teknik inokulasi mikroorganisme

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu

biakan yang murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari

luar. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran

terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan

biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium

agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan

mikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan (Dwijoseputro, 1998).

Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari medium

yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan

demikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untuk

pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik inokulasi biakan

mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari mikrobiologi dengan satu kultur

murni saja.

1.2 Permasalahan

Permasalahan yang akan dibahas dalamp raktikum ini adalah bagaimana

mempelajari teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril.

1.3 Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik inokulasi biakan

mikroorganisme pada medium steril

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pemindahan biakan

Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan

segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik

aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulangkali.

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldu

menunjukkan terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk

pada dasar tabung maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu

pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel (Lay, 1998).

Pertumbuhan mikroorganisme dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas

metabolismenya. Mikroba aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karena

pada bagian ini kandungan oksigen tinggi. Selain dalam media cair, mikroorganisme juga

memperlihatkan pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring

atau lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murni

sedangkan agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan mikroorganisme (Lay,

1998).

2.2 Inokulasi

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan

bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat

tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar

semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar

menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998).

Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman

bakteri (inokulasi) yaitu :

1. Menyiapkan ruangan

Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak

terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan .dalam labotarium pembuataan

serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca

(encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan

agar tekena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986).

2. Pemindahan dengan dengan pipet

Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil

1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986).

3. Pemindahan dengan kawat inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh lurus juga

boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri

kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala

api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986).

2.3 Teknik Inokulasi

Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni

mikroorganisme yaitu :

2.3.1 Metode gores

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi

memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang

sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan

media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara

garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh

menjadi koloni (Winarni, 1997).

Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila

dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang

berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat

goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan (Kus Irianto, 2006)

Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni :

a. Goresan T

b. Goresan kuadran

c. Goresan Radian

d. Goresan Sinambung

2.3.2 Metode tebar

Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan

petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu

disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan

pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada

beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah (Winarni, 1997).

…………… ………………………………

2.3.3 Metode tuang

Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan

pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya

ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).

2.3.4 Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum

ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni,

1997).

2.4 Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri

Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah :

1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk seperti

benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan mudah sekali tumbuh di dalam

suatu media.

2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose yang

berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif banyak

(Rohimat, 2002).

2.5 Macam-Macam Media

Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :

1.Mixed culture: berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme

2. Plate culture: media padat dalam petridish

3. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi

4. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan cara

penusukan.

5. Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.

6. Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok.

(Dwijoseputro, 1998).

2.6 Cara menyelidiki Piaraan Murni

Dalam keadaan sebenarnya ( di alam bebas ) boleh dikatakan tidak ada bakteri yang

hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatan

bersama-sama bakteri saproba. Untuk menyendirikan suatu spesies ada dikenal beberapa

cara, yaitu :

1. Dengan pengenceran

Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies

diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran inii kemudian diambil sampel 1 ml

untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk

disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita

hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu

koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni. Kalau kita

belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang

pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Waluyo, 2005).

Gambar 1. Teknik Pengenceran

2. Dengan Penuangan

Robert koch ( 1943-905 ) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil

sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian

disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian

diperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang

beberapa jam kemudian nampaklah koloni – koloni yang masing – masing dapat dianggap

murni. Denagn mengulang pekerjaan seperti di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan

murni yang lebih terjamin (Waluyo, 2005).

3. Dengan Penggesekan

Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, hanya

sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat rumbuh. Jika ujung kawat

inokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah disentuhkan suatu

koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian

(kurang lebih 12 jam) akan nampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaan

medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil,

maka akan diperoleh suatu piaraan murni (Waluyo, 2005).

4. Dengan Mengucilkan Satu Sel ( Single Cell Isolation )

Mikropipet adalah alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak,

dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Mikropipet ditempatkan pada tangan – tangan suatu

mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca

penutup. Pekerjaan ini dilakuan di bawah obyektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesan

hanya mengandung satu bakteri, maka dengan lain mikropipet, tetesan tersebut

dipindahkan ke medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berkembang biak

dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh piaraan murni. Meode ini sangat memerlukan

kesabaran, lagipula mikromanipulator sangat mahal (Waluyo, 2005).

5. Dengan Inokulasi Hewan

Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat

tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari seseorang yang

disangka menderita tbc. Jika dahak ini disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, maka

bakteri – bakteri �aprobe yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita

peroleh semata – mata hasil tbc saja. Piaraan pneumococcus murni dapat diperoleh dengan

jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati

akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai.

Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit ( intracutaneous ), dapat di bawah kulit

( subcutaneous), dapat di dalam otot ( intramuscular), dapat di rongga tubuh atau lain-lain

tempat lagi (Waluyo, 2005).

2.7 Teknik Aseptik

Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali kita

harus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi. Mikroorganisme ada

dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka mudah lepas dalam udara dan

permukaan. Maka dari itu, kita harus mensterilisasikan medium kultur secepatnya setelah

preparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh.

Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk tindakan pencegahan sampai penanganan

berikutnya mediun kultur harus tetap steril. Demikian materi yang lain yang akan kontak

juga harus tetap terjaga kesterilannya (Cappuccino, 1983).

Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasi

dan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu dibutuhkan keberhasilan

dalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar dengan pendamping

mikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah karena udara selalu kontak

dengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas mikroorganisme didalamnya.

Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak terkontaminasi dengan udara sekitar.

Transfer aseptik pada kultur dari salah satu medium ke medium yang lain harus lihai

dengan loop inokulasi atau jarum harus disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam

pertumbuhan kultur dibutuhkan tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar,

dimana pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal

(Cappuccino, 1983).

Gambar 2. Teknik Aseptik

2.8 Escherichia coli

Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili

Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E.

coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan

manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli

merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare

lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat

dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi

patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).

Klasifikasi

Kingdom : Bakteria

Filum : Proteobacteria

Kelas : Gamma Proteobacteria

Order : Enterobacteriales

Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escheriachia

Spesies : E. coli

Escherichia coli biasanya hidup di dalam intestinum pada manusia ataupun hewan,

memiliki gram negative, dan fakultatif anaerob. Merupakan makhluk prokariot. Pada

kondisi tertentu bisa menjadi pathogen atau dapat menyebabkan penyakit. Dan bakteri ini

juga dapat menyebabkan keracunan makanan, dan yang paling sering adalah dapat

menyebabkan diare serta beberapa penyakit yang sejenis (Anonim, 2008).

Escherichia coli memproduksi racun yang berbahaya di lapisan intestinum. Bila

terjadi desakan pada intestinum maka akan menghasilkan racun tersebut untuk

menkontaminasi daging dan susu. Escherichia coli merupakan mikroorganisme normal

yang berasal dari kotoran hewan atau manusia baik dalam kondisi sehat maupun sakit.

Oleh karena itu, dikenal juga dengan istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechia

coli berupa batang pendek (0,5-1,0 X 1,0-3,0 µm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaitu

flagela secara merata tersebar diseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciri-

ciri biokimiawinya adalah banyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan ini

memberikan cara-cara dasar untuk membedakannya dengan yang lain. Habitatnya pada

lingkungan aquatik, tanah, makanan, air seni dan tinja (Pelczar, 1986).

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Alat yang dipergukan dalam percobaan ini adalah jarum ose, tabung reaksi, lampu

spiritus, penangas air, cawan Petri, dan inkubator.

3.1.2 Bahan

Bahan yang dipergunakan daalm praktikum ini yaitu kapas lemak dan media agar

yanng telah disterilkan.

3.2 Cara kerja

3.2.1 Metode Gores (Streak Plate Method) pada Media Agar Miring

- Ditulis nama spesies mikroorganisme, tanggal serta nama praktikan ditulis

pada tabung reaksi.

- Biakan induk dalam tabung reaksi dan media agar miring yang telah

disterilkan diletakkan pada telapak tangan kiri.

- Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara.

- Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking.

- Disumbat kapas pada biakan induk ditutup.

- Disumbat kapas media agar miring yang akan diinokulasi mikroorganisme

dibuka dengan cara yang sama dengan langkah 4. Kemudian ujung jarum

ose yang sudah mengandung mikroorganisme digeserkan dengan hati-hati

di atas permukaan agar, dimulai dari dasar tabung secara zig-zag menuju

ke bagian atas tabung.

- Disumbat kapas ditutup secepatnya pada media yang telah diinokulasi.

dipanaskan ujung jarum ose kembali sampai membara untuk

memusnahkan mikroorganisme yang masih menempel.

- Disimpan biakan yang baru diinokulasi dalam inkubator. Diamati,

digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri.

