T31527-Optimasi dan.pdf

iii

UNIVERSITAS INDONESIA

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE ANALISIS ASAM NIKOTINAT SERTA STABILITAS

INOSITOL HEKSANIKOTINAT DALAM PLASMA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

TESIS

SRI WARDATUN 0706172481

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM PASCA SARJANA

PROGRAM STUDI ILMU KEFARMASIAN

DEPOK

DESEMBER 2010

Optimasi dan..., Sri Wardatun, Program Studi Ilmu Kefarmasian, 2012

iii

UNIVERSITAS INDONESIA

OPTIMASI DAN VALIDASI METODE ANALISIS ASAM NIKOTINAT SERTA STABILITAS

INOSITOL HEKSANIKOTINAT DALAM PLASMA IN VITRO SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar magister sains

SRI WARDATUN

0706172481

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM PASCA SARJANA

PROGRAM STUDI ILMU KEFARMASIAN

DEPOK

DESEMBER 2010


iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINAL

Tesis ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Sri Wardatun

NPM : 0706172481

Tanda Tangan :

Tanggal : 27 Desember 2010


iv Universitas Indonesia

KATA PENGANTAR Puji syukur saya panjatkan kepada Alloh SWT, karena atas rahmat-Nya, saya

dapat menyelesaikan tesis ini. Penulisan tesis ini dilakukan dalam rangka

memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister Sains Ilmu

Kefarmasian Departemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam Universitas Indonesia.

Saya menyadari bahwa tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari

masa perkuliahan sampai pada penyusunan tesis ini, sangatlah sulit bagi saya

untuk menyelesaikan tesis ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih

kepada:

1) Prof. Dr. Yahdiana Harahap, MS., Apt selaku dosen pembimbing I dan Dr.

Herman Suryadi, MS., Apt selaku pembimbing II yang telah menyediakan

waktu, tenaga dan pikiran untuk mengarahkan saya dalam penyusunan

tesis ini.

2) Prof. Dr. Yahdiana Harahap, MS., Apt selaku Ketua Departemen Farmasi

dan Kepala Laboratorium Bioavailabilitas - Bioekivalen Departemen

Farmasi, FMIPA-UI yang telah memberikan ijin kepada saya untuk

melakukan penelitian di Laboratorium Bioavailabilitas - Bioekivalen

Departemen Farmasi, FMIPA-UI.

3) Prof. Dr. Effionora Anwar, MS selaku Ketua Program Studi Magister Ilmu

Kefarmasian, Departemen Farmasi, FMIPA UI.

4) Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Kementrian Pendidikan Nasional

Republik Indonesia atas Beasiswa Pendidikan Pasca Sarjana (BPPS)

5) Dr. Prasetyorini selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam Universitas Pakuan Bogor dan Ir. E. Mulyati Effendi, MS selaku

Ketua Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Pakuan yang telah

memberikan kesempatan kepada saya untuk melanjutkan sekolah.

6) Orang tua yang selalu memberikan dukungan, dan doa-doanya yang

terucap selalu memberikan kekuatan kepada saya.


v Universitas Indonesia

7) Suamiku Abdul Muis yang senantiasa mendampingi, dan selalu

memberikan dukungan. Anak-anakku Dhaifa, Zalfa, Rafifa dan Musthafa

kalian selalu memberikan inspirasi buat saya.

8) Teman seperjuangan Mba Cici serta Mba Rina, Utami dan Mba Ami di

Laboratorium Bioavailabilitas - Bioekivalensi yang telah banyak

membantu saya dalam menyelesaikan tesis ini.

Akhir kata, saya berharap Alloh SWT berkenan membalas segala kebaikan semua

pihak yang telah membantu. Semoga tesis ini membawa manfaat bagi

pengembangan ilmu.

Penulis


vi Universitas Indonesia

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama : Sri Wardatun NPM : 0706172481 Program Studi : Magister Farmasi Departemen : Farmasi Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Jenis karya : Tesis demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada Universitas Indonesia Hak Bebas Royalti Noneksklusif (Non-exclusive Royalty Free Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul : Optimasi dan Validasi Metode Analisis Asam Nikotinat serta Stabilitas Inositol Heksanikotinat dalam Plasma in Vitro secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti Noneksklusif ini Universitas Indonesia, berhak menyimpan, mengalihmedia/format-kan, mengelola dalam bentuk pangkalan data (database), merawat, dan mempublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta. Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Depok

Pada tanggal : 27 Desember 2010 Yang menyatakan

Sri Wardatun


vii Universitas Indonesia

ABSTRAK

Nama : Sri Wardatun Program Studi : Magister Farmasi Judul : Optimasi dan Validasi Metode Analisis Asam Nikotinat

serta Stabilitas Inositol Heksanikotinat dalam Plasma in Vitro secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Asam nikotinat merupakan obat yang dapat digunakan untuk penyakit penyempitan pembuluh darah (atherosclerosis). Inositol heksanikotinat merupakan senyawa yang dapat terhidrolisis melepaskan asam nikotinat. Konsentrasi asam nikotinat yang dilepaskan inositol heksanikotinat rendah, sehingga dibutuhkan metode analisis yang sensitif dan selektif. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimasi dan validasi metode analisis asam nikotinat, serta menentukan stabilitas inositol heksanikotinat menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. Optimasi metode analisis dilakukan dengan cara variasi komposisi fase gerak, kecepatan alir fase gerak dan optimasi proses ekstraksi. Kondisi analisis yang optimum diperoleh dengan menggunakan kolom Kromasil (250 mm x 4,6 mm) RP, fase gerak campuran kalium dihidrogen fosfat dan dikalium hidrogen fosfat 10 mM yang mengandung tetrabutilammonium bromida 5 mM pH 7 dengan asetonitril (100:9), kecepatan alir 0,8 ml/menit, dengan baku dalam kafein, yang dideteksi pada panjang gelombang 263 nm. Kurva kalibrasi linier dari 124,84 sampai 5000 ng/ml. Hasil validasi metode menunjukkan akurasi -6,8779 hingga 6,8779 %, presisi 0,23 hingga 4,18 % dan perolehan kembali 93,12 hingga 106,389%. Hasil uji stabilitas menunjukkan bahwa inositol heksanikotinat tidak stabil dalam plasma tetapi stabil dalam asam perklorat 0,6 M pada penyimpanan 40C selama 24 jam. Kata Kunci : optimasi, validasi, asam nikotinat, inositol heksanikotinat,

kromatografi cair kinerja tinggi xiv+89 halaman ; 2 gambar; 20 tabel Daftar Pustaka : 46 (1972-2010)


viii Universitas Indonesia

ABSTRACT

Name : Sri Wardatun Program Study : Magister of Pharmacy Judul : Optimization and Validation Analytical Method of

Nicotinic Acid and Inositol Hexanicotinate Stability in Plasma in Vitro By High Performance Liquid Chromatography

Nicotinic acid is a therapeutic agent for treatment atherosclerosis. Inositol hexanicotinate is an agent that can be hydrolyzed with release nicotinic acid. The low level of free nicotinic acid from inositol hexanicotinate in blood, is the reason why its needs method analysis with high sensitivity and selectivity. The aims of this research were to optimize and validation method analysis of nicotinic acid and stability study of inositol hexanicotinate by high performance liquid chromatography. The method was optimated with variation composition mobile phase, variation flow rate and optimation process exctraction. Condition analysis were optimum with use a Kromasil column (250 mm x 4,6 mm) RP, mobile phase mixed dipotassium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate 10 mM containing tetrabuthylammonium bromide 5 mM pH 7 with acetonitril (100:9), flow rate 0,8 ml/minute, with internal standard coffein in 263 nm wave lenght. The standard curve was linear over a concentration range 124,84 to 5000 ng/ml of nicotinic acid in plasma. The HPLC method was validated with accuracy -6,8779 to 6,6779 %, precision 0,23 to 4,18 % and recovery 93,12 -106,389 %. The results of a stability study indicated that inositol hexanicotinate was unstable in plasma samples, but was stable in 0,6 M perchloric acid for up to 24 hour at 40C. Key word : optimization, validation, nicotinic acid, inositol hexanicotinate,

high performance liquid chromatography xiv+89 pages ; 12 pictures; 20 tables Bibliography : 46 (1972-2010)


ix Universitas Indonesia

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i HALAMAN PERNYATAAN ORISINAL ................................................... ii LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................ iii KATA PENGANTAR .................................................................................... iv LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ....................... vi ABSTRAK ...................................................................................................... vii ABSRACT ...................................................................................................... viii DAFTAR ISI ................................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xii DAFTAR TABEL ........................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xiv 1. PENDAHULUAN ................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1 1.2 Tujuan Penelitian .............................................................................. 3 2. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 4

2.1 Asam Nikotinat ................................................................................ 4 2.1.1 Monografi ............................................................................. 4 2.1.2 Aktivitas Farmakologi .......................................................... 4 2.1.3 Sifat Farmakokinetika ........................................................... 5

2.2 Inositol Heksasikotinat ..................................................................... 6 2.2.1 Monografi ............................................................................. 6 2.2.2 Aktivitas Farmakologi .......................................................... 7 2.2.3 Sifat Farmakokinetika ........................................................... 7

2.3 Kafein ............................................................................................... 8 2.3.1 Monografi ............................................................................. 8

2.4. Teofilin ............................................................................................. 9 2.4.1 Monografi ............................................................................. 9

2.5 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ..................................... 10 2.5.1 Teori Dasar ............................................................................ 10 2.5.2 Alat-Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)........... 10

2.5.2.1 Pompa ................................................................... 10 2.5.2.2 Injektor .................................................................. 11 2.5.2.3 Kolom ................................................................... 11 2.5.2.4 Detektor ................................................................. 12 2.5.2.5 Integrator .............................................................. 13

2.5.3 Fase Gerak ............................................................................ 13 2.5.4 Analisis Kuantitatif dengan KCKT ....................................... 13

2.5.4.1 Penggunaan Baku Luar ......................................... 13 2.5.4.2 Penggunaan Baku Dalam .................................... 14

2.5.5 Kromatografi Pasangan Ion ................................................. 14 2.6 Analisis Obat dalam Plasma ............................................................. 15

2.6.1 Pengendapan Protein ............................................................ 15 2.6.2 Ultrafiltrasi`........................................................................... 16


x Universitas Indonesia

2.6.3 Ekstraksi Cair-Cair ............................................................... 16 2.6.4 Ekstraksi Fase Padat ............................................................. 17

