Rabu, 26 Mei 2010

28
Penentuan Interaksi dan Energi Pengikatan Enzim DNA Pol I Taq Terhadap DNA, dCTP, dan Ion Pirofosfat dengan Simulasi Dinamika Molekul Rabu, 26 Mei 2010 Khabib Khumaini (10506046 Pembimbing : Dr. Rukman Hertadi Dr. Santi Nurbaiti

description

Khabib Khumaini (10506046) Pembimbing : Dr. Rukman Hertadi Dr. Santi Nurbaiti. Penentuan Interaksi dan Energi Pengikatan Enzim DNA Pol I Taq Terhadap DNA, dCTP, dan Ion Pirofosfat dengan Simulasi Dinamika Molekul. Rabu, 26 Mei 2010. DNA POLIMERASE I. PRODUK UNGGUL. REKAYASA GENETIKA. - PowerPoint PPT Presentation

Transcript of Rabu, 26 Mei 2010

Page 1: Rabu, 26 Mei 2010

Penentuan Interaksi dan Energi Pengikatan Enzim DNA Pol I Taq Terhadap DNA, dCTP, dan Ion Pirofosfat dengan Simulasi Dinamika Molekul

Rabu, 26 Mei 2010

Khabib Khumaini (10506046)Pembimbing :Dr. Rukman HertadiDr. Santi Nurbaiti

Page 2: Rabu, 26 Mei 2010

DNA POLIMERASE I

BIOTEKNOLOGI

PRODUK UNGGUL

REKAYASA GENETIKA

DNA POL I

Pol I Taq

CEPATTERMOSTABIL

KURANGAKURAT

EKSPLORASI

Page 3: Rabu, 26 Mei 2010

Tujuan Penelitian

Mempelajari interaksi antara DNA pol I Taq dengan dCTP dan produk (ion Pirofosfat)

Menentukan residu-residu yang berperan penting dalam afinitas DNA pol I Taq

Page 4: Rabu, 26 Mei 2010

DNA POLIMERASE I

In vivo : Mendegradasi primer dan

menggantinya dengan DNA pada replikasi

Memperbaiki untai DNA yang rusak In vitro

Katalis untuk reaksi polmirisasi di mesin PCR

Page 5: Rabu, 26 Mei 2010

Tahapan Reaksi Enzimatis DNA Pol I

Page 6: Rabu, 26 Mei 2010

Tahap Keadaan Enzim Bebas

Page 7: Rabu, 26 Mei 2010

Tahap Pengikatan DNA dan dNTP

Page 8: Rabu, 26 Mei 2010

Tahap Perubahan Menjadi Kompleks Teraktivasi (E':p/t:dNTP)Studi Kristalografi

Tahap pergerakan subdomain finger dari open ke closed merupakan tahap yang lambat dan penentu laju

Page 9: Rabu, 26 Mei 2010

Studi Biofisik dan MD

Purohit (2003) : pada KF , Soon-Jong Kim (2003) : pada pol ß, Paul J. Rothwell (2005) : klentaq pergerakan subdomain finger berlangsung cepat penentu laju berlangsung pasca transisi closed dan disebabkan

penataan lokal pada sisi aktif Pada pol ß : tahap penentu laju diduga adalah rotasi Arg258 Saran mekanisme :

pengikatan dNTP:Mg2+ ke pol β konformasi open pengikatan Mg2+ ke pusat aktif Perubahan konformasi dari open ke closed (cepat) penataan ulang residu-residu asam amino di pusat aktif, rantai

template, rantai primer, dan ion Mg2+ (lambat) reaksi kimia pelepasan ion Mg2+ dari sisi katalitik perubahan konformasi dari closed ke open pelepasan PPi:Mg2+

Page 10: Rabu, 26 Mei 2010

Studi Biofisik (II)

Paul J. Rothwell (2007) : klentaq tetapan laju reopening yang

berlangsung pasca reaksi kimia memiliki laju jauh lebih lambat dibandingkan closing pada sebelum reaksi

Tetapan reaksi k3 dan k-3 sekitar 8 s-1 dan 20 s-1 sedangkan tetapan laju reopening sekitar 0.197 s-1.

