Proses Ekstraksi dan Fraksinasi

1. Ekstrak tannin dipekatkan dengan menggunakan vakum rotary evaporator dan pemanasan di

atas water bath pada suhu 40-50°C. Cairan hasil ekstrak kemudian diekstraksi dengan

kloroform (4x25 mL) menggunakan corong pisah sehingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan

kloroform (bawah) dipisahkan dan lapisan air 1 (atas) diekstraksi dengan etil asetat (1x25

mL) dan terbentuk 2 lapisan. Lapisanetilasetat 1 (atas) dipisahkandanlapisan air 2 (bawah)

dipekatkandenganvacum rotary evaporator (Makkar, 1998).

2. Padapemisahandengan KLT analitikdigunakan plat silika G 60 F254 yang

sudahdiaktifkandenganpemanasandalam oven padasuhu 100oC selama 10 menit. Masing-

masingplat denganukuran 1 cm x 10 cm. Ekstraktannin ditotolkanpadajarak 1 cm

daritepibawah platdenganpipakapilerkemudiandikeringkandandielusidenganfasegeraktoluen :

etilasetat (3:1)denganpendeteksiferrisulfat,forestal (asamasetatglasial : H2O : HClpekat)

(30:10:3),etilasetat : metanol :asamasetat (6:14:1) denganpendeteksialuminiumklorida 5%

(Olivina, 2005), n-butanol: asamasetat : air (4:1:5), metanol : etilasetat(4:1)

denganpendeteksi AlCl3 1%, etilasetat : kloroform : asamasetat 10%(15:5:2).

3. Setelahgerakanlarutanpengembangsampaipadagarisbatas, elusidihentikan. Nodayang

terbentukmasing-masingdiukurhargaRfnya,

selanjutnyadenganmemperhatikanbentuknodapadaberbagailarutanpengembangditentukanper

bandinganlarutanpengembangyang paling baikuntukkeperluanpreparatif.

Proses Isolasi

1. Noda yang terbentukdiperiksadenganlampuUV-Vis padapanjanggelombang 254 nm dan366

nm.Padapemisahandengan KLT preparative digunakan plat silika G 60 F254 denganukuran

10cm x 20 cm. Ekstrakpekathasilekstraksidilarutkandenganaseton-air,

kemudianditotolkansepanjang plat padajarak 1 cm darigarisbawahdan 1 cm darigaristepi.

Selanjutnyadielusidenganmenggunakaneluen n-butanol :asamasetat : air (BAA) (4:1:5)

yangmemberikanpemisahanterbaikpada KLTanalitik.

Setelahgerakanlarutanpengembangsampaipadagarisbatas, elusidihentikan. Nodayang

terbentukmasing-masingdiukurnilaiRfnya. Noda-nodadiperiksa di bawahsinar

UVpadapanjanggelombang 254 nm dan 366 nm.

2. Isolat-isolat yang diperolehdarihasilKLT preparatif, dilarutkandenganaseton :

airdandisentrifugekemudiandianalisisdenganspektrofotometer UV-Vis merk

Shimadzu.Masing-masingisolatsebanyak 2

mLdimasukkandalamkuvetdandiamatispektrumnyapadabilangangelombang 200-800nm.

3. IdentifikasidilanjutkandenganpenambahanpereaksigeserNaOH 2 M, AlCl3 5%,

AlCl35%/HCl, NaOAc, NaOAc/H3BO3. Kemudiandiamatipergeseranpuncakserapannya.

Tahapankerjapenggunaanpereaksigeseradalahsebagaiberikut:

a. Isolat yang dapatdiamatipadapanjanggelombang 200-800 nm,

direkamdandicatatspektrum yang dihasilkan.

b. Isolatdaritahap 1 ditambah 3 tetesNaOH 2M

kemudiandikocokhinggahomogendandiamatispektrum yang dihasilkan.

Sampeldidiamkanselama 5 menitdandiamatispectrum yang dihasilkan.

c. Isolatdaritahap 1 kemudianditambah 6tetespereaksi AlCl3 5 % dalammethanol

kemudiandicampurhinggahomogendandiamatispektrumnya. Sampelditambahdenga 3

tetesHClkemudiandicampurhinggahomogendandiamatispektrumnya.

d. Isolatdaritahap 1 ditambahserbuknatriumasetatkuranglebih 250 mg.

Campurandikocoksampaihomogenmenggunakanfortexdandiamatilagispektrumnya.Sel

anjutnyalarutaniniditambahasamboratkuranglebih 150 mg

dikocoksampaihomogendandiamatispektrumnya.

Isolathasil KLT preparatif yang

didugasenyawatanindiidentifikasidenganmenggunakanspektrofotometer FTIR. 0,2

gpeletKBrditambahkandengansatutetesisolate yang didugasenyawatanin,

dikeringkankemudiandiidentifikasidenganspektrofotometerFTIR merk IR Buck M500 Scientific

denganpanjanggelombang 4000-400 cm-1.