2.7 Validasi Metode Analisis .................................................................. 17 2.7.1 Selektivitas ............................................................................ 19 2.7.2 Akurasi .................................................................................. 20 2.7.3 Presisi ................................................................................... 20 2.7.4 Uji Perolehan Kembali (%recovery) ..................................... 20 2.7.5 Kurva Kalibrasi .................................................................... 21 2.7.6 Linearitas dan Rentang ......................................................... 21 2.7.7 Batas Kuantitasi (LOQ) ........................................................ 21 2.7.8 Stabilitas ............................................................................... 22

2.7.8.1 Stabilitas Freeze dan Thaw ..................................... 22 2.7.8.2 Stabilitas Temperatur Jangka Pendek ..................... 22 2.7.8.3 Stabilitas Jangka Panjang ....................................... 23 2.7.8.4 Stabilitas Larutan Stok ............................................ 23 2.7.8.5 Stabilitas Post-Preparative ...................................... 23

2.8 Metode Analisis Asam Nikotinat ...................................................... 23

3. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 26 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................... 26 3.2 Alat dan Bahan ................................................................................. 26

3.2.1 Alat ........................................................................................ 26 3.2.2 Bahan .................................................................................... 26

3.3.2.1 Pembuatan Larutan Induk Asam Nikotinat ........... 26 3.3.2.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Dalam ................ 26 3.3.2.3 Pembuatan Larutan Nikotinamid........................... 27 3.3.2.4 Pembuatan Larutan Inositol Heksanikotinat ......... 27 3.3.2.5 Pembuatan Campuran Kalium Dihidrogen Fosfat

Dikalium Hidrogen Fosfat 10 mM yang Mengandung Tetrabutil Ammonium Bromida 5 mM pH 7 ............................................................... 27

3.3.2.6 Pembuatan Fase Gerak .......................................... 27 3.3 Cara Kerja ........................................................................................... 27

3.3.1 Optimasi Metode Analisis ..................................................... 27 3.3.1.1 Penentuan Panjang Gelombang Optimum ............ 27 3.3.1.2 Pemilihan Konsentrasi Dapar Fase Gerak untuk

Analisis Asam Nikotinat ....................................... 28 3.3.1.3 Pemilihan Komposisi Fase Gerak untuk Analisis

Asam Nikotinat ..................................................... 28 3.3.1.4 Pemilihan Kecepatan Alir Fase Gerak untuk

Analisis Asam Nikotinat ....................................... 28 3.3.1.5 Penentuan Waktu Retensi Nikotinamid dan

Inositol Heksanikotinat ......................................... 28 3.3.1.6 Pemilihan Baku Dalam untuk Analisis Asam

Nikotinat ............................................................... 29 3.3.1.7 Uji Kesesuaian Sistem .......................................... 29 3.3.1.8 Pemilihan Pengendap untuk Ekstraksi Asam

Nikotinat ............................................................... 29


xi Universitas Indonesia

3.3.1.9 Pemilihan Waktu Vorteks untuk Ekstraksi Asam Nikotinat ............................................................... 29

3.3.1.10 Pemilihan Waktu Sentrifugasi untuk Ekstraksi Asam Nikotinat ............... .................................... 30

3.3.2 Validasi Metode Analisis dalam Plasma secara in vitro........ 30 3.3.2.1 Batas Kuantitasi (LOQ) dan Batas Kuantitasi

Terendah (LLOQ) ................................................... 30 3.3.2.2 Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas .......................... 31 3.3.2.3 Uji Keterulangan (Presisi)........................................ 31 3.3.2.4 Uji Akurasi .............................................................. 31 3.3.2.5 Uji Selektivitas ........................................................ 32 3.3.2.6 Uji Perolehan Kembali (% recovery) ...................... 32 3.3.2.7 Pengujian Stabilitas Larutan Stok Asam Nikotinat 33

3.3.3 Stabilitas Inositol Heksanikotinat .. 33

4. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 35 4.1 Hasil .................................................................................................. 35 4.2 Pembahasan....................................................................................... 40

5. KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 48 6. DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 49


xii Universitas Indonesia

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Struktur kimia asam nikotinat ................................................. 4

Gambar 2.2 Struktur kimia inositol heksanikotinat .................................... 6

Gambar 2.3 Hidrolisis inositol heksanikotinat ........................................... 8

Gambar 2.4 Struktur kimia kafein .............................................................. 8

Gambar 2.5 Struktur kimia teofilin ............................................................. 9

Gambar 4.1 Alat kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) ........................ 53

Gambar 4.2 Spektrum serapan larutan asam nikotinat 10 g/ml, kafein 10

g/ml, dan teofilin 10 g/ml dalam pelarut fase gerak ..... 54

Gambar 4.3 Kromatogram asam nikotinat 5 g/ml (tR = 10,693) dalam

kondisi analisis ....................................................................... 55




kondisi analisis ........................................................................ 57

Gambar 4.6 Kromatogram nikotinamid 10 g/ml (tR = 4,500) dalam


Gambar 4.7 Kromatogram inositol heksanikotinat 10 g/ml dalam


Gambar 4.8 Kromatogram kesesuaian sistem asam nikotinat 5 g/ml (tR

= 12,142) dan kafein 5 g/ml (tR =15,875) dalam kondisi

analisis ................................................................................... 60

Gambar 4.9 Kromatogram blanko plasma dalam kondisi analisis ............ 61

Gambar 4.10 Kromatogram asam nikotinat (tR = 11,825) dan kafein (tR =

15,775) dalam plasma dalam kondisi analisis ............. ......... 62

Gambar 4.11 Kurva kalibrasi asam nikotinat untuk mencari LOQ pada


Gambar 4.12 Kurva kalibrasi asam nikotinat pada kondisi analisis ............ 64


xiii Universitas Indonesia

DAFTAR TABEL Tabel 4.1 Hubungan luas area, waktu retensi, jumlah pelat teoritis, dan

faktor ikutan asam nikotinat terhadap perubahan panjang

gelombang ................................................................................... 65

Tabel 4.2 Hubungan luas area, waktu retensi, pelat teoritis, faktor ikutan

dan perubahan konsentrasi dapar ............................. 66

Tabel 4.3 Hubungan waktu retensi, luas area, pelat teoritis dan faktor

ikutan terhadap perubahan komposisi fase gerak ...................... 67

Tabel 4.4 Hubungan waktu retensi, luas area, pelat teoritis dan faktor

ikutan terhadap perubahan kecepatan alir fase gerak ............... 68

Tabel 4.5 Data pemilihan baku dalam ........................ 68

Tabel 4.6 Data kesesuaian sistem .. 69

Tabel 4.7 Hubungan antara pengendap dengan perolehan kembali .......... 69

Tabel 4.8 Hubungan antara waktu vorteks dengan perolehan kembali ..... 70

Tabel 4.9 Hubungan antara waktu sentrifugasi dengan perolehan kembali 71

Tabel 4.10 Data kurva LOQ . 72

Tabel 4.11 Data Lower Limit of Quantitation (LLOQ) ................................ 72

Tabel 4.12 Data kurva kalibrasi asam nikotinat dalam plasma ................. 73

Tabel 4.13 Data akurasi, presisi, dan perolehan kembali hari kesatu ........ 74

Tabel 4.14 Data akurasi, presisi, dan perolehan kembali hari kedua .......... 75

Tabel 4.15 Data akurasi, presisi, dan perolehan kembali hari ketiga .......... 76

Tabel 4.16 Data uji selektivitas ..................................................................... 77

Tabel 4.17 Data stabilitas larutan stok asam nikotinat ................................ 78

Tabel 4.18 Data stabilitas asam nikotinat dengan adanya larutan inositol

heksanikotinat dalam larutan pengekstraksi ............................ 79

Tabel 4.19 Data stabilitas jangka pendek asam nikotinat dengan adanya

larutan inositol heksanikotinat dalam plasma ............................ 80

Tabel 4.20 Data stabilitas freeze dan thaw asam nikotinat dengan adanya

larutan inositol heksanikotinat dalam plasma ............................ 81


xiv Universitas Indonesia

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Cara memperoleh persamaan regresi linier ........................... 82

Lampiran 2 Cara perhitungan simpangan baku dan koefisien variasi ...... 83

Lampiran 3 Cara perhitungan uji perolehan kembali ................................ 84

Lampiran 4 Cara memperoleh % diff ......................................................... 85

Lampiran 5 Sertifikat analisis asam nikotinat ............................................ 86

Lampiran 6 Sertifikat analisis kafein .......................................................... 87

Lampiran 7 Sertifikat analisis teofilin ........................................................ 88

Lampiran 8 Sertifikat analisis nikotinamid ................................................. 89


1Universitas Indonesia

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Vitamin secara normal terdapat dalam makanan sehat dan beberapa

vitamin juga dapat dimanfaatkan sebagai obat (Peoples, 2008). Asam nikotinat

merupakan bagian dari vitamin B kompleks, dimana pada dosis 1000 mg sampai

4000 mg dapat digunakan untuk penanganan gangguan profil lemak darah

(Meyer et al, 2003; Meyer et al, 2004; Guilliams dan Pins, 2005; Vogt et al,

2007). Gangguan profil lemak darah dapat menyebabkan penyempitan pembuluh

darah yang pada puncaknya dapat menyebabkan serangan jantung dan stroke

(Pratanu, 1995; Talbert, 2004; Farmer, 2009).

Penggunaan asam nikotinat pada dosis tinggi dapat menimbulkan efek

samping yang tidak nyaman diantaranya rasa panas dan kemerahan pada kulit

serta gatal-gatal (Reynold, 1996; McEvoy, 2005). Keadaan ini mengakibatkan

pasien seringkali menghentikan penggunaannya. Untuk menghindari efek

samping biasanya pasien dianjurkan untuk mengkonsumsi aspirin atau anti

inflamasi nonsteroid 30 menit sebelum menggunakan asam nikotinat (Talbert,

2004). Alternatif lain untuk menghindari efek samping tersebut adalah dengan

menggunakan inositol heksanikotinat. Inositol heksanikotinat dalam tubuh akan

melepaskan asam nikotinat secara perlahan ke dalam darah akibatnya kadar

asam nikotinat dalam darah rendah tetapi keberadaannya diperlama (Head, 1996;

Filip et al, 2006). Inositol heksanikotinat sendiri telah diadopsi oleh Europe Food

and Safety Authority (EFSA) sebagai sumber asam nikotinat dengan ketersediaan

hayatinya yang dapat diterima (EFSA, 2009). Pada tahun yang sama komisi

regulasi Eropa memasukkan inositol heksanikotinat sebagai sumber vitamin dan

makanan tambahan (Comission Regulation, 2009).

