PERANCANGAN PRIMER UNTUK DETEKSI Fusarium spp.

IIN PREMITASARI

DEPARTEMEN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR2012

Judul : Perancangan Primer untuk Deteksi Fusarium spp.Nama : Iin PremitasariNIM : G34062196

Menyetujui:

Pembimbing 1,

Dr. Utut Widyastuti, M.Si.NIP 19640517 198903 2 001

Pembimbing 2,

Dwi Sugipriatini, S.Si, M.Si.NIP 19741029 200312 2 001

Mengetahui:

Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.NIP 19641002 198903 002

Tanggal lulus:

ABSTRAK

IIN PREMITASARI. Perancangan Primer untuk Deteksi Fusarium spp. Dibimbing oleh UTUTWIDYASTUTI dan DWI SUGIPRIATINI.

Fusarium adalah salah satu genus cendawan yang paling heterogenus dan klasifikasiberdasarkan morfologi dari spesies-spesies dalam genus ini sangat sulit. Selama ini, untukmendeteksi dan identifikasi Fusarium spp. dilakukan berdasarkan ciri morfologi koloni danmorfologi mikroskopis seperti bentuk dan ukuran makrokonidia serta ada/tidak ada mikrokonidiadan klamidospora. Identifikasi spesies kompleks Fusarium spp. berdasarkan morfologi, seringmenimbulkan kesalahan karena mempunyai ciri morfologi yang sama. Pendekatan molekuler telahdikembangkan untuk mendukung studi sistematika cendawan, termasuk pendeteksian spesifikmelalui primer Polymerase Chain Reaction (PCR). Perbedaan ukuran fragmen DNA hasilamplifikasi dengan PCR dapat digunakan sebagai alat untuk membedakan cendawan pada tingkatgenus hingga spesies. Penelitian ini bertujuan untuk merancang primer pada daerah 18-28s rRNAdan menguji primer tersebut dengan PCR untuk mendeteksi Fusarium spp.. Analisis primerforward dan reverse menggunakan urutan nukleotida daerah 18-28s rRNA Fusarium spp.diperoleh dari gene bank National Center of Biology Information (NCBI). Urutan-urutannukleotida yang terkumpul kemudian disejajarkan dan dibuat rancangan primernya menggunakanPrimer3. Hasil analisis primer diberi nama Fus1, Fus2, Fus3, dan Fus4. Isolat-isolat uji yangdigunakan pada penelitian ini adalah F. graminearum, F. acuminatum, F. culmorum, F.oxysporum, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. verticillioides, dan F. equiseti. Pengujianprimer dilakukan dengan mengamplifikasi DNA Fusarium spp. menggunakan PCR. Primer Fus1dan Fus3 mengamplifikasi daerah Internal Trancribe Spacer (ITS) 1 dan 2 menghasilkanamplikon berukuran 650 pb, primer Fus2 mengamplifikasi daerah ITS 1 menghasilkan amplikonberukuran 200 pb, dan primer Fus4 yang mengamplifikasi daerah ITS 2 menghasilkan amplikonberukuran 420 pb. Primer Fus2 mampu mengamplifikasi seluruh isolat uji, sedangkan primerFus1, Fus3, dan Fus4 berhasil mengamplifikasi enam isolat.

ABSTRACT

IIN PREMITASARI. Primer Design for Fusarium spp. Detection. Supervised by UTUTWIDYASTUTI and DWI SUGIPRIATINI.

Fusarium is one of the most heterogeneous fungal genera and classification of specieswithin this genus is very difficult. So far, the detection of Fusarium spp. is based onmorphological colony and microscopic morphological characteristic such as shape and size ofmacroconidia and the presence or absence of microconidia and clamydospores. Similarity in oneof characteristic of Fusarium spp. species complex can lead to misidentify. Molecular approacheshave been developed to support fungal systematic studies, including specific diagnostic by primerof Polymerase Chain Reaction (PCR). DNA fragment size as a result from PCR amplification canused to distinguish fungi from genus until species. This research has a purpose to design PCRprimer on 18-28s rRNA region and use it to detect Fusarium spp.. Analysis of forward and reverseprimer based on 18-28s rRNA sequences were taken from NCBI. The primer were designed atPrimer3. Primer testing were done by PCR amplification. Primer analysis result were named Fus1,Fus2, Fus3, and Fus4. Nine isolates were use in this study are F. graminearum, F. acuminatum, F.culmorum, F. oxysporum, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. verticillioides, and F.equiseti. Primer Fus1 and Fus3 amplificate ITS 1 and ITS 2 produce 650 bp amplicon, primer Fus2amplificate ITS 1 produce 200 bp amplicon, and primer Fus4 amplificate ITS 2 produce 420 bpamplicon. Primer Fus2 was able to amplificate all of the samples, whereas primer Fus1, Fus3, andFus4 were able to amplificate only six samples.

PERANCANGAN PRIMER UNTUK DETEKSI Fusarium spp.

IIN PREMITASARI

SkripsiSebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains padaDepartemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGIFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR2012

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang Maha Esa atas karuniaNya,sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian dalam karya ilmiah inidilakukan sejak 2010 sampai dengan 2011 bertempat di Laboratorium Genetika Cendawan danBiorin Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor.

Terimakasih penulis haturkan pada program kerjasama IPB – Karantina atas nama Ibu Dr.Utut Widyastuti, M. Si atas bantuan dana penelitian yang telah diberikan serta bimbingan danpengarahan selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Terimakasih juga penulis haturkankepada Ibu Dwi Sugipriatini, S.Si, M.Si. atas bimbingan dan pengarahan selama penyusunan karyailmiah ini. Terimakasih juga penulis haturkan kepada Ibu Dr. Sri Listiyowati, M. Si selaku dosenpenguji wakil komisi pendidikan yang telah bersedia menguji dan memberikan masukan padapenulisan karya ilmiah ini, serta kepada Pak Muzuni, Ibu Hanum, Pak Ulung, Ibu Dini, mbak Pepidan semua teman-teman di Laboratorium Genetika Cendawan dan Biorin Pusat PenelitianSumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB, atas semua bantuan teknis dan saran yang telahdiberikan. Penulis juga berterimakasih kepada mamah, Aa, teteh, kakang, semua kerabat danteman-teman Biologi yang telah memberi nasihat, doa, dukungan dan semangat hingga saat ini.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2012

Iin Premitasari

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Cianjur, Jawa Barat pada 8 Maret 1988 dari ayah Bubun Bunyamindan ibu Ai Maesaroh. Penulis adalah putri bungsu dari tiga bersaudara.

