10

SEMINAR JURNAL

IDENTIFIKASI MOLEKUL DARI SPESIES RAGI YANG BERHUBUNGAN LANGSUNG DENGAN HAMEI- YANG BIASA DIGUNAKAN ORANG JAMAN DAHULU DI MANIPUR, INDIA

Dosen Pembimbing :Wiwit, M.SiOleh :Ani SusilaningsihNPM. A1F010016

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIAFAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKANUNIVERSITAS BENGKULU2013AbstrakDi Manipur Negara Bagian Timur Laut India, terdapat anggur yang berasal dari beras ketan yang biasanya digunakan orang-orang zaman dahulu yang dikenal dengan sebutan hamei merupakan minuman yang menarik karena rasanya sangat unik. Sebanyak 163 isolat ragi diperoleh dari lima puluh empat sampel hamei yang dikumpulkan dari bahan anggur beras rumah tangga di desa-desa suku Manipur. Identifikasi molekul dari ragi dilakukan dengan analisis pola pembatasan dari amplifier PCR internal yang di transkripsi dengan 5.85 rRNA gen (ITS1-5.8S-ITS2). Ada tujuh belas profil pembatasan yang berbeda di peroleh dari produk PCR dan pembatasan analisis dengan tiga endonuklease (Hae III, CFO I dan Hinf I). Sembilan kelompok diidentifikasikan sebagai S. cerevisiae, Pichia anomala, Trichosporon sp, Candida tropicalis., Pichia guilliermondi, Candida parapsilosis, Torulaspora delbrueckii, Pichia fabianii dan Candida montana dengan membandingkan profil ini-ITS RFLP dengan strain jenis umum anggur ragi, data yang dipublikasikan dan analisis insiliko data sekuens ITS tersedia dalam database ragi CBS. Profil ITS-RFLP dari kedelapan kelompok tidak sesuai dengan database yang tersedia dari 288 spesies ragi anggur umum. Spesies ragi yang paling sering dihubungkan dengan hamei adalah S. cerevisiae (32,5%), P. anomala (41,7%) dan Trichosporon sp. (8%). Identitas kelompok utama dikonfirmasikan oleh ITS dengan hind III, EcoRI, DDE I dan Msp I. Keanekaragaman genetik kelompok S. Cerevisiae diselidiki menggunakan Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Meskipun sebagian besar dari 53 S. Cerevisiae diperiksa pola spesies umum yang spesifik, tingkat yang berbeda dari panjang kromosom polimorfisme dan variabel jumlah fragmen DNA kromosom diamati dalam spesies. Analisis Cluster menunjukkan tujuh kariotipe utama (K1-K7) dengan kesamaan lebih dari 83%. Kariotipe Pola K1 adalah yang paling sering (67,9%) di antara sampel yang berbeda. Kariotipe K2-K7 yang sangat unik dengan kesamaan kurang dari 80%. Akhirnya digunakan analisis DNA mitokondria (mt-DNA RFLP), S. cerevisiae milik K1 kariotipe utama yang jelas dibedakan dengan polimorfik tinggi oleh Hinf I dan Hae III endonuklease.

I. PENDAHULUAN1.1 Latar BelakangAnggur beras dari beras ketan adalah minuman alkohol tradisional yang populer di Negara bagian Timur Laut India. Anggur ini di produksi di dalam kondisi non-steril dalam skala rumah tangga menggunakan kue padatan beras yang biasa digunakan orang zaman dahulu. Prinsip manufaktur beras anggur terdiri dari sakarifikasi pati nasi oleh enzim pada jamur dalam fermentasi aerobik dan jumlah yang dibentuk dicampur dengan air dan dibiarkan mengalami fermentasi ragi alkohol menggunakan kue tradisional yang digunakan orang-orang zaman dahulu. Atingba adalah minuman beralkohol tradisional di Negara bagian Manipur India dari beras ketan dengan menggunakan Hamei. Hamei adalah kue beras yang mirip dengan ragi di Indonesia, budob di Filipina, Chu di Cina, Naruk di Korea dan Marcha dari Sikkim yangs secara tradisional digunakan untuk bahan anggur beras. Kue Hamei disiapkan dari bahan baku beras dengan yangli 0.25 kg kg-1 bersama dengan air untuk membentuk adonan dengan kadar air 65-70%. Inokulasi dengan bubuk hamei dari kumpulan sebelumnya, di ikuti dengan pencampuran menyeluruh. Adonan di inokulasi dibentuk menjadi kue datar berukuran sekitas 2-7 cm dan diameter ketebalan sekitar 0,6-1,5. Kue beras itu siap di simpan di dalam sekam padi di lantai/bambu keranjang antara 2-3 hari pada suhu kamar (20-30 C). Bagian yang di inginkan untuk fermentasi ditandai dengan pengembungan kue, rasa beralkohol dan warna kekuningan. Perdagangan dilakukan selama mudim panas (mei-juli) dan kue kering memiliki umur simpan hingga satu tahun. Keterbatasan pengetahuan tentang komposisi mikroba penyusun fermentasi berpengaruh terhadap pengembangan industri produksi dari anggur beras. Secara tradisional, ragi telah diidentifikasi berdasrkan morfologi, fisiologi dan karakteristik biokimianya. Metode ini memakan watu dan tenaga. Metode ini berdasarkan pada analisis polimorfisme di DNA dari gen pada ribosom nya (5S, 5.8S, 18S dan 26s) dan non-coding ITS. Pada tahun 1999, Esteve-Zarzoso et al, dan. Granchi et al., mengusulkan metode cepat dan mudah unutk mengidentifikasi ragi terkait dengan makanan fermentasi berdasrkan analisis RFLP dari 5.8S rRNA gen dan Internal Transcribed Spacers (ITS1 dan ITS2). Berdasarkan perbandingan metodologi yang berbeda untuk identifikasi disimpulkan bahwa 5.8S rDNA-ITS-RFLP sebagai metode yang terbaik untuk identifikasi cepat dan akurat dari spesies sel ragi. Perbandingan pembelajaran menunjukkan bahwa kromosom elektroforetik analisis menggunakan Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) (Canas et al, 1997;. Sipiczki et al, 2001;. Almedia et al, 2007.) dan mitokondria DNA-RFLP (Querol dan Barrio, 1990; Querol dan Ramon, 1996) dapat membedakan strain spesies ragi bagi industri penting. Penelitian ini di tujukan unutk diferensiasi, identifikasi dan karekterisasi dari 163 ragi tradisional dari 54 sampel hamei yang dikumpulkan dari berbagai daerah di manipur, India. Spesies ragi di identifikasi melalui analisis dan pentipean spesies ragi untuk kepentingan industri dilakukan dengan menggunakan PFGE dan mt-DNA RFLP.

