BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah Reaksi oksidatif terjadi setiap saat, bahkan ketika kita bernafas pun terjadi reaksi oksidatif. Reaksi ini mencetuskan terbentuknya radikal bebas yang sangat aktif, yang dapat merusak struktur serta fungsi sel. Kerusakan oksidatif yang diakibatkan radikal bebas dalam tubuh kita merupakan masalah yang tidak dapat diabaikan. Dr. Bruce Ames dari Barkeley melaporkan bahwa secara in vitro, dalam satu sel kira-kira terjadi 10.000 kali reaksi oksidasi dalam kurun waktu 24 jam. Dapat dibayangkan betapa banyak kerusakan oksidatif akibat reaksi oksidasi, mengingat sel dalam tubuh berjumlah triliunan. Hal ini membuktikan bahwa stress oksidatif sangat mengancam kehidupan manusia. Stess oksidatif hanya dapat dikendalikan oleh asupan antioksidan dari makanan, yang selanjutnya akan memacu kerja antioksidan alami dalam tubuh (Winarsi, 2011). Akhir-akhir ini penggunaan senyawa antioksidan berkembang dengan pesat, baik untuk makanan maupun pengobatan. Penggunaan sebagai obat makin berkembang seiring dengan makin bertambahnya pengetahuan tentang aktivitas radikal bebas terhadap beberapa penyakit degeneratif seperti penyakit jantung dan kanker (Boer, 2000). Produk-produk antioksidan yang dijual di masyarakat kebanyakan dijual dengan harga yang sangat mahal. Padahal, komponen antioksidan terdapat di alam

1

2

secara melimpah, baik dalam sayur-sayuran maupun buah-buahan. Banyak orang tidak menyadari hal ini karena belum paham betul mengenai macam-macam senyawa antioksidan serta bahan-bahan alam apa saja yang mengandung senyawa antioksidan tersebut. Mangga (Magnifera indica L.) merupakan tanaman tropis yang terkenal di dunia dan memiliki sekitar 69 varietas spesies yang telah diketahui (Stoilova et al., 2005). Daun mangga merupakan bagian dari mangga yang terkenal dapat digunakan sebagai obat di beberapa Negara seperti Bolivia, Southern Guiana, the Antilles, Kolumbia, Filipina dan India. Daun mangga yang hanya berupa tumpukan sampah ternyata memiliki khasiat untuk pengobatan antara lain sebagai antimikroba serta dapat menekan aktivitas neutrofil yang potensial dalam pencegahan dan pengobatan sepsis (Akinpelu dan Onakoya, 2004, Andreu et al., 2006, Nwinuka et al., 2008). Daun dan tunas mangga mengandung senyawa polyphenol. Senyawa atau komponen polyphenol dalam daun dan tunas mangga antara lain Galloyl, hydroxy benzoyl esters dan epicatechin (Masibo dan He, 2008). Studi yang dilakukan oleh Kanwal, et al. (2009) terhadap daun mangga menunjukkan bahwa dalam daun mangga terkandung 5 macam flavonoid di antaranya epichatecin dan quercetin yang memiliki aktivitas sebagai antimikroba. Senyawa flavonoid sendiri diketahui mempunyai aktivitas sebagai antioksidan. Studi yang dilakukan oleh Sanchez et al. (2000) menemukan bahwa ekstrak daun dan tunas mangga menggunakan air panas akan menghasilkan beberapa senyawa asam phenolic (gallic acid, 3,4 dihydroxy benzoic acid, benzoic acid), ester phenolic (gallic acid methyl ester,

3

gallic acid propyl ester, benzoic acid propyl ester), flavan-3-ols (catechin and epicatechin) dan xantone mangiferin yang menyusun sekitar 10% dari ekstrak. Mangiferin merupakan komponen penyusun bunga, cabang, daun serta tunas dimana merupakan komponen penyusun terbanyak dalam tunas daun. Mangiferin merupakan zat yang banyak diteliti dan memiliki efek atau manfaaat sebagai antikanker, antimikroba, antiaterosklerotik, antialergi,

