Pullulanase Type 1Pullulan 6-glucanohydrolase

EC 3. 2. 1. 41(Baccillus subtilis strain

168)

Oleh:Riong Seulina Panjaitan (20511313)Nelson Gaspersz (20512021)

Klasifikasi Enzim Mekanisme Reaksi Enzim Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Struktur 3D Enzim Pullulanase Inhibitor Enzim Kegunaan dan Aplikasi Enzim

Agenda Presentasi

Klasifikasi EnzimEC. 3. 2. 1. 41

Kelas Hidrolase

Menghidrolisis ikatan glikosida

Pada senyawa pullulan, pati dan amilopektin

Pullulanase

Recommended Name: pullulan 6-glucanohydrolase

Synonim Name: α-dextrin endo-1,6-α-glucosidase amylopectin 6-glucanohydrolase limit dextrinase

Pullulanase

kultur inokulasikan dalam media LB 500

mL

Inkubasi, t= 24 jam, T =37 oC, diinduksi

dengan IPTG pada 600 nm

Kultur BakteriMedia LB 500 mL+

Ampisilin 100 µg/mL

Inokulasi

Inkubasi t= 60 jam, T= 18°C

Koloni Bakteri

Kultur bakteri

Sentrifugasi pada 6000 rpm, t=20 menit, T=4oC

Supernatan : dimurnikan dan

uji aktivitas enzim

ekstraseluler

pellet

Buffer tris-HCl pH 8,1

Sonikasi

Sentrifugasi14000 rpm, t=30

menit, T=4oC

Supernatan : dimurnikan dan uji

aktivitas enzim intraseluler

Crude Extract

Sentrifugasi

Supernatan

pellet

Protein dialirkan ke dalam kolom dan

dielusi dengan garam

Dialisis dengan bufferEnzim

Pullulanase

Pellet dilarutkan buffer tris-

HCl

Supernatan : fraksinasi

Amonium Sulfat 60 % dan

sentrifugasi

Uji Aktivitas Enzim (Bernfeld 1955)500 µL pullulan 1 % + 450 µLbuffer asetat 0,2 M pH

5,4 dibiarkan selama 15 menit

+ 50 µL enzim inkubasi T= 37°C t= 4

menit

+ 1 mL pereaksi DNS

campuran divorteks,

didihkan, t=5 menit

absorban diukur = 540

nm

∑ Gula pereduksi

diukur dengan kurva standar

glukosa

Pengujian Enzim

Penentuan parameter

kinetika

Penentuan pH optimum dan suhu optimum

Kadar protein diukur

= 280 nm

Karakterisasi EnzimAnalisis Berat Molekul

SDS-PAGE

Kristalisasi dan Penentuan Struktur 3D dengan XRD

Tabel Hasil Pemurnian Enzim

SDS-PAGE Enzim

Struktur Enzim Pullulanase

Struktur Kristal Enzim Pullulanase

Struktur 3D Enzim Pullulanase

Inhibisi EnzimMekanisme Inhibisi Enzim dapat dibagi 2 yaitu:1. Inhibisi reversibel• Membentuk kompleks enzim inhibitor yang meningkatkan

laju reaksi2. Inhibisi irreversibel• Membentuk senyawa yang stabil dengan enzim melalui

ikatan kovalen dengan residu asam amino pada sisi aktif

Enzim ini dapat menginhibisi produk dan sustrat :• Untuk inhibisi substrat banyak substrat yang dapat

digunakan oleh organisme ketika konsentrasi enzim rendah dan ketika konsentrasi enzim tinggi substrat dapat bertindak sebagai inhibitor pertumbuhan yang beracun

• Untuk inhibisi produk Inhibisi produk akan meningkat ketika produk mengikat enzim bebas dan memblok akses ke substrat.

Sehingga enzim ini bersifat sebagai inhibitor kompetitif

Kegunaan dan Aplikasi EnzimIndustri Aplikasi

Pengolahan Pati Sirup FruktosaSirup Maltosa, Maltotriosa Pemanis makanan

Pembuatan Bir Pada pembuatan malt bir

Produksi Alkohol Produksi Etanol, butanol, aseton

Pembuatan Roti Mengubah pati menjadi gula fermentasi

Tekstil Pada proses pembuatan kain katun untuk memperkuat benang dan men cegah kerusakan pada proses penenunan

Detergen Sebagai aditif pada detergen pencuci piring dan pakaian

REFERENSI

Malle, D., T. Itoh, W. Hashimoto, K. Murata, S. Utsumi and B. Mikami, 2006, Overexpression, purification and preliminary X-ray analysis of pullulanase from Bacillus subtilis strain 168, Acta Cryst. (2006). F62, 381-384.

Singh, Ram S., G. K. Saini, J. F. Kennedy, 2010, Maltotriose syrup preparation from pullulan using pullulanase, Carbohydrate Polymers 80 (2010) 401–407.

Zhang, H., Y. Tian, Y. Bai, X. Xu, Z. Jin, 2012. Structure and properties of maize starch processed with a combination of α-amylase and pullulanase. Int. J. Biol. Macromol. 3407 (2012) 1-7.

Terimakasih

Prof. Dr. Fida M. Warganegara