Spektrum IR Senyawa Hasil Isolas.pdf

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006 USU Repository©2006

RINGKASAN

Puding merah (Gruptophyllum pictum L Griff) merupakan tumbuhan perdu atau

pohon kecil yang banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk berbagai keperluan seperti

untuk obat berbagai penyakit dan pelembut kulit.

Dari uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak daun Puding merah (Graptophyllum

pictum L Griff) mengandung senyawa fenolik. Atas dasar pertimbangan ini maka dilakukan

isolasi dan penentuan struktur senyawa fenolik dari tumbuhan ini dan uji bioassay senyawa

tersebut terhadap larva Artemia salina.

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol. Pemisahan

dan pemurnian lebih lanjut terhadap ekstrak etanol dilakukan dengan cara kromatografi

kolom dan diperoleh kristal sebanyak 37 mg.

Karakterisasi struktur dilakukan dengan spektroskopi IR dan 1H-NMR, Spektrum IR

senyawa hasil isolasi memperlihatkaan pita serapan pads angka gelombang 3431, 3121,

3057, 1618, 1462, 1340, 1060, 970 dan 800 cm-1. Spektrum 1H-NMR memperlihatkan

pergeseran kimia pada 1,5 ; 6,3 dan 7,6 ppm.

Berdasarkan uji fitokimia dan analisis spektrum 1R dan 1H-NMR maka disimpulkan

bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa fenolik yaitu suatu jenis senyawa flavonoid.

Uji bioassay senyawa hasil isolasi menunjukkan aktifitas biologis terhadap larva

Artemia salina yang memberikan harga LC50 sebesar 124,08 μg/ml. ii


DAFTAR ISI

Halaman

LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN .................................................. i

RINGKASAN ......................................................................................................ii

KATA PENGANTAR ......................................................................................... iii

DAFTAR ISI ....................................................................................................... iv

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................v

I. PENDAHULUAN ............................................................................................1

II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................3

III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .................................................15

IV. METODE PENELITIAN ..............................................................................16

V. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................19

VI. KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................................21

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………...22

LAMPIRAN ........................................................................................................23

iv


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Spektrum IR Senyawa Hasil Isolasi………………………….. 23

Lampiran 2. Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi……………........... 24

v


1

I. PENDAHULUAN

Bahan-bahan hayati telah digunakan oleh manusia untuk memenuhi berbagai

keperluan hidup. Indonesia yang beriklim tropis memiliki sumber daya alam hayati yang

sangat beranekaragam yang memproduksi beraneka ragam senyawa kimia karbon alami.

Hutan tropik Indonesia terdapat tumbuh-tumbuhan yang peranannya dalam era

teknologi tidak kalah pentingnya dengan sumber daya alam lainnya seperti gas, batu bara,

mineral dan lain-lain. Dari segi kimia, sumber daya alam hayati ini merupakan

sumber-sumber senyawa kimia yang tak terbatas jenis maupun jumlahnya. Dengan demikian

keanekaragaman hayati dapat diartikan sebagai keanekaragaman kimiawi yang mampu

menghasilkan bahan-bahan kimia baik untuk kebutuhan manusia maupun untuk organisme

lain seperti untuk obat-obatan, insektisida, kosmetika dan sebagai bahan dasar sintesa

senyawa organik yang lebih bermanfaat.

Dalam pengobatan secara tradisional sebagian besar ramuan berasal dari

tumbuh-tumbuhan baik berupa akar, kulit batang, kayu, daun, bunga atau bijinya. Agar

pengobatan secara tradisional dapat dipertangggung jawabkan maka diperlukan penelitian

ilmiah seperti penelitian di bidang farmakologi, toksikologi, identifikasi dan isolasi zat kimia

aktif yang terdapat dalam tumbuhan.

Tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L griff) sering ditemukan tumbuh

liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar. Daun berkhasiat

sebagai peluruh kencing (diuretik), mempercepat pemasakan bisul, pencahar ringan dan

pelembut kulit dan bunganya sebagai pelancar haid. (Dalimartha, 1999).

Tumbuhan umumnya mengandung senyawa aktif dalam bentuk metabolit sekunder

seperti alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, kumarin dan lain-lain. Senyawa bioaktif

hampir selalu toksik pada dosis tinggi. Oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa

terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang

mempunyai bioaktifitas.


2

Salah satu organisme yang sangat sesuai untuk hewan uji tersebut adalah brine shrimp

(udang laut). Brine shrimp test sudah digunakan untuk berbagai sistem bioassay yaitu untuk

menganalisa residu pestisida, mikotoksin, polutan pada air sungai, ananstetik, toksin

dinofagelata, senyawa yang berupa morfin, toksisitas pada dispersant minyak dan

kokarsinogenik ester phorbol. Dalam fraksinasi yang diarahkan dengan bioassay, metoda

brine shrimp telah digunakan untuk memonitor fraksi aktif mikotoksin dan antibiotik pada

ekstrak jamur. (Dharma. A,2001)

Kebanyakan kandungan kimia utama yang diisolasi dari tumbuhan akhir-akhir ini

aktifitas biologisnya belum terungkap karena belum diteliti. Potensi ini perlu untuk

didayagunakan untuk kemanusiaan dan juga untuk menjaga kelestarian tumbuhan tersebut

dengan menggali potensi bahan alam untuk bahan obat, untuk mengontrol hama tumbuhan

dan lain-lain.

Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini dimaksudkan untuk mengisolasi

kandungan kimia utama Puding Merah (Graptophyllum pictum L griff) dan menentukan

bioaktifitasnya melalui uji brine shrimp.


3 II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Tinjauan Botani Tumbuhan (Graptophyllum pictum L Griff)

Tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L griff) sering ditemukan tumbuh

liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar. Tumbuhan ini

berupa perdu atau pohon kecil, tinggi 1,5 - 3 m, batang berkayu, kulit dan daun berlendir dan

buahnya kurang enak. Cabang bersudut tumpul, berbentuk galah dan beruas rapat. Daun

tunggal bertangkai pendek letaknya berhadapan bersilang, bulat telur sampai lanset, ujung

dan pangkal runcing, tepi bergelombang, pertulangan menyirip, panjang 8 - 20 cm, lebar

3 - 13 cm, permukaan atas warnanya ungu mengkilap. Perbungaan majemuk, keluar dari

ujung batang, tersusun dalam rangkaian berupa tandan yang panjangnya 3 – 12 cm, warna

merah keunguan. Buahnya buah kotak, bentuknya lonjong, warnanya ungu kecoklatan.

Daun berkhasiat sebagai peluruh kencing (diuretik), mempercepat pemasakan bisul,

pencahar ringan dan pelembut kulit dan bunganya sebagai pelancar haid. (Dalimartha, 1999) 2.2. Teknik Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder

Untuk mengisolasi suatu senyawa kimia yang berasal dari bahan alam hayati pada

dasarnya menggunakan metode yang sangat bervariasi, seperti yang diaplikasikan dalam

proses industri. Metode pengempaan digunakan pada senyawa katecin dari daun gambir juga

isolasi CPO dari buah kelapa sawit.

Metode ini umum digunakan karena senyawa organik yang diperoleh dengan

kuantitas yang cukup banyak. Tetapi berbeda dengan senyawa bahan alam hasil proses

metabolit sekunder lainnya yang pada umumnya dengan kandungan yang relatif kecil, maka

metode-metode dalam proses industri tersebut tidak dapat digunakan.

Berdasarkan hal diatas maka metode yang umum dalam isolasi senyawa metabolit

sekunder dapat digunakan. Metode standar laboratorium dengan kuantitas sampel terbatas

dan perlunya menentukan metode yang paling sesuai dengan maksud tersebut. (Darwis.D,

2000)

Dari identifikasi awal, maka dapat diamati kandungan senyawa dari tumbuhan

sehingga untuk isolasi dapat diarahkan pada suatu senyawa yang lebih dominan dan salah


4

satu usaha mengefektifkan isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan

pelarut organik yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih

mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya senyawa non polar lebih mudah larut dalam

pelarut non polar. (Harborne, 1987) 2.2.1. Identifikasi Kandungan Kimia

Sebelum melakukan isolasi terhadap suatu senyawa kimia yang diinginkan dalam

suatu tumbuhan maka perlu dilakukan identifikasi pendahuluan kandungan senyawa

metabolit sekunder yang ada pada masing-masing tumbuhan, sehingga dapat diketahui

kandungan senyawa yang ada secara kualitatif dan mungkin juga secara kuantitatif golongan

senyawa yang dikandung oleh tumbuhan tersebut. untuk tujuan tersebut maka diperlukan

metoda persiapan sampel dan metoda identifikasi pendahuluan dari senyawa metabolit

sekunder sebagai berikut (Darwis.D, 2000)

a. Senyawa Alkaloid Metode yang cukup dikenal adalah metode identifikasi pandahuluan Culvenor Fitgerald

yaitu 4 gram sampel dipotong halus, digerus dengan lumpang dengan bantuan pasir yang

bersih dan dibasahi dengan 10 ml kloroform. ditambah dengan kloroforrn amoniak 0,05

M, digerus kembali dan disaring kedalam tabung reaksi, ditambah 0,5 ml asam sulfat 2 N,

kocok dan biarkan terjadi dua lapisan. Ambil lapisan asam sulfat dan masukkan kedalam

tabung` reaksi dan kemudian tambahkan satu tetes pereakksi meyer. Terbentuknya

endapan putih menandakan positif alkaloid.

b. Senyawa Terpenoid, steroid, fenolik, flavonoid dan saponin

4 gram sampel segar dirajang halus dan dididihkan dengan 25 ml etanol selama lebih

kurang 25 menit, disaring dalam keadaan panas, kemudian pelarut diuapkan sampai

kering. Ektrak dikocok kuat dengan kloroform lulu ditambahkan air suling, biarkan

sampai terbentuk dua lapisan.

- Lapisan kloroform diteteskan pada plat tetes dan biarkan kering, tambahkan beberapa

tetes asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann Burchard).

Terbentuknya warna merah atau pink menandakan positif untuk senyawa terpenoid dan

terbentuknya warna biru atau hijau positif untuk steroid.


5 - Lapisan air

* 1 ml lapisan air dikocok selama satu menit, terbentuknya busa yang tidak hilang selama 5

menit menandakan adanya saponin.

* Beberapa tetes ditempatkan dalam tabung reaksi ditambahkan besi (III) klorida, timbul

warna hijau sampai ungu menandakan positif fenolik

* Beberapa tetes ditempatkan dalam tabung reaksi, ditambahkan asam klorida pekat dan

serbuk magnesium dan timbulnya warna merah menunjukkan adanya flavonoid.