Hasil

Tabung Reaksi

3.2.2 Metode Gores (Streak Plate Method) pada Media Agar Datar

- Ditulis nama spesies mikroorganisme, tanggal serta nama praktikan pada

cawan petri.

- Biakan induk dalam tabung reaksi diletakkan pada telapak tangan kiri.

- Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara.

- Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking.

- Disumbat kapas pada biakan induk ditutup.

- Dipanaskan pinggiran cawan petri untuk proses sterilisasi cawan petri

- Dibuka sedikit tutup cawan petri dengan tetap melakukannya di dekat api

bunsen.

- Digeserkan ujung jarum ose yang sudah mengandung mikroorganisme

dengan hati-hati di atas permukaan agar, dimulai dari atas permukaan

secara zig-zag menuju ke bagian bawah (goresan T dan kuadran).

- Ditutup secepatnya pada media cawan petri yang telah diinokulasi.

dipanaskan ujung jarum ose kembali sampai membara untuk

memusnahkan mikroorganisme yang masih menempel.

- Disimpan biakan yang baru diinokulasi dalam inkubator. Diamati,

digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri.

Hasil

Tabung Reaksi

3.2.3 Metode taburan (Pour Plate Method)

- Dicairkan medium bakteri di atas penagas air dan didinginkan sampai

suhu 50°C.

- Dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptic dan dibiarkan sampai

padat.

- Diencerkan susupensi bahan yang mengandung mikroorganisme seencer

mungkin dan diteteskan secara aseptic.

- Diratakan dengan digoyang seperti angka delapan.

- Ditutup cawan petri dan diberi label, kemudian diinkubasi dalam keadaan

terbalik dalam incubator selama 24-48 jam masa inkubasi

Medium Biakan

Hasil

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

4.1.1. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar)

No. Perlakuan Pengamatan

1. Disiapkan media biakan induk dari

jenis mikroorganisme :

Bakteri : Escherichia coli

- Diberikan pada 2 sampel medium,

menggunakan goresan kuadran dan

goresan T

- Pada medium biakan induk, koloni

bakteri tampak berwarna putih

2. Medium NA pada tabung reaksi yang

telah disterilkan, dipanaskan di atas

kompor listrik selama 10-15 menit

- Medium berwarna bening

kekuningan

- Pemanasan bertujuan untuk

mencairkan media sehingga dapat

dituangkan untuk media agar datar

pada cawan petri

3.

Disediakan dua buah cawan petri dan

sekeliling pinggirnya dipanaskan dekat

api bunsen

- berfungsi untuk mensterilisasi cawan

petri dari kontaminan

mikroorganisme yang lain

4. Dituangkan Medium NA panas ke

dalam cawan petri steril

- berfungsi sebagai tempat

menggoreskan bakteri dan tempat

pertumbuhan koloni bakteri

5. Didiamkan selama beberapa menit

cawan petri yang telah diberi medium

NA panas

- berfungsi agar medium NA menjadi

padat seperti agar

6. Di panaskan jarum ose hingga

membara

- berfungsi untuk mensterilisasi jarum

sehingga tidak ada mikroorganisme

lain yang menempel disana.

7. Dibuka sumbat kapas tabung reaksi

yang berisi isolat biakan induk,

kemudian dipanaskan bibir tabung

- berfungsi untuk mensterilisasi tabung

dan biakan dari mikroorganisme lain

8. Dimasukkan jarum ose bulat pada

medium biakan induk jarum ose untuk

inokulasi bakteri

pengambilan inokulum dengan

menggoreskan ujung bulat pada jarum ke

media biakan induk, memungkinkan

bakteri dapat terambil banyak

9. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang

berisi isolat biakan induk, kemudian

segera ditutup dengan sumbat kapas



10. Setiap perlakuan di usahakan dilakukan

secara aseptis (di dekat api bunsen)

