Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

56
Kelompok 6 1.Setia Bakti (1106004292) 2.Muslimah (1106017622) 3.Tatia Chairunnisa (1106012924) 4.Yulianto (1106002116) Teknik-Teknik Memodifikasi dan Memutasi Gen

description

rekayasa genetika, cut and ligase, restriksi, ligasi, DNA, metode-metode transformasi gen, Restriction Endonucleases, enzim-enzim yang berperan dalam pemotongan DNA, teknik-teknik Modifikasi gen, phosfotase, metilase, polymerase, exonucleases, penggabungan gen, T4 DNA ligase, E.coli DNA ligase, Topo isomerase, transpotase, Recombinase, Metode-metode transformasi (chemical,

Transcript of Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Page 1: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Kelompok 61. Setia Bakti (1106004292)2. Muslimah (1106017622)3. Tatia Chairunnisa (1106012924)4. Yulianto (1106002116)

Teknik-Teknik Memodifikasi dan Memutasi Gen

Page 2: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

TIGA KEGIATAN UTAMA PROSES REKAYASA GENETIKA

PEMOTONGAN MODIFIKASI

PENYAMBUNGAN

Page 3: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Materi genetik dipotong dengan suatu enzim bernama nucleases, dimana untuk :- RNA : Ribonucleases (RNases)- DNA : Deoxyribonucleases (DNases)

• Yang paling banyak digunakan adalah Restriction Endonucleases, yang memiliki 3 tipe/kelas berbeda. Namun, hanya Tipe II saja yang memotong DNA tepat di area pengenalan (recognition site).

I. PEMOTONGAN

Page 4: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia
Page 5: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia
Page 6: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Beberapa hal tekait pemotongan materi genetik

Enzim yang berbeda dapat memiliki sekuens pemotongan ataupun ujung pemotongan yang sama.

Proses pemotongan dapat dipengaruhi berbagai faktor: metilasi, buffer yang digunakan, serta stuktur sekunder dari materi genetik.

Penggunaan enzim restriction endonucleases rekayasa genetika harus bebas dari enzim nucleases lainnya.

Selain enzim, pemotongan DNA dapat dilakukan secara fisika, seperti dengan vibrasi atau pengadukan berfrekuensi tinggi.

Page 7: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

II. MODIFIKASIPhosphatases• Menghilangkan gugus fosfat

DNA, dan menggantikannya dengan gugus hidroksil.

• Menyebabkan proses ligasi (penggabungan) DNA tidak dapat terjadi.

• Dapat di-inaktifkan dengan proses pemanasan.

Methylases• Penambahan gugus metil

kedalam untai DNA, khususnya pada Sitosin.

• Menyebabkan proses ekspresi gen terhambat.

• Pada rekayasa gengetik, berfungsi melindungi DNA dari degradasi enzim.

II. MODIFIKASI

Page 8: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

PolymerasesBerperan dalam proses

polimerisasi, dan terdapat 4 tipe, yaitu:- DNA-dependent DNA

polymerases: berperan mensitesis DNA komplementer dari suatu templet DNA.

- RNA-dependent DNA polymerases: dikenal juga dengan reverse transcriptase, yang berperan mensintesis DNA dari suatu templet RNA.

- DNA-dependent RNA polymerases: berperan mensitesis RNA dari suatu templet DNA.

- Template-independent polymerases: berperan dalam menambahkan untai nukleotida pada DNA, tanpa harus menggunakan suatu templet.

Page 9: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Exonucleases

• Berperan dalam merusak/melisis untai DNA yang menonjol pada bagian luar (ujung) DNA.

• Terdapat 2 peran utama, yakni:a. Menghilangkan ujung DNA dari

suatu untai secara terpisah.b. Menghilangkan ujung DNA dari

kedua untai secara bersamaan.• Kondisi mana yang akan terjadi

dapat disebabkan oleh faktor lamanya waktu inkubasi serta jumlah enzim nuklease yang ada.

Page 10: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Merupakan pembentukan ikatan fosfodiester dari ujung-ujung 2 untai DNA (umumnya pada untai ganda).

Terdapat 2 jenis reaksi ligasi, yakni:- Intermolekuler: ujung 2 molekul DNA saling bergabung- Intramolekuler: ujung molekul DNA yang sama saling

bergabung sehingga membentuk suatu sirkular.

