiapkan pada chamber, lalu disemprotkan 1 mL buffer dari

    chamber atas ke dalam setiap kolom, masing-masing 2 kali hingga setiap kolom

    terhubung dengan buffer atas dengan genangan buffer.

    3) Setiap kolom diisi dengan marker 6 L serta hasil PCR sebanyak 10 L.

    4) Elektroforesis dijalankan dengan tegangan 100 V selama 60 menit.

    b. Pewarnaan (staining)

    1) Kaca PAGE dibuka secara hati-hati agar gel tidak robek, kemudian gel yang menempel

    pada 1 sisi kaca dilepas menggunakan stik hitam.

    2) Gel ditempatkan pada wadah pewarnaan dan diisi fiksator (asam asetat+metanol) 100

    mL, kemudian di-steering selama 30 menit.

    3) Larutan dibuang dan dicuci dengan aquades 200 mL, di-steering 10 menit. Selanjutnya

    aquades dibuang dan dicuci kembali dengan aquades baru sebanyak 200 mL dan di-

    steering selama 3 menit.

    4) Aquades dibuang, lalu dimasukkan 100 mL perak (AgNO3) dan di-steering 20-30 menit.

    5) Perak (AgNO3) dibuang dan dicuci dengan aquades 250 mL, lalu di-steering selama 20

    detik.

    6) Aquades dibuang, kemudian dimasukkan pengembang (Na2CO3) sebanyak 100 mL,

    digoyang-goyang menggunakan tangan selama 3-5 menit.

    7) Kertas seukuran gel dimasukkan ke dalam larutan tepat di bawah gel, kemudian diangkat

    jika sepenuhnya kertas telah menjadi alas bagi gel.

    8) Panjang lintasan diukur dari dasar kolom hingga garis pita dengan akurasi 0,05 cm,

    demikian juga pita tiap marker.

    9) Dihitung panjang basa dan alelnya.

    Sekian tentirnya, semoga apa yang dipelajari dapat bermanfaat. Kalau bisa baca lagi literatur

    lain selain tentir ini.

    Semoga bermanfaat.

    -RP-