2.2.2. Ekstraksi dan Isolasi Secara umum ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari seluruh bagian tunbuhan

seperti bunga, buah, daun, kulit batang dan akar menggunakan sistem maserasi menggunakan

pelarut organik polar seperti metanol.

Beberapa metode ekstraksi senyawa organik bahan alam yang umum digunakan antara lain:

(Darwis. D,2000) 1. Maserasi

Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan

pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalamisolasi senyawa bahan alam

karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran

sel akibat perbedaan tekanan antara didalam dan diluar sel sehingga metabolit sekunder yang

ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan

sempuma karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk

proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan kelarutan

senyawa bahan alam alam pelarut tersebut. Secara umum pelarut metanol merupakan pelarut

yang paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alum, karena

dapat melarutkan seluruh golongan metabolit sekunder.

2. Perkolasi

Merupakan proses melewatkan pelarut organik pada sampel sehingga pelarut akan membawa

senyawa organik bersama-sama pelarut. Tetapi efektifitas dari proses ini hanya akan lebih

besar untuk senyawa organik yang sangat mudah larut dalam pelarut yang digunakan.

6

3. Sokletasi

Menggunakan soklet dengan pemanasan dan pelarut akan dapat dihemat karena terjadinya

sirkulasi pelarut yang selalu membasahi sampel. Proses ini sangat baik untuk senyawa yang

tidak terpengaruh oleh panas

4. Destilasi Uap

Proses destilasi lebih banyak digunakan untuk senyawa organik yang tahan pada suhu yang

cukup tinggi, yang lebih tinggi dari titik didih pelarut yang digunakan. Pada umumnya lebih

banyak digunakan untuk minyak atsiri.

5. Pengempaan

Metode ini lebih banyak digunakan dalam proses industri seperti pada isolasi CPO dari buah

kelapa sawit dan isolasi katecin dari daun gambir. Dimana pada proses ini tidakmenggunakan

pelarut.

Hasil yang diperoleh berupa ekstrak yang mana seluruh senyawa bahan alam yang

terlarut dalam pelarut yang digunakan akan berada pada ekstrak ini.

Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT)

dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan

komponen-komponen pada KLT dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk

memisahkan komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi dan sebagai

fasa diam dapat digunakan silika gel dan eluen yang digunakan berdasarkan basil yang

diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalau kepolaraan eluen pada kolom kromatografi

sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT.

'F

Pemilihan eluen sebaiknya dimulai dari pelarut organik yang tidak polar seperti

heksana dan peningkatan kepolaran dengan etil asetat atau pelarut yang lebih polar lainnya

masing-masing pelarut (Harbone, 1987).



7

2.2.3 Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur

Suatu senyawa bahan alam hasil isolasi akan diidentifikasi berdasarkan kimia, fisika

dan identifikasi dengan spektroskopi. Dari isolasi yang dengan menggunakan metoda standar

tidak semua senyawa akan secara utuh seperti yang terdapat dalam tumbuhan tersebut, karena

sebagian senyawa ada yang terlarut dan terpecah selama proses isolasi dan hasil terjadi seperti

putusnya ikatan glikosida membentuk aglikon dan gula dengan adanya air.

Identifikasi senyawa metabolit sekunder dan elusidasi struktur senyawa ditemukan

merupakan pekerjaan yang sangat menentukan dalam proses mengenal, mengetahui dan pada

akhirnya menetapkan rumus molekul yang aebenarnya dari senyawa tersebut.

Diantara metode identifikasi dan elusidasi struktur yang diperoleh dapat dilakukan

dengan metoda standar yang sudah dikenal untuk menentukan senyawa kimia dan termasuk

derivat-derivatnya antara lain : (Silverstein, 1991)

1. Metoda Spektroskopi

Metoda spektroskopi saat ini sudah merupakan metoda standar dalam

penentuan struktur senyawa organik pada umumnya dan senyawa metabolit

sekunder pada khususnya. Metoda tersebut terdiri dari beberapa peralatan dan

mempunyai hasil pengamatan yang berbeda, yaitu

a. Spektroskopi UV

Merupakan metoda yang akan memberikan informasi adanya kromofor dari senyawa

organik dan membedakan senyawa aromatik atau senyawa ikatan rangkap yang

berkonjugasi dengan senyawa alifatik rantai jenuh.

b. Spektroskopi IR

Metoda yang dapat menentukan serta mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat

dalam senyawa organik, yang mana gugus fungsi dari senyawa organik akan dapat

ditentukan berdasarkan ikatan dari tiap atom dan merupakan bilangan frekuensi yang

spesifik.

c. Nuklir Magnetik Resunansi Proton Metoda ini akau mengetahui posisi atom-atom

karbon yang mempunyai proton atau tanpa proton. Disamping itu akan dikenal

atom-atom lainnya yang berkaitan dengan proton

d. Nuklir Magnetik Kesonansi Isotop Karbon 13


8

Digunakan untuk mengetahui jumlah atom karbon dan menentukan jenis atom karbon

pada senyawa tersebut.

e. Spektroskopi massa

mengetahui berat molekul senyawa dan ditunjang dengan adanya fragmentasi ion

molekul yang menghasilkan pecahan-pecahan spesifik untuk suatu senyawa

berdasarkan m/z dari masing-masing fragmen yang terbentuk. Terbentuknya

fragmen-framen dengan terjadinya pemutusan ikatan apabila disusun kembali akan

dapat menentukan kerangka struktur senyawa yang diperiksa.