Menggunakan enzim ligase, yang banyak digunakan khususnya pada proses replikasi DNA (penggabungan fragmen okazaki, dll).

III. PENGGABUNGAN

Page 11: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

1. T4 DNA Ligase: disandikan oleh bakteriofage T4 untuk diinfeksikan ke sel E. coli. Dengan bantuan ATP, dapat menggabungkan berbagai jenis ujung sambungan (blunt atau sticky end).

2. E.coli DNA Ligase: tidak dapat menggabungkan ujung tumpul dari suatu DNA (blunt end). Membutuhkan nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) sebagai kofaktor.

3. Topoisomerase: untuk mengubah tingkat ke-superkoil-an molekul DNA.

4. Transposase: berfungsi untuk menggabungkan suatu potongan DNA ke suatu untai DNA.

5. Recombinase: untuk mengkatalis pemecahan dan menggabungkan kembali molekul DNA pada area tertentu.

Mekanisme T4 DNA Ligase

Enzim pada Proses Ligasi (Penggabungan DNA)

Page 12: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

TransformasiProses pemindahan DNA ke dalam sel kompeten.Metode-metode transformasi DNA:

‘Natural’methods

Chemical transformation

Electroporation

Physical methods

Page 13: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Cara penyiapan sel kompeten berbeda untuk teknik transformasi yang berbeda.

• Hal yang membedakan diantaranya:-Tahapan perlakuan pada sel- Jenis larutan untuk meresuspensi

• Hal yang diperhatikan:-Suhu saat dilakukan treatment pada sel-Ada tidaknya tahap pemusingan-Suhu dan lamanya waktu inkubasi sel sebelum digunakan

Mempersiapkan Sel Kompeten

Page 14: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Terjadi pada sebagian siklus hidup mikroorganisme, biasanya bakteri, melalui konjugasi.

• Terjadi pada kondisi kompeten sel, yaitu pada menjelang fase stasioner.

• Frekuensi sangat rendah karena syarat tertentu seperti: kontak antar sel, homologi DNA, proses modifikasi dalam inang, kondisi morfologi, dan perlunya gen khusus seperti gen tra untuk konjugasi.

• DNA yg dapat dipindahkan hanya DNA linear atau DNA kromosom, DNA plasmid tidak dapat.

‘Natural’methods

Page 15: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Prinsip Menggunakan larutan kimia, pendinginan dengan es dan heat shock.

• Jenis larutan kimia biasanya : CaCl2.

• Jenis bahan kimia lain yang lebih kompleks seperti bahan kimia yang mengandung mangan, hexamine cobalt dan rubidium, ion potasium serta ion kalsium, bersama dengan dimetil sulfoksida dan dithiothreitol.

• Lebih efisien daripada cara alami.

Chemical transformation

• Bisa juga ditambah dengan bantuan lipid atau polisakarida yang sudah dimodifikasi seperti diethylaminoethyl (DEAE)-dextran.

Page 16: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Electroporation• Prinsip menggunakan beda

potensial listrik untuk meregangkan membran sel kompeten.

• Dapat digunakan untuk sel prokariotik dan eukariotik.

• Memiliki efisiensi lebih tinggi daripada metide alami dan kimia.

• Membutuhkan micropulser.

Page 17: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Physicalmethods• Menggunakan particle gun, dikenal

juga dengan biolistic transformation.• Prinsip :- adsorpsi DNA pada permukaan

microprojectile (gold atau tungsten).- macroprojectile didorong oleh

ledakan dari pistol (bubuk mesiu atau gas terkompresi).

- macroprojectile akan tertahan plat berlubang, namun microprojectile akan melewati lubang dan masuk ke jaringan target.

• Cara lainnya yaitu dengan:- Memvortex sel menggunakan

silicon carbide whiskers / glass beads dan DNA target.

- Mikroinjeksi DNA melalui jarum suntik kecil (femtosyringe) dengan diameter 0,1 mm.