Pada tahun 2006, penulis lulus dari SMUN 3 Bogor dan diterima di Institut PertanianBogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru dan pada tahun 2007, masuk DepartemenBiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Penulis aktif sebagai anggota Divisi Informasi dan Komunikasi Himpunan MahasiswaBiologi (HIMABIO) IPB pada tahun 2007/2008. Penulis juga berpartisipasi dalam kepanitiaanberbagai acara yang diselenggarakan oleh HIMABIO dan Badan Eksekutif Mahasiswa FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam seperti Biologi Cinta Lingkungan, Revolusi Sains,Lomba Cepat Tepat Biologi, dan Pesta Sains. Penulis melakukan Praktik Lapang di Bina UsahaFlora, Cipanas pada tahun 2009.

DAFTAR ISI

HalamanDAFTAR TABEL..........................................................................................................................viiiDAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viiiDAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viiiPENDAHULUAN.............................................................................................................................1

Latar Belakang..............................................................................................................................1Tujuan...........................................................................................................................................1

BAHAN DAN METODE .................................................................................................................1Waktu dan Tempat........................................................................................................................1Alat dan Bahan .............................................................................................................................1Metode ..........................................................................................................................................2

Perancangan Primer..................................................................................................................2Pengujian Primer ......................................................................................................................2Penyiapan Kultur Cendawan ....................................................................................................2Ekstraksi DNA Genomik dan PCR. .........................................................................................2Elektroforesis. ..........................................................................................................................3Pengurutan Nukleotida Hasil PCR. ..........................................................................................3

HASIL...............................................................................................................................................3Perancangan Primer ......................................................................................................................3Pengujian Primer dengan Amplifikasi PCR..................................................................................4

PEMBAHASAN ...............................................................................................................................6SIMPULAN DAN SARAN ..............................................................................................................8

Simpulan .......................................................................................................................................8Saran .............................................................................................................................................8

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................................8LAMPIRAN....................................................................................................................................10

DAFTAR TABELHalaman

1 Hasil rancangan primer Fusarium spp………………………………………………….….......32 Hasil analisis bioinformatika menggunakan megaBLAST dari NCBI.………………………..53 Perbedaan urutan nukleotida beberapa spesies Fusarium berdasarkan hasil pengurutan

nukleotida…........................................................................................................................... .....84 Primer forward spesifik……………………………………………………………….……......8

DAFTAR GAMBARHalaman

1 Skema posisi keempat primer pada urutan nukleotida rRNA Fusarium spp……….…………..42 Amplifikasi PCR pada rDNA F. graminearum menggunakan berbagai pasangan primer: (1)

Fus1, (2) Fus2, (3) Fus4, dan (4) Fus3…………………………………………………………43 Perbadingan hasil amplifikasi PCR menggunakan empat macam primer yang berbeda pada

rRNA: (1) 1Kb ladder, (2) F. graminearum, (3) F. acuminatum, (4) F. semitectum, (5) F.proliferatum, (6) F. culmorum, (7) F. oxysporum, (8) F. solani, (9) F. verticillioides, (10) F.equiseti……………………………………………………………….…………………………5

DAFTAR LAMPIRANHalaman

1 Urutan nukleotida Input Primer Fusarium spp. berdasarkan 18-28srRNA....……...………………………………………………………………………….…….11

2 Cara membuat larutan buffer TAE 1x……………………………...………………......……..123 Cara membuat larutan CTAB 2%.............................................................................................134 Hasil analisis bioinformatika menggunakan megaBLAST dari NCBI……………………….14

PENDAHULUAN

Latar BelakangFusarium adalah salah satu genus

cendawan yang paling heterogenus danklasifikasi berdasarkan morfologi darispesies-spesies dalam genus ini sangat sulit.Saat ini, diferensiasi Fusarium didasarkanpada karakteristik fisiologis dan morfologi,seperti bentuk dan ukuran makrokonidia,keberadaan mikrokonidia dan klamidospora,dan morfologi koloni. Perbedaan khas dalamkarakteristik tunggal dapat merujuk ke salahsatu spesies. (Llorens et al. 2005).

Perbedaan susunan nukleotidaDNA dari gen telah digunakanuntuk mendukung identifikasi morfologi darispesies Fusarium. Contohnya, berdasarkankarakter morfologi, isolat-isolat dari lahandan isolat-isolat dari kultur stok, 30 isolatteridentifikasi sebagai F. verticillioides, 20isolat sebagai F. sacchari, tujuh isolatsebagai F. subglutinans, 12 isolat sebagai F.proliferatum dan sembilan isolat sebagai F.fujikuroi. Sedangkan berdasarkan urutannukleotida Translation Elongation Factor 1-ά, 23 isolat diidentifikasi sebagai F.verticillioides, enam isolat sebagai F.andiyazi, 29 isolat sebagai F. sacchari, 11isolat sebagai F. fujikuroi dan sembilansebagai F. proliferatum (Hsuan et al. 2011).

Metode pemeriksaan berdasarkanPolymerase Chain Reaction (PCR)merupakan salah satu teknik alternatif untukmendeteksi dan mengawasi keberadaancendawan mikotoksigenik (Suanthie et al.2009). Perbedaan profil fragmen DNA hasilamplifikasi dengan PCR dapat digunakansebagai alat untuk membedakan mikrobapada tingkat genus, spesies bahkan genotipespesifik dari patogen (Edel 1998).Penggabungan metode PCR danperancangan primer untuk mengamplifikasiberbagai daerah yang terdapat pada DNAribosom (rDNA) sangat mendukung upayapengembangan perangkat deteksi cendawanpatogen tanaman (Darmono et al. 2006).

Urutan nukleotida DNA yangmenyandi rRNA telah luas digunakan untukstudi hubungan taksonomi dan variasigenetik pada cendawan. Kelompok genrRNA ditemukan dalam nukleus danmitokondria, dan terdiri atas daerah yangsangat konservatif dan daerah variabel yangmeliputi gen-gen untuk pembentukan rRNAberukuran kecil (18s rRNA), 5.8s dan

berukuran besar (28s rRNA) yang mengapitdaerah Internal Transcribe Spacer (ITS)(White et al. 1990). Daerah ITS biasanyamengalami perubahan atau mutasi sehinggadapat berbeda atau bervariasi di antaraspesies (Darmono et al. 2006). Semua urutannukleotida rDNA yang digunakan padapenelitian ini, berasal dari nukleus danmitokondria Fusarium spp., data diambildari gene bank National Center of BiologyInformation (NCBI).