2. Kromatografi Penggunaan kromatografi sangat membantu dalam pendeteksian senyawa metabolit

sekunder dan dapat dijadikan sebagai patokan untuk proses pengerjaan berikutnya dalam

menentukan struktur senyawa.

Berbagai jenis kromatografi yang umum digunakan antara lain (Darwis.D,2000)

a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

Merupakan salah satu metoda identifikasi awal untuk menentukan kemurnian senyawa

yang ditemukan atau dapat menentukaan jumlah senyawa dari ekstrak kasar metabolit

sekunder.. Cara ini sangat sederhana dan merupakan suatu pendeteksian awal dari basil

isolasi.

b. Kromatografi Kolom

Digunakan untuk pemisahan campuran beberapa senyawa yang diperoleh dari isolasi

tumbuhan. Dengan menggunakan fasa padat dan fasa cair maka fraksi-fraksi senyawa

akan menghasilkan kemurnian yang cukup tinggi. c. Kromatografi Gas

Pemisahan campuran senyawa yang cukup stabil pada pemanasan, karena

sampelyangdigunakan akan dirobah menjadi fasa gas dan dengan adanya perbedaan

keterikatan senyawa pada fasa padat yang digunakan terhadap senyawa organik sehingga

terjadi pemisahan musing-musing senyawa dari campurannya.

d. Kromatografi Cair


9

Lebih dikenal dengan HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) dan lebih dari 75

% dari pemakaiaan HPLC menggunakan fasa padat ODS (Oktadesil Sifane) atau C-18

sedangkan fasa cair sebagai pefarut pembawa senyawa dapat diganti kepolarannya pada

saat digunakan dan kondisi seperti itu dikenal sebagai fasa gradien. Pada kondisi gradien,

senyawa non polar akan diadsorpsi lebih lemah oleh fasa padat dan akan dielusi dengan

pelarut non polar dan sebaliknya senyawa polar akan diadsorpsi lebih kuat dan

membutuhkan pelarut polar. Jika sampel mempunyai polaritas yang luas, pemisahan

harus dilakukan dengan merubah kepolaran pelarut yang digunakan. efisiensi penggunaan

HPLC ditentukan dengan pengaturan dan penggunaan peralatan sebagai pembantu dalam

pemakaian HPLC.

2.3. Uji Bioaktifitas Senyawa Metabolit Sekunder

Dipermukaan bumi ini terdapat ratusan ribu spesies yang masing-masing berpotensi

mengandung metabolit sekunder yang unik. Dengan demikian jumlah senyawa metabolit

sekunder pun menjadi sangat banyak. Di antaranya ada yang mempunyai aktifitas biologis

dan ada pula yang tidak aktif biologis.

Untuk penapisan senyawa berkhasiat dari sumber alam maupun dari bahansintetik

yang jumlahnya ribuan diperlukan suatu metode penapisan yang cepat dan akurat. Untuk

mempersempit jumlah bahan yang akan ditapis secara bioassay bisa juga dilakukan penapisan

etnofarmasi terlebih dahulu. Dalam hal ini bahan yang akan diuji hanyalah yang secara

tradisional digunakan oleh masyarakat sebagai obat.

Penemuan bahan berkhasiat dari bahan alam maupun dari perpustakaan senyawa yang

dihasilkan dari program "Combinatorial Chemistry" memerlukan teknologi penapisan

senyawa khasiat dan teknologi isolasi dengan tuntunan uji bioekatifitas. Bioassay bisa

dilakukan in vivo maupun in vitro. Tetapi untuk penapisan senyawa dengan aktifitas tertentu

diperlukan suatu bioassay yang sederhana dan cepat sehingga dapat menapis banyak senyawa

dalam waktu yang lama dan tidak memerlukan banyak biaya. Untuk penapisan bahan khasiat,

dilakukan dengan dua kelompok assay yaitu selular dan molekular assay. Uji bioaktifitas

selular menggunakan sel utuh dengan target random yaitu apa saja yang menghambat

pertumbuhan sel. Sedangkan uji bioaktifitas molekuler menggunakan sistem terisolasi seperti

enzim, reseptor, DNA dan lain-lain dengan target subseluler tunggal. (Dharma. A,2001)

10

Dalam hal ini bioassay terhadap senyawa bahan alam dilakukan dengan mengukur

daya hambat senyawa terhadap aktifitas enzim farnesil transperase. Prosedur bioassay dari

senyawa alam maupun sintetis sangat tergantung pada aktifitas biologis apa yang dicari atau

ditapis dari perpustakaan senyawa yang ada.

Bioassay sangat murah, mudah dan cepat merupakan pilihan untuk menapis senyawa

bahan alam, baik penapisan esktrak kasar maupun dalam penapisan fraksi-fraksi sewaktu

isolasi, diantaranya adalah : (Dharma. A,2001)

1. Aktivitas racun terhadap ikan (Piscidal Activity). Salah satu bioassay berdasarkan brine

shrimp bioassay. Tumbuhan yang mempunyai aktititas racun bagi ikan juga ditemukaan

mempunyai aktifitas lain seperti insektisida, inhibitor pertumbuhan tumbuhan,

co-karsinogen atau irritant. Dalam hal ini, aktifitas piscidal merupakan marker yang

berguna untuk bioaktifitas lainnya.