antiinflamasi dan imunnomodulatory (Masibo dan He, 2008). Analisis in vivo yang dilakukan oleh Roulliard et al. (1998) menggunakan mencit menunjukkan bahwa mangiferin dapat digunakan sebagai pelindung hati dan jantung terhadap radikal bebas. Selain itu, mangiferin juga berpotensi sebagai pelindung membran mitokondria terhadap oksidasi. Ada berbagai macam metode yang bisa digunakan untuk menguji adanya aktivitas antioksidan, salah satunya adalah metode linoleat-tiosianat. Dalam metode linoleat-tiosianat ini yang digunakan sebagai sumber radikal adalah asam linoleat yang merupakan asam lemak tak jenuh dengan 2 buah ikatan rangkap yang mudah mengalami oksidasi membentuk radikal peroksida. Radikal peroksida ini akan mengoksidasi ion fero (dari feroklorida) menjadi ion feri yang dengan adanya ion tiosianat akan menghasilkan kompleks feri-tiosianat yang berwarna merah dan dapat diukur intensitasnya pada panjang gelombang 490 nm (Rohman dan Riyanto, 2005). Asam linoleat termasuk dalam golongan asam lemak essensial yang diperlukan oleh tubuh manusia untuk menjaga kesehatan jantung, namun sayangnya senyawa ini tidak bisa disintesis di dalam tubuh karena manusia tidak

4

memiliki enzim yang dapat mensintesisnya. Oleh karena itu kebutuhan asam linoleat hanya dapat dipenuhi melalui makanan. Asam linoleat dalam tubuh akan diubah menjadi asam -linolenat dengan bantuan enzim 6 desaturase (Bajpai, 1993). Metabolisme yang terjadi dalam tubuh dapat pula menyebabkan asam linoleat yang merupakan asam lemak tak jenuh akan teroksidasi membentuk radikal bebas yang disebut radikal peroksida. Radikal peroksida terbentuk melalui reaksi peroksidasi lipid yaitu reaksi antara radikal bebas (dalam hal ini yaitu radikal bebas yang terbentuk secara alami dalam tubuh) dengan asam lemak tak jenuh (dalam hal ini asam linoleat). Radikal yang terbentuk karena reaksi metabolisme dalam tubuh disebut radikal endogenus. Perbedaan antara metode linoleat-tiosianat ini dengan metode DPPH yang lazim digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan terletak pada 2 hal, yaitu pada sumber radikal dan prinsip kerja keduanya. Pada metode linoleat tiosianat, sumber radikal yang digunakan adalah asam linoleat yang kemudian akan diubah menjadi radikal bebas peroksida di mana dalam penelitian, radikal ini diasumsikan sebagai radikal endogenus karena terbentuk akibat reaksi dalam tubuh, sedangkan pada metode DPPH, DPPH yang merupakan senyawa kimia sintetik merupakan radikal bebas itu sendiri yang dalam penelitian dianggap sebagai radikal eksogenus karena radikal ini terbentuk di luar tubuh. Pada metode linoleat-tiosianat, prinsipnya yaitu ingin melihat penghambatan terbentuknya senyawa radikal, sedangkan pada metode DPPH prinsipnya ingin melihat kemampuan senyawa antioksidan dalam meredam senyawa radikal (DPPH).

5

Pemilihan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode linoleat-tiosianat ini dimaksudkan untuk melihat kemampuan ekstrak dan senyawa yang hendak diuji (flavonoid) dari daun mangga (Mangifera indica L.) dalam menghambat terbentuknya radikal yang bersifat reaktif. Pada metode ini, yang diukur adalah radikal peroksida yang membentuk kompleks dengan Fe[Fe(SCN)6]. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan khasiat antioksidasi dari ekstrak dan isolat flavonoid dari daun mangga (Mangifera indica L.). Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai khasiat antioksidasi dari daun mangga (Mangifera indica L.) secara in vitro.

1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang tersebut di atas, maka rumusan masalah dari penelitian ini adalah : 1. Apakah ekstrak etanol dan isolat flavonoid dari daun mangga (Mangifera indica L.) mempunyai aktivitas antioksidan ? 2. Adakah perbedaan aktivitas antioksidan antara ekstrak etanol dan isolat flavonoid dari daun mangga (Mangifera indica L.) ? 3. Bagaimanakah struktur kimia senyawa flavonoid hasil isolat daun mangga (Mangifera indica L.) yang teridentifikasi secara spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometri IR ?

