Spektrofluorometri

JURUSAN FARMASI FKIKUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

Oleh : Hendri Wasito, S. Farm., Apt.

(http : // www.hendriapt.wordpress.com)

Tinjauan UmumPenyerapan energi oleh molekul memungkinkan terjadinya : ( Eksitasi, Fluorescensi, dan Fosforescensi)Banyak senyawa kimia memiliki sifat fotoluminensi (dapat dieksitasikan oleh cahaya dan memancarkan kembali sinar dengan panjang gelombang sma atau berbeda dengan semula).Ada dua peristiwa fotoluminensi : (Fluorosensi dan Fosforesensi)

Luminescen

Diagram Fotoluminisensi

Deaktivasi molekul tereksitasi Merupakan suatu proses kembalinya molekul yang

tereksitasi ke keadaan asas (dari S1 atau T ke S0) :

Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) Konversi didalam (Internal Conversion = IC) Pradisosiasi Disosiasi Konversi keluar Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX) Pemadaman sendiri (selfquenching = SQ) Fluoresensi (F) Fosforisensi (P)

Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) Perpindahan energi vibrasi

dari molekul yang tereksitasi Molekul yang tereksitasi

kehilangan energi eksitasi vibrasionalnya (lewat tumbukan) menjadi keadaan vibrasional S2

Terjadi sangat cepat (10-3) detik

Dapat terjadi pada tingkat energi elektronik tereksitasi atau azas

Konversi didalam (Internal Conversion = IC)

Perpindahan energi dalam 1 molekul

Elektron pindah dari tingkat energi elektronik yang lebih tinggi ke tingkat energi elektron yang lebih rendah tanpa memancarkan sinar (S2 S1 atau T2 T1)

Dapat terjadi jika kedua tingkat energi elektronik tersebut berdekatan, sehingga terjadi tumpang tindih diantara tingkat energi vibrasi

Pradisosiasi Kelanjutan IC Perpindahan

electron dari suatu tingkat energi elektronik tereksitasi (mis S2) ke tingkat energi vibrasi yang lebih tinggi dari tingkat energi elektronik tereksitasi yang lebih rendah

Disosiasi

Putusnya suatu ikatan dalam molekul karena menyerap energi sinar tanpa didahului peristiwa konversi kedalam

Elektron ikatan terlepas

Konversi keluar

Perpindahan energi elektronik akibat antaraksi molekul yang tereksitasi dengan molekul lain

Tidak ada pemancaran sinar

Energi yang dipindahkan adalah energi elektronik

Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX)

Pembalikan arah spin elektron yang tereksitasi dari tereksitasi SINGLET (S) menjadi TRIPLET (T)

dapat mudah terjadi jika tingkat energi vibrasi dari S overlapping dengan tingkat energi vibrasi dari T

Terjadi pada molekul dengan berat molekul tinggi

Pemadaman sendiri (selfquenching = SQ) Intensitas fluoresensi berkurang Terjadi akibat tabrakan-tabrakan

antar molekul sendiriAdanya pemadam akan

menginduksi deeksitasi dari suatu molekul analit yang tereksitasi sehingga tidak ada sinar yang diemisikan

Contoh : Oksigen bagi senyawa poliaromatis hidrokarbon

Fluoresensi (F)

Pemancaran sinar dari S1 S0

Waktunya amat singkat (10-8) detik

Jika eksitasi dihentikan,fluoresensi terhenti

Emisi foton sama nilainya dengan energi ang diserap oleh suatu molekul.

Fosforesensi (P) Peroses sutu molekul

melangsungkan suatu transisi (emisi) dari tingkat triplet ke tingkat dasar.

Pemancaran sinar dari T1 S0

Waktunya lebih lama (10-4 detik)

Jika eksitasi dihentikan,fosforisensi masih dapat berlangsung

Biasanya didahului oleh L.A.S.