Page 18: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Teknik Pemurnian Plasmid

Penghancuran sel

Menghilangkan protein dan DNA kromosom

PresipitasiMetode Alternative

Teknik Umum

Page 19: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Penghancuran (Lisis)

lisozime

detergen

menghidrolisis dinding sel yang terdiri

dari ikatan N-asetil

glukosamin dan asam N-

asetil muramik yang

dihubungkan oleh peptida.

Page 20: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Memisahkan Gen dari Protein & DNA Kromosom

• Ekstraksi• Benchtop microsentrifuge

DNA Kromosom

Page 21: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Menghilangkan DNA Kromosomal

DNA kromosomal dihilangkan dengan

cara sentrifugasi. Karna ukuran

molekulnya yang besar, DNA

kromosomal dapat dipisahkan dari gen

menggunakan benchtop

microsentrifuge

Page 22: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Menghilangkan Protein dari Sel

Protein dapat dipisahkan dari gen dengan cara EKSTRAKSI menggunakan FENOL & KLOROFORM karena fenol & kloroform merupakan larutan

yang paling efisien untuk memutuskan ikatan hidrogen yang terdapat pada protein

Metode ekstraksi yang digunakan bisa di variasikan menggunakan perebusan dan penggunaan senyawa-senyawa lain seperti sodium

hidroksida dan sodium dodesil sulfat yang dapat mendenaturasi protein dan DNA Kromosomal sehingga mempermudah proses sentrifugasi.

Page 23: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

PresipitasiAsam nukleat yang tertinggal dalam larutan lalu di PRESIPITASI biasanya menggunakan campuran dari sodium atau amonium asetat dengan etanol

Pada proses presipitasi ini asam nukleat masih mengandung DNA plasmid (yang tertinggal dari proses sentrifugasi) dan RNA.

Ada beberapa cara untuk menghilangkan DNA plasmid yang masih tertinggal

Page 24: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Metode Alternatif

Enzim

Eksonuklease untuk memotong secara linear fragmen DNA kromosomal

Ribonuklease untuk menghilangkan RNA

Page 25: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Alternative pemurnian DNA menggunakan ion-exchange yang mengandung silika turunan dari grup DEAE

• Grup DEAE ini akan mengepung & mengikat DNA, RNA dan juga protein.

• Molekul lainnya dielusikan melalui kolom ion-exchange dengan kondisi ionic berbeda-beda . Hal ini menjadikan DNA lebih murni (tidak terdapat kontaminan)

Senyawa grup DEAE atau dietilaminoetil

Metode Alternatif

Page 26: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Sentrifugasi menggunakan perbedaan densitas sesium

klorida• Prinsip larutan sesium klorida yang diputar menggunakan

ultrasenrifuge akan membentuk perbedaan (gradien) konsentrasi & densitas dikarenakan kandungan ionnya yang sangat berat.

• Gradien ini akan membuat DNA berpindah posisi sesuai massa jenisnya yang akan sama dengan larutan disekitarnya.

• Dalam posisi kesetimbangan ini, sentrifugasi tidak akan merubah posisi dari DNA. Plasmid sirkular DNA yang tertutup membentuk satu posisi pada tabung sentrifuge.

• Plasmid DNA yang terperangkap dan fragmen linear dari DNA kromosomal akan terbentuk pada kolom yang lebih diatas

• RNA akan terbentuk pada bagian dasar tabung dan protein akan mengambang diatas tabung.

Page 27: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Lokasi dari plasmid DNA dapat dilihat dari terbentuknya noda berwarna orange kemerahan dari ethidium bromida didalam larutan sebelum di sentrifugasi.

• Molekul Et-Br sangat ramping & hidrofobik, sehingga dapat diletakan diantara rantai ganda DNA.

• Et-Br ini akan ber-flourosence menjadi warna merah jambu saat berada dibawah sinar ultraviolet.

• Peristiwa flourosence ini dapat digunakan sebagai indikator keberadaan DNA saat ditabung sentrifuge

Page 28: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Gel Elektroforesis• Prinsip DNA, RNA atau protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekulnya oleh medan listrik sesuai laju perpindahan oleh GGL di dalam matriks gel.

• Digunakan untuk analisis atau pemurnian DNA, RNA atau protein sebelum digunakan dalam metode lain seperti PCR, cloning, spektrometri massa, sekuensing, dll.