Analisis obat dilakukan untuk memonitoring obat, mempelajari parameter-

parameter farmakokinetik suatu obat, serta bermanfaat dalam penetapan regimen

dosis. Dalam melakukan analisis obat diperlukan suatu metode analisis dengan

tingkat sensitivitas dan selektivitas yang tinggi, nilai akurasi dan presisi yang

tinggi, serta sedikit kemungkinan adanya gangguan. Oleh karena itu, metode



analisis yang akan digunakan harus divalidasi terlebih dahulu. Validasi metode

dilakukan dengan melakukan serangkaian percobaan yang bertujuan untuk

memastikan bahwa parameter-parameter metode analisis yang divalidasi

memenuhi persyaratan yang ditetapkan (Swartz, 1997; Chung Chow Chan et al,

2004). Parameter validasi metode analisis dalam matriks biologi meliputi

sensitivitas, akurasi, presisi, perolehan kembali, linieritas, dan selektivitas (FDA,

2001; Chung Chow Chan et al, 2004)

Metode analisis obat dalam plasma yang sering digunakan adalah dengan

menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan berbagai variasi

detektor. Dari beberapa penelitian yang telah dilakukan, asam nikotinat dapat

ditentukan kadarnya dengan metode KCKT menggunakan detektor UV-Vis dan

LC-MS/MS (Katsumi, 1988: Michael et al, 2008; Lewiston et al, 2010; Pelzer et

al, 1993; Zhang Li et al (n.d), Tsing H, (n.d), sedangkan penetapan kadar asam

nikotinat yang dilepaskan oleh inositol heksanikotinat belum dilaporkan. Oleh

karena itu akan dilakukan penelitian mengenai analisis asam nikotinat yang dapat

diaplikasikan untuk menentukan kadar asam nikotinat yang dilepaskan oleh

inositol heksanikotinat.

Kadar asam nikotinat yang dihasilkan oleh inositol heksanikotinat dalam

darah rendah (EFSA, 2009), oleh karena itu diperlukan metode analisis yang

sesuai dengan selektivitas dan sensitifitas tinggi. Pada penelitian ini akan dicoba

untuk mengoptimalkan metode analisis asam nikotinat dengan kromatografi cair

kinerja tinggi pasangan ion dengan sistem fase terbalik menggunakan detektor

UV-Vis, karena dapat menganalisis komponen dengan kadar yang sangat kecil

dan mampu memisahkan obat dengan senyawa-senyawa endogen dalam plasma

(Katsumi, 1988). Asam nikotinat merupakan senyawa polar dimana jika

digunakan sistem fase terbalik, asam nikotinat kurang tertahan dalam kolom.

Dengan adanya pasangan ion asam nikotinat akan lebih lama tertahan di dalam

kolom dibandingkan senyawa endogen plasma (Katsumi, 1988). Kolom yang

digunakan pada penelitian sebelumnya adalah kolom Chemcosorb 5-ODS-H

dengan panjang kolom 15 cm (Katsumi, 1988), pada penelitian ini akan dicoba

menggunakan kolom Kromasil dengan panjang 25 cm agar pemisahan senyawa

obat dari senyawa endogen lebih optimum.



Sebelum diinjeksikan ke alat KCKT, sampel plasma perlu diberikan

perlakuan untuk menghasilkan analisis yang sensitif dan menghindari gangguan

dari komponen endogen yang terdapat dalam plasma (Chung Chow Chan et al,

2004; Evans, 2004). Gangguan dari komponen endogen plasma dapat dihilangkan

dengan pengendapan protein plasma. Metode pengendapan protein plasma akan

dilakukan dengan penambahan senyawa asam. Dalam plasma, obat terikat pada

permukaan protein sehingga obat harus dibebaskan terlebih dahulu (Evans, 2004).

Penambahan senyawa asam sangat efisien untuk mengendapkan plasma dimana

kelarutan protein plasma akan menurun dan selanjutnya akan mengendap

sehingga obat akan terbebas dari sisi ikatan protein (Evans, 2004).

Pada proses validasi metode analisis in vitro diperlukan baku dalam untuk

memperkecil kesalahan akibat ketidakstabilan instrumen atau kesalahan pada

tahap isolasi sampel (Chamberlain, 1985). Pada penelitian sebelumnya penentuan

asam nikotinat tidak menggunakan baku dalam (Katsumi, 1988), pada penelitian

ini akan dicoba menerapkan baku dalam kafein dan teofilin sesuai dengan

penelitian yang dilakukan oleh Zhang Li et al (n.d).

Inositol heksanikotinat dapat terhidrolisis oleh enzim esterase yang

terdapat di dalam plasma (EFSA, 2009). Penentuan stabilitas inositol

heksanikotinat dilakukan untuk mendapatkan metode penanganan plasma yang

mengandung asam nikotinat dengan adanya inositol heksanikotinat in vitro.

Penentuan stabilitas ini dilakukan terhadap plasma yang mengandung asam

nikotinat dengan jumlah diketahui, selanjutnya ditambahkan larutan inositol

heksanikotinat (Dong Liang, 2008).

1.2 Tujuan Penelitian

1. Memperoleh kondisi yang optimum untuk analisis asam nikotinat di dalam

plasma in vitro secara kromatografi cair kinerja tinggi-dengan detektor UV.

2. Memperoleh metode yang valid untuk analisis asam nikotinat dalam plasma

in vitro secara kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor UV.

3. Menentukan stabilitas inositol heksanikotinat dalam plasma in vitro secara

kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor UV.



BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Asam Nikotinat

2.1.1 Monografi (DepKes RI, 1995; ONeil, 2004; EFSA, 2009; Moffat et al,

2004; Reynold, 1996)

a. Struktur Kimia

[Sumber : DepKes RI, 1995]

Gambar 2.1. Struktur kimia Asam nikotinat

b. Rumus Molekul : C6H5NO2

c. Nama Kimia : 3-pyridinecarboxylic acid

d. Bobot Molekul : 123,11

e. Sinonim : Niasin

f. Pemerian : Hablur atau serbuk hablur, putih atau putih

kekuningan, tidak berbau atau berbau lemah,

rasa agak asam

g. Kelarutan : Larut dalam 55 bagian air, mudah larut dalam

air mendidih dan dalam etanol (95%)

mendidih, praktis tidak larut dalam eter, larut

dalam larutan alkali hidroksida.

h. Titik Leleh : 236.6C

2.1.2 Aktivitas Farmakologi

Asam nikotinat dikonversi dalam tubuh menjadi nikotinamid adenin

dinukletida (NAD) dan nikotinamid adenin dinukletida fosfat (NADP) melalui

transfer elektron dalam rantai respirasi. Kekurangan asam nikotinat

mengakibatkan penyakit pellagra yang ditandai dengan kehilangan nafsu makan,



lesu, lemah, diare, kulit kasar, dan perubahan mental dan psikis. Asam nikotinat

juga digunakan sebagai vasodilator (Reynold 1996; ONeil,2004; EFSA, 2009).

Pada dosis tinggi asam nikotinat dapat menghambat mobilisasi asam

lemak bebas dari jaringan adipose ke hati, akibatnya sintesis trigliserida, sintesis

dan sekresi VLDL (Very Low Density Lipoprotein), serta sintesis LDL (Low

Density Lipoprotein) dari VLDL menurun. Asam nikotinat juga dapat

mengurangi katabolisme apolipoprotein A yang menyebabkan peningkatan

produksi HDL (High Density Llipoprotein)/ kolesterol baik. Partikel HDL dalam

pembuluh darah memegang peranan penting dalam pemindahan kolesterol jahat

yang berasal dari jaringan ke hati untuk dikeluarkan sehingga dapat mencegah

timbulnya plak dan penyempitan pembuluh (Reynold, 1996; Michael, 2003;

APA, 2005; McEvoy, 2005).

2.1.3 Sifat Farmakokinetika

Absorpsi

Asam nikotinat secara cepat diabsorpsi setelah pemberian oral (60-70%).

Konsentrasi puncak tergantung pada bentuk pelepasan sediaan. Untuk pelepasan

yang dipercepat dan diperlama, konsentrasi puncak plasma tercapai setelah 30-60

menit dan 4-5 jam setelah pemberian oral (McEvoy, 2005).

Distribusi

Asam nikotinat didistribusikan terutama pada hati, ginjal dan jaringan

adipose. Obat juga terdistribusi sampai air susu manusia (McEvoy, 2005).

Metabolisme

Asam nikotinat secara cepat termetabolisme. Asam nikotinat

dimetabolisme melalui 2 jalur. Jalur pertama adalah konjugasi dengan glisin yang

akan menghasilkan asam nikotinurat dan diiringi oleh timbulnya rasa panas dan

kemerahan pada kulit. Jalur kedua adalah jalur amidasi dengan beberapa reaksi

oksidasi reduksi yang menghasilkan nikotinamid, N-metilnikotinamid dan

sejumlah metabolit piridin diantaranya N-metil-2-piridon-5-karboksamid, N-

metil-6-piridon-3-karboksamid, N-metil-4-piridon-3-karboksamid dan N-metil-4-

piridon-5-karboksamid (Reynold 1996; EFSA, 2009).



Eliminasi

Asam nikotinat secara cepat tereksresi dalam urin, kira-kira 60-70% dosis

akan tereksresikan dalam bentuk tidak berubah atau metabolit inaktif (McEvoy,

2005).