Hasil penelitian ini diharapkandapat dimanfaatkan salah satunya untukmencegah penyebaran berbagai penyakitdari negara luar yang disebabkan olehFusarium spp. ke Indonesia. Fusarium HeadBlight (FHB) yang disebabkan olehbeberapa spesies Fusarium adalah salah satupenyakit utama yang disebabkan olehcendawan pada sereal di dunia. Di Manitoba(Kanada), FHB mengakibatkan kerugianekonomi senilai US $300juta pada 1993-1998 pada komoditas serealia (Windels2000) dan Fusarium oxysporum f.sp.elaeidis menyebabkan layu pembuluh padakelapa sawit (Surachmat 1996). Hal inisangat penting, mengingat kelapa sawitmerupakan komoditas unggulan. Selain itu,F. graminearum dapat menyebabkanpenyakit scabies pada gandum (Patola 2008)dan F. oxysporum menyebabkan layufusarium pada tomat (Winarsih 2007).

TujuanPenelitian ini bertujuan untuk

merancang primer pada daerah 18-28s rRNAdan menguji primer tersebut dengan PCRuntuk mendeteksi Fusarium spp.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan TempatPenelitian ini dilaksanakan mulai

bulan Februari-Juli 2011, bertempat dilaboratorium BIORIN Pusat PenelitianSumberdaya Hayati dan Bioteknologi(PPSHB), Institut Pertanian Bogor.

Alat dan BahanAlat yang digunakan pada

penelitian ini adalah laptop yang terhubungke internet, laminar, shaker, mortar, waterbath, mesin sentrifugasi merk Jouan, mesinvacuum, mesin spektrofotometri, hot plate,freezer, mesin PCR, mesin elektroforesis,UV translumintor, dan peralatan

2

laboratorium laninnya. Bahan yangdigunakan adalah isolat Fusarium spp. yangtelah diidentifikasi secara morfologi, yaituF. graminearum BIO956 dan F.proliferatum BIO967 yang diisolasi dari bijikakao, F. verticillioides BIO957 yangdiisolasi dari beras, F. semitectum BIO969yang diisolasi dari biji kacang tanah, dan F.equiseti BIO955 koleksi SEAMEOBIOTROP. Selain itu, digunakan pula isolatF. culmorum IPBCC 88.084 yang diisolasidari tanah ladang gandum, F. solani IPBCC88.114 yang diisolasi dari Solanumtuberosum, F. oxysporum IPBCC 07.540yang diisolasi dari serasah penanaman daunmeranti, dan F. acuminatum IPBCC 88.017koleksi IPB Culture Collection (IPBCC)yang tidak diketahui substratnya. MediaPotato Dextrose Agar (PDA), media PotatoDextrose Broth (PDB), Nitrogen cair, CetylTrimethyl-Ammonium Bromide 2%(CTAB), ß-mercapto ethanol, ChlorofoamIsoamil (24:1) (CI), Phenol ChlorofoamIsoamil (25:24:1) (PCI), 2 M NaOAC pH5,2, ethanol 100%, ethanol 70%, ddH2O,RNAse, enzim taq polymerase, empatpasang primer (Fus1 sampai Fus4), dNTPs,taq buffer, DNA template, gel agarosa 1%(b/v), TAE 1x, 1 Kb Ladder, loading dye6X, dan Ethidium Bromida (EtBr) (5mg/ml).

MetodePerancangan Primer. Analisis

primer forward dan reverse menggunakanurutan nukleotida daerah 18-28s rRNAFusarium spp. yang diperoleh dari NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov). Urutan nukleotidaDNA Fusarium spp. yang digunakan sebagaiacuan rancangan primer pada penelitian initerdiri atas lima daerah konservasi, yaitu 18srRNA, ITS1, 5.8s rRNA, ITS2, dan 28srRNA. Masing-masing urutan nukleotidalengkap dari setiap daerah konservasi,disejajarkan untuk mendapatkan urutannukleotida yang paling seragam sebagaiacuan rancangan primer. Setelah itu, primerdirancang berdasarkan daerah konservasinyamenggunakan Primer3 yang terdapat dihttp://frodo.wi.mit.edu/. Hasil rancanganprimer yang dipilih adalah primer yangmemiliki persentase GC sebesar 50-55%,angka dimer dan hairpin yang kecil, dansuhu leleh (melting) sekitar 60-62 oC. Primerhasil rancangan yang diperoleh selanjutnyadisintesis DNA melalui jasa 1st Base,Singapura.

Pengujian Primer. Langkahpertama dalam tahap pengujian primeradalah meremajakan dan menumbuhkanisolat-isolat Fusarium spp. ke media PDBuntuk ekstraksi DNA. Hasil ekstraksi inidiamplifikasi dengan PCR menggunakanprimer yang telah dirancang sebelumnya.Kemudian, hasil amplifikasi PCR tersebutdiurutkan nukleotidanya dan dibandingkandengan urutan nukleotida dalam gene bankmenggunakan megaBLAST yang dilakukandi http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Penyiapan Kultur Cendawan.Sebanyak sembilan isolat spesies Fusariumspp. diremajakan pada media agar miringPDA, kemudian ditumbuhkan ke media agarcawan PDA, dan PDB di atas shaker dengankecepatan ±80 rpm pada suhu ruang,masing-masing tahap peremajaan isolatdilakukan selama 7-10 hari. Miseliumdisaring dan langsung digunakan untukekstraksi DNA.

Ekstraksi DNA Genomik danPCR. Ekstraksi DNA genomik daricendawan dilakukan dengan metode Bluhmet al. (2002) yang telah dimodifikasi.Sembilan isolat Fusarium spp. diisolasi darimedia PDB, diambil secukupnya, disaringmenggunakan kertas saring steril,dikeringkan menggunakan vakum, kemudiandigerus menggunakan N2 cair dalam mortar.Hasil penggerusan dimasukkan ke dalamtabung eppendorf yang telah diisi dengan600 µL CTAB 2% (Lampiran 1) dan 1,2 µLß-mercapto ethanol yang sudah diinkubasipada suhu 65 oC dalam waterbath. Tabungependorf yang berisi hasil gerusan inidibolak-balik dan diinkubasi dalamwaterbath pada suhu 65 oC. Setelah 30menit, diangkat dan disimpan dalam es.Setelah kurang lebih lima menit,ditambahkan ± 600 µL CI (24:1), dibolak-balik, disentrifus pada suhu 4 oC dengankecepatan 10.000 rpm. Setelah 10 menit,sebanyak 600 µL supernatan diambil,ditambahkan ± 600 µL PCI (25:24:1),dibolak-balik, dan disentrifus pada suhu 4 oCdengan kecepatan 10.000 rpm. Setelah limamenit, supernatan diambil secukupnya,ditambah 2 M NaOAC pH 5,2 sebanyak 0,1x volume supernatan yang diambil, ditambahethanol 100% sebanyak 2 x volumesupernatan yag diambil, dan disimpan dalamfreezer. Setelah ± 30 menit, disentrifugasipada suhu 4 oC dengan kecepatan 10.000rpm. Setelah 5 menit, supernatan dibuang,dikeringkan dalam vakum, ditambahkan 50µL ddH2O, ditambahkan RNAse (1 mg/mL)

3

sebanyak 0,2 x volume, disimpan dalamoven bersuhu 37 oC selama 10 menit, dandiinaktifkan pada suhu 70 oC selama 10menit.