Efesiensi Fluoresensi

Bilangan yang menyatakan perbandingan mol yang berfluoresensi dan jumlah total mol yang tereksitasi (min = 0 dan max = 1)

itereksitasyangmoltotalJumlahensiberfluoresyangmolJumlahEF

DPDIXECICF

F

KKKKKKK

EF

Catatan Indeks :K = Tetapan LajuF = FluoresensiIC = Konversi didalamEC = Konversi keluarIX = Lintasan antar systemPD = PradisosiasiD = Dissosiasi

Faktor Lingkungan = KIC, KEC dan KIXFaktor Struktur Kimia = KF, KPD dan KD

EF dan Jenis Transisi Elektron EF lebih mungkin terjadi pada transisi *

dari pada * n karena: Absorptivitas molar transisi * jauh lebih

besar dari absorptivitas molar transisi * n Umur eksitasi * lebih lama dari pada

umur eksitasi n * sehingga Kn * lebih besar dari pada K *

Kix pada * lebih kecil dari pada KIX pada n * , karena energi yang diperlukan untuk pembalikan arah spin pada * jauh lebih besar dari pada n *

EF dan Jenis Transisi ElektronNilai absortivitas molar

merupakan kebolehjadian terjadinya transisi, makin besar makin mudah terjadi transisi makin mudah terjadi fluoresensi.

LAS lebih sulit pada *, maka * Fluoresenensi n * Fosforisensi

Hubungan Intensitas Fluoresensi (PF) dengan kadar

PF adalah proporsional dengan jumlah molekul yang tereksitasi : 1............PPQPF of

dimana : PF = Intensitas fluoresensi Qf = Effisiensi fluoresensi P0 = Intensitas yang dikenakan

pada sample P = Intensitas setelah mengenai

sample

Menurut Hukum Lambert-Beer

)2......(10PP bc

0

bcPP 100

bc00ff 10PPQP

)3.......(101Q bcf

Jika persamaan 3 dikembangkan dalam

suatu seri makabc0ff PQP

)4(!1n

bc........!4bc

!3bc

!2bc1

n32

Jika bc kecil maka

)5........(bcPQP 0ff Qf = Effisiensi fluoresensi (nilainya tetap)Po = Intensitas awal (nilainya tetap)Σ = Absorptivitas molar (nilainya juga tetap)b = Tebal kuvet (nilainya juga tetap)

Sehingga persamaan menjadi :Pf = (Nilai tetap QF, Po, Σ dan b) c

= Kc Jadi intensitas fluoresensi yang terbaca berbanding

langsung dengan kadar

Faktor-faktor yang berpengaruh pada fluoresensi

1. Temperatur (Suhu) a. EF berkurang pada suhu yang dinaikkan b. Kenaikan suhu menyebabkan tabrakan

antar mol atau dengan mol pelarut c. Energi akan dipancarkan sebagai sinar fluoresensi diubah menjadi bentuk lain

misal : EC2. Pelarut

a. Dalam pelarut polar intensitas fluoresensi bertambah,

karena dalam pelarut polar b. Jika pelarut yang digunakan

mengandung atom-atom yang berat (CBr4, C2H5I) maka intensitas

fluoresensi berkurang, sebab ada interaksi

gerakan spin dengan gerakan orbital elektron ikatan

mempercepat LAS maka intensitas menjadi berkurang

3. pH pH mempengaruhi keseimbangan bentuk molekul dan ionic Phen

olPhenolat

OHλ eks = 285 λ eks = 310 λ em = 365 λ em = 410

Int = 18 Int = 10

4. Oksigen terlarut Adanya oksigen terlarut dalam larutan cuplikan menyebabkan intensitas fluoresensi berkurang

sebab : a. Oksigen terlarut oleh pengaruh cahaya

dapat mengoksidasi senyawa yang diperiksa b. Oksigen mempermudah LAS

5. Kekakuan struktur (structural rigidity) Struktur yang rigid (kaku) mempunyai intensitas yang tinggi

Adanya -CH2- pada fluoren menyebabkan strukturnya lebih kaku

EF = 0,20FluorenBifenil

Hubungan Struktur Molekul dan Fluoresensi Struktur molekul yang mempunyai ikatan

rangkap mempunyai sifat fluoresensi karena strukturnya kaku dan planar

EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada sistem dapatmenaikkan intensitas fluoresensi

EWG (NO2, Br, I, CN, COOH) dapat menurunkan bahkan menghilangkan sifat fluoresensi

Penambahan ikatan rangkap (aromatik polisiklik) dapat menaikkan fluoresensi

Pengaturan pH dapat merubah intensitas fluoresensi, Contoh : Phenol menjadi phenolat menaikkan fluoresensi Amina aromatik menjadi ammonium aromatik menurunkan fluoresensiHeterosiklis dengan atom N, S dan O mempunyai sifat fluoresensi

Heterosiklis dengan gugus NH, jika medianya asam akan menaikkan intensitas fluoresensi

