PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment length Polymorphism)

Polimorfisme: perbedaan urutan DNA pada individu atau populasi yang tidak mempengaruhi fenotipe.Umumnya pada daerah bukan pengode protein.

PCR-RFLP

Merupakan suatu metode yang berdasarkan pada pemotongan enzim restriksi di sisi pengenalan enzim restriksi pada templat DNASisi restriksi ini dapat terbentuk pada templat DNA normal atau templat DNA yang termutasi dimana mutasi menciptakan suatu sisi pengenalan untuk enzim restriksi tertentu.

PCR-RLFP merupakan marker DNA yang paling awal dikembangkan yang diperantarai oleh penemuan enzim restriksi. Spesifitas enzim restriksi akan memotong DNA sesuai dengan targetnya. Perbedaan genetik antar kromosom (individu) akan memberi panjang fragmen DNA hasil pemotongan enzim restriksi yang berbeda pula. Sehingga panjang fragmen yang dihasilkan dari pemotongan enzim restriksi menunjukkan diversitas gen yang ada.

Teknik ini dapat digunakan untuk aplikasi data polimorfisme dalam studi antropologi molekul, untuk kebutuhan forensik untuk mengetahui hubungan antar individu, dan untuk upaya mendefinisikan mutasi yang berkaitan dengan penyakit.

Prinsip RFLPXABBBBAAABMEnzim AEnzim BAlele1Alele 21 2 1 2

Restriction Enzyme TypesAt present, three different types of restriction-modification systems are known-types I, II, and III. Each system consists of two distinct enzyme activities: a DNA methylase and an endonuclease that catalyzes a double-strand DNA break. The type II sequence-specific endonucleases are the most widely used ones in molecular biology.

Properties of each of the three types of restriction systems

Enzim restriksi tipe II: enzim yang mengenali urutan tertentu dari DNA dan memotong DNA pada tempat yang spesifik.Satuan: Unit/ulSatu unit biasanya didefenisikan jumlah enzim yang dapat memotong 1ug DNA tertentu.Reaksi berlangsung dengan bantuan buffer yang sesuai.

Restriksi dan Ligasi DNAPemotongan DNA dengan enzim restriksi:

5- NNNGAATTCNNN -3 3- NNNCTTAAGNNN -5

EcoRI

5- NNNGAATTCNNN -33- NNNCTTAA GNNN -5

Sisi pengenalan enzim restriksi:Urutan nukleotida rantai atas = Urutan nukleotida rantai bawahPenyambungan DNA dengan ligase

5- NNNGOH PAATTCNNN -33- NNNCTTAAP OHGNNN -5

ligase

5- NNNGAATTCNNN -3 3- NNNCTTAAGNNN -5

PCR-RFLP Untuk Analisis Penyakit

ANALISIS MUTASI DENGAN METODE PCR-RFLP

Contoh SoalIdentifikasi mutasi heteroplasmi A3243G gen tRNALeu dengan enzim restriksi ApaI. Sisi restriksi enzim tsb adalah G/GGCCC, sedangkan gen normal mempunyai urutan GAGCCC. Setelah diamplifikasi dengan primer D1/D2, kemudian direstriksi dengan enzim ApaI.D1: AAC GTT GGG GCC TTT GCG TA (3.423-3.404)D2: AGG ACA AGA GAA ATA AGG CC (3.130-3.149)Tentukan pola restriksi dan karakterisasi?

PCR-RFLP

Mutasi Heteroplasmi A3243G 294 bp182 bp112 bp