- berfungsi agar saat inokulasi, bahan

serta alat gelas yang digunakan tetap

steril

11. Digoreskan inokulum di permukaan

media agar di dalam cawan petri yang

telah disediakan menggunakan metode

gores mulai dari sisi samping secara

merata. Metode gores yang dipakai

meode T dan kuadran

- Media agar untuk bakteri digunakan

media NA (Nutrien Agar), fungsi

penggunaan medium NA karena

komposisinya yang terdiri dari

ekstrak daging sapi didalamnya yang

mengandung protein, karbohidrat,

vitamin, dan sedikit lemak, juga

terdapat adanya faktor pertumbuhan

yang tidak mampu disintesis

mikroorganisme

- Agar koloni yang terbentuk tersebar

merata, tampak jelas dan tidak

bertumpukan

12. Ditutup cawan petri dan dipanaskan

kembali sekeliling cawan petri dan

diisolasi dengan selotip bening

- berfungsi untuk mensterilisasi cawan

petri dan biakan dari

mikroorganisme lain

13. Inokulum cawan petri diinkubasi di

inkubator pada suhu 370C

- sebagai tempat penyimpanan steril

cawan petri dengan menyeting suhu

optimum bakteri untuk tumbuh

14. Disimpan inokulum ke dalam inkubator

dengan posisi terbalik, diamati dan

difoto bentuk koloni yang terbentuk

setelah diinkubasi selama 2 x 24 jam

dan 4 x 24 jam

Posisi cawan petri terbalik untuk

menghindari uap air hasil metabolisme

bakteri akan menetes dari tutup cawan

ke permukaan media. Hal ini akan

menghasilkan suatu masa pertumbuhan

yang menganak sungai dan

menghancurkan pembentukan koloni

secara individu. Sehingga untuk

menghindari hal ini, maka ketika

diinkubasi, bagian bawah cawan petri

diletakkan di atas atau terbalik

15. Setelah diinkubasi selama 2x 24 jam

a. Sampel 1:

b. Sample 2:

- tidak terbentuk koloni bakteri karena

tidak nampak goresan putih menyebar

- tidak terbentuk koloni bakteri karena

tidak nampak goresan putih menyebar


a. Sampel 1:

b. Sampel 2:

- belum terbentuk koloni bakteri

dengan jumlah lebih banyak karena

belum terdapat goresan yang

nampak jelas

- belum terbentuk koloni bakteri

dengan jumlah lebih banyak karena

belum terdapat goresan yang

nampak jelas

4.1.2 Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring)

No. Perlakuan Pengamatan

1. Disiapkan media biakan induk dari

jenis mikroorganisme :

Bakteri : Escherichia coli

- Masing-masing biakan induk berada di

tabung reaksi yang berisi media agar

miring yang berwarna kuning

- Pada medium biakan induk koloni

bakteri tampak berwarna putih

- Diberikan pada 3 sampel media

2.

Disediakan tiga buah tabung reaksi

steril berisi medium agar padat

- Medium agar miring berwarna

kekuningan

- berfungsi sebagai tempat

menggoreskan bakteri maupun jamur

dan tempat pertumbuhan koloni

bakteri maupun jamur

3. Di panaskan jarum ose hingga

membara

- berfungsi untuk mensterilisasi jarum

sebelum digunakan dari

mikroorganisme lain

4. Dibuka sumbat kapas tabung reaksi

yang berisi isolat biakan induk,

kemudian dipanaskan bibir tabung



5. Dimasukkan jarum ose bulat pada

medium biakan induk untuk inokulasi

bakteri

- pengambilan inokulum dengan

menggoreskan ujung bulat pada jarum

ke media biakan induk,

memungkinkan bakteri dapat terambil

banyak

6. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang

berisi isolat biakan induk, kemudian

segera ditutup dengan sumbat kapas



7. Setiap perlakuan di usahakan dilakuan

secara aseptis (di dekat api bunsen)

- berfungsi agar saat inokulasi, bahan

serta alat gelas yang digunakan tetap

steril

5. Digoreskan inokulum di permukaan

media agar di dalam tabung reksi yang

telah disediakan menggunakan metode

gores mulai dari sisi samping arah zig

– zag secara merata

- Media agar untuk bakteri digunakan

media NA (Nutrien Agar), fungsi

penggunaan medium NA karena

komposisinya yang terdiri dari ekstrak

daging sapi di dalamnya yang

mengandung protein, karbohidrat,

vitamin, dan sedikit lemak, juga

terdapat adanya faktor pertumbuhan

yang tidak mampu disintesis

mikroorganisme

- Digunakan arah zig – zag agar

memungkinkan koloni yang terbentuk

tersebar merata, tampak jelas dan tidak

bertumpukan

6. Dipanas di sekeliling mulut tabung

dan segera ditutup dengan sumbat

kapas


reaksi dan biakan dari mikroorganisme

lain

7. Disimpan inokulum ke dalam

inkubator pada suhu 370C , diamati

dan difoto bentuk koloni yang

terbentuk setelah diinkubasi selama 2x

24 jam dan 4 x 24 jam

- sebagai tempat penyimpanan steril

cawan petri dengan menyeting suhu

optimun bakteri untuk tumbuh


a. Sampel 1:

b. Sampel 2:

c. Sampel 3:

- Terbentuk koloni bakteri dengan

jumlah yang tidak dapat dihitung,

terdapat goresan putih menyebar yang

nampak jelas.