• Jenis gel yang digunakan ada 2 yaitu: Agarosa dan poliakrilamida

Page 29: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

AGAROSA• Bahan: ekstrak rumput laut yang sudah

dimurnikan.• Kelebihan: sederhana, preparasi gel

lebih cepat, pembuatan gel lebih mudah, gel bersifat non toksik, laju pemisahan lebih cepat, lebih murah (konsentrasi rendah).

• Kelemahan: mudah rusak oleh tangan, bands yang dihasilkan dapat berkabut dan menyebar agak jauh.

• Resolusi lebih rendah dari poliakrilamida

• Dapat memisahkan DNA dan RNA yang berukuran > 100 bp-50kb dan memisahkan protein berukuran > 200kDa.

• Gerak medan: Horizontal• Voltase yang digunakan rendah

Perbedaan berdasarkan jenis gel

POLIAKRILAMIDA• Kelebihan: dapat menampung DNA

dalam jumlah lebih besar.• Kelemahan: pembuatan lebih sulit,

preparasi lama, biaya mahal, bersifat toksik, laju pemisahan lambat.

• Resolusi lebih tinggi daripada gel agarosa, sehingga panjang molekul yang berbeda hanya 1 nukleotida saja dapat terdeteksi.

• Dapat memisahkan protein dengan ukuran 5-200kDa dan DNA 5-500 bp.

• Gerak medan vertikal• Voltase yang digunakan tinggi.

Page 30: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Sebelum dimasukkan sampel diberi pemberat berupa larutan buffer seperti polietilenglikol atau gliserin, bromofenol biru dan aquades agar dapat masuk ke gel dengan baik

• Gel kemudian dialiri listrik, sampel dna akan bergerak menuju kutub positif

• Semakin panjang rantai DNA maka semakin banyak pula waktu yang dibutuhkan untuk menuju kutub positif

• Kemudian sampel diberi warna (staining) agar dapat terlihat jelas

• Pewarnaan dapat menggunakan : Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue)

Prinsip Kerja

Page 31: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Sejarah

Sekuensi DNA phage-λ-Wu&Taylor (1971)

Metode “The Chain Terminator”-Sanger (1977)

Modifikasi menggunakan reagen untuk memotong basa tertentu-Maxam&Gilbert (1977)

Sekuensing

Page 32: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Prinsip Kerja

• DNA sequencing menggunakan prinsip metode PCR (Polymerase Chain Reaction)

• DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.

Proses Cycle Sequencing (Image from appliedbiosystems.com)

Page 33: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Perbedaan Cycle Squencing dengan PCR

1. Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti PCR

2. ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan menghilangkan gugus 3 -OH pada ribosa.′

Struktur molekul dNTP dan ddNTP (csa.fi.it)

Page 34: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3 -OH yang ′seharusnya bereaksi dengan gugus 5 -Posfat dNTP berikutnya ′membentuk ikatan posfodiester.

• Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.

continued

Page 35: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Metode Sanger (1975)

• Caranya Melakukan reaksi cycle sequencing pada

empat tabung terpisah yang masing-masing

berisi semua pereaksi yang dibutuhkan.

Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk

setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang

ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika

ddTTP.

Page 36: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Continued

•Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah.•Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek).•Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP. Prinsip Sanger Method dengan primer labelling

(www.noaa.gov)

Page 37: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Cara Pembacaan HasilDye Primers dengan Label Berbeda• Agar proses pemisahan fragmen

pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur saja pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing

Setelah digabung• Dengan teknik ini visualisasi dan

penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda.

Page 38: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Cara Terbaru : Dye-Terminators Sequencing

Prinsi melabel ddNTP dengan 4 label

fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP

dan ddTTP

Sehingga reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.

Page 39: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Dengan mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat dan terotomatisasi.

• Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya.

• Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya.

continued

Page 40: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Contoh Electropherogram (image from ggpht.com)

• Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya digunakan untuk menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang aplikasi lainnya.

• Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini.

continued

Page 41: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

PCR

Page 42: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Prinsip Dasar PCR

DENATURASI yaitu pemutusan ikatan hidrogen DNA pada suhu 950C.