2.2 Inositol Heksanikotinat

2.2.1 Monografi (EFSA, 2009; Reynold, 1996, Moffat et al, 2004; ONeil, 2004)

a. Struktur Kimia

[Sumber : EFSA, 2009] Gambar 2.2 Struktur kimia inositol heksanikotinat

b. Rumus Molekul : C42H30N6O12

c. Nama Kimia : Myo- Inositol hexa-3-pyridinecarboxylate;

hexanicotynil cis-1,2, -3,5 trans -4,6-

cyclohexane

d. Bobot Molekul : 810.71

e. Nomor CAS : 6556-11-2

f. Sinonim : Hexanicotinoyl inositol, inositol niacinate.

g. Pemerian : Kristal putih atau hampir putih

h. Kelarutan : praktis tidak larut dalam air, aseton, etanol dan

eter, larut dalam larutan asam.

i. Titik Leleh : 254,3-254,9C



2.2.2 Aktivitas Farmakologi

Kerja inositol heksanikotinat dalam tubuh dipercaya sama dengan asam

nikotinat termasuk menurunkan mobilitas asam lemak, menurunkan sintesis

VLDL dalam hati sehingga terjadi penurunan kolesterol LDL, total kolesterol dan

trigliserida, menghambat sintesis kolesterol dalam hati, meningkatkan HDL

dengan menurunkan katabolisme dan memiliki efek fibrinolitik (Head, 1996;

ONeil, 2004; EFSA, 2009)

2.3 Sifat Farmakokinetika (EFSA, 2009)

Inositol heksanikotinat diserap dalam saluran cerna rata-rata 70% setelah

pemberian oral. Setelah diabsorpsi, inositol heksanikotinat yang diberikan secara

oral, akan dihidrolisis dalam tubuh oleh enzim esterase menghasilkan enam mol

asam nikotinat bebas dan satu mol inositol (EFSA, 2009). Hidrolisis ikatan ester

terjadi perlahan memakan waktu lebih dari 48 jam, lebih lama dibandingkan saat

inositol heksanikotinat diinkubasi dalam serum tikus atau anjing. Setelah

pemberian oral 0,8 sampai 4,2 gram inositol heksanikotinat, konsentrasi puncak

asam nikotinat tercapai setelah 6-10 jam. Hidrolisis 1 gram inositol heksanikotinat

akan menghasilkan 0,91 gram asam nikotinat dan 0,22 gram inositol (EFSA,

2009). Inositol heksanikotinat digolongkan ke dalam sediaan asam nikotinat

yang bekerja secara diperpanjang sehingga konsentrasi asam nikotinat yang

dihasilkan dari hidrolisis selalu dibandingkan dengan golongan tersebut (EFSA,

2009). Konsentrasi maksimal dari salah satu sediaan yang bekerja diperpanjang

setelah pemberian 2000 mg adalah 2,73-4,90 g/ml dengan konsentrasi terkecil di

darah sekitar 220 ng/ml. Inositol heksanikotinat yang tidak terabsorpsi

tereksresikan pada feses dalam bentuk tidak berubah (EFSA, 2009).



[Sumber : http://www.biosynth.com/index.asp]

Gambar 2.3 Hidrolisis inositol heksanikotinat

2. 3 Kafein (DepKes, 1995)

2. 3.1 Monografi

a. Struktur Kimia

[Sumber: DepKes, 1995]

Gambar 2.4 Struktur kimia kafein

b. Rumus Molekul : C8H10N4O2

c. Bobot Molekul : 194,19

d. Nama Kimia : 3,7 - dihydro-1,3,7-trimethyl- 1H- purine -

2,6 - dione; 1,3,7 trimethylxanthine; 1,3,7-

trimethyl-2,6-dioxopurine,

e. Sinonim : metilteobromin

f. Pemerian : Serbuk atau hablur bentuk jarum mengkilat

biasanya menggumpal, putih, tidak berbau,

rasa pahit. Larutan bersifat netral terhadap

1 mol inositol heksanikotinat 6 mol asam

nikotinat

1 mol inositol

+



kertas lakmus, bentuk hidratnya mekar di

udara.

g. Kelarutan : Agak sukar larut dalam air dan dalam etanol

(95%), mudah larut dalam kloroform, sukar

larut dalam eter.

h. Jarak Leleh : 235-237,5C

2. 4 Teofilin (DepKes, 1995)

2.4.1 Monografi

a. Struktur Kimia

[Sumber : DepKes, 1995]

Gambar 2.5 Struktur kimia teofilin

b. Rumus Molekul : C7H8N4O2. H2O

c. Bobot Molekul : 198,18

d. Nama Kimia : 3,7 dihydro - 1,3 dimethyl - 1H purine -

2,6-dione; 1,3 dimethykxanthine.

e. Pemerian : Serbuk hablur, putih, tidak berbau, rasa pahit,

stabil di udara

f. Kelarutan : Sukar larut dalam air, tetapi mudah larut

dalam air panas, mudah larut dalam larutan

alkali hidroksida dan dalam ammonium

hidroksida, agak sukar larut dalam etanol,

dalam kloroform dan dalam eter.

g. Jarak Leleh : 270-274C



2. 5 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

2. 5.1 Teori Dasar ( Nollet, 1992; Johnson dan Stevenson ,1991)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT

(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) merupakan teknik pemisahan yang diterima

secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel

pada sejumlah bidang.

Adapun kelebihan metode ini dibandingkan metode lain yaitu : waktu

analisis cepat, daya pisahnya baik, peka, pemilihan kolom dan eluen sangat

bervariasi, kolom dapat dipakai kembali, dapat digunakan untuk molekul besar

dan kecil, mudah untuk memperoleh kembali cuplikan, dapat menghitung sampel

dengan kadar yang sangat rendah

Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali

jika KCKT dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Keterbatasan

lainnya adalah jika sampelnya sangat komplek maka resolusi yang baik sulit

diperoleh.

2.5.2 Alat-Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Nollet, 1992;

Johnson dan Stevenson, 1991; Evans, 2004, Engelhardt, 1985)

Alat KCKT terdiri dari beberapa bagian, yaitu pompa, injektor, kolom,

detektor, dan integrator.

2.5.2.1 Pompa

Pompa berfungsi untuk mengalirkan eluen ke dalam kolom (Evans, 2004).

Pompa, segel-segel pompa dan semua penghubung dalam sistem kromatografi

harus terbuat dari bahan yang secara kimiawi tahan terhadap fase gerak. Bahan

yang umum digunakan adalah gelas, baja nirkarat, teflon, dan batu nilam (Johnson

dan Stevenson, 1991) .

Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai

5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 mL/menit.

Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase

gerak dengan kecepatan 20 mL/menit (Engelhardt, 1985).



Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran

fase gerak berlangsung secara tepat, reproduksibel, konstan dan bebas dari

gangguan.

Ada beberapa jenis pompa, yaitu ((Nollet, 1992; Johnson dan Stevenson,

1991; Engelhardt, 1985):

1. Pompa tekanan tetap

Pompa ini merupakan tipe yang paling populer karena harganya yang

relatif tidak mahal dan dapat bekerja pada berbagai kecepatan alir.

2. Pompa semprit

Pompa ini menggunakan satu piston yang bekerja menghasilkan suatu

aliran yang konstan.

3. Pompa tekanan uap

Pompa ini menggunakan piston besar yang digerakkan oleh tenaga gas.

Pompa ini telah jarang digunakan.

2.5. 2. 2 Injektor (Nollet, 1992)

Injektor berfungsi untuk memasukkan cuplikan ke dalam kolom. Adapun

jenis-jenis injektor, antara lain:

a) Aliran henti

Aliran dihentikan, penyuntikan dilakukan pada tekanan atmosfer, setelah

sistem ditutup, aliran dilanjutkan kembali.

b) Septum

Merupakan injektor langsung pada aliran, dapat dipakai pada tekanan sampai

60-70 atm tetapi tidak dapat dipakai untuk pelarut kromatografi cair.

c) Katup jalan kitar

Biasa dipakai untuk menyuntikkan volume yang lebih dari 10 l.

d) Autoinjektor

Merupakan otomatisasi dari katup jalan kitar.

2. 5. 2. 3 Kolom

Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen

(Engelhardt, 1985). Kolom yang ada telah tersedia dalam berbagai macam ukuran.

Untuk menahan tekanan tinggi, kolom dibuat bahan yang kokoh seperti stainless



steel atau campuran logam dengan gelas. Penghubung dan sambungan harus

dirancang tanpa ada ruang kosong. Isi kolom dijaga oleh penahan yang ada di

ujung-ujung kolom.

Kemampuan kolom untuk memisahkan senyawa yang dianalisis

merupakan ukuran kinerja kolom. Dasar yang banyak digunakan untuk

pengukuran kinerja kolom adalah resolusi (R) dan efisiensi kolom. Pemisahan

berbagai komponen sampel oleh kolom tergantung kepada daya pisah kolom

terhadap komponen tersebut. Daya pisah ini sangat dipengaruhi oleh faktor

kapasitas tiap komponen sampel.

2.5.2.4 Detektor (Engelhardt, 1985)

Detektor berfungsi untuk mendeteksi atau mengidentifikasi komponen

yang ada dalam eluat dan mengukur jumlahnya.

Detektor yang baik mempunyai sifat sebagai berikut :

1) Mempunyai respon cepat terhadap solut dan reproduksibel

2) Mempunyai sensitifitas tinggi yaitu mampu mendeteksi solut pada kadar yang

sangat kecil

3) Stabil dalam pengoperasian

4) Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran

pita.

5) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran

yang luas.

6) Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

Macam-macam detektor yang dapat digunakan (Chamberlain, 1985) :

1. Detektor serapan optik

2. Detektor indeks bias (RID)

3. Detektor fluoresensi

4. Detektor elektrokimia (ECD)

5. Detektor ionisasi nyala (FID)

6. Detektor evaporation light scattering (ELSD)

7. Detektor radioaktif



2.5.2.5 Integrator

Integrator berfungsi untuk menghitung area. Ada dua macam integrator,

yaitu:

1) Integrator piringan yang bekerja secara mekanik

2) Integrator digital/elektronik, dapat memberikan ketelitian tinggi dan waktu

integrasi yang singkat.

2.5.3 Fase Gerak (Engelhartd, 1985))

Fase gerak pada KCKT biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih

polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya

polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada

fase gerak) kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas.