2.Aktifitas untuk menghambat pertumbuhaaan mikroba seperti pada uji antimikroba dan anti

jamur. Bioassay untuk anti mikroba dapat dilakukan dengan menguji daya hambat

pertumbuhan mikroba dalam medium padat oleh senyawa yang diuji dan menguji daya

hambat senyawa uji terhadap enzim yang berfungsi dalam sintesis protein, DNA atau

dinding sel. Metoda yang paling sederhana adalah dengan melakukan uji daya hambat

senyawa uji terhadap pertumbuhan mikroba tersebut pada medium padat.

3. Uji Antifeedant untuk mendeteksi dan mengisolasi senyawa metabolit sekunder tumbuhan

yang bersifat aktif biologis terhadap Serangga. ekstrak tumbuhan yang diuji ditambahkan

kedalam makanan serangga, kemudian beberapa jenis serangga uji diberi makan dengan

diet yang telah dicampur dengan ekstrak uji dan kemudian serangga tersebut dianalisa.



11 2.3.1. Uji Antimikroba

Pemakaian antibakteri yang berlebihan menyebabkan mikroba yang semula sensitif

terhadap antibiotik menjadi resisten. Oleh karena itu, senyawa antibakteri diperlukan untuk

mengatasi bakteri resisten tersebut. Disamping itu juga perlu pengembangan antiseptik dan

desinfektan baru yang lebih aman bagi kulit dan jaringan manusia. Umumnya antibiotik yang

ada sekarang adalah metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme sedangkan

antibiotik dari tumbuhan tingkat tinggi masih dalam pencarian. Metode uji anti mikroba dari

tumbuhan:(Hostettmann. K, 1991)

1. Sampel (bagian tumbuhan) diekstrak dengan cara dan pelarut yang sesuai. Ektraksi bisa

dilakukan dengan perendaman, soklet dan lainnya. Pelarut yang digunakan akan bisa

bervariasi tergantung dengan senyawa target dan biasanya etanol. Ekstrak dipekatkan dan

dikeringkan.

2. Larutan stock (dalam air atau etanol 85 %) dengan konsentrasi 1000 mg/ml disiapkan.

Larutan stock adalah larutan ekstrak yang akan diuji bioaktifitasnya. Larutan ini nantinya

akan diencerkan dengan air hingga diperoleh konsentrasi yang diketahui.

3. Persiapan biakan bakteri atau jamur uji. Bakteri dibiakan pada medium nutrien agar slant

dan ragi/jamur pada sabouroud agar slant. Inolukasi ini dinkubasi pada 37°C untuk bateri

dan 30°C untuk jamur.

4. Persiapkan medium agar pada cawan petri untuk uji bioaktifitas

5. Uji bioaktifitas antibiotik dari esktrak dapat dilakukan dengan tiga metode yaitu :

- Metode difusi.

Dengan metode difusi ini, ekstrak uji yang diserap dengan kertas saring dimasukkan ke

dalam silinder atau dimasukkan ke dalam lubang, dikontakkan dengan media yang telah

diinokulasi. Kemudian setelah diinkubasi, diameter daerah bening di sekitar reservior

diukur. Diameter daerah bening ini merupakan daerah inhibisi dari kestrak sampel

terhadap mikroba uji. Untuk menurunkan limit deteksi, sistem dibiarkan pada suhu

rendah selama beberapa jam sebelum diinokulasi, yaitu untuk memberikan kesempatan

kepada antibiotik untuk berdifusi sebelum mikroba tumbuh.

-Metoda Pengenceran

Pada metoda pengenceran, Sampel yang akan diuji dicampur dengan medium yang cocok


12

yang sebelumnya telah diinokulasi dengan mikroba uji. Setelah inkubasi, pertumbuhan

mikroba dapat ditentukan dengan cara visual atau dengan perbandingan turbidimetri dari

kultur uji dengan kultur kontrol. Kurtul kontrol adalah kultur yang tidak diberi sampel

yang akan diuji bioaktifitasnya.

-Metoda Bioautografi

Merupakan metoda untuk menentukan tempat (posisi) senyawa yang mempunyai aktifitas

mikroba pada kromatogram. Caranya adalah dengan memindahkan senyawa uji dari

kromatogram lapis tipis atau kertas ke medium agar yang sudah diinokulasi dengan

mikroba uji. Daerah inhibisi kemudian dilihat dengan cara yang sesuai.

2.3.2. Uji Brine Shrimp Lethality Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi. Oleh karena itu daya bunuh in

vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak

tumbuhan yang mempunyai bioaktifitas dan juga untuk memonitor fraksi bioaktif selama

fraksinasi dan pemurnian . (Meyer, 1982).

Salah satu organisme yang sangat sesuai untuk hewan uji tersebut adalah brine shrimp

(udang laut). Brine shrimp test sudah digunakan untuk berbagai sistem bioassay yaitu untuk

menganalisa residu pestisida, mikotoksin, polutan pada air sungai, ananstetik, toksin

dinoflagelata senyawa yang berupa morfin, toksisitas pada dispersant minyak dan

kokarsinogenik ester phorbol. Dalam fraksinasi yang diarahkan dengan bioassay, metoda brine

shrimp telah digunakan untuk memonitor fraksi aktif mikotoksin dan antibiotik pada ekstrak

jamur. (Abdi,2001)

Metoda uji aktifitas brine shrimp adalah: (Hostettman, 1991)

1. Air laut dimasukkan kedalam tanki kecil dan masukkan telur udang ke dalam salah satu

bagian dari tanki, tutup bagian ini. Lampu yang terletak pada sisi lain dihidupkan untuk

rnenarik udang melalui lubang pembatas. Larva udang siap untuk digunakan setelah

berumur dua hari.