- Koloni terbentuk dengan goresan putih

zig-zag agak menyebar




a. Sampel 1:

b. Sampel 2:

- Terbentuk koloni bakteri dengan jumlah

lebih banyak dan sebagian dapat

dihitung, terdapat goresan putih

menyebar yang nampak jelas



c. Sampel 3:



4.2. Pembahasan

Pada percobaan ini dilakukan inokulasi bakteri Escherichia coli pada medium agar

datar dan medium agar miring.

4.2.1. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar)

Pada penggunaan metode gores dengan medium agar datar, mula –mula disiapkan

media biakan induk dari jenis mikroorganisme bakteri Escherichia coli.

Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama

bakteri gram negatif. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa

digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk

dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam

penanganannya.

Biakan induk berada di tabung reaksi yang berisi media agar miring berwarna

kuning. Pada medium biakan induk, koloni bakteri tampak berwarna putih. Disediakan

sebuah cawan petri steril berisi medium agar padat (medium agar yang sebelumnya telah

dipanaskan, dituagkan pada cawan petri steril, kemudian didiamkan untuk proes

pendingina). Medium agar datar ini berwarna kekuningan, berfungsi sebagai tempat

menggoreskan bakteri dan tempat pertumbuhan koloni bakteri. Selanjutnya dipanaskan

jarum ose hingga membara, berfungsi untuk mensterilisasi jarum sebelum digunakan dari

mikroorganisme lain. Sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka,

kemudian dipanaskan bibir tabung, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari

mikroorganisme lain. Kemudian dimasukkan jarum ose pada medium biakan induk dimana

yang digunakan adalah jarum ose bentuk bulat, pengambilan inokulum dengan

menggoreskan ujung bulat pada jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri

dapat terambil banyak. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk,

berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme udara lain. Setelah

itu tabung reaksi segera ditutup dengan sumbat kapas. Digunakan sumbat kapas disini

karena sifatnya yang dapat menyerap uap air, yang terjadi ketika masa inkubasi. Setiap

perlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen) berfungsi agar saat

inokulasi, tidak ada mikroorganisme kontam. Sebelum inokulasi juga terlebih dahulu harus

diusahakan agar semua alat-alat yang digunakan dan medium benar-benar steril. Hal ini

untuk menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan.

Gambar 3. Metode Inokulasi pada Cawan Petri

Selanjutnya digoreskan inokulum di permukaan media agar di dalam cawan petri

yang telah disediakan dengan menggunakan metode gores mulai dari sisi samping secara

merata.

Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar), fungsi penggunaan

medium NA karena komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi didalamnya yang

mengandung protein, karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor

pertumbuhan yang tidak mampu disintesis mikroorganisme. Ditutup cawan petri, dipanas

di sekeliling cawan petri dan diisolasi dengan selotip bening. Perlakuan ini berfungsi

untuk mensterilisasi cawan petri dari mikroorganisme lain. Disimpan inokulum ke dalam

inkubator dengan posisi terbalik, diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah

diinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam. Posisi cawan petri diletakkan terbalik karena

selama inkubasi terbentuk air yang mengembun di dalam cawan petri. Air akan menetes

dari tutup cawan ke permukaan. Hal ini akan menghasilkan suatu masa pertumbuhan yang

menganak sungai dan menghancurkan pembentukan koloni secara individu. Untuk

menghindari hal ini, maka ketika diinkubasi, bagian bawah cawan petri diletakkan di atas

atau terbalik .

Penggoresan inokulum pada media agar dilakukan untuk dua sampel. Sampel

pertama menggunakan goresan kuadran dan sampel ke 2 goresan T.

Gambar 4. Metode Gores pada Cawan Petri

Dari hasil pengamatan 2 x 24 jam dapat dilihat tidak terbentuknya koloni bakteri

dengan tidak adanya goresan putih meyebar zig-zag pada permukaan medium NA, dengan

kata lain bakteri belum tumbuh pada jangka waktu ini.

Setelah diinkubasi selama 4x 24 jam koloni Escherichia coli masih juga belum

terbentuk, belum terlihat adanya streak putih zig-zag menyebar.