Secara umum eluen yang baik harus mempunyai sifat sebagai berikut :

murni, tidak bereaksi dengan kolom, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan

cuplikan, selektif terhadap komponen, viskositasnya rendah, memungkinkan

dengan mudah untuk memperoleh cuplikan kembali jika diperlukan, harganya

wajar, dapat memisahkan zat dengan baik

2.5.4 Analisis Kuantitatif dengan KCKT

Dasar perhitungan kuantitatif untuk suatu komponen zat yang dianalisis

adalah dengan mengukur areanya. Ada beberapa metode yang dapat digunakan,

yaitu :

2.5.4.1 Penggunaan Baku Luar

Metode yang paling umum untuk menetapkan konsentrasi senyawa yang

tidak diketahui konsentrasinya dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan

kurva kalibrasi menggunakan baku luar. Larutan baku dengan berbagai

konsentrasi disuntikkan dan diukur areanya. Buat kurva kalibrasi antara area

terhadap konsentrasi. Sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan



ditentukan selanjutnya diinjeksikan dan dianalisis dengan cara yang sama

(Engelhardt, 1985; Johnson dan Stevenson, 1991)

2.5.4.2 Penggunaan Baku Dalam

Baku dalam merupakan senyawa yang berbeda dengan analit, meskipun

demikian senyawa ini harus terpisah dengan baik selama pemisahan. Baku dalam

dapat menghilangkan pengaruh karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran

sampel atau konsentrasi

Ada beberapa persyaratan yang harus dipenuhi oleh senyawa baku dalam,

yaitu (Johnson dan Stevenson, 1991; Engelhardt, 1985; Chamberlain, 1985):

1) harus terpisah sama sekali dari puncak cuplikan

2) harus terelusi dekat dengan puncak yang diukur

3) konsentrasi dan tanggapan detektornya harus sama dengan konsentrasi dan

tanggapan detektor puncak yang diukur.

4) tidak boleh bereaksi dengan komponen cuplikan

5) tidak terdapat dalam cuplikan asal

6) harus sangat murni dan stabil pada penyimpanan

7) larut dalam pelarut pengekstraksi

8) memiliki respon yang sama terhadap sistem analisis

2.5.5 Kromatografi Pasangan Ion

Kromatografi pasangan ion berdasar pada pembentukan pasangan ion dari

analit yang bermuatan dengan reagen pasangan ion yang berlawanan muatannya.

Kromatografi pasangan ion memiliki banyak kesamaan dengan kromatografi fase

terbalik. Kolom dan fase gerak yang digunakan untuk pemisahan umumnya sama,

perbedaan terutama pada penambahan senyawa/reagen pasangan ion pada fase

gerak untuk kromatografi pasangan ion. Penggunaan pasangan ion ditujukan

untuk mengubah tambatan analit. Mekanisme terbentuknya pasangan ion adalah

senyawa/reagen pasangan ion akan tertarik pada fase diam melalui gugus alkil

hidrofobik fase diam yang mengakibatkan fase diam menjadi bermuatan. Muatan

fase diam yang berlawanan dengan analit mengakibatkan analit tertarik pada fase



diam yang menghasilkan penahanan analit pada fase diam (Snyder et al, 1997;

Engelhartd, 1985).

Pasangan ion yang sering digunakan adalah alkil ammonium rantai

panjang sebagai suatu kation dan alkilsulfat sebagai anion pada kebanyakan nilai

pH. Pasangan ion yang paling banyak digunakan adalah alkilsulfat dengan karbon

4-8, sedangkan sebagai kation adalah garam tetrametil, tetraetil, tetrapropil dan

tetrabutilamonium (Munson, 1991).

Kadar reagen pasangan ion juga berpengaruh pada waktu retensi.

Menaikkan kadar reagen pasangan ion akan meningkatkan waktu retensi tetapi

pengaruhnya lebih kecil dibandingkan memperpanjang rantai. Peningkatan kadar

reagen pasangan ion juga dibatasi kelarutannya. Pasangan ion rantai pendek cukup

larut dalam beragam fase gerak, tetapi untuk melarutkan reagen pasangan ion

rantai panjang diperlukan kadar tinggi pemodifikasi organik. Penyaringan fase

gerak sangat penting bila menggunakan pasangan ion karena umumnya senyawa

ini tidak begitu murni (Munson, 1991).

2. 6 Analisis Obat dalam Plasma

Konsentrasi obat dalam plasma umumnya rendah pada dosis terapi. Oleh

karena itu diperlukan persiapan sampel khusus untuk analisis obat dalam plasma.

Dalam plasma, obat terikat pada permukaan protein sehingga obat harus

dibebaskan terlebih dahulu. Beberapa cara yang bisa dilakukan untuk mencapai

tujuan di atas diantaranya ialah dengan (Evans, 2004, ) :

2. 6. 1 Pengendapan Protein

Pada pengendapan protein, biasanya digunakan asam atau pelarut organik

yang dapat bercampur dengan air untuk memisahkan protein dari plasma. Asam

seperti asam trikloroasetat, dan asam perklorat sangat efisien untuk

mengendapkan plasma. Protein pada pH rendah ada dalam bentuk kationik akan

membentuk garam tidak larut dengan asam. Pelarut organik seperti metanol,

asetonitril, aseton dan etanol, meskipun memiliki efisiensi yang relatif rendah

dalam memisahkan protein, tetapi pelarut ini telah digunakan secara luas dalam

bioanalisis karena kompatibilitasnya dengan fase gerak KCKT (Evans, 2004).



Setelah dicampur (biasanya menggunakan bantuan vorteks), sampel

disentrifugasi untuk menghasilkan supernatan yang jernih, berisi komponen yang

diinginkan. Larutan yang telah bebas protein mungkin perlu diekstraksi lebih

lanjut dengan teknik ekstraksi cair-cair dengan pelarut organik yang tidak

bercampur, atau dapat langsung disuntikkan pada sistem analisis yang akan

digunakan, bila diyakini obat sepenuhnya larut dalam supernatan.

2.6. 2 Ultrafiltrasi

Larutan bebas protein dapat diperoleh melalui proses penyaringan dengan

melewatkan larutan pada suatu membran semipermeabel yang selektif dengan

menggunakan tekanan dalam membran yang berbentuk kerucut. Dalam hal ini

digunakan tekanan hidrostatik (1-10 atm) untuk memberikan dorongan dalam

proses pemisahan. Membran ultrafiltrasi mempunyai struktur mikroporous dan

semua molekul yang ukurannya lebih besar dari diameter terbesar pori-pori

membran akan tertahan, sedangkan molekul yang ukurannya lebih kecil dari

diameter terkecil pori-pori akan dapat menembus membran (Ladu, et al, 1972)

2.6. 3 Ekstraksi Cair-Cair

Ekstraksi cair-cair adalah proses pemindahan suatu komponen dari satu

fase cair ke fase cair lainnya yang tidak saling bercampur sesamanya. Prosesnya

disebut partisi atau distribusi. Jika suatu zat yang terlarut terdistribusi antara dua

cairan atau pelarut yang tidak saling bercampur, maka dalam sistem akan terjadi

keseimbangan.

Umumnya, salah satu fasenya berupa air atau larutan air. Cara paling

umum yang sering digunakan untuk pemisahan parsial adalah metode ekstraksi

dengan pelarut organik. Agar obat dapat terekstraksi dalam pelarut organik, maka

obat itu harus dalam bentuk tidak terionisasi. Oleh karena itu, pH fase air harus

dioptimasi agar diperoleh bentuk tidak terionisasi dengan sempurna. Optimasi

dapat dilakukan dengan menghitung atau menentukan pKa obat.

Beberapa kekurangan ekstraksi cair-cair yaitu teknik tidak dapat

diterapkan pada semua komponen. Molekul dengan kepolaran tinggi sulit untuk

diekstraksi cair-cair walaupun ditambahkan pasangan ion untuk membentuk



molekul. Masalah lainnya adalah terbentuknya emulsi yang sulit dihilangkan

walaupun dengan sentrifugasi atau ultrasonik dan dapat menyebabkan kehilangan

analit karena terjerap dalam emulsi. Pengurangan kecepatan pengocokan atau

peningkatan volume pengekstraksi dapat membantu mengurangi masalah emulsi

ini (Evans, 2004).

2.6. 4 Ekstraksi Fase Padat

Ekstraksi fase padat adalah suatu teknik yang dapat mengatasi beberapa

masalah yang ditemui pada ekstraksi cair-cair. Pada ekstraksi fase padat, analit

ditahan oleh fase padat saat sampel dilewatkan, kemudian dilanjutkan dengan

elusi analit oleh pelarut yang sesuai. Pada teknik ini digunakan kolom berukuran

kecil dengan adsorben yang mirip dengan yang digunakan pada saat analisis.

Metode ekstraksi fase padat ini berdasarkan prinsip dari kromatografi, yaitu

adsorpsi obat dari larutan ke dalam adsorben atau fase diam (Evans, 2004).

Pemilihan cara isolasi obat dalam plasma harus dilakukan karena akan

memberikan nilai perolehan kembali (recovery) yang maksimum dari obat yang

dianalisis. Selain itu, untuk memperbaiki ketelitian, maka penggunaan baku dalam

dapat ditambahkan pada sampel.

2.7 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Swart,

1997; Chung Chow Chan et al, 2004).

Validasi metode analisis yang dilakukan dalam matriks biologi biasanya

disebut sebagai validasi metode bioanalisis. Validasi metode bioanalisis ini

digunakan pada studi farmakologi klinis, pengujian bioavailabilitas (BA) dan

bioekuivalensi (BE), serta uji farmakokinetika (PK). Metode analisis yang selektif

dan sensitif untuk evaluasi obat dan metabolitnya (analit) secara kuantitatif sangat

berpengaruh terhadap kesuksesan studi farmakologi pre-klinik dan klinik.

Parameter-parameter penting dalam validasi metode bioanalisis adalah akurasi,



presisi, selektivitas, sensitivitas, reprodusibilitas, dan stabilitas (FDA, 2001;

Chung Chow Chan et al, 2004).

Pada validasi metode bioanalisis terdapat tiga tipe dan tingkatan validasi,

yaitu (FDA, 2001; Chung Chow Chan et al, 2004) :

1. Validasi lengkap (full validation)

Validasi lengkap ini sangat penting apabila ingin mengembangkan metode

dan mengimplementasikan metode bioanalisis untuk pertama kalinya. Validasi ini

penting untuk obat baru dan untuk penentuan metabolitnya.