1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang di atas,dapat dirumuskan beberapa masalah yaitu:1. Apakah jenis strain yang terdapat dalam hamei?2. Berapa persentase spesies ragi yang sering dihubungkan dalam hamei?3. Bagaimana mengidentifikasi kelompok ragi utama dalam hamei?

1.3 Batasan PenelitianBerdasarkan rumusan masalah penelitian ini hanya membahas tentang jenis strain yang terdapat dalam hamei, berapa persentase jenis spesies ragi yang sering dihubungkan dalam hamei dan cara mengidentifikasi jenis kelompok ragi utama dalam hamei.

1.4 Tujuan Berdasarkan rumusan masalah, tujuan penelitian ini adalah:1. Mengidentifikasi jenis strain yang terdapat dalam hamei2. Mengetahui persentase spesies ragi dalam hamei3. Mengetahui cara mengidentifikasi kelompok ragi utama dalam hamei

1.5 Manfaat penelitianAdapum manfaat penelitian dari jurnal ini adalah:1. Untuk mengidentifikasi jenis strain yang terdapat dalam hamei2. Untuk mengetahui persentase jenis ragi dalam hamei3. Untuk mengetahui cara mengidentifikasi kelompok ragi utama dalam hamei

II. TINJAUAN PUSTAKA2.1 Studi LiteraturPCR yaitu suatu suatu proses penggandan atau amplifikasi DNA didalam laboratorium dengan menggunakan primer yaitu 2 oligonukleotida sintesis yang berlawanan lokasinya (5 dan 3) pada masing-masing pasangan lembar tunggal DNA dan dikatalisasi dengan enzim DNA polymerase. Polimorfisme pada sekuens DNA manusia dapat di deteksi dengan RFLP yaitu dengan memotong DNA dengan enzim restriksi yang mempunyai recogninition site tertentu (M. H. Faradz : 2004)2.2 Studi PustakaSaccharomyces cerevisiae termasuk ke dalam ragi fermentasi yang kuat yang terjadi pada makanan namun jarang digunakan karena lebih merusak. Karakteristik koloni dan sel degan sporulasi kerja di definisikan sebagai jenisnya. Ketidak adaan sporulasi, diidentifikasikan sebagai dugaan ketiadaan identifikasi penuh system Barnett et al. (2000) menggunakan metode aplikasi molekul (I. Pitt : 2007)PFGE diartikan sebagai Pulsed-Field Gel Electrrophoresis, yakni sebuah metode yng melibatkan pertukaran lokasi untuk memisahkan DNA besar. Dua konfigurasi didiskusikan sebagai PFGE versi asli dengan poin elektroda dan versi lama menggunakan elektroda berkelanjutan. Dalam semua tekhnik PFGE, biasanya dua perbedaan lokasi karena hidupnya aruh diantara dua permukaan elekroda ( Burmeister : 1990)Haploid alami dari mtDNA, mengeliminasi rekombinasi genetic di mitokondria gen yang mungkin responsif melindungi beentuk allelnya. Dua strategi yang dapat digunakan untuk memperkirakan bermacam-macam fungi pada mitokondria adalah analisis RFLP dan urutan DNA (S. Foster : 2000 )

III. METODE PENELITIAN3.1 Alat dan Bahana. Pengumpulan SampelPengumpulan sampel hamei dilakukan pada Mei-Juni 2004 dari desa yang berbeda suku (Khurkhul, Sekmai, Mahabalikhun, Dewlaland, Keikhu, Sangaithel choubok, Andro, Keinou, Jiribam, Sangaiprou, Kabuikhul, Irilbung) Manipur dan Silchar Assam, India. Kemudian dibawa ke laboratorium dan di simpan pada suhu 5 C. Untuk analisis mikroba. hamei di laboratorium dengan metode tradisional digunakan dalam penelitian ini.

b. IsolasiSepuluh gram bubuk sampel hamei dalam 90 ml campuran yang tersterilisasi dari 0,85% w/v. Pada pengenceran (106 dan 107) tersebar pada piring YEP agar (Yeast Extract 1%, Pepton 2%, Glukosa 2%, 2% Agar, pH 6,5; Himedia, Mumbai, India) dilengkapi dengan ampisilin 100 ng l-1dan di inkubasi pada suhu 28 C. Koloni yang muncul dihitung sebagai koloni unit (CFU) g-1 berat sampel kering. Koloni yang dominan dipilih berdasarkan perbedaan morfologi koloni di mikroskop (teropong mikroskop Stereo SZ-ST, Olympus). Terpilihlah sub kultur koloni di piring baru dan dimurnikan dengan goresan ulang. Sebanyak 163 isolat diperoleh dan di pertahankan di YEP pada 5 C dan dalam stok gliserol (30%) pada -20 C.

