2.4. Strategi Pemasukan Gen Apoptin Rekombinan ke dalam E.coli

BL12(DE3) Elisabeth

1306371035

Pemilihan bakteri Escherichia Coli sebagai sel inang dalam proses kloning gen apoptin

Escherichia coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar 2 micrometer dan diameter 0.5 micrometer.

Bakteri ini umumnya hidup pada rentang 20- 400C, optimum pada 370.

E. coli ditemukan pertama kali oleh Theodore Eschetrch pada tahun 1885

Escherichia coli

Kingdom : Bacteria Phylum : Proteobacteria Class : Gamma proteobacteria Order : Enterobacteriales Family : Enterobactericeae Genus : Escherichia coli Species : Escherichia coli

Kelebihan E. coli

Laju pertumbuhan

yang cenderung lebih cepat

Dapat dikultivasi pada medium kultur biasa

Berbagai gen asing yang mengkode

protein target dapat diterima

dan diekspresikan dengan baik oleh

E.coli

Kelemahan E.coli Sinyal transkripsi dan translasi spesies lain tidak dikenali dengan baik oleh inang E.coli, sehingga ekspresi gen-gen heterolog di E.coli lemah.

Degradasi protein produk secara cepat dan seringkali protein rekombinan justru terakumulasi dan membentuk agregat kompak, yang bersifat inaktif tidak larut (sehingga menghambat proses purifikasi), yang disebut dengan badan inklusi (inclusion bodies). Protein dapat menjadi tidak aktif. Hal ini terjadi karena keterbatasan E.coli dalam membentuk struktur tiga dimensi protein secara benar dalam proses pelipatan pasca translasi.

E.coli BL21(DE3) sebagai Host CellPada proses kloning gen apoptin ini, hots cell yang digunakan adalah E.coli BL21(DE3).

Kelebihan E.coli BL21 (DE3)

Tingkat efisiensi transformasi yang cenderung lebih

tinggi

Memiliki gen DE3 pengkode T7 RNA polimerase yang dapat mengekspresikan gen target pada vektor ekspresi dengan

induksi IPTG (Isopropil thiogalaktosida).

Induksi dari T7 RNA polimerase pada E.coli BL21 (DE3) akan mensintesis

mRNA dalam jumlah yang tinggi. Dan pada sebagian besar penelitian,

akumulasi protein heterologus dalam jumlah tinggi juga dapat diperoleh.

Memiliki mutasi Ion dan OmpT protease sehingga

dapat meminimalisir degradasi protein rekombinan

yang terekspresi.

Pembuatan bakteri kompeten Sebelum dilakukan proses transformasi, terlebih dahulu E.coli BL21(DE3) harus dibuat kompeten. Keadaan kompeten adalah keadaan dimana bakteri (host cell) siap untuk dimasukin oleh materi genetik asing.

Penambahan larutan CaCl2 membantu mengubah sifat permeabilitas sel.

Tahap Lanjutan

Bakteri yang tadinya terdapat pada bagian pelet kemudian diresuspensi kembali dengan larutan MgCl2.

Mg2+ dapat menurunkan kerapatan membran

Hal ini dikarenakan adanya interaksi antara mineral tersebut dengan bagian hidrofilik membran.

Melalui hasil ini dapat diketahui bahwa penambahan MgCl2 berperan dalam mengganggu kestabilan membran sel E.coli BL21(DE3).

Transformasi gen apoptin rekombinan ke dalam E.coli BL21(DE3)

Transformasi adalah tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang karena

sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki

molekul DNA rekombinan.

Teknik Transformasi DNA:

Electroporation, menggunakan kejutan listrik.

Chemical transformation, menggunakan metode heat shock.

Elektroforasi

• Sejak tahun 1980 telah digunakan teknik elektroforasi

Gambar . Skema Elektroforasi

Chemical transformation

Dalam teknik kloning gen apoptin menggunakan

vektor plamid dan E.coli BL21(DE3) sebagai host cell, teknik transformasi yang digunakan adalah

chemical tranformation.

Chemical Transformation

• Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor.

Tahapan

Gambar . Skema Chemical Transformation