Komponen fluorometer

Lightsource

Excitation(prymary)

filter

Excitation filter

Sampel cell

Transmitted Light

Fluorecent(emitted)

light

Fluorecence(secondary)

filter

PhototubePhotomultiplier tube

Keuntungan dari analisis fluoresensi Kepekaan yang baik karena :1.Intensitas dapat diperbesar dengan

menggunakan sumber eksitasi yang tepat

2.Detektor yang digunakan seperti tabung pergandaan foto sangat peka

3.Pengukuran energi emisi lebih tepat daripada energi terabsorbsi

4.Dapat mengukur sampai kadar 10-4 – 10-9 M

kelompok analisis obat secara fluoresensi (1) Obat yang mempunyai sifat

fluoresensi alamiah dalam hal ini tidak diperlukan tambahan pereaksi

Contoh : Quinine Larutan obat ini mengabsorbsi

sinar UV dan mengemisi sinar Vis

kelompok analisis obat secara fluoresensi (2) . Turunan obat yang dibentuk dengan

pengikatan dengan senyawa berfluoresensi Contoh : Asam amino diikat oleh

syclorida [ 5 –(dimethylamino) naphtalene-1-sulfonyl-hloride] dansyl asam aminoyang intensitas fluoresensinya tinggi

R=CH-CO

OHNH2

+ - HCL

N(CH3)2

SO3-NH-CHR-COOH

N(CH3)2

SO23CL

kelompok analisis obat secara fluoresensi (3)Membentuk molekul

berfluoresensi (a. fluorophore)H3C N

N

+NH3

CH2 N+

S

CH3

CH2-CH2OH.2CLFe(CN)6OH

----

Vitamin B1

H3C N

N

N

N

S CH2-CH2OH

CH3

ThiochromeBerfluorensi

eks = 365 nm em eks = 440 nm

Spektra Eksitasi dan Emisi dari kinin-SO4 1 ppm

1.Secara teoritis spektra eksitasi identik dengan spektra absorsi u.v. Spektra ini dapat digunakan untuk menentukan spesifik yang menyebabkan timbulnya emisifluoresensi/ fosforisensi dan yang menimbulkan emisi yang maksimal disebut eksitasi

2.Spektra emisi adalah duplikat dari spektra eksitasi. Hanya timbul pada yang lebih panjang. emisi dipilih suatu yang menimbulkan intensitas maksimal

Cara memperoleh Dibuat cuplikan dalam pelarut air, etanol, maupun

sikloheksan Lar. cuplikan masukkan kedalam kuvet

spektrofotometer Atur monokromator eksitasi pada suatu didaerah

u.v. (misal A). Kemudian monokromator emisi diputar sampai diperoleh intensitas yang maksimal misal B nm (B : emisi)

Atur monokromator, emisi pada B nm dan sekarang monokromator eksitasi yang diubah sampai diperoleh intensitas yang maksimum misal A’ nm (A’ nm = eksitasi)

Monokromator eksitasi diatur pada A’ nm dan buat spektra emisi dengan merecord intensitas sebagai fungsi dari panjang gelombang () akan diperoleh harga yang mempunyai intensitas maksimal misal : B’ nm

Maka eksitasi : A’ nm emisi : B’ nm

Beberapa obat yang bersifat fosforisensi Senyawa

AspirinBennocaine Cocaine DiazepamIproniazid PapaverinePhenacetinStrychnin

PO4

Thioridazine

eks240310240290,32

5300,37

0260410290335

fos380430400400,470,51

0440480499440500

Waktu

2,13,42,70,07-1,5-1,20,07

KondisiEPAEpharm EthanolEWEWEthanolEPAEthanolEW

EW : Ethanol – water = 1 : 1EPA : campuran Diethyleter-isopentane-ethanol (5:5:2)

Latihan Soal Jelaskan penggunaan fluoresensi dan

fosforesensi dalam analisis kualitatif dan kuantitatif obat atau metabolitnya ?

Suatu senyawa griseofulvin standar disiapkan pada pH 7, intensitas fluoresensinya diukur pada λ eksitasi dan emisi masing-masing pada 295 nm dan 450 nm serta memberikan data sebagai berikut :

Hitunglah konsentrasi obat (dalam ng/mL) dalam sampel yang memiliki intensitas fluoresensi sebesar 64 !

Konsentrasi (ng/mL) 10 20 40Intensitas fluoresensi 20 42,5 85

HATUR NUHUN PISAN ......

Jangan lupa untuk membaca literatur lainnya baik dari buku maupun internet serta banyak latihan soal ...

Kita BISA karena BIASA ...