Amplifikasi potongan daerah 18-28s rRNA terhadap isolat sampel dilakukandengan mesin PCR menggunakan primerhasil rancangan penelitian ini. Sebanyak 1µL DNA sampel konsentrasi 100 ng/µLdimasukkan ke dalam 9 µL mix PCR yangterdiri atas 0,1 µL enzim taq polymerase 5U/µL; 0,25 µL primer forward 10 pmol(Fus1 sampai Fus4); 0,25 µL primer reverse10 pmol (Fus1 sampai Fus4); 1 µL dNTPs 2mM; 1 µL 10x taq buffer; dan 6,4 µLddH2O. Volume campuran reaksi sebanyak10 µL dimasukkan dalam mesin PCRdengan program denaturasi awal 94 oCselama 75 detik, denaturasi 95 oC selama 35detik, penempelan 56 oC selama 30 detik,dan ekstensi 72 oC selama 1 menit yangdijalankan sebanyak 35 siklus. Setelah itu,dilanjutkan dengan pasca ekstensi 72 oCselama 5 menit dan pendinginan 15 oCselama 10 menit (Jurado et al. 2006).

Elektroforesis. Produk PCRselanjutnya dielektroforesis dalam gelagarosa 1% (b/v) dengan marker 1 Kb ladderdalam larutan bufer TAE 1X (Lampiran 2).Sebanyak 5 µL DNA hasil PCR dicampurdengan 2 µL loading dye 6X kemudiandimasukkan dalam sumur yang terdapatpada gel. Elektroforesis dijalankan padategangan 100 volt selama 29 menit.Kemudian hasil elektroforesis direndamdalam larutan ethidium bromida (1 mg/L)selama 5 menit lalu dibilas dengan akuades.

Selanjutnya gel diletakkan di atas UVtransluminator dan difoto untukdokumentasi.

Pengurutan nukleotida HasilPCR. Amplifikasi PCR disiapkan denganvolume campurannya 70 µL untuk masing-masing kombinasi menggunakan pasanganprimer Fus1 dan Fus2 pada program yangsama. Sebagian hasil PCR ini, sebanyak 5µL digunakan untuk cek elektroforesis.Sisanya dikirim ke perusahaan analisa DNA(1st Base, Singapura).

HASIL

Perancangan PrimerHasil pensejajaran semua urutan

nukleotida lengkap Fusarium spp. daerahITS1, 5.8s rRNA, dan ITS2 serta sebagianurutan nukleotida 18s rRNA dan 28s rRNAmemperlihatkan keseragaman tinggi denganurutan nukleotida Giberella zeae (faseseksual F. graminearum) AB250414.1 danAY188924.1. Urutan nukleotida hasilpensejajaran ini kemudian disebut denganurutan nukleotida input primer Fusarium sp.(Lampiran 1). Hasil analisis ProgramPrimer3 diperoleh tiga macam daerahamplifikasi, yaitu 18-28s rRNA (Fus1 danFus 3), 18-5.8s rRNA (Fus 2), dan 5.8-28srRNA (Fus 4) (Tabel 1, Gambar 1).

Tabel 1 Hasil rancangan primer Fusarium spp.

Primer Gen rRNA Urutan nukleotida primer 5’.....3’ Ukuran amplikonyang diharapkan

Fus1F18-28s rRNA

5’– AACCAGCGGAGGGATCATTA – 3’653 pbFus1R 5’– CACCGCATCAAAGTCATCCT – 3’

Fus2F18-5.8s rRNA

5’– ACCAGCGGAGGGATCATTAC – 3’203 pbFus2R 5’– CGATGCCAGAACCAAGAGAT – 3’

Fus3F18-28s rRNA

5’– CGGAGGGATCATTACCGAGT – 3’647 pbFus3R 5’– CACCGCATCAAAGTCATCCT – 3’

Fus4F5.8-28s rRNA

5’– AACGGATCTCTTGGTTCTGG – 3’ 421 pbFus4R 5’– CCGCATCAAAGTCATCCTC – 3’

4

Gambar 1 Skema posisi keempat primer pada urutan nukleotida rRNA cendawan

Pengujian Primer dengan AmplifikasiPCR

Urutan nukleotida input primerFusarium sp. digunakan sebagai dasarrancangan primer forward dan reverse padaProgram Primer3 di http://frodo.wi.-mit.edu/primer3/. Hasil rancangan primermemperlihatkan perbedaan ukuran produkPCR. Primer Fus1 dan Fus3 mampumengamplifikasi daerah 18s rRNA hingga28s rRNA berukuran 650 pb amplikon, Fus2mampu mengamplifikasi daerah 18s rRNAhingga 5.8s rRNA berukuran 200 pbamplikon, dan Fus4 mampumengamplifikasi daerah 5.8s rRNA hingga28s rRNA berukuran 420 pb amplikon(Gambar 2).

Pengujian primer dilakukan padasembilan isolat Fusarium yaitu : F. equiseti,F. graminearum, F. proliferatum, F.verticillioides, F. semitectum, F. culmorum,F. oxysporum, F. solani, dan F.acuminatum. Primer Fus2 mampumendeteksi sembilan isolat uji, sedangkanprimer Fus1, Fus3, dan Fus4 mampumendeteksi enam dari sembilan isolat uji,sehingga tiga isolat uji, yaitu F. solani, F.verticillioides, dan F. equiseti hanya dapatdideteksi oleh primer Fus2 (Gambar 3).Hasil pengurutan nukleotida rDNAFusarium spp. menggunakan primer Fus1dan Fus2 dianalisis menggunakan megaBlastdi NCBI (Tabel 2).

Gambar 2 Amplifikasi PCR pada rRNA F. graminearum menggunakan berbagai pasanganprimer: (M) Marker 1 Kb ladder, (1) Fus1, (2) Fus2, (3) Fus4, dan (4) Fus3.