ANNEALING yaitu proses penempelan primer pada template DNA pada suhu

55-600C

SINTESIS DNA dimana Taq Polymerase melakukan sintesis pada DNA yang

baru dibentuk pada suhu 720C

Sumber : oceanexplorer.noaa.gov

Page 43: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Tipe – Tipe PolimerisasiTaq Polymerase• Memiliki kekurangan

pada aktivitas diluar nukleus 3’-5’ sehingga memiliki error yang tinggi 10-4 – 2x10-5

• Bisa terdisosiasi sebelum DNA selesai disintesis

• Tidak terlalu tahan panas hanya selama 40menit di 950C

• Bisa menggabung kan residu yang berlebih

• Dihasilkan oleh Thermus aquaticus.

Pfu Polymerase• Memiliki rentang

error pada 285x10-6 – 57x10-6

• Bisa tahan selama lebih dari satu jam pada suhu 950C

• Dihasilkan dari Pyrococcus furiosus

Tli Polymerase• Memiliki rentang error diantara Pfu dan Taq•Bisa tahan sampai 7 jam pada suhu 950C•Dihasilkan Thermococcus litolaris

Page 44: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• primer yang lebih pendek lebih baik digunakan untuk ketepatan amplifikasi dan primer panjang pada DNA eukariotik

Ukuran

• Primer tidak perlu cocok semuanya, yang terpenting cocok pada bagian ujung 3’ agar template bisa tercetak dengan sempurna

Mismatches

• Waktu primer untuk melebur harus cocok dengan template agar bisa terjadi proses annealing dengan sempurna

Waktu Peleburan

• Primer menggulung sehingga membentuk suatu intramolekulInternal secondary structure

• Dimana terjadi pengikatan diantara primer – primer yang adaPrimer – Primer Annealing

Mendesain Primer

Page 45: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Ketidak Pastian dalam Mendesain Primer

Primer yang berdasar langsung pada sususan

asam amino

Hal ini bisa terjadi ketidak cocokan karena

kode genetik mengalami degenerasi

Primer yang berdasar pada kemiripin

susunan asam amino atau DNA

Digunakan untuk mengetahui

kekerabatan dari suatu organisme

Page 46: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Faktor – Faktor Yang Mempengaruhi PCR

•Fragmen yang ada dipengaruhi oleh jenis polimerase yang digunakan

Ukuran

•Hal ini bisa dicegah dengan meningkatkan temperatur dan mengatur konsentrasi ion magnesium yang dapat meningkatkan spesifikasi pengikatan primer

Memperbanyak Urutan yang Salah

•Bisa terjadi karena adanya kontaminan dari pipet yang sebelumnya digunakan untuk PCR ataupun dari luar yaitu bakteri,dsb

•Pencegahan kontaminasi : •Menggunakan

pipet khusus dan memisahkan ruang pre-PCR dan post-PCR

•Melakukan PCR dengan hati – hati seperti membersihkan permukaan luar sebelum ekstraksi DNA

Kontaminasi

Page 47: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Heterozygosity

Bisa dideteksi dengan melakukan

sekuensing secara langsung produk dari

PCR

Tidak bisa dideteksi ketika produk yang digunakan adalah

single cloned

Population Heterogenoity

Terjadi ketika template DNA

yang digunakan berasal lebih dari

satu individu

DNA Damage and

Polymerase Error

Kerusakan DNA terjadi karena

adanya oksidasi atau deaminasi basa,

cross – linking kimia

Mengakibatkan adanya kesalahan

dalam menggabungkan

basa

Sequence Heterogeneity

cont

Page 48: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

• Jumping PCR– Ketika DNA yang

terdegradasi diperbanyak

• Interpretasi1. Nukleotida yang jarang

merupakan nukleotida yang terbentuk dari DNA template yang rusak

2. Melihat sekuens dari allel yang ada :• Yang sering terbentuk

merupakan hasil yang diinginkan

• Yang jarang terbentuk merupakan Jumping PCR

cont

Page 49: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Modifikasi PCR

Hot Start PCR• Prinsip : dipanaskan hingga temperatur maksimal saat siklus pertama

( DNA polimerase dimasukkan saat sudah siap untuk sintesis DNA atau dimasukan kedalam beads atau kapsul)

• Digunakan untuk sampel yang berjumlah sedikit.