3.2 Langkah Kerjaa. Tipe RagiStrain ragi dari berbagai spesies diperoleh untuk kontrol dari Microbial Type Culture Collection (MTCC) Institut Teknologi Mikroba (Imtech), Chandigarh. Berikut strain yang di dipelajari: Candida tropicalis MTCC184, C. intermedia MTCC1404, C. cacaoi MTCC1904, Saccharomyces cerevisiae MTCC180, Pichia anomala MTCC237, Williopsis satunus MTCC638, Wickerhamilla domerequiae MTCC2887 dan Trigonopsis variablis MTCC1354.

b. Amplifikasi ITS-PCRSel koloni ragi segar dari 48 jam lalu berkembang di piring YEP agar di kumpulkan dengan ujung tusuk gigi yang bersih dan di tangguhkan dalam PCR campuran dan langsung digunakan untuk analisis PCR. Amplifikasi dari ITS1-5.8S-ITS2 dilakukan pada 25 l reaksi pencampuran berisi 2.5 l buffer PCR (10 x) (Promega, A3511, USA) 1,0 ml 25 mM MgCl2, 0,5 ml 25 mM dNTP (Promega, U1240), 1 l masing-masing maju dan kemunduran primer (200 pmol ml-1) 0,5 ml (3U) DNA polimerase Taq (Promega, M1901) dan 18,5 ml air deionisasi diautoklaf (MilliQ, Millipore India). Amplifikasi dilakukan dengan total 36 PCR yang berputar di lingkaran termal (ICycler, Biorad, USA). Perputaran program dimulai dengan identitas sel awal lisis pada 95 C selama 10 menit diikuti dengan 36 siklus denaturasi pada 94 C selama 30 detik, penguatan pada 55 C selama 30 detik dan elongasi pada 72 C selama 1 menit. PCR berakhir pada ekstensi akhir pada suhu 72 C selama 7 menit dan produk didinginkan pada suhu 4 C. Amplifi fragmen DNA dipisahkan dengan 3 l dari produk PCR dengan 0.5 buffer pemuat (6x) (Promega, DV4371) sampai 1% agarosa (Promega, V3125) gel yang mengandung 0,5 ml ml-1 etidium bromida (Promega, H5041). DNA penanda (Ryodan, RMBD135; Promega, G5711) dimasukkan sebagai standar untuk perhitungan ukuran fragmen DNA . gel dijalankan dalam 0,5 x buffer TBE (89 mM Tris l-1 (Promega, H5131), 89 mM Asam Borat (Promega, H5003), 25 mM na2- EDTA (Promega, H5031, pH 8,0) selama 2 jam pada 100 V (Sub-your GT dan 192, Biorad) dan difoto gel menggunakan sistem dokumentasi (Gel Doc EQ, Biorad). Ukuran Band diperkirakan dengan membandingan DNA tangga menggunakan Kuantitas Salah satu perangkat lunak versi 4.5.1 (Biorad, USA).

c. Analisis PembatasanEmpat mikroliter dari produk PCR dicerna lebih lanjut tanpa pemurnian dalam volume 10 l reaksi (1,0 l 10 buffer 0,4 l enzim pembatas (Promega), 0,2 ml BSA dan 4,4 ml steril deionised air), menggunakan instruksi dan kondisi dengan perbedaan enzim pembatas yang berbeda. Enzim pembatas yang digunakan untuk semua isolat ragi adalah Hae III, Hinf I dan CFO I (Esteve-Zarzoso et al., 1999; Granchi et al, 1999). Kelompok utama dikonfirmasikan dengan enzim tambahan DDE I, Msp I, III dan Hind Eco RI (Promega). Reaksi pencernaan diinkubasi dalam air mandi 37 C semalam. Produk RFLP dianalisis dengan elektroforesis horisontal pada 2% (w/v) gel agarose. Fragmen DNA dipisahkan dengan 10 l produk PCR dengan 1,5 penyangga penggganggu (Promega, H5041).

Gambar 3. Penggolongan ITS-RFLP dari ragi isolasi dari hamei oleh PCR amplification daerah ITS-5.85-ITS2 (A) dengan menggunakan profil ITS-RFLP (B) dengan menggunakan pembatas Hae III enzim endonucleaseDNA tanda 100 bp (Ryodan, RMBD135) dan 1 kb (Promega, G5711) ukuran Tangga DNA dimasukkan untuk perhitungan ukuran fragmen DNA. Gel berjalan pada 0,5 penyangga TBE selama 2 jam pada 80 V (Sub-cell GT dan 192, Biorad) dan difoto menggunakan sistem dokumentasi gel (Gel Doc EQ, Biorad). Gel dianalisis menggunakan Kuantitas Salah satu software versi 4.5.1 (Biorad, USA) yang memungkinkan penentuan molekul ukuran produk pembatasan.