Page 11: Rabu, 26 Mei 2010

Mekanisme reaksi kimia

Page 12: Rabu, 26 Mei 2010

Metodologi Penelitian

Alat Komputer Program AMBER 10 Program VMD (Visualizing Molecular

Dynamic) versi 1.87 Program GNUplot versi 4.4

Bahan Struktur 3D protein dengan kode 1KTQ,

2KTQ, dan 3KTQ

SIMULASI :

1.PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA KONFORMASI OPEN

2.PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA KONFORMASI CLOSED

3.PENGIKATAN PIROFOSFAT DALAM ENZIM-DNA PASCA REAKSI

4.ENZIM-DNA PASCA REAKSI

5.PENGIKATAN dTTP DALAM ENZIM-DNA KONFORMASI OPEN

(SALAH PENGIKATAN)

Page 13: Rabu, 26 Mei 2010

Hasil dan Pembahasan :PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA

KONFORMASI OPEN

PENGIKATAN dCTP SPONTAN

Page 14: Rabu, 26 Mei 2010

Hasil dan Pembahasan ( 0 ns) :PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA

KONFORMASI OPEN

K663

R573

dCTP

TEMPLATE

O-HELIKS

Page 15: Rabu, 26 Mei 2010

Hasil dan Pembahasan (5.5 ns)PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA

KONFORMASI OPEN

R573

TEMPLATE

JIKA DIMUTASI ENERGI PENGIKATAN 8 KKAL LEBIH POSITIFO-HELIKS

Page 16: Rabu, 26 Mei 2010

Hasil dan PembahasanPENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA

KONFORMASI CLOSED

PENGIKATAN dCTP SPONTAN

Page 17: Rabu, 26 Mei 2010

Hasil dan PembahasanPENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA

KONFORMASI CLOSED

R650

K663

R573

dCTP

O-heliks

BILA DIMUTASI MENJADI ALANIN,ENERGI PENGIKATAN MENJADI LEBIH POSTIF

13 kkal12.1 kkal

5 kkal

Page 18: Rabu, 26 Mei 2010

BUKTI EKSPERIMEN

ΔΔG = ΔGbinding-closed – ΔGbinding-open=-42 kcal

Paul J. Rothwell (2007) : Perubahan konformasi dari open ke closed

sangat cepat. Umumnya setelah mengikat dNTP langsung diikuti perubahan konformasi

KD4=96.4 µMΔGD4= -23 kJ = - 6 kkal

Page 19: Rabu, 26 Mei 2010

Hasil dan PembahasanPelepasan Ion Pirofosfat Pasca Reaksi Kimia

SUPERIMPOSISIMERAH = 0 nsBIRU = 8 nsTERJADI REOPENING

Page 20: Rabu, 26 Mei 2010

Hasil dan Pembahasan (0 ns)Pelepasan Ion Pirofosfat Pasca Reaksi Kimia

K663

R650ION PIROFOSFAT

UJUNG PRIMER

Page 21: Rabu, 26 Mei 2010

Hasil dan Pembahasan (8 ns)Pelepasan Ion Pirofosfat Pasca Reaksi Kimia

R650

K663

K831

ION PIROFOSFAT

Page 22: Rabu, 26 Mei 2010

BUKTI EKSPERIMEN

BERDASARKAN SIMULASI : Tahap reopening dan pelepasan pirofosfat

tidak disukai (ΔG pelepasan = +64 kkal)

Paul J. Rothwell (2007) : Tahap reopening dan pelepasan fosfat

merupakan tahap penentu laju

tetapan laju reopening sekitar 0.197 s-1.

Page 23: Rabu, 26 Mei 2010

KESIMPULAN

Energi pengikatan dCTP pada konformasi open sebesar – 76 kkal sedangkan pada closed -118 kkal

Energi pelepasan ion pirofosfat sebesar 64 kkal Tahap reopening pasca reaksi jauh lebih tidak

spontan dibandingkan penutupan sebelum reaksi Residu Lys831 menghambat pelepasan ion

pirofosfat Residu Arg660 dan Lys663 menstabilkan dCTP

pada konformasi closed Residu Lys573 menstabilkan dCTP pada

konformasi open

Page 24: Rabu, 26 Mei 2010

Ucapan Terima Kasih

Dr. Rukman Hertadi dan Dr. Santi Nurbaiti selaku dosen pembimbing

Rekan-rekan di Lab Kimia Komputasi Rekan-rekan dan petugas di Lab Biokimia Seluruh yang telah banyak membantu saya

SPESIAL UNTUK……

ANGKATAN 2006 YANG TELAH MENGAJARKANBANYAK HAL KE SAYAKALIAN ADALAH KELUARGAKU

Page 25: Rabu, 26 Mei 2010
Page 26: Rabu, 26 Mei 2010

DNA pol

Ada 7 tipe : (A) Klentaq1 (famili

A) (B) DNA pol RB69

(famili B) (C) pol β (famili X) (D) DNA pol Dpo4

(famili Y) (E) subunit p66

reverse tranciptase (famili RT)

Sisanya famili C dan D

Page 27: Rabu, 26 Mei 2010

SUPERIMPOSISIBIRU = 0 nsMERAH = 6 ns

Page 28: Rabu, 26 Mei 2010

SUPERIMPOSISIBIRU 0 nsMERAH 6 ns