1)

432M)

650 pb

200 pb

420 pb

5

Gambar 3 Perbadingan hasil amplifikasi PCR menggunakan empat macam primer yang berbedapada rRNA: (M) Marker 1 Kb ladder, (1) F. graminearum, (2) F. acuminatum, (3) F. semitectum,

(4) F. proliferatum, (5) F. culmorum, (6) F. oxysporum, (7) F. solani, (8) F.verticillioides, (9) F. equiseti

Tabel 2 Hasil analisis bioinformatika menggunakan megaBLAST dari NCBI

Fragmen rRNAsampel

Homologi No. Akses SkorQuery

coverageE value

Maxident

F. graminearum F. graminearum spesies kompleks,yang terdiri dari:F. vorossi NRRL 45800F. aethiopicum NRRL 46738F. culmorum NRRL 25475F. lunulosporum NRRL 13393F. brasilicum NRRL 31238F. cortadariae NRRL 31185F. acaciae-mearnsii NRRL 34207F. boothii NRRL 29105F. mesoamericanum NRRL 29148F. austroamericanum NRRL 28585F. asiaticum NRRL 29720F. meridionale NRRL 28723

FJ240315.1,FJ240310.1,

DQ459870.1,DQ459868.1,DQ459860.1,DQ459859.1,DQ459854.1,DQ459848.1,DQ459844.1,DQ459839.1,DQ459836.1,DQ459842.1

118111811181118111811181118111811181118111811181

100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%100%

0.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.00.0

99%99%99%99%99%99%99%99%99%99%99%99%

F. acuminatum F. acuminatum NRRL 54217

Fusarium sp. NRRL 34036

HM068325.1(unpublished),GQ505451.1

1205

1208

100%

100%

0.0

0.0

99%

99%F. culmorum F. graminearum spesies kompleks

yang terdiri dari:F. aethiopicum NRRL 46738F. vorossi NRRL 45800Fusarium sp. NRRL 45833

FJ240310.1,FJ240315.1,FJ240316.1

119011901190

100%100%100%

0.00.00.0

99%99%99%

F. oxysporum F. oxysporum f. sp. melonis AY188919.1 1188 100% 0.0 99%F. proliferatum F. proliferatum NRRL 6413 GQ167230.1 1149 98% 0.0 98%F. semitectum Fusarium incartatum-equiseti

spesies kompleks yang terdiri dari:F. equiseti NRRL 36478F. lacertatum NRRL 20423

GQ505743.1,GQ505682.1,

11751175

100%100%

0.00.0

99%99%

F. solani F. solani isolat 10 FJ460589.1 364 100% 9e-98 99%F. verticillioides Gibberella moniliformis strain

PUF014HQ165917.1 322 100% 4e-85 100%

F. equisetiFusarium sp. 3 TMS-2011 voucherMS2-4

HQ630965.1 368 100% 7e-99 99%

650 pb

650 pb

420 pb

200 pb

Fus3 Fus4

Fus1 Fus2M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

6

PEMBAHASAN

Perancangan primer pada daerah18s–28s rDNA digunakan untuk mendeteksiFusarium spp.. Sehubungan hal itu, primeryang dipilih harus mempunyai nukleotidayang sama antara spesies Fusarium.Persamaan urutan nukleotida pada Fusariumdiperoleh dari pensejajaran Fusarium spp.dari NCBI kemudian diedit dan selanjutnyadianalisis pada program Bioedit danPrimer3. Hasil pensejajaran urutannukleotida Fusarium sp. 18s-28s rRNAmemperlihatkan bahwa daerah 5.8s rRNAlebih seragam bila dibandingkan dengandaerah konservasi lainnya. MenurutHershkovitz dan Lewis (1996), daerah 5.8srRNA bersifat sangat konservatif, sedangkanITS1 berevolusi sangat cepat dan ITS2berevolusi dari cepat hingga sangat cepat.Daerah 18s rRNA dan 28s rRNA digunakansebagai bahan dalam merancang primeruniversal untuk mendeteksi Fusarium sp.pada berbagai bahan pangan.

Urutan nukleotida input primerFusarium spp. digunakan sebagai dasarrancangan primer forward dan reverse padaProgram Primer3 di http://frodo.wi.-mit.edu/primer3/. Hasil rancangan primermemperlihatkan perbedaan ukuran produkPCR. Suhu optimal annealing keempatpasang primer terletak antara 54-57 oC,namun pada penelitian ini suhu annealingyang digunakan adalah 56 oC karena hasilamplifikasi terlihat paling jelas, tidakterbentuk dimer di bagian bawah gelagarosa. Perbedaan antara primer Fus2dengan primer lain terletak pada urutannukleotida reverse yang tidak komplemen didaerah 28s rRNA seperti reverse pada Fus1,Fus3, dan Fus4 (Gambar 1). Primer-primerdengan target daerah 18s rRNA dan 5.8srRNA mampu menempel dengan baik,sehingga seluruh sampel dapatteramplifikasi. Sedangkan primer dengantarget daerah 28s rRNA tidak menempelpada daerah 28s rRNA, karena perbedaansusunan nukleotida antara primer dan urutannukleotida target. Hal tersebut merupakansalah satu penyebab tidak muncul pita hasilPCR pada F. solani, F. verticillioides, dan F.equiseti yang menggunakan primer Fus1,Fus3, dan Fus4. Primer forward Fus1, Fus2,Fus3, dan Fus4 menempel dengan sangatbaik pada daerah 18s rRNA karena daerah

ini bersifat lebih konservatif daripada daerah28s rRNA.

Urutan nukleotida hasil PCR F.acuminatum, F. oxysporum, dan F. Pro-liferatum yang menggunakan primer Fus1identik dengan spesies yang sama. Urutannukleotida F. graminearum dan F.culmorum homolog satu sama lain danhomolog dengan anggota F. graminearumspesies kompleks (O’Donnell et al. 2008),yaitu F. vorossi (FJ240315.1), F.aethiopicum (FJ240310.1), F. lunulosporum(DQ459868.1), F. brasilicum (DQ459-860.1), F. cortaridae (DQ459859.1), F.acacia-mearnsii (DQ459854.1), F. boothii(DQ459848.1), F. mesoamericanum (DQ-459844.1), F. austroamericanum (DQ-459839.1), F. asiaticum (DQ459836.1), danF. meridionale (DQ459842.1). Selain itu,urutan nukleotida F. graminearum jugaidentik dengan G. zeae (DQ459831.1) yangmerupakan fase seksual dari F.graminearum. Urutan nukleotida F.verticillioides homolog dengan faseseksualnya, yaitu G. moniliformis. Hasilpensejajaran urutan nukleotida F.graminearum dengan G. zeae dan F.verticillioides dengan G. moniliformis,menunjukkan tidak ada perbedaan susunannukleotida yang menandakanmikroorganisme tersebut berada pada faseseksual atau aseksual (Tabel 2). Isolat-isolatFusarium spp. yang digunakan dalampenelitian ini merupakan hasil identifikasiberdasarkan morfologi. Namun, hasilpensejajaran urutan nukleotida F.semitectum dengan urutan nukleotida yangterdapat di genbank menunjukkan perbedaandengan hasil identifikasi berdasarkanmorfologi. Urutan nukleotida yang homologdengan F. semitectum adalah F. equiseti(GQ505743.1), F. lacertatum (GQ50568-2.1), dan F. incartatum (AY633745.1).Ketiga spesies tersebut merupakan anggotaFusarium incartatum-equiseti spesieskompleks (O’Donnell et al. 2009).