d. Karyotyping ElektroforesisAnalisis kariotipe dilakukan dengan Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) (Gene navigator, Amersham Bioscience, Hong Kong) dengan mengikuti protokol yang dijelaskan oleh Schwartz dan Cantor (1984) dengan beberapa modifikasi. Isolat S. cerevisiae yang dikembangkan dalam 5 ml YEP broth dan diinkubasi pada suhu 28 C semalam. Volume sesuai dengan 5 OD 660 nm dalam sentrifugasi 4000 rpm selama 5 menit pada 4 C, dicuci dua kali dengan 500 ml 50 mM EDTA dan resuspended dalam 200 ml 50 mM EDTA. Spheroplast disiapkan dengan menambahkan 60 ml lyticase (Sigma) 1 mg ml-1 dengan 300 ml sampel (untuk 6 penyumbat) diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit. Kromosom DNA dari colokan S. cerevisiae disusun oleh pencampuran suspensi spheroplast dengan volume sama 1 % agarosa leleh rendah pada 40 C. Campuran tersebut dibagikan ke dalam cetakan untuk membentuk colokan agarosa dan disimpan dalam lemari es pada suhu 4 C selama 15 menit untuk solidifikasi. Colokan diinkubasi selama semalam di 37 C dalam larutan 0.25 M EDTA dan 5% mercaptoethanol. Selanjutnya colokan agar dicuci empat kali dengan 2 ml 50 mM EDTA dan diinkubasi dengan larutan mengandung 0,4 M EDTA, 10 mM Tris (pH 8.0), SDS 1% dan 0,5 mg ml-1 preoteinase-K (Ryodan) pada 50 C semalam. Colokan dicuci dua kali dengan 2 ml 50 mM EDTA dan disimpan dalam 2 ml 50 mM EDTA pada 4 C sampai digunakan. Elektroforesis dilakukan pada 1,0% agarosa (Agarose-PFGE, Amersham) dan 0,5 TBE buffer pada 9 C dan 180 V. Gel dijalankan selama 26 jam dengan kecepatan 60 detik selama 15 jam diikuti 90 detik untuk 11 jam. S. cerevisiae MTCC 180 kromosom digunakan sebagai kontrol. Untuk menjalankannya, PFGE penanda (225-22,000 kb) dari S. cerevisiae strain YPH80 (D4658, Sigma) sebagai penanda berat molekul. Setelah elektroforesis, gel diwarnai dengan larutan etidium bromida (0,5 mg ml-1) dan difoto menggunakan gel sistem dokumentasi (Gel Doc EQ, Biorad). Pola perbandingan dievaluasi oleh inspeksi visual dan dianalisis menggunakan Kuantitas Satu perangkat lunak versi 4.5.1 (Biorad, USA). Isolat dianggap identik hanya jika semua band yang cocok persis. Isolat dengan profil kariotipe yang berbeda hanya dengan posisi band atau dengan ada atau tidak adanya satu band yang dianggap berbeda strain. Program komputer NTSYSpc software versi 2.20f adalah digunakan untuk generasi analisis cluster dalam dendrogram berdasarkan cc.

e. Mitochondria DNA-RFLPLima milliliter culture yang tumbuh semalam di pidahkan ke 100 ml kaldu YEP dalam 250 ml labu kerucut dan disimpan di bawah 200 rpm pada 28 C selama 2-3 jam. Sel dipanen pada 6000 rpm pada suhu 4 C selama 10 menit dan dilarutkan dalam 5 ml buffer TE. DNA total diisolasi dengan menggunakan metode yang dijelaskan oleh Querol et al., 1992. DNA hasil isolasi dihitung menggunakan spektrofotometer (ND-1000, Nano Drop) dan dibekukan kering menggunakan rangkaian vakum konsentrator Dice algorithm and Unweighed Pair Group Method Using Arithmetic averages (UPGMA) analisis cluster berdasarkan kesamaan Jaccard Indeks menggunakan versi software LALU 0,82. Satu kilobyte DNA tangga (G5711, Promega) digunakan sebagai penanda ukuran.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Identifikasi MolekulDalam rangka untuk memastikan flora ragi yang dominan dalam 'Hamei', total ragi 163 isolat dari 54 sampel 'Hamei' diambil untuk penelitian ini. Wilayah rRNA gen unit pengulangan yang mencakup dua non-coding daerah ditunjuk sebagai Internal Transkripsi Spacer (ITS1 dan ITS2) dan gen rRNA 5.8S diamplifikasi dan dicerna oleh beberapa endonuklease restriksi. Pola yang diperoleh untuk setiap isolat dibandingkan dengan pola referensi strain dari spesies yang paling umum hadir dalam anggur (Data tidak dipublikasikan dari Universitas Basilicata, Potenza, Italia) dan dijelaskan sebelumnya dalam literatur (Guillamon et al, 1998;. Esteve-Brambly et al, 1999 Grancher et al, 1999 Fernandez-Espinar et al... 2000, Llanos et al, 2004;. Villa-Carvajal et al, 2006).

Gambar 4. Penggolongan ITS-RFLP dari ragi isolasi menggunakan Hinf I restriction digestion