2. Setiap fraksi diuji pada konsentrasi 1000, 100, 10 μl/ml. Setiap perlakuan dilakukan dengan

tiga kali ulangan.


13 3. Penyiapan sampel dapat dilakukan dengan salah satu dari dua cara berikut :

a. 20 mg sampel dilarutkan dengan 2 ml pelarut (20 mg/2 ml). Dengan menggunakan

syringe, larutan sampel dipindahkan ke dalam botol masing-masing 500, 50 dan 5 μL.

Pelarut diuapkan di bawah nitrogen dengan vakum tinggi selama 12 jam.

b. Sampel dilarutkan dengan DMSO, maksimum 50 μL DMSO per 5 ml larutan garam.

Konsentrasi DMSO yang lebih tinggi dari 50 μL/5 ml berakibat toksik pada larva udang.

Untuk kontrol, larutan sampel diganti dengan pelarut saja.

4. Ke dalam masing-masing hotel yang sudah berisi larutan sampel dimasukkan 5 ml larutan

air garam dan 10 larva udang.

5. Setelah 24 jam kemudian, dihitung jumlah larva yang masih hidup. Kemudian tentukan

LC50 dari hewan uji.

2.3.3. Uji Aktifitas Terhadap Serangga

Kebanyakan metabolit sekunder tumbuhan dapat mempengaruhi tingkah laku,

pertumbuhan dan reproduksi serangga sehingga dapat digunakan untuk mengontrol serangga

hama. Cara uji aktifitas serangga adalah sebagai berikut : (Arbain.D,1995)

1. Pilih serangga uji dengan pertimbangan yaitu kepentingan ekonomis, kecenderungan

untuk bertelur atau membentuk koloni, sensitif terhadap banyak bahan kimia dan lain-

lain.

2. Ekstraksi tumbuhan dan uapkan pelarutnya. Siapkan 10 % larutan ekstrak dalam etanol sebagai larutan contoh

3. Siapkan tiga wadah dan kctiganya dihubungkan dengan slang plastik. Dengan hati-

hati tempatkan 12 ekor serangga uji dalam salah satu wadah. Pada wadah kedua

tempatkan kertas saring lembab dan pada wadah ketiga tempatkkan kertas saring yang

Lelah ditetesi sampel. Kemudian dikeringkan diudara sampai tidak tercium ball etanol.

Amati yang terjadi selang satu jam selama satu malam.

4. Jika semua serangga uji berkumpul pada wadah sampel dan masih hidup maka diduga

sampel mengandung senyawa yang bersifat penarik "atractant'" serangga., jika berada

pada wadah sampel tetapi mati maka diduga sampel mengandung senyawa yang bersifat


14

insektisida, jika tidak satupun berada pada wadah sampel maka diduga sampel

mengandung senyawa yang bersifat penolak "repellent" serangga. Jika tidak terlihat

perbedaan nyata dapat dikatakan bahwa sampel uji tidak aktif terhadap serangga.


15 III. TUJUAN DAN MANFAAT

3.1. Tujuan Penelitian

Puding Merah (Graptophyllum pitum L griff) merupakan tumbuhan perdu atau pohon keci! yang sering ditemukan tumbuh liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar. Tumbuhan ini banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk berbagai keperluan terutama sebagai obat.

Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan pemisahan komponen kimia utama

tumbuhan ini dan dilakukan uji bioassay terhadap larva Artemia salina untuk mengetahui

aktifitas biologisnya melalui metode uji brine shrimp

3.2. Manfaat Penelitian

Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi baru mengenai kandungan kimia utama dan aktifitas biologis daun Purling Merah (Graptophyllum pictum L

grill) dan diharapkan dapat memberikan konstribusi dalam pengembangan kimia bahan alami


16 IV. METODE PENELITIAN

4.1. Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam Jurusaan Kimia Fakultas

Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara medan.

4.2. Bahan dan Alat yang Digunakan

4.2.1. Bahan-bahan

Bahan-Bahan yang digunakan adalah etanol, n-heksana, etil asetat, butanol, metanol, asam

klorida pekat, serbuk magnesium, asam sulfat, silika gel, plat kromatografi lapis tipis, larva

Artemia salina

4.2.2. Peralatan

Peralatan yang digunakan adalah bejana maserasi, rotary evaporator, kolom kromatografi,

tanki biakan larva dan peralatan gelas.

4.3. Prosedur Penelitian

Penelitian ini dimulai dari pengumpulan daun tumbuhan puding merah

(Graptophyllum pictum L Griff) dan determinasi. Kemudian dikeringkan dan digiling menjadi

serbuk kering, dilanjutkan dengan isolasi kandungan kimia utamanya dengan metoda ekstraksi

dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol. Pemisahan dilakukan dengan kromatografi

kolom.