Fusarium solani, F. verticillioides,dan F. equiseti diidentifikasi menggunakanurutan nukleotida berdasarkan primer Fus2,sehingga amplikon yang dihasilkan jauhlebih sedikit bila dibandingkan dengan hasilurutan nukleotida Fusarium lainnya yangdigunakan pada penelitian ini. Hal inimemberikan dampak pada skor dan E-valuehasil pensejajaran dengan MegaBlast. Ketikaurutan nukleotida yang berukuran 400-650pb diblast menghasilkan E-value bernilai 0.Sedangkan ketika urutan nukleotida yang

7

berukuran 200 pb diblast menghasilkan E-value tidak sama dengan 0. Ukuranamplikon mempengaruhi nilai E-value,ketika ukuran amplikon kecil menghasilkannilai E-value besar, tetapi saat ukuranamplikon besar menghasilkan nilai E-valuekecil. Semakin besar skor dan semakin kecilE-value, semakin baik dan identik hasilpensejajarannya (Tisdall 2001). Nilai E-value besar menunjukkan tingkat kesalahanyang terjadi ketika proses pensejajaranantara urutan nukleotida input dengan urutannukleotida yang terdapat dalam basis dataNCBI. Hal ini disebabkan oleh ukurannyalebih kecil dari urutan nukleotida yangterdapat di NCBI. Urutan nukleotida F.solani tidak hanya identik dengan F. solani(fase aseksual Nectria haematococca), tetapijuga dengan urutan nukleotidamikroorganisme lain seperti F. oxysporum.Begitu juga dengan urutan nukleotida F.verticillioides, tidak hanya identik dengan G.moniliformis, tapi juga identik denganFusarium spp. lainnya. Sedangkan urutannukleotida F. equiseti, tidak homologdengan F. equiseti, melainkan denganFusarium sp., G. intermedia dan G.moniliformis.

Berdasarkan hasil rancangan,primer Fus1, Fus2, Fus3, dan Fus4merupakan primer universal untuk genusFusarium karena mampu mendeteksi lebihdari satu spesies Fusarium. Primer-primertersebut mampu membedakan Fusarium darigenus lain. Hal tersebut dapat dibuktikandari hasil blast (Tabel 2). Sedangkanberdasarkan hasil pengurutan nukleotidamenggunakan primer Fus1, dapat dirancangprimer spesies spesifik yang mampumembedakan antara spesies Fusarium.

Berbeda dengan primer universal,untuk merancang primer spesifik dibutuhkansusunan nukleotida yang khas pada spesiestertentu agar amplifikasi primer spesifiktersebut hanya akan mendeteksi spesiestarget. Oleh karena itu, urutan nukleotida F.graminearum, F. acuminatum, F. culmorum,F. oxysporum, F. proliferatum, dan F.semitectum hasil PCR sebelumnyadisejajarkan menggunakan program Bioedit

sehingga terlihat perbedaan urutannukleotida antar spesies. Data urutannukleotida DNA yang berbeda dijadikandasar untuk merancang primer forward danreverse yang baru. Perancangan primerdilakukan dengan memilih urutan nukleotida(21-28 nukleotida) yang berbeda kemudiandianalisis dalam Program Oligocalc dihttp://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html.

Hasil pensejajaran urutan-urutannukleotida Fusarium spp. memperlihatkanadanya kesamaan antara urutan nukleotidaF. graminearum dengan urutan nukleotidaF. culmorum (Tabel 3). Hal ini disebabkanF. culmorum hasil pengurutan nukleotidapenelitian ini termasuk dalam anggota F.graminearum spesies kompleks. Hasilanalisis primer forward menggunakanOligocalc, tidak ditemukan strukturpalindrom dan bentuk seperti jepit rambut.Primer-primer dirancang dari urutannukleotida ITS1 (Tabel 4). SedangkanPrimer reverse dapat diambil dari primerreverse Fus2 atau primer reverse universaluntuk fungi.

Sampai saat ini terdapat tigamacam urutan nukleotida yang telahdianalisis keefektifannya sebagai dasaruntuk mendeteksi Fusarium secaramolekuler, yaitu Internal Transcribe Spacer(ITS), Intergenic Spacer (IGS), danTranslation Elongation Factor 1-ά (TEF 1-ά). Primer Fus2 adalah primer universaluntuk genus Fusarium yang dirancangberdasarkan ITS1 dapat mendeteksiFusarium spp. (Premitasari 2012). Primer-primer yang dirancang berdasarkan IGSmerupakan primer universal dan spesiesspesifik, dapat mendeteksi kontaminasiFusarium mikotoksigenik pada serealia(Jurado et al. 2006). Primer EF-1/EF-2adalah primer spesies spesifik yangdirancang berdasarkan TEF 1-ά dapatmendeteksi spesies Fusarium dalam spesieskompleks Gibberella fujikuroi (Hsuan et al.2011). Penggunaan primer-primer tersebutdapat disesuaikan dengan tujuanpendeteksian.

8

Tabel 3 Perbedaan urutan nukleotida beberapa spesies Fusarium berdasarkan hasil pengurutannukleotida

No. Spesies Urutan nukleotida1. F. graminearum GAA CAT ACC T-T ATG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC2. F. acuminatum GAA CAT ACC TTA ATG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC3. F. culmorum GAA CAT ACC T-T ATG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC3. F. oxysporum GAA CAT ACC ACT –TG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC4. F. proliferatum GAA CAT ACC AAT –TG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC5. F. semitectum GAA CAT ACC TAT ACG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC

Tabel 4 Kandidat primer forward spesies spesifik berdasarkan daerah ITS

No. Spesies Urutan nukleotidaTm(oC)

Ta(oC)

GC(%)

1. F. graminearum CCT TAT GTT GCC TCG GCG GAT 56,3 51,3 572. F. graminearum GAA CAT ACC TTA TGT TGC CTC GGC GG 61,1 56,1 543. F. graminearum AAC ATA CCT TAT GTT GCC TCG GCG 57,4 52,4 504. F. graminearum TTA TGT TGC CTC GGC GGA TCA GCC C 62,6 57,6 605. F. acuminatum CCT TAA TGT TGC CTC GGC GGA T 56,7 51,7 556. F. acuminatum CCT TAA TGT TGC CTC GGC GGA TCA G 61 56 567. F. acuminatum TTA ATG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC 62,7 57,7 588. F. oxysporum CCA CTT GTT GCC TCG GCG GAT 58,3 53,3 629. F. oxysporum CCA CTT GTT GCC TCG GCG GAT CAG 62,5 57,5 6310. F. oxysporum ACT TGT TGC CTC GGC GGA TCA GCC C 64,2 59,2 6411. F. proliferatum CCA ATT GTT GCC TCG GCG GAT 56,3 51,3 5712. F. proliferatum CCA ATT GTT GCC TCG GCG GAT CAG 60,8 55,8 5813. F. proliferatum AAT TGT TGC CTC GGC GGA TCA GCC C 62,6 57,6 6014. F. semitectum CCT ATA CGT TGC CTC GGC GGA T 58,6 53,6 5915. F. semitectum CCT ATA CGT TGC CTC GGC GGA TCA G 62,6 57,6 6016. F. semitectum TAT ACG TTG CCT CGG CGG ATC AGC CC 64,3 59,3 60

