A. Spektrofotometer Uv-Vis

1. Pendahuluan

Gambar 1. Spektrofotometer Uv-Vis

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang

digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan

kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang

digunakan dalam spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud

dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa

atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.

Dalam interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi

elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan

sehingga dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun

spektroskopi emisi. Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi

penyerapan cahaya, baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga

spektrofotometri disebut juga sebagai spektroskopi absorbsi.

Spektrofotometri UV-Vis merupakan gabungan antara spektrofotometri UV

dan Visible. Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya yang berbeda, yaitu

sumber cahaya UV dan sumber cahaya Visible. Larutan yang dianalisis diukur

serapan sinar ultra violet atau sinar tampaknya. Konsentrasi larutan yang dianalisis

akan sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terapat dalam larutan

tersebut.

Warna yang diserap oleh suatu senyawa merupakan warna komplementer dari

warna yang teramati. Beberapa warna yang diamati dan warna komplementernya

terdapat pada tabel berikut ini :

Tabel 1. Spektrum Warna

Panjang

GelombangWarna Terlihat Warna Komplementer

<400 Ultraviolet -

400-450 Violet Kuning

450-490 Biru Jingga

490-550 Hijau Merah

550-580 Kuning Ungu

580-650 Jingga Biru

650-700 Merah Hijau

>700 Inframerah

2. Prinsip Kerja

Prinsip kerja pada spektrofotometer uv-vis berdasarkan adanya interaksi

antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu.

Spektrofotometri uv-vis mengacu pada hukum Lambert-Beer. Apabila cahaya

monokromatik melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya tersebut akan

diserap, sebagian dipantulkan dan sebagian lagi akan dipancarkan.

Bunyi Hukun Lambert-Beer : “Jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet,

inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu

larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal

larutan”.

Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung

banyaknya cahaya yang hamburkan:

T=I tI 0

atau%T=I tI 0

x100 %

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus :

A=−logT=−logI tI 0

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya

setelah melewati sampel.

Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:

A=a .b . catau A=ε .b .c

dimana:

A = absorbansi

b = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)

c = konsentrasi larutan yang diukur

ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam

molar)

a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).

3. Bagian-Bagian Alat

Gambar 2. Skema Alat Spektrofotometer UV-Vis

a. Sumber cahaya

Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang

stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber cahaya pada spektrofotometer UV-Vis

ada dua macam :

1) Lampu Tungsten (Wolfram)

Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. Bentuk

lampu ini mirip dengna bola lampu pijar biasa. Memiliki panjang gelombang

antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya berupa garis lengkung. Umumnya

memiliki waktu 1000 jam pemakaian.

2) Lampu Deuterium

Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm. Spektrum energy

radiasinya lurus, dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada

daerah uv. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.

b. Monokromator

Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi

cahaya tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu.

Bagian-bagian monokromator, yaitu :

1) Prisma

Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya

di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis.

2) Grating (kisi difraksi)

Kisi difraksi memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi

sinar akan disebarkan merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi

akan lebih baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh

jangkauan spektrum.

3) Celah optis

Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan

dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi

akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang

diharapkan.

4) Filter

Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang

diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang

gelombang yang dipilih.

c. Kompartemen sampel

Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet. kuvet

merupakan wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis.

Pada spektrofotometer double beam, terdapat dua tempat kuvet. Satu kuvet

digunakan sebagai tempat untuk menaruh sampel, sementara kuvet lain

digunakan untuk menaruh blanko. Sementara pada spektrofotometer single beam,

hanya terdapat satu kuvet.

Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut :

1) Permukaannya harus sejajar secara optis

2) Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat di transmisikan

3) Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia

4) Tidak rapuh

5) Bentuknya sederhana

Terdapat berbagai jenis dan bentuk kuvet pada spektrofotometer. Umumnya pada

pengukuran di daerah UV, digunakan kuvet yang terbuat dari bahan kuarsa atau

plexiglass. Kuvet kaca tidak dapat mengabsorbsi sinar uv, sehingga tidak

digunakan pada saat pengukuran di daerah UV. Oleh karena itu, bahan kuvet

dipilih berdasarkan daerah panjang gelombang yang digunakan. Gunanya agar

dapat melewatkan daerah panjang gelombang yang digunakan.

UV : fused silika, kuarsa

Visible : gelas biasa, silika atau plastic

IR : KBr, NaCl, IRTRAN atau kristal dari senyawa ion

Tabel 2. Bahan Kuvet dan Panjang Gelombangnya

Bahan Panjang gelombang

Silika 150-3000

Gelas 375-2000

Plastik 380-800

d. Detektor

Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian

diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan

dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer).

Terdapat beberapa jenis detector pada spektrofotometer :

Tabel 3. Jenis Detektor Berdasarkan Panjang Gelombang

Jenis detector λ  range (nm) Sifat pengukuran Penggunaan

Phototube 150 – 1000 arus listrik UV

Photomultiplier 150 – 1000 arus listrik UV/Vis

Solid state 350 – 3000

Thermocouple 600 – 20.000 arus listrik IR

Thermistor 600 – 20.000 hambatan listrik IR

Syarat-syarat ideal sebuah detector adalah :

1) Mempunyai kepekaan tinggi

2) Respon konstan pada berbagai panjang gelombang

3) Waktu respon cepat dan sinyal minimum tanpa radiasi

4) Sinyal listrik ayng dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi

e. Visual display

Merupakan system baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik,

menyatakan dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi.