Berikut gambar perbandingan antara koloni bakteri Escherichia coli yang terbentuk

dari sumber referensi dibandingkan dengan hasil pengamatan :

-Terbentuk koloni (Anonim, 2008) -Hasil pengamatan 96 jam (tidak terbentuk koloni)

Goresan Kuadran Goresan T

Dari hasil pengamatan, pada kedua perlakuan dengan waktu yang berbeda, tidak

ditemukan koloni yang terbentuk. Tidak terbentuk koloni bakteri bisa disebabkan adanya

bahan kontaminan yang masuk saat inokulasi, penggunaan jarum ose belum benar – benar

steril / belum tersterilisasi secara keseluruhan.

Metode gores yang dilakukan pada percobaan ini dengan menggunakan cawan petri.

Cawan petri ini berfungsi berfungsi sebagai tempat madium agar datar untuk penanaman

mikroorganisme dan tempat isolasi. Keuntungan penggunaan cawan petri adalah untuk

memperoleh biakan dengan jumlah yang banyak dan lebih mudah untuk melihat morfologi

biakan.

Medium yang digunakan adalah Nutrient Agar yang sebelumnya dipanaskan agar

bisa membentuk medium. Agar lalu didinginkan dalam tabung reaksi hingga memadat dan

berwarna kuning muda sehinnga membentuk agar tegak. Medium agar tegak adalah

medium yang dibuat dalam tabung reaksi yang diletakkan tegak pada waktu pendinginan.

Keuntungan dari media agar tegak ini adalah luas permukaan besar sehingga memudahkan

untuk identifikasi sedangkan kerugiannya adalah peluang kontaminasi yang besar karena

luas permukaan yang lebar.

4.2.2. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring)

Untuk penggunaan metode gores dengan medium agar miring, mula-mula disiapkan

media biakan induk dari jenis mikroorganisme bakteri Escherichia coli. Biakan induk

berada di tabung reaksi yang berisi media agar miring yang berwarna kuning. Pada

medium biakan induk, koloni tampak berupa sebaran/suspensi putih pada permukaan atas

media. Disediakan tiga buah tabung reaksi steril berisi medium agar padat. Medium agar

miring berwarna kekuningan berfungsi sebagai tempat menggoreskan jamur dan tempat

pertumbuhan koloni jamur. Jarum ose dipanaskan hingga membara berfungsi untuk

mensterilisasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain. Sumbat kapas tabung

reaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka, kemudian bibir tabung dipanaskan berfungsi

untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain.

Setelah itu, jarum ose dimasukkan pada medium biakan induk. Jarum ose bentuk

bulat untuk inokulasi bakteri. Pengambilan inokulum dengan menggoreskan ujung bulat

jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak. Mulut

tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dipanaskan kembali, berfungsi untuk

mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain. Kemudian segera ditutup

dengan sumbat kapas Sumbat kapas lemak bertujuan agar keadaan mikroorganisme di

dalam tabung reaksi tetap steril, apabila ada kontaminan yang akan masuk, maka dapat

terserap dengan sumbat kapas tanpa dapat mempengaruhi mikroorganisme yang akan

dibiakkan.

Gambar 5. Teknik Inokulasi pada Media Miring

Setiap perlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen)

berfungsi agar saat inokulasi, bahan serta alat gelas yang digunakan tetap steril. Inokulum

digoreskan di permukaan media agar miring di dalam tabung reksi yang telah disediakan

menggunakan metode gores mulai dari sisi samping arah zig-zag. Arah zig-zag digunakan

supaya memungkinkan koloni yang terbentuk tersebar merata dan tampak jelas serta tidak

bertumpuk dari koloni yang akan terbentuk. Dipanas di sekeliling mulut tabung dan

segera ditutup dengan sumbat kapas berfungsi untuk mensterilisasi tabung reaksi dan

biakan dari mikroorganisme lain. Inokulum disimpan ke dalam inkubator agar medium

dapat tumbuh pada wadah yang steril dengan menyeting suhu 370C sebagai suhu optimun

bakteri untuk tumbuh, kemudian diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah

diinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam. Berikut gambar perbandingan antara koloni

bakteri Escherichia coli yang terbentuk dari sumber lain dengan hasil pengamatan

-Terbentuk koloni (Anonim, 2008) -Hasil pengamatan 96 jam (terbentuk koloni)

Dari hasil pengamatan dapat dilihat mulai terbentuknya satu koloni bakteri dan

terdapat goresan yang nampak samar. Pada suatu percobaan pada umumnya bentuk koloni

yang terbentuk di medium agar miring adalah berwarna putih (dilihat dari tiga sampel yang

diamati).