6

1.3 Batasan Masalah 1. Tanaman yang digunakan adalah bagian daun yang masih segar dari pohon mangga (Mangifera indica L.) jenis arumanis yang diperoleh dari daerah Tlogosari, Semarang. 2. Ekstrak etanol daun mangga adalah ekstrak yang dibuat dengan cara menyari daun mangga (Mangifera indica L.) yang telah dikeringkan dan dihaluskan menggunakan metode maserasi dengan penyari etanol 70 %. 3. Isolasi senyawa flavonoid dilakukan dengan menggunakan metode

kromatografi kolom menggunakan fase gerak BAA (n butanol-asam asetat glasial-air) dengan perbandingan 4:1:5. 4. Analisis kualitatif dilakukan dengan menggunakan pereaksi warna, metode pemisahan secara KLT, dan KLT 2 dimensi. 5. Hasil isolasi senyawa flavonoid diidentifikasi dengan spektrofotometer UVVis (Shimadzu UV-Vis mini 1240) dan IR (Shimadzu tipe FTIR 8201-PC). 6. Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode linoleat tiosianat menggunakan baku pembanding vitamin E.

1.4 Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui ada tidaknya aktivitas antioksidan ekstrak etanol dan isolat flavonoid dari daun mangga (Mangifera indica L.). 2. Untuk mengetahui apakah ada perbedaan aktivitas antioksidan antara ekstrak etanol dan isolat flavonoid dari daun mangga (Mangifera indica L.).

7

3. Untuk mengetahui struktur kimia senyawa flavonoid hasil isolat daun mangga (Mangifera indica L.) secara spektrofotometri UV-Vis dan spektrofotometri IR..

1.5 Manfaat Penelitian 1. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa senyawa flavonoid dalam ekstrak etanol daun mangga (Mangifera indica L.) mempunyai efektivitas sebagai antioksidan. 2. Penelitian ini diharapkan dapat menambah wawasan dan pengetahuan serta memperkaya data ilmiah tentang penggunaan antioksidan alami dari tumbuhan.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA DAN HIPOTESIS

2.1 Tinjauan Pustaka 2.1.1 Tanaman Mangga (Mangifera indica L.) 2.1.1.1 Klasifikasi Tanaman Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi Kelas Sub Kelas Ordo Famili Genus Spesies : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) : Rosidae : Sapindales : Anacardiaceae : Mangifera : Mangifera indica L. (Anonim, 2010).

2.1.1.2 Morfologi Tanaman Pohon mangga berperawakan besar, dapat mencapai tinggi 40 m atau lebih, meski kebanyakan mangga yang dibudidayakan hanya sekitar 10 m atau kurang. Batang mangga tegak, bercabang agak kuat dengan daun-daun lebat membentuk tajuk yang indah berbentuk kubah, oval atau memanjang, dengan diameter sampai 10 m. Kulit batang tebal dan kasar dengan banyak celah-celah kecil dan sisik-sisik

8

9

bekas tangkai daun. Warna pepagan (kulit batang) yang sudah tua biasanya coklat keabuan, kelabu tua sampai hampir hitam (Anonim, 2010). Mangga berakar tunggang yang bercabang-cabang, sangat panjang hingga bisa mencapai 6 m. Akar cabang makin ke bawah semakin sedikit, paling banyak akar cabang pada kedalaman lebih kurang 30-60 cm (Anonim, 2010). Daun tunggal, dengan letak tersebar, tanpa daun penumpu. Panjang tangkai daun bervariasi dari 1,25-12,5 cm, bagian pangkal membesar dan pada sisi sebelah atas ada alurnya. Aturan letak daun pada batang biasanya 3/8, tetapi makin mendekati ujung, letaknya makin berdekatan sehingga nampaknya seperti dalam lingkaran (roset). Helai daun bervariasi namun kebanyakan berbentuk jorong sampai lanset, 2-10 8-40 cm, agak liat seperti kulit, hijau tua berkilap, berpangkal melancip dengan tepi daun bergelombang dan ujung meluncip, dengan 12-30 tulang daun sekunder. Beberapa variasi bentuk daun mangga: 1. Lonjong dan ujungnya seperti mata tombak. 2. Berbentuk bulat telur, ujungnya runcing seperti mata tombak. 3. Berbentuk segi empat, tetapi ujungnya runcing. 4. Berbentuk segi empat, ujungnya membulat. Daun yang masih muda biasanya berwarna kemerahan, keunguan atau kekuningan yang di kemudian hari akan berubah pada bagian permukaan sebelah atas menjadi hijau mengkilat, sedangkan bagian permukaan bawah berwarna hijau muda. Umur daun bisa mencapai 1 tahun atau lebih (Anonim, 2010). Bunga mangga berumah satu (monoecious) dan merupakan bunga majemuk yang berkarang dalam malai bercabang banyak di ujung ranting. Karangan bunga