4. Cara Kerja

Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat

polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada

spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan

mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas-

berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang

mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya

yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini

kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang

diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap

sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan

diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif.

B. Elektroforesis Kapiler

1. Pendahuluan

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau

partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif,

biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik. Secara

teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang

bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya

teknik dari cikal-bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu

koloid. Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan

sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas

muatan ionik.

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada

pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik

dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan

bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk

memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi

tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Elektroforesis kapiler

menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion

atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik

pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh

tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta

konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun

boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal.

Gambar 3. Elektroforesis Kapiler

2. Prinsip Kerja

Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen

bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-)

pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil yang

didapatkan dari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan informasi

mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan

migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses kromatografi.

Gambar 4. Skema Elektroforesis

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa komponen yang bermuatan positif

akan bergerak searah dengan medan listrik menuju kutub negatif. Apabila dalam

campuran terdapat dua jenis komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2)

komponen netral (N), maka komponen negatif akan bergerak menuju kutub positif

(+) sedangkan komponen netral (N) akan tetap diam. Skema alat elektroforesis secara

sederhana dapat dilihat pada gambar di bawah ini. Pada gambar tersebut dapat dilihat

komponen yang bermuatan positif akan mengalir ke arah kutub negatif, sedangkan

komponen bermuatan negatif akan mengalir ke arah kutub positif.

3. Bagian-Bagian Alat

Gambar 5. Bagian Alat Elektroforesis Kapiler

a. Pipa kapiler

Pipa kapiler bertindak sebagai kolom tempat proses pemisahan pengganti kertas

atau agar-agar pada elektroforesis konvensional. Pipa kapiler terbuat dari gelas

dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 µm dan panjang antara 50-100 cm.

semakin kecil ukuran diameter pipa kapiler maka semakin besar harga N. Oleh

karena itu, semakin besar diameter (>100) maka pemisahan semakin tidak efisien.

b. Larutan buffer

Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut

tercelup dalam larutan buffer. Larutan buffer berfungsi sebagai larutan elektrolit

untuk menghantarkan arus listrik dan untuk pengontrol muatan molekul. Karena

molekul dapat bermuatan positif, negative, atau netral bergantung pada pH

larutan dan sebagaimana fungsi buffer dalam menahan pH. Dengan kata lain, pH

buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan elektroforesis,

c. Sumber arus searah

Dalam elektoforesis konvesional dialirkan arus searah sekitar 100 volt tetapi

dalam elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertegangan sangat tinggi

10.000-30.000 volt. Oleh karena itu, ekperimen elektroforesis kapiler dapat

dilakukan dalam beberapa menit sedangkan eksperimen elektroforesis

konvensional dilakukan dalam waktu sehari.

d. Detector

Detector dapat diletakkan disalah satu ujung pipa kapiler yaitu dekat katoda.

Berbagai detector telah digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil

pemisahan, antara lain : spektrometri (seperti UV dan fluoresen) dan detector

elektrokimia (seperti konduktometri dan amperometri).

4. Cara Kerja

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan pada kolom-kolom

(disebut well atau "sumur") pada sisi elektroda negatif, kemudian dialirkan listrik

dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Ketika aliran listrik

diberikan, maka terjadi pengaliran elektron, sehingga zat objek akan bergerak dari

elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Molekul-molekul sampel tersebut

akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan

muatannya. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan

berat molekul DNA.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk

mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.

Pada elektroforesis terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase

bergerak. Fase diam berfungsi menyaring objek yang akan dipisah, sementara fase

bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Elektroda positif dan negatif

diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis.

C. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

1. Pendahuluan

Gambar 6. High Performance Liquid Chromatography

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut

dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun

1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang

diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan

farmasetik.

2. Prinsip Kerja

Pada prinsipnya kerja HPLC adalah sama yaitu pemisahan analit-analit

berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan

tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan

kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong

fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya dan

kecepatannya untuk sampai kedektetor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan

teramati pada spectrum yang puncak-puncaknya terpisah. Ukuran skala polaritas :

golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan

eter < golongan ester < golongan keton < golongan alcohol < golongan asam.

3. Bagian-Bagian Alat

Gambar 7. Skema HPLC

4. Cara Kerja

Adapun cara kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan

diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan

terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) sesuai dengan perbedaan

afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector

(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang

tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder

yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan

personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

D. Melting Point Apparatus

1. Pendahuluan

2. Prinsip Kerja

Menggunakan proses konduksi dari logam untuk penghantaran panas. Pada alat ini

terdapat dua lubangdi bagian atas yang digunakan untuk meletakkan pipa kapiler dan

thermometer. Sementara dua lubang di samping digunakan untuk mengamati

keadaan padatan yang akan menjadi cairan.

3. Bagian-Bagian Alat

4. Cara Kerja

Pertama manyalakan melting point apparatus dengan memutar pemutar suhu

hingga 20oC/menit. Kedua, ketika suhu pada termometra 60% dari titik lebur/titik

leleh suatu senyawa murni yang sudah di tetapkan oleh ilmuwan, maka pemutar suhu

diturunkan hingga mencapai 10oC/menit. Ketiga, jika pada thermometer suhunya

sudah mencapai suhu titik lebur/titik leleh pada suatu senyawa murni maka pemutar

suhu harus diputar kekiri hingga 1oC/menit.