4.3.1. Ekstraksi dan Pemisahan

a. Ekstraksi

Daun tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) yang telah dikeringkan

sebanyak 1 kg dihaluskan, kemudian sampel yang telah berbentuk serbuk tersebut dimaserasi

dengan menggunakan pelarut etanol selama dua hari sambil sekali-kali dikocok. Selanjutnya

sari etanol dipisahkan dengan cara penyaringan. Ekstrak etanol dipekatkan dengan rotary

evaporator, kemudian dilakukan skrining fitokimia untuk mengetahui kandungan kimia

utamanya. Kemudian ekstrak etanol di fraksinasi berturut-turut dengan n-heksana dan etil

asetat. Terhadap


17

masing-masing fraksi dilakukan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui jumlah komponen

senyawa kimia dalam fraksi tersebut. Fraksi yang memberikan kandungan senyawa kimia

paling banyak dilakukan . pemisahan komponennya lebih lanjut. Dimana pada daun puding

merah (Graptophyllum pictum L Griff) fraksi yang mempunyai kandungan kimia paling

banyak adalah fraksi etil asetat.

c. Pemisahan

Pemisahan kandungan kimia dari fraksi etanol dilakukaan dengan kromatografi kolom dengan

fasa diam silika gel 60. Silika gel yang telah disuspensikan dengan n-heksana dimasukkan

kedalarn kolom. Ekstrak etanol pekat dilarutkan dan ditambahkan silika gel dengan berat yang

sama dan diuapkan sampai kering. Hasil preabsorpsi dimasukkan kedalam kolom lalu dielusi

dengan n-heksana, kemudian kepolaran eluen ditingkatkan dengan menambahkan etil asetat

secara bertahap. Komposisi eluen yang digunakan adalah n-heksana - etil asetat (90: 10, 80:20,

70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70 dan 20:80) dengan volume masing-masing eluen tersebut

adalah 100 m1.

Fraksi yang keluar dari kolom ditampung dengan menggunakan botol vial dengan volume 10

ml dan dimonitor dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi dengan nilai Rf yang sama digabung

yaitu fraksi dengan nomor vial 124 - 131 dan diuapkan pelarutnya. Fraksi ini direkristalisasi

sehingga diperoleh kristal mumi.

4.3.2. Uji Bioaktifitas Larva Artemia salina

a. Penyiapan larva artemia salina

Larva udang disiapkan dengan cara menetaskan telur Artemia salina dua hari sebelum

dilakukan pengujian. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur udang tersebut

kedalam air laut buatan yang mengandung NaCl 2% (b/v) sebanyak 200 m1. Setelah 24 jam

perendaman, telur menetas dan menghasilkan larva Artemia salina


18

b. Penyiapan sampel

Sampel dengan berat 20 mg dilarutkan dengan 2 ml pelarut. Larutan sampel dipindahkan

masing-masing sebanyak 500, 50 dan 5 μl ke dalam botol. Pelarut diuapkan sampai betul-betul

kering.

c. Pelaksanaan uji

Kedalam masing-masing botol yang telah berisi sampel dimasukkan air laut buatan dan 10

larva udang yang telah berumur 2 hari. Setelah 24 jam kemudian dihitung jumlah larva yang

mati.

4.3.3. Analisis data

Terhadap senyawa hasil isolasi dilakukan analisis spektroskopi IR dan 1H

NMR. Untuk analisis data uji hayati dilakukan dengan analisis probit (Koestoni, 1985) untuk

menghitung LC50. Barga LC50 dibawah 1000 μg/ml dinyatakan sebagai sanyawa bioaktif,

apabila diatas 1000 μg/ml dinyatakan sebagai senyawa tidak bioaktif.


19 V. HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Hasil Penelitian

Ekstraksi terhadap 1000 gram serbuk daun puding merah (graptophyllum pictum L

Griff) dengan menggunakan etanol diperoleh ekstrak kasar etanol. Setelah dilakukan uji

fitokimia dengan menambahkan serbuk magnesium dan asam klorida pekat maka ekstrak

tersebut menghasilkan Warna merah yang menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mengandung

senyawa flavonoid.

Dari hasil pemisahan dengan menggunakan kromatografi kolom diperoleh. kristal

sebanyak 37 mg dan dari kromatografi lapis tipis memberikan noda tunggal dengan berbagai

eluen. Karakterisasi Inframerah senyawa spektrum (IR) hasil_isolasi memperlihatkan pita serapan

pada angka gelombang 3431, 3111, 3057, 1618, 1462, 1340, 1060, 970 dan 800 cm-1

(Iampiran 1) dan spektrum 1H-NMR memperlihatkan adanya pergeseran kimia pada 1,5 ; 6,3

dan 7,6 ppm (lampiran 2). Uji bioassay senyawa hasil isolasi menunjukkaan aktifitas biologis

terhadap larva Artemia salina yang memberikan LC50 sebesar 124,08 μg/ml.

5.2. Pembahasan

Analisis spektrum Inframerah (IR) senyawa hasil isolasi (lampiran 1)memperlihatkan

adanya pita serapan pada angka gelombang 3431 cm-1 yang merupakan serapan dari regang

O-H dengan bentuk pita yang agak lebar. Pita serapan di atas 3000 cm-1 menunjukkan adanya

regang C-H aromatis dimana pada spektrum senyawa hasil isolasi muncul pada angka

gelombang 3111 dan 3057cm-1 Pita serapan pada angka gelombang 1618 cm-1 menunjukkan

adanya regang C=O dengan pita serapan yang kuat. Pita serapan pada angka gelombang 1475

1300 cm-1 merupakan lentur C-H alifatik dan pita serapan pada angka gelombang 1462 cm-1

menunjukkan absorpsi dari metil dan metilena.

