Rabu, 26 Mei 2010
description
Transcript of Rabu, 26 Mei 2010
Penentuan Interaksi dan Energi Pengikatan Enzim DNA Pol I Taq Terhadap DNA, dCTP, dan Ion Pirofosfat dengan Simulasi Dinamika Molekul
Rabu, 26 Mei 2010
Khabib Khumaini (10506046)Pembimbing :Dr. Rukman HertadiDr. Santi Nurbaiti
DNA POLIMERASE I
BIOTEKNOLOGI
PRODUK UNGGUL
REKAYASA GENETIKA
DNA POL I
Pol I Taq
CEPATTERMOSTABIL
KURANGAKURAT
EKSPLORASI
Tujuan Penelitian
Mempelajari interaksi antara DNA pol I Taq dengan dCTP dan produk (ion Pirofosfat)
Menentukan residu-residu yang berperan penting dalam afinitas DNA pol I Taq
DNA POLIMERASE I
In vivo : Mendegradasi primer dan
menggantinya dengan DNA pada replikasi
Memperbaiki untai DNA yang rusak In vitro
Katalis untuk reaksi polmirisasi di mesin PCR
Tahapan Reaksi Enzimatis DNA Pol I
Tahap Keadaan Enzim Bebas
Tahap Pengikatan DNA dan dNTP
Tahap Perubahan Menjadi Kompleks Teraktivasi (E':p/t:dNTP)Studi Kristalografi
Tahap pergerakan subdomain finger dari open ke closed merupakan tahap yang lambat dan penentu laju
Studi Biofisik dan MD
Purohit (2003) : pada KF , Soon-Jong Kim (2003) : pada pol ß, Paul J. Rothwell (2005) : klentaq pergerakan subdomain finger berlangsung cepat penentu laju berlangsung pasca transisi closed dan disebabkan
penataan lokal pada sisi aktif Pada pol ß : tahap penentu laju diduga adalah rotasi Arg258 Saran mekanisme :
pengikatan dNTP:Mg2+ ke pol β konformasi open pengikatan Mg2+ ke pusat aktif Perubahan konformasi dari open ke closed (cepat) penataan ulang residu-residu asam amino di pusat aktif, rantai
template, rantai primer, dan ion Mg2+ (lambat) reaksi kimia pelepasan ion Mg2+ dari sisi katalitik perubahan konformasi dari closed ke open pelepasan PPi:Mg2+
Studi Biofisik (II)
Paul J. Rothwell (2007) : klentaq tetapan laju reopening yang
berlangsung pasca reaksi kimia memiliki laju jauh lebih lambat dibandingkan closing pada sebelum reaksi
Tetapan reaksi k3 dan k-3 sekitar 8 s-1 dan 20 s-1 sedangkan tetapan laju reopening sekitar 0.197 s-1.
Mekanisme reaksi kimia
Metodologi Penelitian
Alat Komputer Program AMBER 10 Program VMD (Visualizing Molecular
Dynamic) versi 1.87 Program GNUplot versi 4.4
Bahan Struktur 3D protein dengan kode 1KTQ,
2KTQ, dan 3KTQ
SIMULASI :
1.PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA KONFORMASI OPEN
2.PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA KONFORMASI CLOSED
3.PENGIKATAN PIROFOSFAT DALAM ENZIM-DNA PASCA REAKSI
4.ENZIM-DNA PASCA REAKSI
5.PENGIKATAN dTTP DALAM ENZIM-DNA KONFORMASI OPEN
(SALAH PENGIKATAN)
Hasil dan Pembahasan :PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA
KONFORMASI OPEN
PENGIKATAN dCTP SPONTAN
Hasil dan Pembahasan ( 0 ns) :PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA
KONFORMASI OPEN
K663
R573
dCTP
TEMPLATE
O-HELIKS
Hasil dan Pembahasan (5.5 ns)PENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA
KONFORMASI OPEN
R573
TEMPLATE
JIKA DIMUTASI ENERGI PENGIKATAN 8 KKAL LEBIH POSITIFO-HELIKS
Hasil dan PembahasanPENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA
KONFORMASI CLOSED
PENGIKATAN dCTP SPONTAN
Hasil dan PembahasanPENGIKATAN dCTP DALAM ENZIM-DNA
KONFORMASI CLOSED
R650
K663
R573
dCTP
O-heliks
BILA DIMUTASI MENJADI ALANIN,ENERGI PENGIKATAN MENJADI LEBIH POSTIF
13 kkal12.1 kkal
5 kkal
BUKTI EKSPERIMEN
ΔΔG = ΔGbinding-closed – ΔGbinding-open=-42 kcal
Paul J. Rothwell (2007) : Perubahan konformasi dari open ke closed
sangat cepat. Umumnya setelah mengikat dNTP langsung diikuti perubahan konformasi
KD4=96.4 µMΔGD4= -23 kJ = - 6 kkal
Hasil dan PembahasanPelepasan Ion Pirofosfat Pasca Reaksi Kimia
SUPERIMPOSISIMERAH = 0 nsBIRU = 8 nsTERJADI REOPENING
Hasil dan Pembahasan (0 ns)Pelepasan Ion Pirofosfat Pasca Reaksi Kimia
K663
R650ION PIROFOSFAT
UJUNG PRIMER
Hasil dan Pembahasan (8 ns)Pelepasan Ion Pirofosfat Pasca Reaksi Kimia
R650
K663
K831
ION PIROFOSFAT
BUKTI EKSPERIMEN
BERDASARKAN SIMULASI : Tahap reopening dan pelepasan pirofosfat
tidak disukai (ΔG pelepasan = +64 kkal)
Paul J. Rothwell (2007) : Tahap reopening dan pelepasan fosfat
merupakan tahap penentu laju
tetapan laju reopening sekitar 0.197 s-1.
KESIMPULAN
Energi pengikatan dCTP pada konformasi open sebesar – 76 kkal sedangkan pada closed -118 kkal
Energi pelepasan ion pirofosfat sebesar 64 kkal Tahap reopening pasca reaksi jauh lebih tidak
spontan dibandingkan penutupan sebelum reaksi Residu Lys831 menghambat pelepasan ion
pirofosfat Residu Arg660 dan Lys663 menstabilkan dCTP
pada konformasi closed Residu Lys573 menstabilkan dCTP pada
konformasi open
Ucapan Terima Kasih
Dr. Rukman Hertadi dan Dr. Santi Nurbaiti selaku dosen pembimbing
Rekan-rekan di Lab Kimia Komputasi Rekan-rekan dan petugas di Lab Biokimia Seluruh yang telah banyak membantu saya
SPESIAL UNTUK……
ANGKATAN 2006 YANG TELAH MENGAJARKANBANYAK HAL KE SAYAKALIAN ADALAH KELUARGAKU
DNA pol
Ada 7 tipe : (A) Klentaq1 (famili
A) (B) DNA pol RB69
(famili B) (C) pol β (famili X) (D) DNA pol Dpo4
(famili Y) (E) subunit p66
reverse tranciptase (famili RT)
Sisanya famili C dan D
SUPERIMPOSISIBIRU = 0 nsMERAH = 6 ns
SUPERIMPOSISIBIRU 0 nsMERAH 6 ns