Medium yang digunakan adalah larutan Nutrient Agar yang sebelumnya

dipanaskan agar bisa membentuk medium miring yang didinginkan hingga memadat

dengan memiringkan tabung reaksi sehinnga membentuk agar miring dan berwarna kuning

muda. Medium agar miring adalah medium yang dibuat dalam tabung reaksi yang

diletakkan miring pada waktu pendinginan.

Keuntungan media agar miring ini yaitu luas permukaan yang kecil sehingga

peluang kontaminasi rendah dan dapat memperluas bidang untuk digunakan strain murni

(indukan murni). Sedangkan kerugiannya hanya memuat sedikit mikroorganisme.

Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar) karena

komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi di dalamnya yang mengandung protein,

karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor pertumbuhan yang

tidak mampu disintesis mikroorganisme. Medium NA berfungsi untuk membiakkan

berbagai macam mikroorganisme serta kultur bakteri. Medium NA dibuat atau disediakan

untuk medium bagi bakteri. Sedangkan medium NA yang instant merupakan media non

sintetik karena menggunakan bahan yang terdapat di alam biasanya tidak diketahui

kandungannya secara rinci. Struktur protein besar dan relatif insolubel yang mana hanya

sebagian kecil bakteri saja yang dapat langsung menggunakannnya, tetapi enzim yang

disebut pepton dapat mengurai protein menjadi rantai yang lebih kecil yang disebut pepton.

Bagian kecil dan solubel ini dapat dicerna oleh sebagian besar bakteri. Medium ini

memiliki komposisi kimia tertentu antara lain OXOID CMD003 Nutrient Agar, typcal

formula (g/l) yaitu :Lab-lemco powder 1.0, Yeast extract 2.0 (yang berfungsi sebagai

fermentor), Pepton 5.0 (sebagai sumber protein), Sodium Chlorida 5.0 (sebagai sumber

unsure S dan sumber garam mineral), Agar 15.0 (sebagai pemadat), Akuades

1000 ml, Ekstrak daging sapi : 3 gr, NaCl : 8 gr.

Pada praktikum ini kita mempelajari bagaimana melakukan teknik inokulasi biakan

mikroorganisme pada medium steril. Sehingga setelah melakukan serangkaian acara

praktikum ini dapat didefinisikan bahwa teknik inokulasi adalah pekerjaan memindahkan

bakteri dari medium lama ke medium baru dengan tingkat ketelitian sangat tinggi dan

dituntut sekali bekerja secara aseptik yaitu bebas dari pengaruh kontaminan

mikroorganisme pengganggu yang lain. Teknik aseptik dilakukan dengan penyediaan alat-

alat kerja yang steril dan bekerja di dekat api bunsen agar terhindar dari kontaminan udara.

Pada waktu inokulasi, jarum yang digunakan untuk memindahkan mikroba harus

dipijarkan di atas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini

menghancurkan semua bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat

pemindahan. Setelah diinokulasi, biakan bakteri disimpan atau diinkubasi dalam

lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan. Kumpulan dari sel-sel anakan akan tampak

dengan mata telanjang sebagai suatu kekeruhan dalam media cair atau populasi yang

terpisah yang disebut koloni pada media padat.

4.2.4 Esherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri yang hidup dalam saluran usus manusia dan hewan

berdarah panas tetapi tidak pada ikan. Beberapa penelitian terdahulu menemukan bahwa

92,9 % Escherichia coli yang mencemari bahan makanan berasal dari tinja manusia.

Sehingga keberadaannya pada bahan makanan atau ikan segar menunjukkan adanya

ancaman kesehatan pada konsumen (manusia), sebab dapat diartikan bahwa bahan

makanan atau ikan telah tercemar oleh tinja manusia. Oleh karenanya maka, Escherichia

coli dipakai sebagai indikator cemaran yang berbahaya bagi manusia (Buckle, dkk. 1990).