2. Validasi parsial (partial validation)

Validasi parsial merupakan modifikasi dari metode bioanalisis yang sudah

divalidasi. Ada beberapa tipe metode analisis yang termasuk dalam validasi

parsial antara lain :

a. Metode bioanalisis yang ditransfer antar laboratorium atau analisis

b. Adanya perubahan pada metode analisis (misalnya ada perubahan pada sistem

deteksi)

c. Perubahan antikoagulan

d. Perubahan matriks pada spesies yang sama (misalnya plasma manusia diganti

urin)

e. Perubahan prosedur saat memproses sampel

f. Perubahan spesies pada matriks yang sama (misalnya plasma mencit diganti

plasma tikus)

g. Perubahan rentang konsentrasi

h. Perubahan instrument atau platform software

i. Volume sampel terbatas

j. Matriksnya jarang

k. Memilih hasil demonstrasi analit pada pemberian obat yang bersamaan

l. Memilih hasil demonstrasi analit bila terdapat metabolit spesifik

3. Validasi silang (cross validation)

Validasi silang dilakukan dengan membandingkan parameter-parameter

validasi apabila digunakan dua atau lebih metode bioanalisis untuk mendapatkan

data pada studi yang sama atau pada studi yang berbeda. Pada validasi ini



digunakan metode validasi yang original sebagai pembanding dan metode

bioanalisis lainnya sebagai komparator.

Analisis obat dan metabolitnya dalam matriks biologi memerlukan baku

pembanding (reference standard) dan sampel yang digunakan sebagai quality

control (QC). Kemurnian baku pembanding yang dipakai dapat mempengaruhi

data yang diperoleh. Baku pembanding yang digunakan sebaiknya identik dengan

analit, apabila tidak bisa digunakan basa bebas atau asamnya, maka dapat

digunakan garam atau ester dengan kemurnian yang diketahui. Baku pembanding

dapat berupa baku dalam dan baku luar. Ada tiga macam sumber baku

pembanding, antara lain (FDA, 2001; Chung Chow Chan et al, 2004):

a. Baku pembanding yang mempunyai sertifikat (misalnya USP standar)

b. Baku pembanding yang dijual secara komersil dari sumber yang dapat

dipercaya.

c. Baku pembanding yang disintesis oleh laboratorium analit atau institusi non

komersial lainnya.

Parameter penting untuk validasi metode bioanalisis meliputi akurasi,

presisi, selektivitas, sensitivitas, reprodusibilitas, dan stabilitas. Stabilitas analit

pada sampel plasma juga perlu ditentukan. Pengembangan metode bioanalisis

meliputi evaluasi selektivitas, akurasi, presisi, uji perolehan kembali (% recovery),

kurva kalibrasi, dan stabilitas (FDA, 2001, Swart dan Krull,1997; Chung Chow

Chan et al, 2004).

2.7.1 Selektivitas

Selektivitas merupakan kemampuan metode analisis untuk membedakan

dan mengukur kadar analit dengan adanya komponen-komponen lain dalam

sampel (cairan biologis) (Swart dan Krull, 1997). Pada uji selektivitas pengukuran

dilakukan pada 6 blanko plasma manusia yang berbeda. Setiap sampel blanko

sebaiknya diuji terhadap adanya gangguan dan selektivitas pada lower limit of

quantification (LLOQ) (FDA, 2001; Chung Chow Chan et al, 2004).



2.7.2 Akurasi

Akurasi menggambarkan kedekatan hasil pengujian dengan kadar

sebenarnya (Swart, 1997). Akurasi dilakukan pada sampel yang mengandung

jumlah analit yang diketahui. Akurasi dilakukan minimal 5 replikat untuk tiap

kadar yaitu pada konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi. Pengukurannya dapat

dilakukan intra assay (dalam satu kali analisis) dan inter assay (dilakukan analisis

selama 5 hari). Pengukuran akurasi memenuhi syarat jika nilai % diff tidak

menyimpang dari -15% sampai +15%, kecuali jika pengukuran dilakukan pada

kadar LLOQ maka tidak boleh menyimpang dari -20% sampai +20% (FDA, 2001;


2.7.3 Presisi

Presisi menggambarkan kedekatan antara hasil pengujian yang satu

dengan hasil pengujian lainnya (Swart dan Krull, 1997). Pada pengukuran presisi

dilakukan minimal 5 replikat unuk tiap kadar yaitu pada konsentrasi rendah,

sedang, dan tinggi. Pengukurannya dapat dilakukan intra assay (dalam satu kali

analisis) dan inter assay (dilakukan analisis selama 5 hari). Penentuan presisi pada

tiap konsentrasi memenuhi syarat jika koefisien variasi (KV) tidak menyimpang

dari -15% sampai +15%, kecuali jika pengukuran dilakukan pada kadar LLOQ

maka tidak boleh menyimpang dari -20% sampai +20% (FDA, 2001; Chung

Chow Chan et al, 2004).

2.7. 4 Uji Perolehan Kembali (% recovery)

Uji perolehan kembali (% recovery) merupakan perbandingan respon

detektor analit yang diekstraksi dari sampel biologis dengan respon detektor kadar

yang sebenarnya dari standar murni (FDA, 2001). Perolehan kembali dari analit

tidak perlu 100% tetapi perolehan kembali dari analit dan baku dalam harus

konsisten, presisi, dan reprodusibel. Uji perolehan kembali dilakukan dengan

membandingkan hasil analisis dari sampel yang diekstraksi pada tiga konsentrasi

(konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dan standar yang tidak diekstraksi di

mana uji perolehan kembalinya 100%. Penentuan uji perolehan kembali (%



recovery) pada tiap konsentrasi memenuhi syarat jika % recovery berkisar antara

80-120% (FDA, 2001)

2.7. 5 Kurva Kalibrasi

Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara respon instrumen dengan

konsentrasi analit yang diketahui. Kurva kalibrasi harus terdiri dari 1 sampel

blanko (matriks tanpa baku dalam), 1 sampel zero (matriks dengan baku dalam)

dan 6-8 sampel yang mencakup kisaran konsentrasi pengukuran (termasuk

konsentrasi pada LLOQ) (FDA, 2001; Chung Chow Chan et al, 2004) Standar

terendah dari kurva kalibrasi yang dapat diterima sebagai LLOQ jika memenuhi

kondisi sebagai berikut :

a. Respon analit pada LLOQ sedikitnya lima kali respon blanko.

b. Respon analit (puncak analit) dapat diidentifikasi, terpisah, dan reproduksibel

dengan koefisien variasi tidak menyimpang dari -20% sampai +20% dan

akurasi tidak menyimpang dari -20% sampai +20%.

2.7. 6 Linearitas dan Rentang

Linieritas adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil yang

proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Swart, 1997). Linearitas

suatu metode bioanalisis harus diuji untuk mengetahui adanya hubungan yang

linear antara kadar zat dengan respon detektor. Linearitas diperoleh dari koefisien

korelasi (r) pada analisis regresi linier yang didapat dari kurva kalibrasi. Dengan

dilakukan uji ini, maka dapat diketahui batas-batas konsentrasi dari analit yang

memberikan respon detektor yang linear. Analisis harus dilakukan pada

konsentrasi yang termasuk batas-batas linier dari konsentrasi yang telah

dilakukan. Rentang metode adalah pernyataan konsentrasi terendah dan tertinggi

analit yang dianalisis memberikan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang

dapat diterima (FDA, 2001).

2.7. 7 Batas Kuantisasi (LOQ)

Batas kuantisasi adalah analit terkecil yang dapat ditentukan dengan

ketelitian dan akurasi tertentu (Swart dan Krull, 1997). Batas kuantisasi dihitung



secara statistik melalui garis regresi linier dan kurva kalibrasi. Nilai pengukuran

akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linear y = a + bx, sedangkan

simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual (Sy/x) dan rumus

yang dapat digunakan yaitu :

Sy/x = Simpangan baku respons analisis dari blanko

S1 = Arah garis linier (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap

konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y=a + bx)

2.7. 8 Stabilitas

Berbagai kondisi seperti panas, cahaya, kelembaban, dan pH yang

berbeda, kandungan kimia dari obat, matriks serta wadah penyimpanan dapat

mempengaruhi kestabilan obat. Sehingga obat yang ada dalam matriks biologis

dapat terurai sewaktu penyimpanan dan tidak dapat terdeteksi sewaktu sampel

dianalisis. Untuk menentukan stabilitas obat dalam matriks biologis maka

digunakan beberapa sampel yang dipersiapkan dari larutan induk analit yang

dibuat segar dan analit dalam matriks biologi (FDA, 2001; Chung Chow Chan et

al, 2004). Penentuan stabilitas obat dalam matriks biologi dapat dilakukan dengan

lima cara antara lain :

2.7. 8. 1 Stabilitas Freeze dan Thaw

Stabilitas sebaiknya ditentukan setelah tiga siklus pembekuan/pencairan.

Pengujian dilakukan paling sedikit pada tiga konsentrasi sampel uji (konsentrasi

rendah, sedang, tinggi) dalam plasma, kemudian disimpan pada temperatur yang

diharapkan selama 24 jam dan pada temperatur kamar. Jika analit tidak stabil

selama penyimpanan pada temperatur yang diharapkan, maka sampel sebaiknya

disimpan pada temperatur -70o C selama tiga siklus freeze dan thaw (FDA, 2001;


2.7. 8. 2 Stabilitas Temperatur Jangka Pendek

Pengujian dilakukan dengan menggunakan tiga konsentrasi sampel uji

(konsenrasi rendah, sedang, dan tinggi) dalam plasma, kemudian disimpan pada



temperatur kamar selama 4 sampai 24 jam (FDA, 2001; Chung Chow Chan et al,

2004).

2.7. 8.3 Stabilitas Jangka Panjang

Pada stabilitas jangka panjang, pengujian dilakukan dengan menggunakan

tiga konsentrasi sampel uji (konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dalam plasma.

Pengujian dilakukan pada waktu mulai sampel dikumpulkan sampai tanggal

terakhir sampel dianalisis yaitu dilakukan selama 0, 20, 60, dan 90 hari. Selama

periode uji stabilitas, larutan uji disimpan pada lemari pendingin (-20oC).

Konsentrasi analit diukur setelah rentang waktu penyimpanan tersebut (FDA,

2001; Chung Chow Chan et al, 2004).

2.7.8.4 Stabilitas Larutan Stok

Uji stabilitas larutan stok dilakukan dengan pengujian mengunakan larutan

stok obat dan baku selama 6 jam pertama pada temperatur kamar dan untuk hari

ke 20 pada penyimpanan di lemari pendingin (FDA, 2001; Chung Chow Chan et

al, 2004).

2.7.8.5 Stabilitas Post-Preparative

Stabilitas post-preparative yaitu stabilitas selama analit berada pada

autosampler.