Daerah pada angka gelombang 1000 - 650 cm-1 memberikan informasi tentang sifat

khas alkena dan posisi substitusi pada cincin aromatis dimana pada spektrum IR muncul pita

serapan pada angka gelombang 970 cm-1 yang menandakan adanya alkena dalam bentuk trans

dan pita serapan pada angka gelombang 800 cm-1 menandakan adanya aromatik meta.

Analisis spektrun 1H-NMR senyawa hasil isolasi (lampiran 2) terlihat adanya beberapa


20

kelompok proton dengan pergeseran kimia yang berbeda-beda. Pada pergeseran kimia 1,5

ppm muncul sinyal multiplet yang menunjukkan proton alifatik atau proton OH yang

diperkuat oleh spektrum IR pada angka gelombang 3431 cm-1. Adanya sinyal multiplet pada

pergeseran kimia 6,3 ppm menunjukkaan adanya alkena disertai pembelahan jarak jauh. Pada

pergeseran kimia 7,6 ppm muncul sinyal multiplet yang menunjukkan proton-proton cincin

aromatik. Sinyal-sinyal yang muncul pada pergeseran kimia 6,0 - 8,0 ppm merupakan sinyal

untuk proton-proton aromatik.

Dari analisis spektrum IR dan 1H-NMR serta hasil uji fitokimia dengan menggunakan

perekasi serbuk magnesium dan asam klorida pekat yang menghasilkan warna merah maka

disimpuIkan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa aromatis atau fenolik dan

diperkirakan merupakan suatu jenis senyawa flavonoid.

Uii bioassay senyawa hasil isolasi :

Jumlah larva yang mati tiap konsentrasi (μg/ml) Nomor vial

10 100 1000 kontrol

1 2 4 7 0 I 2 2 5 7 0

3 3 5 8 0 Jumlah kematian 7 14 22 0 i

'Jumlah larva 30 30 30 30 r

% kematian 23,3 46,7 73,3 -

Log konsentrasi 1 2 3 -

Nilai probit 4,2710 4,9172 5,6219 -

Uji bioassay senyawa hasil isolasi dilakukan terhadap larva Artemia salina dan analisis data

uji dilakukan dengan analisis probit yang memberikan LC50 sebesar 124,08 μg/ml.


21

VI. KESIMPULAN DAN SARAN 6.1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian dan pembahasan yang dilakukan maka dapat disimpulkan :

1. Isolasi terhadap 1000 gram daun puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) diperoleh

kristal sebanyak 37 mg dan dari analisis spektrum IR dan 1H-NMR serta uji fitokimia maka

senyawa hasil isolasi diperkirakan merupakan senyawa aromatik atau fenolik yaitu suatu jenis

senyawa flavonoid. 2. Pengujian aktifitas biologis senyawa hasil isolasi terhadap larva Artemia salina menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi termasuk senyawa bioaktif dengan LC50 sebesar 124,08 μg/ml.

6.2. Saran

Untuk meperoleh informasi tentang jenis dan struktur senyawa flavonoid hasil isolasi

maka disarankan untuk melakukan analisis spektroskopi 13C –NMR dan MS serta analisis-

analisis lainnya.


22

DAFTAR PUSTAKA

Arbain.D, 1995, Uji Bioaktifitas dan Penelitian Kimia Bahan Alam, Workshop Isolasi Senyawa Aktif Biologis, FMIPA Universitas Andalas Padang

Dalimartha.S, 1999, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid I, Cetakan 1, Trubus Agriwidya, Jakarta Darwis.D, 2000, Teknik Dasar Laboratorium Dalam Penelitian Senyawa Bahan Alam Hayati, Workshop Pengembangan Sumber Daya Manusia Dalam Bidang Kimia Organik Bahan Alam Hayati, FMIP A Universitas Andalas Padang

Dharma.A, 2001, Uji Bioaktifitas Metabolit Sekunder, Workshop Peningkatan Sumber Daya Manusia Untuk Pemanfaatan Sumber Daya Alam Hayati dan Rekayasa Bioteknologi, FMIPA Universitas Andalas Padang

HarborneJ.B, 1987, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata., lTB Bandung Heyne.K, 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid II, Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan, Departemen Kehutanan, Diterjemahkan oleh Badan Litbang Kehutanan, Jakarta

Hosettmann.K, 1991, Methods in Plant Biochemistry, Vol 6, Academic press, New York Koestoni.T, 1985, Analisis probit, Kelompok Peneliti Hama, Balai Penelitian Hortikultura, Lembang Mc.Laughlin.J.L, 1991, The Unesco Regional Workshop on The Bioassay of Natural Product with Special Emphasis on Anticancer Agents, Institute Advanced Studies, University of Malaysia

Meyer.B.N, 1982, Brine Shrimp Agregaat Convenient General Bioassay For Active Plant Constituens, Planta Med, 45,31-34 Silverstein.R.M, 1991, Spectrometric Identification of Organic Compounds, edisi ke-5, Jhon Willey & Sons

Spektrum IR Senyawa Hasil Isolas.pdf

Documents

Transcript of Spektrum IR Senyawa Hasil Isolas.pdf