SIMPULAN DAN SARAN

SimpulanTerdapat empat macam primer

yang berhasil dirancang, yaitu Fus1 danFus3 yang dapat mengamplifikasi daerahITS 1 dan ITS 2 berukuran 650 pb amplikon,Fus2 yang dapat mengamplifikasi daerahITS1 berukuran 200 pb amplikon, dan Fus4yang dapat mengamplifikasi daerah ITS2berukuran 420 pb amplikon. Primer Fus2mampu mengamplifikasi seluruh isolat uji,sedangkan primer Fus1, Fus3, dan Fus4berhasil mengamplifikasi enam isolat.

SaranPerlu dilakukan pengujian

spesifitas primer terhadap spesies Fusariumlainnya dan spesies kontaminan.

DAFTAR PUSTAKA

Bluhm BH, Flaherty JE, Cousin MA, danWoloshuk CP, 2002. Multiplexpolymerase chain reaction assayfor the differential detection oftrichothecene and fumonisin-producing species of Fusarium incornmeal. J Food Protect 65:1955–1961.

Darmono TW, Jamil I, Dwi AS. 2006.Pengembangan penandamolekuler untuk deteksiPhytophtora palmivora padatanaman kakao. MenaraPerkebunan 74(2): 87-96.

Edel V. 1998. Polymerase chain reaction inmycology: an overview. In:Bridge PD et al. (editor).Applications of PCR in Mycology.United Kingdom: CABIntenational. Hlm 1-20.

Jurado M, Va´zquez C, Mari´n S, Sanchis V,Gonza´lez-Jae´n MT. 2006. PCR-based strategy to detectcontamination with mycotoxigenic

9

Fusarium species in maize. SystAppl Microbiol 29: 681-689.

Hershkovitz, M.A. and Lewis, L.A. 1996.Deep-level diagnostic value of therDNA-ITS region. Mol Biol Evol13:1276–95

Hsuan HM, Salleh B, Zakaria L. 2011.Molecular identification ofFusarium species in Gibberellafujikuroi species complex fromrice, sugarcane and maize fromPeninsular Malaysia. Int J Mol Sci12: 6722-6732.

Llorens A. et al. 2005. Characterization ofFusarium spp. isolates by PCR-RFLP analysis of the intergenicspacer region of the rRNA gene(rDNA). Int J Food Microbiol106: 297-306.

McDowell D. 1999. PCR: Factors affectingreliability and validity. Di dalam:Saunders GC, Parkers HC, editor.Analytical molecular Biology:quality and validation.Teddington: Laboratory of theGovernment Chemist. hlm 58-80.

O’Donnell K. et al. 2008. Multilocusgenotyping and molecularphylogenetics resolve a novelhead blight pathogen within theFusarium graminearum speciescomplex from Ethiopia. FungalGenet Biol 45: 1514–1522.

O’Donnell K. et al. 2009. Novel multilocussequence typing scheme revealshigh genetic diversity of humanpathogenic members of theFusarium incarnatum-F. equisetiand F. chlamydosporum speciescomplexes within the UnitedStates. J Clin Microbiol 47(2):3851–3861.

Patola E. 2008. Lingkungan tumbuh,organisme pengganggu tanamangandum, serta pengendaliannya.Jurnal Inovasi Pertanian 7(1): 19-25.

Suanthie Y, Maribeth AC, Charles PW.2009. Multiplex real-time PCR fordetection and quantification ofmycotoxigenic Aspergillus,Penicillium and Fusarium. JStored Prod Res 45: 139-145.

Surachmat M. 1996. Deskripsi BeberapaPenyakit Penting pada TanamanKelapa Sawit di Persemaian.Jakarta: Badan KarantinaPertanian

Tisdall J. 2001. Beginning Perl forBioinformatics. California:O’Reilly & Associates, Inc.

White TJ, Bruns T, Lee S, dan Taylor J.1990. Amplification and directsequencing of fungal ribosomalRNA genes for phylogenetics.PCR protocols a guide to methodsand applications. San Diego:Academic Press: 315-322.

Winarsih S. 2007. Pengaruh bahan organikpada pertumbuhan Gliocladiumvirens dan daya antagonisnyaterhadap Fusarium oxysporumsecara in-vitro. Jurnal Ilmu-IlmuPertanian Indonesia Edisi khusus3: 386-390.

Windels CE. 2000. Economic and socialimpacts of Fusarium Head Blight :changing farms and ruralcommunities in the Northern greatplains. Phytopathology 90: 17–21.

Yuwono T. 2006. Teori dan AplikasiPolymerase Chain Reaction.Yogyakarta: ANDI.

10

LAMPIRAN

11

Lampiran 1 Urutan nukleotida Input Primer Fusarium spp. berdasarkan 18-28s rRNA 2805 pb