Isolat menunjukkan perbedaan ukuran produk-ITS PCR, mulai dari 440 bp menjadi 880 bp (Tabel 1) (Gambar 3A). PCR produk dicerna dengan Cfo dan, Hae III dan HinfI, dan enzim yang dianalisis, dimana terdapat 17 perbedaan profil-RFLP (Gambar 3B dan 4). Sebuah angka romawi yang ditunjuk masing-masing kelompok (Kelompok I toXVII). Besarnya PCRproducts dan pembatasan Diidentifikasi spesies utama dalam penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 1. Untuk perbandingan, PCR-RFLP dari regionwas ITS Terapan bersamaan dengan bersertifikat strain dari MTCC, Imtech, Chandigarh. Selain itu, kelompok mayor di identifikasi dengan insilico dikonfirmasi menggunakan analisis data sekuens ITS tersedia dalam database ragi CBS (www.cbs.knaw.nl / index.htm). Kami Tidak Mampu mengidentifikasi semua isolat karena beberapa ITS-RFLP pola tidak ssesuai tahun dengan strain referensi diterbitkan tanggal. Sembilan dari mayor ITS-RFLP ditetapkan dengan membandingkan ukuran molekul dari produk pembatas yang dijelaskan sebelumnya. Sembilan kelompok tersebut adalah S. cerevisiae, P. Anomali Trichosporon sp. C. tropicalis, Pichia guilliermondi, Candida parapsilosis Torulaspora delbrueckii, Pichia dan Candida montana fabianii. Ragi yang paling sering dihubungkan dengan 'Hamei' diidentifikasi sebagai S. Cerevisiae (32,5%) dan P. anomala (41,7%). Spesies berikutnya sering hadir adalah Trichosporon sp. (8%) dan C. tropicalis (2,5%). Sisanya adalah kelompok (group X ke XVII) tidak ditemukan sesuai dengan 288 jenis umum ragi anggur-ITS RFLP pengumpulan data dari Universitas dari Basilicata, Potenza, Italia dan Institute of Bioresources and Sustainable Development (IBSD), Imphal, India. Untuk mengkonfirmasi identitas Kelompok I (S. cerevisiae), ditambahkan pembatasan analisis dengan Hind III, DDE, Msp I dan RI Eco endonuklease yang digunakan (III Hind: 880 bp, DDE: 760 +120 bp; Msp I: 740 bp, RI Eco: 480 +370 bp). Enam puluh delapan isolat P. anomala (group II) fragmen lebih besar ITS (650-680 bp) dibandingkan yang sebelumnya (605-650 bp), meskipun sama dua primer tetap digunakan. Pola band dari Isolat yang benar-benar bertepatan dengan jenis P. anomala tipe ketegangannya MTCC 237 dan dilaporkan menggunakan tiga enzim yang sama. Enzim restriksi Hae III melambat pada satu fragmen dari 635 bp untuk isolat sama dengan jenis P. anomala strain MTCC 237. Enzim tunggal dipotong HinfI, memperlambat situs dan dua fragmen memiliki ukuran 315 bp dan menunjukkan band tunggal. Pola ini sesuai dengan hasil yang dilaporkan oleh Grancher et al, 1999. dan Brambly-Esteve et al., 1999. Kami hanya mengamati satu band 610 bp untuk CFO dan bukan dua fragmen 600 +50 bp seperti yang dilaporkan sebelumnya. Alasan mengapa kita amati kurang dari 50 bp tidak mungkin untuk mendeteksi gel agarose elektroforesis dalam jangka panjang. Dalam rangka mencari identitas Kelompok III,produk pengukuran ITS-PCR dan pola ITS-RFLP yang Dibandingkan dengan data sekuens DNA-ITS tersedia dalam database ragi CBS menggunakananalisis insilico (Tabel 2). Koloni morfologi sel (Gambar 5) dan analisis insilico dari RFLP ITS profil kelompok III menunjukkan homologi yang sangat tinggi untuk Trichosporon sp. Trichosporon adalah genus ragi anamorphic (Basidiomycete, Hymenomycetes, Trichosporonales) dengan karakter morfologi yang berbeda dari miselia sejati (Gambar 5B).

Gambar 5. (A) Morfologi koloni (B) mycelia dengan balistoconidia (C) Trichosporon

Gambar 6. Karyotype elektroforesis dari S. cerevisae di hamei

Grup XI menunjukkan jumlah yang sama dan ukuran fragmen sebagai orientalis Issatchenkia (Clemente-Jimenez et al., 2004) setelah pencernaan dengan Hae III dan Hinf I, tetapi ukuran dari fragmennya 200 dan 180 bp bukannya 150 dan 125 bp saat CFO saya digunakan. Grup X menunjukkan kemiripan sangat dekat dengan Hanseniaspora valbyensis (ITS bp 750, Hae III: 750 bp, Hinf I: 250 +220 170 105 bp dan CFO I: 630 +120 bp) (Esteve-Zarzoso et al, 1999.). Ukuran wilayah ITS untuk kelompok XII sampai XV (810-855 bp) yang sangat mirip dengan Torulaspora spp (Esteve-Zarzoso et al, 1999).

Gambar 7: dendogram pada UPGMA

Gambar 8: Contoh mt-DNA kariotip K1 menggunakan Hinf I (A) dan Hae III (B)

4.2 Hasil Karyotyping ElektroforesisPFGE digunakan untuk memverifikasi keragaman industri penting S. cerevisiae isolat didasarkan pada polimorfisme kromosom mereka. Gambar. 6 menunjukkan kariotipe elektroforesis dari S. cerevisiae strain. Semua kariotipe menunjukkan tingginya jumlah kromosom band dengan ukuran molekular mulai dari 225 kb-22, 000 kb.All 53 isolat S. cerevisiae dianalisis dikelompokkan ke dalam 32 kariotipe elektroforetik (EK) profil yang berbeda satu sama lain. Kesamaan koefisien EKs bervariasi antara 0,65-1,00. Dendrogram dikembangkan dengan menggunakan persamaan koefisien Dice (Gambar 7) menunjukkan kemiripan yang tinggi (lebih dari 83%) di antara 18 profil EK dikelompokkan sebagai kariotipe I (K1) dengan 36 isolat S. cerevisiae. Strain dalam kelompok K1 ditampilkan pola kromosom sangat mirip hanya berbeda samar dalam variasi posisi band atau adanya doublet. erbedaan minor yang direproduksi dalam tiga kali pengulangan gel agarosa elektroforesis untuk konfirmasi. Dari cluster utama K1, empat sub-cluster yang didefinisikan dengan koefisien kesamaan diatas 90% (K1B, K1A11, K1A12 dan K1A2).K1A12 berisi 19 isolat dengan lebih dari dua sub-cluster sebagai K1A12a dan K1A12b menunjukkan kesamaan 95-100%. Kelompok besar lainnya K1A11 dengan 7 isolat menunjukkan lebih dari 92% kesamaan antara isolat. Sebuah cluster ketiga (K1A2) dengan 7 isolat dikelompokkan dengan kesamaan di bawah 90%. Isolat yang tersisa dikelompokkan ke minor cluster minor dengan tingkat kesamaan lebih rendah yaitu K2,, K3 K4, K5 dan K6 yang menunjukkan kesamaan kurang dari 76%. Strain S. cerevisiae bertugas sebagai kariotipe KA12 yang lebih lanjut dikelompokkan ke dalam kelompok 'a' dan 'b' di kromosom XVI (945 kb) dan XIII (915 kb) baik dipisahkan untuk grup 'b', tetapi bergabung bersama-sama dalam kelompok 'a' . Kariotipe K1A11 menunjukkan kemiripan dengan K1A12 tetapi memisahkan Kromosom band IV (22.000 kb) dan Kromosom XII (16.400 kb). Dalam kasus lain biasanya tidak digabung bersama-sama. Kariotipe K2memiliki perbedaan ukuran pada kromosom X dan XIV (800-850 kb). Pada K3, kromosom XIV telah bergeser jauh di atas (800 kb) daripada yang lain. Pada K4, kromosom XVI dan Kromosom XIII secara luas dipisahkan bersama dengan band tambahan pada ukuran 925 kb. Ditemukan bahwa modifikasi ukuran kromosom meningkat sama pada kromosom VI (320 kb) pergeseran mengarah ke atas menghasilkan kariotipe K6 dan penurunan ukuran pada kromosom III (350 kb) dan ukuran peningkatan kromosom I (250 kb) mengarah ke K5. Satu-satunya isolat dari cluster K7 (S. cerevisiae galur H40Y3) menunjukkan perbedaan kariotipe elektroforesis yang paling berbeda jika dibandingkan dengan isolat lain, yang diisolasi dari desa Keiku wilayah perbukitan yang terpisah secara geografis yang dihuni oleh suku-suku.