2. 8 Metode Analisis Asam Nikotinat

Terdapat beberapa studi yang berkaitan dengan metode analisis asam

nikotinat dalam plasma yang sudah dipublikasikan diantaranya yaitu:

1. Penetapan kadar asam nikotinat dan metabolit utama asam nikotinurat dalam

darah dan urin menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase balik

(Katsumi, 1988).

Kondisi:

Metode analisis menggunakan KCKT detektor ultra violet dengan panjang

gelombang maksimal 260 nm, menggunakan kolom Chemcosorb 5-ODS-H

(150 mm x 4.6 mm i.d.) suhu 25C. Fase gerak yang digunakan adalah



campuran 10 mM kalium dihidrogen fosfat dikalium hidrogen fosfat yang

mengandung 5 mM tetra-n-butil amonium bromida (pH 7.0)-asetonitril (100:9).

Kecepatan alir 1,0 ml/menit.

2. Penetapan kadar asam nikotinat dalam plasma manusia dengan menggunakan

ekstraksi cair-cair dan kromatografi cair-spektroskopi massa (Michael et al.,

2008).

Kondisi:

Metode analisis menggunakan kromatografi cair-spektroskopi massa,

menggunakan kolom Betamax Acid (50 mm x 2,1 mm i.d., 5 m) dan bekerja

pada suhu 35C. Fase gerak yang digunakan adalah fase gerak A (0,1% asam

format dalam air) dan fase gerak B (0,1% asam format dalam asetonitril) secara

gradien. Perbandingan dimulai dengan 80:20, berubah menjadi 70% fase B

pada menit 1 s/d 1,5 menit dan kembali menjadi 20% fase B pada menit 2,5 s/d

2,7. Volume injeksi 30 l. Kecepatan alir 0,25 ml/menit. Kurva kalibrasi linear

pada rentang konsentrasi 5 - 1000 ng/ml.

3. Pengujian kadar asam nikotinat dalam plasma manusia dengan LC/MS/MS

(Lewiston et al, 2010).

Kondisi:

Metode analisis menggunakan kromatografi cair/spektroskopi massa,

menggunakan kolom Phenomenex Polar RP (150 mm x 2,0 mm i.d., 3 m).

Fase gerak yang digunakan adalah campuran air - asetonitril - air (91,5 : 8,5 :

0,1 v/v/v). Baku dalam yang digunakan adalah asam isonikotinat. Kurva

kalibrasi linear pada rentang konsentrasi 20 - 10.000 ng/ml.

4. Penetapan kadar asam nikotinat dalam plasma manusia dengan KCKT( Pelzer

et al, 1993).

Kondisi:

Metode analisis menggunakan detektor UV, menggunakan kolom IB-SIL CN.

Fase gerak yang digunakan adalah campuran asetonitril - metanol - air - asam

asetat (700:150:150:1, v/v/v/v). Baku dalam yang digunakan adalah 6-metil

nikotinat. Kurva kalibrasi linear pada rentang konsentrasi 20 - 2000 ng/ml.



5. Penentuan asam nikotinat dalam plasma tikus secara KCKT (Zhang Li et al.

(n.d)

Kondisi :

Metode analisis menggunakan detektor UV pada 261 nm, menggunakan kolom

Shim-pack VP-ODS (250 mm x 4,6 mm, 5 m). Fase gerak yang digunakan

campuran metanol-isopropil alkohol-natrium oktanil sulfonat (7:2:91 v/v).

Kecepatan alir 1,0 ml/menit dan kafein sebagai baku dalam. Batas deteksi 20

ng/ml kurva linier antara 0.22 sampai 42,6 g/ml.

6. Penentuan asam nikotinat formulasi lepas lambat dengan KCKT dalam plasma

anjing (Tsing H. (n.d))

Kondisi :

Metode analisis menggunakan detektor UV pada 263 nm, menggunakan kolom

Lichrosper C_18 (250 mm x 4,6 mm, 5 m). Fase gerak yang digunakan

campuran asetonitril 10 mM - dikalium fosfat (8 : 92 v/v) pH 4 diatur dengan

asam fosfat. Kecepatan alir 1,0 ml/menit.



BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioavailabilitas - Bioekivalensi

Departemen Farmasi Universitas Indonesia selama 12 bulan.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan terdiri dari seperangkat alat kromatografi cair kinerja

tinggi (KCKT) yang dilengkapi dengan detektor UV, kolom Kromasil C18-RP,

syringe, filter eluen, ultrasonik, timbangan analitik, vorteks, sentrifugator, pH

meter, tabung sentrifugasi, alat-alat kimia.

3.2.2 Bahan

Asam nikotinat (Sigma), inositol heksanikotinat (Sigma), teofilin (BPFI),

nikotinamid (BPFI), kafein (BPFI), plasma (PMI Jakarta), akuabides (Ika),

asetonitril, kalium dihidrogen fosfat (Merck), dikalium hidrogen fosfat (Merck),

kalium hidroksida (Merck), te trabutil amoniumbromida (Merck).

Bahan-bahan tersebut digunakan untuk membuat larutan-larutan berikut

ini :

3.2.2.1 Pembuatan Larutan Induk Asam Nikotinat

Ditimbang secara seksama lebih kurang 5,0 mg asam nikotinat, kemudian

dimasukkan ke dalam labu 50,0 ml dan dilarutkan dalam akuabides sampai tanda

batas labu ukur. Diperoleh konsentrasi larutan asam nikotinat lebih kurang 100

ppm. Pengenceran dilakukan untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi

tertentu.

3.2.2.2 Pembuatan Larutan Induk Baku Dalam

Ditimbang secara seksama masing-masing lebih kurang 5,0 mg teofilin

dan kafein kemudian dimasukkan ke dalam labu 50,0 ml dan dilarutkan dalam

akuabides sampai tanda batas labu . Diperoleh konsentrasi larutan baku dalam

lebih kurang 100 ppm. Pengenceran dilakukan untuk mendapatkan larutan dengan

konsentrasi tertentu.



3.2.2.3 Pembuatan Larutan Nikotinamid

Ditimbang secara seksama lebih kurang 5,0 mg nikotinamid kemudian

dimasukkan ke dalam labu 50,0 ml dan dilarutkan dalam akuabides sampai tanda

batas labu. Diperoleh konsentrasi larutan lebih kurang 100 ppm. Pengenceran

dilakukan untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi tertentu.

3.2.2.4 Pembuatan Larutan Inositol Heksanikotinat

Ditimbang secara seksama lebih kurang 5,0 mg inositol heksanikotinat

kemudian dimasukkan ke dalam labu 50,0 ml dan dilarutkan dalam asam klorida

metanol 0,1 N sampai tanda batas labu. Diperoleh konsentrasi larutan lebih

kurang 100 ppm. Pengenceran dilakukan untuk mendapatkan larutan dengan

konsentrasi tertentu.

3.2.2.5 Pembuatan Campuran Kalium Dihidrogen Fosfat - Dikalium Hidrogen

Fosfat 10 mM yang Mengandung Tetrabutil Ammonium Bromida 5 mM

pH 7

Ditimbang secara seksama masing-masing 0,340 gram kalium dihidrogen

fosfat, 0,436 gram dikalium hidrogen fosfat dan 0,403 gram tetrabutil ammonium

bromida kemudian dilarutkan dengan akuabides 200,0 ml. pH diatur

menggunakan KOH 0,1 N dan diencerkan dengan akuabides secukupnya hingga

250 ml. Selanjutnya disaring.

3.2.2.6 Pembuatan Larutan Fase Gerak

Larutan kalium dihidrogen fosfat - dikalium hidrogen fosfat 10 mM yang

mengandung tetrabutil ammonium bromida 5 mM pH 7 dicampur dengan

asetonitril dengan berbagai perbandingan. Selanjutnya udara dalam larutan

dihilangkan .

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Optimasi Metode Analisis

3.3.1.1 Penentuan Panjang Gelombang Optimum

Dibuat spektrum UV larutan asam nikotinat 10 g/ml dalam fase gerak

campuran kalium dihidrogen fosfat dikalium hidrogen fosfat 10mM yang

mengandung tetrabutil amonium bromida 5 mM pH 7 dan asetonitril (100:9).



Serapan diukur pada 200-400 nm. Hal serupa dilakukan untuk kafein 10 g/ml

dan teofilin 10 g/ml.

3.3.1.2 Pemilihan Konsentrasi Dapar Fase Gerak untuk Analisis Asam Nikotinat

Larutan standar asam nikotinat 5 g/ml disuntikkan sebanyak 20 l ke

dalam kolom dengan kondisi awal fase gerak kalium dihidrogen fosfat dikalium

hidrogen fosfat 10mM yang mengandung tetrabutil amonium bromida 5 mM pH 7

dan asetonitril (100:9) dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit dan dideteksi pada

panjang gelombang terpilih. Selanjutnya dicatat waktu retensi, area, faktor ikutan,

jumlah lempeng teoritis dan HETP. Dilakukan pula hal yang sama untuk fase

gerak kalium dihidrogen fosfat dikalium hidrogen fosfat 5mM yang

mengandung tetrabutil amoniumbromida 5 mM pH 7 - asetonitril (100:9).

3.3.1.3 Pemilihan Komposisi Fase Gerak untuk Analisis Asam Nikotinat


dalam kolom dengan kondisi awal fase gerak kalium dihidrogen fosfat dikalium

hidrogen fosfat 10mM yang mengandung tetrabutil amonium bromida 5 mM pH

7- asetonitril (100:9) dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit dan dideteksi pada

panjang gelombang terpilih. Selanjutnya dicatat waktu retensi, area, faktor ikutan,

jumlah lempeng teoritis dan HETP. Dilakukan pula hal yang sama untuk fase

gerak KH2PO4 10 mM yang mengandung tetrabutil amonium bromida 5 mM pH

7 - asetonitril (100:11) dan (100:7).

3.3.1.4 Pemilihan Kecepatan Alir Fase Gerak untuk Analisis Asam Nikotinat


dalam alat KCKT dengan fase gerak terpilih dengan kecepatan alir 0,8; 1,0; 1,2

ml/menit, kemudian dicatat waktu retensi, area, faktor ikutan, HETP dan jumlah

lempeng teoritis.