1 CATGCATGTC TAAGTATAAG CAATTATACA GCGAAACTGC GAATGGCTCA TTATATAAGT TATCGTTTAT 70

71 TTGATAGTAC CTTACTACTT GGATAACCGT GGTAATTCTA GAGCTAATAC ATGCTAAAAA TCCCGACTTC 140

141 GGAAGGGATG TATTTATTAG ATTAAAAACC AATGCCCTCC GGGGCTCACT GGTGATTCAT GATAACTCCT 210

211 CGAATCGCAT GGCCTTGCGC CGGCGATGGT TCATTCAAAT TTCTTCCCTA TCAACTTTCG ATGTTTGGGT 280

281 ATTGGCCAAA CATGGTTGCA ACGGGTAACG GAGGGTTAGG GCTCGACCCC GGAGAAGGAG CCTGAGAAAC 350

351 GGCTACTACA TCCAAGGAAG GCAGCAGGCG CGCAAATTAC CCAATCCCGA CACGGGGAGG TAGTGACAAT 420

421 AAATACTGAT ACAGGGCTCT TTTGGGTCTT GTAATTGGAA TGAGTACAAT TTAAATCCCT TAACGAGGAA 490

491 CAATTGGAGG GCAAGTCTGG TGCCAGCAGC CGCGGTAATT CCAGCTCCAA TAGCGTATAT TAAAGTTGTT 560

561 GTGGTTAAAA AGCTCGTAGT TGAACCTTGG GCCTGGCTGG CCGGTCCGCC TCACCGCGTG TACTGGTCCG 630

631 GCCGGGCCTT TCCCTCTGTG GAACCCCATG CCCTTCACTG GGCGTGGCGG GGAAACAGGA CTTTTACTGT 700

701 GAAAAAATTA GAGTGCTCCA GGCAGGCCTA TGCTCGAATA CATTAGCATG GAATAATAGA ATAGGACGTG 770

771 TGGTTCTATT TTGTTGGTTT CTAGGACCGC CGTAATGATT AATAGGGACA GTCGGGGGCA TCAGTATTCA 840

841 ATTGTCAGAG GTGAAATTCT TGGATTTATT GAAGACTAAC TACTGCGAAA GCATTTGCCA AGGATGTTTT 910

911 CATTAATCAG GAACGAAAGT TAGGGGATCG AAGACGATCA GATACCGTCG TAGTCTTAAC CATAAACTAT 980

981 GCCGACTAGG GATCGGACGG TGTTATTTTT TGACCCGTTC GGCACCTTAC GAGAAATCAA AGTGCTTGGG 1050

1051 CTCCAGGGGG AGTATGGTCG CAAGGCTGAA ACTTAAAGAA ATTGACGGAA GGGCACCACC AGGGGTGGAG 1120

1121 CCTGCGGCTT AATTTGACTC AACACGGGGA AACTCACCAG GTCCAGACAC AATGAGGATT GACAGATTGA 1190

1191 GAGCTCTTTC TTGATTTTGT GGGTGGTGGT GCATGGCCGT TCTTAGTTGG TGGAGTGATT TGTCTGCTTA 1260

1261 ATTGCGATAA CGAACGAGAC CTTAACCTGC TAAATAGCCC GTATTGCTTT GGCAGTACGC TGGCTTCTTA 1330

1331 GAGGGACTAT CGGCTCAAGC CGATGGAAGT TTGAGGCAAT AACAGGTCTG TGATGCCCTT AGATGTTCTG 1400

1401 GGCCGCACGC GCGCTACACT GACGGAGCCA GCGAGTACTT CCTTGTCCGA AAGGTCCGGG TAATCTTGTT 1470

1471 AAACTCCGTC GTGCTGGGGA TAGAGCATTG CAATTATTGC TCTTCAACGA GGAATCCCTA GTAAGCGCAA 1540

1541 GTCATCAGCT TGCGTTGATT ACGTCCCTGC CCTTTGTACA CACCGCCCGT CGCTACTACC GATTGAATGG 1610

1611 CTCAGTGAGG CGTCCGGACT GGCCCAGAGT GGTGGGCAAC TACCGCTCAG GGCCGGAAAG CTCTCCAAAC 1680

1681 TCGGTCATTT AGAGGAAGTA AAAGTCGTAA CAAGGTCTCC GTTGGTGAAC CAGCGGAGGG ATCATTACCG 1750

1751 AGTTTACAAC TCCCAAACCC CTGTGAACAT ACCTTATGTT GCCTCGGCGG ATCAGCCCGC GCCCCGTAAA 1820

1821 AAGGGACGGC CCGCCGCAGG AACCCTAAAC TCTGTTTTTA GTGGAACTTC TGAGTATAAA AAACAAATAA 1890

1891 ATCAAAAAAC TTTCAACAAC GGATCTCTTG GTTCTGGCAT CGATGAAGAA CGCAGCAAAA TGCGATAAGT 1960

1961 AATGTGAATT GCAGAATTCA GTGAATCATC GAATCTTTGA ACGCACATTG CGCCCGCTGG TATTCCGGCG 2030

2031 GGCATGCCTG TTCGAGCGTC ATTTCCCCAA ATTGATTGGC GGTCACGTCG AGCTTCCATA GCGTAGTAAT 2100

2101 TTACACATCG TTACTGGTAA TCGTCGCGGC CACGCCGTTA AACCCCAACT TCTGAATGTT GACCTCGGAT 2170

2171 CAGGTAGGAA TACCCGCTGA ACTTAAGCAT ATCAATAAGC GGAGGAAAAG AAACCAACAG GGATTGCCCT 2240

2241 AGTAACGGCG AGTGAAGCGG CAACAGCTCA AATTTGAAAT CTGGCTCTCG GGCCCGAGTT GTAATTTGTA 2310

2311 GAGGATGACT TTGATGCGGT GCCTTCCGAG TTCCCTGGAA CGGGACGCCA TAGAGGGTGA GAGCCCCGTC 2380

2381 TGGTTGGATG CCAAATCTCT GTAAGTCTCC TTCGACGAGT CGAGTAGTTT GGGAATGCTG CTCTAAATGG 2450

2451 GAGGTATATG TCTTCTAAAG CTAAATACCG GCCAGAGACC GATAGCGCAC AAGTAGAGTG ATCGAAAGAT 2520

2521 GAAAAGCACT TTGAAAAGAG AGTTAAAAAG TACGTGAAAT TGTTGAAAGG GAAGCGTTTA TGACCAGACT 2590

2591 TGGGCTTGGT TAATCATCTG GGGTTCTCCC CAGTGCACTT TTCCAGTCCA GGCCAGCATC AGTTTTCGCC 2660

2661 GGGGGATAAA GGCTTCGGGA ATGTGGCTCC CCTCGGGGAG TGTTATAGCC CGTTGTGTAA TACCCTGGCG 2730

2731 GGGACTGAGG TTCGCGCTTC TGCAAGGATG CTGGCGTAAT GGTCATCAAC GACCCGTCTT GAAACACGGA 2800

2801 CCAAG 2805

12

Lampiran 2 Cara membuat larutan buffer TAE 1x

Komposisi

Tris base 242 gr

Glacial acetic acid 57,1 mL

0,5M EDTA 100 mL

Aquades 1,25 liter

Cara membuat:

1. Pertama-tama, buat larutan stok buffer TAE 50x dengan cara mencampurkan Tris base 242 gr,

Glacial acetic acid 57,1 ml, dan 0,5M EDTA 100 ml, kemudian tambahkan Aquades hingga

1 liter

2. Untuk membuat larutan buffer TAE 1x sebanyak 250 mL, campurkan 5 mL larutan stok

buffer TAE 50x ke dalam 250 mL aquades.

13

Lampiran 3 Cara membuat larutan CTAB 2%

Komposisi:

Cetyl Trimethyl-Ammonium Bromide 2 gr

Aquades 100 ml

Cara membuat larutan CTAB:

1. Masukkan 2 gr CTAB ke dalam labu erlemeyer

2. Tera hingga 100 ml

3. Kocok labu Erlenmeyer agar larutan tercampur rata