4.3 Hasil Mitochondria DNA-RFLPPembatasan analisis mt-DNA dilakukan untuk mendeteksi variable genetik di antara isolat S. cerevisiae. Pola mt-DNA-RFLP dihasilkan oleh Hinf I dan Hae III membedakan strain terisolasi dari desa yang berbeda di Manipur. Kariotipe K1A12a jelas berbeda dari K1A12b di mt-DNA RFLP menggunakan Hinf I (Gambar 8A). Menariknya Hae III utama selanjutnya dibedakan mt-DNA Hinf I-RFLP dengan band polimorfik yang sangat tinggi (Gambar 8B). Hal ini menunjukkan bahwa mt-DNA-RFLP menggunakan Hae III bisa digunakan untuk membedakan kariotipe yang sama atau mt-RFLP kelompok yang dibentuk oleh Hinf I. Kami juga membandingkan pola pembatasan mt-DNA pembatasan strain S. cerevisae 'Hamei' dengan strain air anggur Italia dari University of Culture Collection Ragi Basilicata. Enam S. Cerevisiae strain (F3, 4 L3, Ba85, R7Sc2, IC3-1 dan S G4) yang digunakan untuk percernaan mt-DNA dan dibandingkan dengan mt-DNA yang dominan dengan profil RFLP (S. cerevisiae galur H17Y1) 'Hamei'. Jenis strain S. Cerevisiae NCYC 738T digunakan sebagai kontrol. Pembatasan pencernaan menggunakan Hinf I dan Rsa I menunjukkan polimorfik berulang profil mt-DNA-RFLP (Gambar 9A). Dari hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa strain masing-masing digunakan untuk penelitian ini unik dan sangat berbeda satu sama lain. Analisis cluster UPGMA berdasarkan indeks kesamaan Jaccard dihasilkan jelas dua cluster dengan tingkat kemiripan 25% (Gambar 9B). Pola mt-DNA-RFLP utama (strain H17Y1) ditemukan menjadi 70% berbeda dengan strain lainnya yang dipelajari dan pola terdekat adalah dengan tipe S. cerevisiae NCYC738 dengan kesamaan 40%.

4.4 Hasil DiskusiRata-rata sampel mikroba 'Hamei' dikumpulkan dari suku desa Manipur dan laboratorium persiapan menggunakan metode tradisional disajikan pada Tabel 3. Nomor ragi tertinggi (8 sampai 9 log CFU g-1) di semua sampel yang diteliti.Populasi mould adalah 5 sampai 7 log CFU g-1 dan bakteri tidak terdeteksi dalam sebagian besar sampel hingga pengenceran 10-3. Sebagian besar isolat jamur menjadi sumber utama produksi enzim amilolitik dengan lebih dari 4 cm dengan pembersihan zona dalam 48 jam pertumbuhan agar pati dengan larutan iodine. Mucor spp. dan Rhizopus spp. adalah hasil dominan dalam 'Hamei' dan terbentuk pada frekuensi masing-masing 75% dan 12%. Kegiatan antimikroba kulit bubuk A. myriophylla (Tabel 4) mungkin menjadi alasan untuk mengurangi muatan bakteri di 'Hamei' pada Gram amilolitik menghambat bakteri positif. Ini adalah laporan pertama tentang spesies jamur terkait dengan 'Hamei'. Pola pembatasan analisis daerah ITS menggunakan Hae III, Hinf I dan Cfo I (pembatasan yang paling umum digunakan untuk endonuklease identifikasi ragi anggur) cepat dan efektif mengidentifikasi spesies ragi pada 'Hamei'. Dlauchy et al. (1999) menyarankan Msp I, Alu I dan Rsa I sebagai enzim alternatif untuk identifikasi ragi. Identifikasi S. cerevisiae ditempatkan di kelompok Saccharomyces sensu stricto. Dengan demikian jelaslah bahwa kelompok ini berisi strain yang biasanya digunakan dalam produksi minuman beralkohol. Dominasi P. anomala (41,7%) adalah fitur unik dari 'Hamei'. Ini mungkin alasan rasa yang unik terkait dengan beras anggur Manipur yang disebut 'Atingba'. Secara umum, ragi non-Saccharomyces seperti P. anomala adalah penyebab pembusukan dalam makanan fermentasi dan minuman beralkohol (Caggia et al., 2001).