3.3.1.5 Penentuan Waktu Retensi Nikotinamid dan Inositol Heksanikotinat

Larutan standar nikotinamid 5 g/ml dan larutan standar inositol

heksanikotinat 5 g/ml disuntikkan sebanyak 20 l ke dalam kolom dengan

kondisi awal fase gerak kalium dihidrogen fosfat dikalium hidrogen fosfat



10mM yang mengandung tetrabutil amoniumbromida 5 mM pH 7 dan asetonitril

(100:9) dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit dan dideteksi pada panjang gelombang

terpilih. Selanjutnya dicatat waktu retensi, area, faktor ikutan, jumlah lempeng

teoritis dan HETP.

3.3.1.6 Pemilihan Baku Dalam untuk Analisis Asam Nikotinat

Larutan standar asam nikotinat dan larutan kafein dengan konsentrasi 5

g/ml, kemudian disuntikkan sebanyak 20,0 l ke alat KCKT dengan fase gerak

dan kecepatan alir terpilih. Ditentukan waktu retensi dan resolusinya. Dilakukan

hal yang sama untuk baku dalam teofilin.

3.3.1.7 Uji Kesesuaian Sistem

Larutan asam nikotinat dan baku dalam terpilih dengan konsentrasi 10

g/ml disuntikkan sebanyak 20 l ke alat KCKT dengan fase gerak dan kecepatan

alir terpilih, diulangi sebanyak 6 kali. Kemudian ditentukan area, jumlah lempeng

teoritis, resolusi dan koefisien variasi.

3.3.1.8 Pemilihan Pengendap untuk Ekstraksi Asam Nikotinat

Ke dalam tabung sentrifus dimasukkan 0,5 ml sampel plasma yang

mengandung asam nikotinat dengan konsentrasi 1 g/ml dan 50 l baku dalam

terpilih (10 g/ml). Sampel plasma selanjutnya diekstraksi dengan cara sebagai

berikut : pada tabung sentrifus ditambahkan 1000 l asam perklorat 0,6 M.

Setelah itu tabung ditutup, kemudian dikocok menggunakan vorteks selama 30

detik hingga homogen, dibiarkan selama 5 menit dan disentrifugasi 3000 rpm

selama 15 menit. Supernatan sebanyak 20 l disuntikkan dengan fase gerak dan

kecepatan alir optimum. Deteksi menggunakan detektor UV pada panjang

gelombang terpilih. Kemudian dicatat waktu retensi, area dan % recovery. Hal

yang sama dilakukan untuk pengendap metanol.

3.3.1.9 Pemilihan Waktu Vorteks untuk Ekstraksi Asam Nikotinat





terpilih (10 g/ml). Sampel plasma diekstraksi dengan cara sebagai berikut : pada

tabung sentrifus ditambahkan 1000 l asam perklorat 0,6 M . Setelah itu tabung

ditutup, kemudian dikocok menggunakan vorteks selama 5, 10, 15 dan 30 detik

hingga homogen, dibiarkan selama 5 menit dan disentrifugasi 3000 rpm selama 15

menit. Supernatan sebanyak 20 l disuntikkan dengan fase gerak dan kecepatan

alir optimum. Deteksi menggunakan detektor UV pada panjang gelombang

terpilih. Kemudian dicatat waktu retensi, area dan % recovery.

3.3.1.10 Pemilihan Waktu Sentrifugasi untuk Ekstraksi Asam Nikotinat



terpilih (10 g/ml). Sampel plasma diekstraksi dengan cara sebagai berikut : pada

tabung sentrifus ditambahkan 1000 l asam perklorat 0,6 M. Setelah itu tabung

ditutup, kemudian dikocok menggunakan vorteks selama waktu 15 detik, dan

disentrifugasi 3.000 rpm selama 10, 15 dan 20 menit. Supernatan disuntikkan

sebanyak 20 l ke alat KCKT dengan fase gerak dan kecepatan alir optimum.

Deteksi menggunakan detektor UV pada panjang gelombang terpilih. Kemudian

dicatat waktu retensi, area dan % recovery.

3.3.2 Validasi Metode Analisis dalam Plasma secara in vitro

3. 3. 2. 1 Batas Kuantitasi (LOQ) dan Batas Kuantisasi Terendah (LLOQ)


mengandung asam nikotinat dengan konsentrasi bertingkat (200, 1000, 2000,

3000, 4000 dan 5000 ng/ml) dan 50 l baku dalam terpilih (10 g/ml). Sampel

plasma diekstraksi sesuai dengan kondisi yang sudah optimum. Supernatan

disuntikkan sebanyak 20 l ke alat KCKT dengan fase gerak dan kecepatan alir

optimum. LOQ dihitung secara statistik melalui garis regresi linear dari 6

konsentrasi yang telah dibuat. LLOQ diperoleh dengan mengencerkan konsentrasi

LOQ dari sampel dengan blanko plasma hingga 1/2 atau 1/4, lalu diukur melalui

lima replikasi. Dari data pengukuran kemudian dihitung nilai % diff dan koefisien

variasinya (KV). LLOQ adalah kondisi terendah yang menunjukkan akurasi (nilai



% diff) tidak menyimpang dari -20% sampai +20% dan presisi (koefisien variasi)

tidak menyimpang dari -20% sampai +20%.

3.3.2.2 Kurva Kalibrasi dan Uji Linieritas

Terdiri dari 1 sampel blanko (matriks tanpa baku dalam), 1 sampel zero

(matriks dengan baku dalam), dan 6 sampel plasma dengan konsentrasi berbeda.

Pada tiap-tiap sampel plasma dilakukan prosedur sebagai berikut : ke dalam

tabung sentrifus dimasukkan 0,5 ml sampel yang mengandung asam nikotinat

dengan 6 konsentrasi berbeda (124,84 1000, 2000, 3000, 4000 dan 5000 ng/ml)

serta 50 l baku dalam terpilih (10 g/ml), kemudian diekstraksi sesuai dengan

kondisi yang sudah optimum. Supernatan kemudian disuntikkan sebanyak 20 l

ke alat KCKT dengan fase gerak dan kecepatan alir optimum. Selanjutnya dibuat

kurva persamaan regresi linear (y = a + bx), dimana x adalah konsentrasi asam

nikotinat dan y adalah perbandingan area asam nikotinat dan baku dalam.

Linearitas dari kurva kalibrasi dilihat dengan menghitung koefisien korelasi dari

persamaan garis regresi linear.

3.3.2.3 Uji Keterulangan (Presisi)


mengandung asam nikotinat dengan 3 konsentrasi berbeda (374,52; 2187,25; dan

4000 ng/ml ) dan 50 l baku dalam terpilih ( 10 g/ml), kemudian sampel plasma

diekstraksi sesuai dengan kondisi yang sudah optimum. Supernatan disuntikkan


Diulangi sebanyak lima kali, kemudian dihitung nilai simpangan baku relatif atau

koefisien variasi (KV) dari masing-masing konsentrasi larutan tersebut.

3.3.2.4 Uji Akurasi


mengandung asam nikotinat dengan 3 konsentrasi berbeda (374,52; 2187,24 dan

4000 ng/ml) dan 50 l baku dalam terpilih (10 g/ml), kemudian sampel plasma

diekstraksi sesuai dengan kondisi yang sudah optimum. Supernatan disuntikkan




Diulangi sebanyak lima kali, kemudian dicatat areanya. Akurasi diperiksa dengan

menghitung perbedaan nilai terukur dengan nilai sebenarnya (% diff).

3.3.2.5 Uji Selektivitas

Pengukuran dilakukan pada 6 blanko plasma manusia yang berbeda. Pada

tiap-tiap blanko plasma dilakukan prosedur sebagai berikut : ke dalam tabung

sentrifus dimasukkan 0,5 ml sampel plasma yang mengandung asam nikotinat

pada konsentrasi 124,84 ng/ml dan 50 l baku dalam (10 g/ml), kemudian

diekstraksi sesuai dengan kondisi yang sudah optimum. Supernatan sebanyak 20

l ke alat KCKT dengan fase gerak dan kecepatan alir optimum. Diamati adanya

gangguan pada kromatogram di sekitar waktu retensi asam nikotinat, kemudian

dihitung nilai koefisien variasi (KV) dan akurasinya (% diff).

3.3.2.6 Uji Perolehan Kembali (% recovery)


mengandung asam nikotinat dengan 3 konsentrasi berbeda (374,52; 2187,25 dan

4000 ng/ml) dan 50 baku dalam terpilih (10 g/ml), kemudian sampel plasma

diekstraksi sesuai dengan kondisi yang sudah optimum. Supernatan sebanyak 20

l ke alat KCKT dengan fase gerak dan kecepatan alir optimum. Diulangi

sebanyak lima kali, kemudian dicatat area dan dihitung nilai perolehan kembali

(% recovery). Nilai perolehan kembali (% recovery) dihitung dengan

membandingkan konsentrasi obat dalam plasma yang diperoleh dari hasil

ekstraksi dengan konsentrasi obat sebenarnya.

3.3.2.7 Pengujian Stabilitas Larutan Stok Asam Nikotinat

Dilakukan pada larutan stok asam nikotinat 5 g/ml yang mengandung baku

dalam 5 g/ml. Larutan disuntikkan sebanyak 20 l ke alat KCKT dengan fase

gerak dan kecepatan alir optimum pada jam ke 0, jam ke 6 sampai 10 hari.

Diamati adanya ketidakstabilan zat dengan menghitung nilai % diff dan diamati

bentuk masing-masing kromatogram.



3.3.3 Stabilitas Inositol Heksanikotinat

1) Stabilitas larutan asam nikotinat dengan adanya inositol heksanikotinat dalam

pelarut pengekstraksi

Pengujian dilakukan pada konsentrasi larutan standar asam nikotinat 374.52

ng/ml yang mengandung larutan kafein 1 g/ml dalam larutan asam perklorat

0.6 M. Larutan tersebut selanjutnya ditambahkan 50 l larutan inositol

heksanikotinat 100 g/ml. Larutan standar tersebut disimpan pada temperatur

kamar dan disuntikkan sebanyak 20 l ke alat KCKT dengan fase gerak dan

kecepatan alir optimum. Pengukuran dilakukan pada jam ke 0; 1; 2; 3; 6 jam

dan untuk hari ke 1 pada penyimpanan di lemari pendingin (5C). Diamati

adanya ketidakstabilan zat dengan menghitung nilai % diff dan diamati bentuk

masing-masing kromatogramnya.

2) Stabilitas jangka pendek asam nikotina

T31527-Optimasi dan.pdf

Documents

Transcript of T31527-Optimasi dan.pdf