1

PERUBAHAN ASAM AMINO GLN PERUBAHAN ASAM AMINO GLN MENJADI LEU PADA KODON MENJADI LEU PADA KODON rpoB513 rpoB513

Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis L1 L1 RESISTEN RIFAMPINRESISTEN RIFAMPIN

Puti Syahrani(20505015)

Pembimbing:A. Saifuddin Noer, Ph.D

2

Materi Presentasi

• Pendahuluan

• Tinjauan Pustaka

• Metodologi Penelitian

• Hasil dan Pembahasan

• Kesimpulan

3

Latar BelakangData WHO 2006:• Menginfeksi 1/3

populasi dunia• 8 juta kasus TB

aktif/tahun• Tingkat kematian 2

juta orang/tahunIndonesia :• Peringkat ketiga,

tingkat kematian 140.000 orang/tahun

• Jawa Barat peringkat keempat

Pendahuluan

Mycobacterium tuberculosis

Antibiotik

Penderita Tuberkulosis

RESISTEN !!

4

Resistensi M. tuberculosisPendahuluan

SINGLE MDR XDR

Resisten Rifampin & Isoniazid

katG – INHR

(Musser, 1995; Ramaswamy, 1998)

rpoB – RIFR (Telenti, et al., , 1993; Musser, 1995;

Ramaswamy, 1998)

• Mutasi gen rpoB (pengkode RNA polimerase subunit

• Daerah penentu sifat resistensi RIF, 81 pb, kodon 507-533

• Dideteksi dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) multipleks spesifik alel

Mutasi paling umum dan persentasenya

%No

Kodon

42%Ser Leu43%531

23%His Tyr36%526

Mutasi pada gen rpoB

5

Menentukan penyebab resistensi RIF pada isolat klinis M. tuberculosis MDR

selain mutasi pada rpoB526 dan rpoB531

Tujuan Penelitian

Isolat klinis M. tuberculosis MDR, katG- tetapi rpoB+ (tidak termutasi pada kodon rpoB526 dan rpoB531)

(Noviana, 2006)

Pendahuluan

Strategi:Amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR)

multipleksSekuensing fragmen hasil PCR

Analisis in silico

6

Rifampin

RNA Polimerase - RifampinTinjauan Pustaka

• RNA polimerase (RNAP) berperan pada proses transkripsi, terdiri atas subunit ’

• Target rifampin (RIF), obat anti-TB lini pertama

• RIF berikatan dengan RNAP subunit pada kantung pengikatan RIF

• RIF menghambat proses transkripsi dengan menghalangi jalur perpanjangan RNA (Campbell, et al.2001)

Interaksi RNAP Taq – RIF(Campbell, et al., 2001)

7

Polymerase Chain Reaction (PCR) Multipleks

• Menggunakan sepasang primer luar (forward dan reverse), ditambah primer dalam

• Mengamplifikasi sekaligus dua atau lebih fragmen target

• Dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi pada posisi-posisi tertentu

Tinjauan Pustaka

Fragmen AC

Fragmen BC

Primer forward

Primer reverse

Primer dalam

A B C

8

PCR Multipleks: rpoB526 dan

rpoB531 Isolat L1, L16, R4,

R7 Visualisasi gel

agarosa 1,5%

Metodologi Penelitian

PCR Multipleks

Sekuensing

Analisis in silico

Metodologi Penelitian

Sekuensing: Macrogen Inc., Korea 3730xl DNA analyzer

Salah satu primer Fragmen 249 pb

Analisis in silico: Penjajaran

(alignment) SeqMan dan MegAlign DNA Star

Pemodelan PyMOL

9

Hasil PCR Multipleks rpoB526

M : pUC19/HinfI

C+ : Kontrol + (M. tbc H37Rv)

Hasil & Pembahasan

M C- L1C+ L16 R4 R7

249 pb

181 pb

249 pb

181 pb

RR

RF R526

CAC

5261419 pb

517 pb396 pb214 pb75 pb

Ujung 3’ primer dalam komplemen dengan basa

kedua kodon 526.

10

M C- L1C+ L16 R4 R7

249 pb

167 pb

Hasil PCR Multipleks rpoB531

M : pUC19/HinfI

C+ : Kontrol + (M. tbc H37Rv)

Hasil & Pembahasan

249 pb

167 pb

1419 pb

517 pb396 pb214 pb75 pb

Ujung 3’ primer dalam komplemen dengan basa

kedua kodon 531.

RR

RF R531

531

TCG

11

Rangkuman Hasil PCR Multipleks

Hanya isolat M. tbc MDR L1 yang tidak termutasi pada rpoB526 dan rpoB531 Sekuensing

Hasil & Pembahasan

Isolat249 pb

167 pb

rpoB531

L1 +

L16 x -

R4 x -

R7 x -

Isolat249 pb

181 pb

rpoB526

L1 +

L16 +

R4 +

R7 +

12

Penjajaran SeqMan DNA StarHasil & Pembahasan

Penjajaran MegAlign :Mutasi A (adenin) T (timin) pada basa kedua kodon

rpoB513 (CAA CTA) menyebabkan Gln (Q) Leu (L)

13

Mutasi rpoB513

Wild type(H37Rv)

Isolat L1

Glutamin (Gln, Q)(Polar/hidrofil, tidak bermuatan)

Leusin (Leu, L)(Non polar/ hidrofob, alifatik)

Hasil & Pembahasan

mutasi

translasi

translasi

14

Interaksi RIF-RNAP

• Gln Leu menyebabkan hilangnya ikatan hidrogen dengan RIF

• Mengganggu interaksi RIF-RNAP & aktivitas inhibisi RIF

• Dapat menyebabkan resistensi RIF

Hasil & Pembahasan

O2

N2

O2

Pemodelan dengan PyMOL

15

Kesimpulan

• Sifat resistensi RIF pada isolat klinis M. tuberculosis MDR L1 disebabkan adanya mutasi A T pada basa kedua kodon rpoB513, yang menyebabkan perubahan asam amino Gln Leu.

• Perubahan ini dapat mengganggu interaksi RIF-RNAP sehingga RIF tidak dapat menginhibisi RNAP dan M. tuberculosis menjadi resisten RIF.

16

SEKIAN

TERIMAKASIH

17

PCR Multipleks

Primer dalam

Urutan 5’ 3’ Ukuran

R526 GTCGGGGTTGACCCA 15 nt

R531 ACAAGCGCCGACTGTC 16 nt

Siklus PCR : Denaturasi awal: 96°C, 3 menit 5 siklus: 95°C, 45 detik - 60°C, 1 menit - 72°C, 30 detik 5 siklus: 95°C, 40 detik - 59°C, 50 detik - 72°C, 30 detik 22 siklus: 94°C, 50 detik - 55°C, 40 detik - 70°C, 30 detik Elongasi akhir pada 72°C selama 3 menit

Metodologi Penelitian

18

Inhibisi RIF terhadap RNAP

Menjadi halangan sterik pada jalur perpanjangan RNA pada ujung 5’, ketika panjang transkrip 2-3 nukleotida

(Campbell, et al., 2001)

Tinjauan Pustaka

19

Daerah resistensi RIFpada RNAP subunit

Tinjauan Pustaka

Daerah resistensi RIF pada rpoB prokariot (E. coli, Taq, M. tbc)(Campbell, et al., 2001)