Besar perbedaan koloni morfologi dan perbedaan kecil dalam ukuran daerah ITS (640 - 680 bp) menunjukkan heterogenitas intraspesifik pada isolat P. anomala. Villa-Carvajal et al. (2006) menyatakan bahwa pola-ITS RFLP menggunakan Hae III, CFO I dan Hinf gagal untuk membedakan semua spesies Pichia dan dapat dibedakan dengan menggunakan enzim alternatif untuk mencerna produk 5.8S-ITS-rDNA PCR, wilayah urutan 5.8S rRNA-ITS atau urutan dari domain D1/D2 dari gen rDNA 26S untuk identifikasi tepat. P. anomala dan Trichosporon sp. Yang menunjukkan aktivitas amilolitik tinggi di piringan agar pati. Mereka mungkin memainkan peran utama dalam kekurangan sampel populasi 'Hamei' untuk sakarifikasi beras ketan selama fermentasi anggur beras. Ini adalah laporan pertama dari Trichosporon sp. yang berhubungan dengan starter anggur beras. Trichosporon sp. memiliki kemampuan untuk mengasimilasi kekhasan senyawa tanaman seperti polygalacturate, gallic, asam tannic dan sinamat yang menunjukkan bahwa mereka aktif mengambil bagian dalam mineralisasi pembusukan bahan tanaman. Asal Trichosporon sp. mungkin dari kulit A. myriophylla, yang ditambahkan selama persiapan 'Hamei'. Trichosporon sp. tumbuh dengan baik dengan polygalactimate sebagai sumber karbon tunggal. Hal ini menunjukkan kemungkinan penggunaan Trichosporon sp. untuk mengklarifikasi jus buah selama fermentasi anggur. Molnar et al. (2004) melaporkan bahwa kemampuan Trichosporonmycotoxinivorans sp. nov. untuk detoxify mycotoxins Ini bisa berguna untuk detoxify mycotoxins yang mungkin dilepaskan selama sakarifikasi beras ketan dengan cetakan. Trichosporon sp. sebelumnya dilaporkan dalam fermentasi jus jeruk alami. Pola ITS-RFLP dari Trichosporon sp. (group III) tidak benar-benar cocok dengan urutan data 32 spesies Trichosporon dalam ITS database ragi CBS dengan analisis insilico (Tabel 2). Studi terbaru berdasarkan urutan wilayah D1/D2 yang besar subunit dari rDNA menunjukkan homologi besar di antara tujuh spesies T. debeurmannianum, T. porosum, T. dermatis, T cutaneum, T. Moniliiforme, T. coremiiforme, T. laibachii, T. jirovecii dan T. sporotrichoides dan menyarankan untuk mengurutkan dan daerah ITS D1/D2 bisa membantu identifikasi kelompok. Trichosporon sp. ini spesies ragi yang dominan terkait dengan pemula anggur beras lain India dari wilayah Himalaya (Sikkim dan Nepal) disebut "Marcha 'diidentifikasi sebagai S. bayanus, C. glabrata, P. anomala, Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomycopsis capsularis dan Pichia burtonii. Menariknya dominasi S. cerevesiae dan P. anomala di Manipuri 'Hamei' adalah mirip dengan pemula anggur beras Bali ragi tape dan pemula anggur beras Vietnam 'Mem. Dari ini, hipotesis bahwa spesies ragi yang terkait dengan anggur beras pemula digunakan di Indo-Burma Biodiversity hotspot (termasuk Manipur, Vietnam dan Indonesia, asia tenggara) yang jelas berbeda dari pemula yang digunakan di wilayah Himalaya termasuk Sikkim dan Nepal (Himalaya Biodiversity hotspot). Ini adalah bukti pertukaran budaya Manipur Selatan lainnya Negara Asia Tenggara. Teknik seperti karyotyping kromosom, amplifikasi PCR acak (RAPD) atau daerah gen tertentu (rDNA atau mt-DNA), studi pembatasan fragmen polimorfisme (RFLP) dan urutan gen tertentu telah digunakan untuk membedakan dan mengidentifikasi berbagai spesies ragi. Karyotyping kromosom menggunakan PFGE adalah salah satu yang pertama dan merupakan teknik handal yang digunakan untuk membedakan ragi. Hal ini didasarkan pada perubahan genetik yang besar. Sementara perubahan kecil (Mutasi titik), analisis pembatasan mt-DNA merupakan salah satu teknik yang paling kuat dalam penyelidikan keragaman intra spesifik S. cerevisiae. PFGE dan analisis pembatasan mt-DNA S. cerevisiae dari 'Hamei' mengungkapkan perbedaan pola genotip, bahkan dalam sampel tempat produksi yang sama. Ada beberapa korelasi antara pengelompokan kariotipe dan analisis pembatasan mt-DNA. Karyotyping Elektroforesis (EK) pola isolat S. cerevisiae sebanding dengan jumlah kromosom yang diamati pada studi sebelumnya. Modifikasi PFGE berjalan selama 26 jam pada 9 C dengan pulsa dari 60 detik selama 15 jam dan 90 detik untuk 11 jammenunjukkan pemisahan kromosom yang lebih baik. Strain standar (S. cerevisiae YPH80) menampilkan 15 band selama Karyotyping Elektro. Kromosom XII dan IV bermigrasi bersama sebagai single band. Di penelitian ini 53 isolat S. cerevisiae dengan 32 pola EK dikelompokkan menjadi 7 kelompok besar. Perbedaan frekuensi tinggi kromosom terjadi antara strain setelah kariotipe elektroforetik yang sangat diskriminasi teknik untuk membedakan isolat. Besar penyusunan ulang kromosom seperti translokasi yang mengalami timbal balik selama meiosis bisa menjadi alasan untuk sebuah asosiasi lebih dari dua kromosom homolog. Transposon mungkin juga menjadi sumber utama dari perubahan struktur kromosom dalam ragi yang tumbuh di bawah seleksi yang kuat. Itu diasumsikan bahwa setiap dua profil kromosom identik berhubungan dengan strain yang sama dan jika ada perbedaan yang terlihat di antara mereka, mereka adalah strain yang berbeda. Isolat dengan profil karyotypic yang dikelompokkan dalam cluster dengan nilai-nilai kesamaan di atas 0,8 adalah dianggap kelompok yang sama strain sebagai akibat dari evolusi mikro. S. cerevisiae dari K1 kariotipe menunjukkan pola PFGE yang sama (Gambar. 6), meskipun masing-masing pita memiliki sedikit perbedaaan karena polimorfisme panjang kromosom. Kromosom homolog yang muncul sebagai dua band (sesuai dengan kromosom yang sama) adalah regangan diploid. Kehadiran karyotype yang sangat mirip ini mendukung kemungkinan penyebaran klonal ini EK melalui sampel 'Hamei' pasaran dari lokasi produksi utama seperti Andro dan desa Sekmai. Menariknya ragi anggur isolat dari sampel desa yang sama menunjukkan variasi karyotypic tinggi. Variasi ini mungkin karena lokasi Manipur (Indo-Burma Biodiversity hotspot). Pola kariotipe KI dari 'Hamei' sangat mirip dengan kariotipe dominan dari 'ragi tape' yang digunakan untuk fermentasi 'brem' anggur beras Bali. Hal ini mendukung hubungan budaya antara Manipur dan Indonesia selama peradaban. Di masa depan, penelitian suksesi mikroba diperlukan untuk mengetahui dominasi kariotip S. cerevisiae dalam fermentasi anggur beras. analisis pembatasan mt-DNA merupakan salah satu peralatan yang paling kuat dalam penyelidikan keragaman S. cerevisiae fermentasi anggur. Ragi anggur mengalami proses adaptasi selektif terhadap etanol dan permanen terkena untuk efek mutagen yang spesifik untuk mt-DNA. Isolat S. cerevisiae milik kariotipe K1 dibagi menjadi dua kelompok utama menggunakan pencernaan Hinf I. Distribusi homogeny dari fragmen mt-DNA fragmen ditemukan dengan pencernaan Hinf I dari kariotipe K1. Menariknya endonuclease Hae III menunjukkan distribusi fragmen heterogen (enam kelompok) dengan kariotipe di K1. Hasil ini menunjukkan bahwa Hae III bisa lebih kuat dalam membedakan strain dari kariotipe yang sama. Pola pembatasan mitrokondria DNA isolat dari geografis yang sama yang cukup beragam. Hasil ini jelas menggaris bawahi keragaman S. cerevisiae terisolasi dari desa dekat Manipur. Kombinasi PFGE dan pendekatan mt-DNA RFLP dapat mengestimasi lebih cepat dan dapat diandalkan untuk mengetahui frekuensi S. cerevisiae yang berbeda dalam sampel 'Hamei'. Dua belas strain S. cerevisiae (dari 53) menunjukkan berbagai tingkat koloni warna merah muda di piring YEP. Ini mungkin karena efek mutagenik / mutan kekurangan metionin. Ditemukan korelasi antara warna pink dan kariotipe atau mt-DNA RFLP. Polimorfisme yang diamati mungkin timbul dari titik mutasi atau penghapusan kecil. Hubungan strain ragi yang spesifik dengan karakteristik metabolisme spesifik/rasa akan memungkinkan memproduksi anggur dengan fitur yang diinginkandalam setiap iklim mikro daerah/desa serta anggur beras yang berbeda industry rumah tangga di desa.