Touch – Down PCR• Prinsip : menggunakan suhu maksimal penggabungan dan kemudian

dikurangi secara perlahan baru dilakukan sintesis DNA.• Digunakan untuk mengurangi kesalahan saat penggabungan template

DNA dan primer saat menggunakan suhu dibawah maksimal.

Nested PCR• Prinsip : Hasil dari PCR pertama digunakan untuk template PCR kedua

kemudian primer akan disesuaikan dengan template PCR pertama.

Page 50: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Hard Copies

• Digunakan jika tidak ada restriction area yang jelas pada DNA template

• Cara lain adalah menggunakan enzim Topoisomerase I untuk mengenalkan site pada primer yang ada

Page 51: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Inverse PCR

• Melakukan PCR dengan membuat template DNA yang diinginkan berada pada daerah luar

Reverse Transcriptase PCR

Digunakan untuk memperbanyak molekul RNA

Prinsip melakukan reverse transcription dengan menggunakan enzim reverse transcription dan primer tunggal untuk membentuk cDNA

Page 52: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

In Situ PCR

• Menggunakan jaringan permeabel• Digunakan untuk mengetahui lokasi DNA pada suatu jaringan

Mutagenesis

• Digunakan untuk merancang primer yang sesuai dengan DNA yang sudah termutasi

Asymetric PCR

• Digunakan untuk memilih untai DNA yang ingin diperbanyak

Emulsion PCR

• Menggunakan droplet sebagai tempat PCR dan temperatur bisa diatur dengan mudah

Isothermal Amplification• Menggunakan suhu yang konstan pada 650C dengan alat LAMP ( Loop-

Mediated Isothermal Amplification)• Digunakan untuk mendeteksi patogen diluar laboratory khusus dengan mesin

PCR yang mahal

cont

Page 53: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Quantitative PCR

Menggunakan PCR standar dan visualisasi menggunakan gel elektroforesis dibandingkan dengan standar yang ada

DNA yang dihasilkan akan terfluoresens oleh binding dye yang nantinya akan diukur

Menggunakan RT-PCR

Ketika probe yang

mengandung pewarna (reporter) menempel

pada daerah yang

diamplifikasi dan

kemudian akan

bergerak dan akhirnya

terletak pada oligonukleotida yang sama dan akhirnya

berhenti berfluoresen

s

Dibatasi oleh primer yang tersedia karena

baru bisa diukur setelah semua siklus

terjadi

Page 54: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Anchored PCR

• Digunakan ketika hanya satu daerah sekuens yang diketahui

• Hasil yang didapat akan menjadi primer yang daerah tempat primer yang kedua

• Dua metode :1. Memotong menjadi fragmen

dengan susunan molekul yang diketahui

2. Memasang buntut enzymatic pada sampel DNA yang atau molekul yang diproduksi pada ronde pertama

Page 55: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

APLIKASI PCR• Dengan adanya ddNTPs (dideonucleoxyde

triphospates) memungkinkan reaksi DNA sequencing berjalan sukses dengan jumlah template yang sedikit

DNA sequencing

• Digunakan untuk mendiagnosa penyakit atau kontaminasi makanan, contoh : sickle cell anemia

Diagnostic

• Dapat menggandakan jumlah DNA yang sangat kecil seperti rambut untuk identifikasi

Forensic

• Bisa memperbanyak DNA dalam jumlah besar sehingga bisa memperkirakan kekerbatan dari organisme yang ada

Present – Day Population Genetics

• Bisa menggandakan sampel – sampel yang sudah tua

Arkeologi and Evolution

Page 56: Teknik Modifikasi dan Mutasi Gen  Teknologi Bioproses Universitas Indonesia

Daftar Sumber

Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation. New York: Cambridge University Press

Primrose, S.B, dkk. 2001. Principles of Gene Manipulation. Italy: Blackwell Science

Prasetyo, Afiono Agung. 2008. Transformasi Metode Elektroporasi, CaCl2, dan Menyiapkan Sel Kompeten. http://afie.staff.uns.ac.id, diakses pada 12 September 2013 pukul 20:23

Anonim. Physical method of nucleid acid transfer: general concepts and aplication. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Diakses pada 12 September pukul 20:51