Klasifikasi :

Superdomain:Phylogenetica

Filum:Proteobacteria

Kelas:GammaProteobacteria

Ordo:Enterobacteriales

Famili:Enterobacteriaceae

Genus:Escherichia

Spesies: E. coli

(Wikipedia, 2008)

Escherichia coli merupakan mikroorganisme normal yang berasal dari kotoran

hewan atau manusia baik dalam kondisi sehat maupun sakit. Oleh karena itu, dikenal juga

dengan istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechia coli berupa batang pendek (0,5-

1,0 X 1,0-3,0 µm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaitu flagela secara merata tersebar

diseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciri-ciri biokimiawinya adalah

banyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan ini memberikan cara-cara dasar

untuk membedakannya dengan yang lain. Habitatnya pada lingkungan aquatik, tanah,

makanan, air seni dan tinja (Pelczar, 1986).

Pada jurnal imiah analisa bakteri kloriform jenis E.coli pada air minum dilakukan

tes pelengkap menggunakan metode medium agar miring NA dengan jarum inokulasi

secara aseptik. Diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positif

terbentuk asam dan gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung bakteri

Escherichia coli. Berdasarkan media agar miring NA, dibuat pewarnaan Gram dimana

bakteri Escherichia coli menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk

membedakan bakteri golongan koli dari bakteri golongan coli fekal (berasal dari tinja

hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu

370C (untuk golongan koli ) dan satu seri diinkubasi pada suhu 420C (untuk golongan koli

fekal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C, sedangkan

golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C (Widiyanti et al, 2004).

BAB V

KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka dapat diperoleh kesimpulan

bahwa teknik inokulasi merupakan teknik pemindahan bakteri ke dalam media dengan

perlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian biakan bakteri. Teknik inokulasi

dapat dilakukan dengan metode gores pada agar datar (streak plate method) dan metode

gores pada agar miring (streak plate method). Proses inokulasi harus benar-benar aseptik

atau steril supaya tidak terjadi kontaminasi oleh mikroorganisme lain. Pada hasil

pengamatan metode gores agar miring terlihat adanya garis zig-zag putih menyebar yang

menandakan koloni bakteri E.coli biakan tumbuh. Sedangkan pada metode gores agar datar

tidak ditemukan garis zig-zag putih yang menandakan belum tumbuhnya koloni bakteri

E.coli dan hal ini dapat dikarenakan oleh beberapa faktor penentu.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2008. www.google.com.images diakses pada tanggal 10 Nopember 2008 pukul

13.40 WIB

Anonim, 2008. www.wikipedia.com diakses pada tanggal 10 Nopember 2008 pukul 13.40

WIB

Buckle,K.A., J.A. Davey, M.J. Eyles, A.D. Hocking, K.G. Newton, and E.J. Stuttard.

1989. Foodborne Microorganisms of Public Health Significance. 4ed.. AIFST

(NSW Branch).Australia.

Cappuccino, J.G and N.Sherman. 1983. Microbiology: a Laboratory Manual. Adison-

Wesley Publishing company: California

Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang.

Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta.

Rohimat, I. 2002. Teknik Inokulasi Mycorrhizae arbuscular pada Bibit Jambu Mente. Buletin Teknik Pertanian Vol.7 Nomor 2. Hal : 80-83.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang.

Winarni, D. 1997. Diktat Teknik Fermentasi. Program Studi D3 Teknik Kimia FTI-ITS : Surabaya.

Widiyanti, Ni Luh Putu Manik, Ni Putu Ristianti. Analisis Kualitatif Bakteri Koliform

Pada Depo Air Minum Isi Ulang Di Kota Singaraja Bali. Jurnal Ekologi

Kesehatan Vol 3 No 1, April 2004 : 64 - 73

LAMPIRAN

Diskusi:

1. Mengapa pada saat dilakukan inokulasi bakteri pada media agar miring dimulai

dari dasar tabung menuju ke bagian atas tabung secara zig-zag?

2. Mengapa biakan yang baru diinokulasi harus disimpan dalam inkubator dalam suhu

tertentu?

Jawaban:

1. Supaya pertumbuhan bakteri tersebar pada seluruh bagian permukaan media dan

dilakukan secara zig-zag supaya pertumbuhan bakteri semakin banyak karena

penggoresan juga semakin banyak dan terjadi degradasi, pada akhir goresan akan

semakin jarang dan tampak bentukan koloninya.

2. Supaya biakan bakteri dapat tumbuh secara optimal sesuai dengan suhu yang

dibutuhkan. Karena tiap jenis bakteri membutuhkan suhu yang berbeda-beda dalam

pertumbuhannya, ada yang 1800C ada pula yang kurang dari 1000C.

teknik inokulasi mikroorganisme

Documents

Transcript of teknik inokulasi mikroorganisme