V. PENUTUP 5.1 Simpulana. Jenis strain yang terdapat pada hameiadalah S. cerevisiae, Pichia anomala, Trichosporon sp, Candida tropicalis., Pichia guilliermondi, Candida parapsilosis, Torulaspora delbrueckii, Pichia fabianii dan Candida montanab. Spesies ragi yang paling sering dihubungkan dengan hamei adalah S. cerevisiae (32,5%), P. anomala (41,7%) dan Trichosporon sp. (8%)c. Cara mengidentifikasi kelompok utama dalam hamei adalah dengan mengidentifikasi identitas kelompok utama yang dikonfirmasikan oleh ITS dengan hind III, EcoRI, DDE I dan Msp I, keanekaragaman genetik kelompok S. Cerevisiae diselidiki menggunakan Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE).5.2 Sarana. Penelitian selanjutnya disarankan dengan tujuan penyaringan strain S. cerevisiae yang sesuai untuk beras ketan fermentasi dan dapat meningkatkan kualitas produksi anggur beras tradisional.

Daftar Pustaka

Burmeister, Margit dan Ulanovsky, Levy. Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Protocols, Methods and Theories. New York : Academic Press inc

I. Pitt, John dan Hocking, Ailsa Ailsa Diane. Fungi and Food Spoilage. Brazil : FEMS Yeast Res

M. H. Faradz, Sultana. Retardasi Mental Pendekatan Seluler dan Molekuler. Semarang : UNDIP

S. Foster, Mercedes dan F. Bills, Gerrald. Biodiversity of Fungi: Inventory and Monitoring Methods. Trends Food sci. Technol