10

biasanya berbulu, tetapi sebagian ada juga yang gundul, kuning kehijauan, panjang sampai 40 cm. Bunga majemuk ini terdiri dari sumbu utama yang mempunyai banyak cabang utama. Setiap cabang utama ini mempunyai banyak cabang-cabang, yakni cabang kedua. Ada kemungkinan cabang bunga kedua ini mempunyai suatu kelompok yang terdiri dari 3 bunga atau mempunyai cabang tiga. Setiap kelompok tiga bunga terdiri dari tiga kuntum bunga dan setiap kuntum bertangkai pendek dengan daun kecil. Jumlah bunga pada setiap bunga majemuk bisa mencapai 1000-6000. Bunga-bunga dalam karangan berkelamin campuran, ada yang jantan dan ada pula yang hermafrodit (berkelamin dua). Besarnya bunga lebih kurang 6-8 mm. Bunga jantan lebih banyak daripada bunga hermafrodit, dan jumlah bunga hermafrodit inilah yang menentukan terbentuknya buah. Persentase bunga hermafrodit bermacam-macam, tergantung dari varietasnya, yaitu antara 1,25%77,9%, sementara yang mempunyai bakal buah normal kira-kira 5-10%. Bunga mangga bertangkai pendek, jarang sekali yang bertangkai panjang, dan berbau harum. Kelopak bunga biasanya bertaju 5, demikian juga mahkota bunga terdiri dari 5 daun bunga, tetapi kadang-kadang ada yang 4 sampai 8. Warnanya kuning pucat, sedangkan pada bagian tengah terdapat garis timbul berjumlah 3 sampai 5 yang warnanya sedikit tua. Bagian tepi daun mahkota berwarna putih. Pada waktu akan layu, warna mahkota bunga tadi menjadi kemerahan. Benang sari berjumlah 5 buah, tetapi yang subur hanya satu atau dua buah sedangkan yang lainnya steril. Benang sari yang subur mempunyai panjang

11

hampir sama panjang dengan putik, yakni kira-kira 2 mm, sedangkan yang steril lebih pendek. Kepala putik berwarna kemerah-merahan dan akan berubah warna menjadi ungu pada waktu kepala sari membuka untuk memberi kesempatan kepada tepung sari yang telah dewasa untuk menyerbuki kepala putik. Bentuk tepung sari biasanya bulat panjang, lebih kurang 20-35 mikron (Anonim, 2010). Bakal buah tidak bertangkai dan terdapat dalam suatu ruangan, serta terletak pada suatu piringan. Tangkai putik mulai dari tepi bakal buah dan ujungnya terdapat kepala putik yang bentuknya sederhana. Dalam suatu bunga kadangkadang terdapat tiga bakal buah (Anonim, 2010). Buah mangga termasuk kelompok buah batu (drupa) yang berdaging, dengan ukuran dan bentuk yang sangat berubah-ubah bergantung pada macamnya, mulai dari bulat (misalnya mangga gedong), bulat telur (gadung, indramayu, arumanis) hingga lonjong memanjang (mangga golek). Panjang buah kira-kira 2,5-30 cm. Pada bagian ujung buah, ada bagian yang runcing yang disebut paruh. Di atas paruh ada bagian yang membengkok yang disebut sinus, yang dilanjutkan ke bagian perut (Anonim, 2010). Kulit buah agak tebal berbintik-bintik kelenjar, hijau, kekuningan atau kemerahan bila masak. Daging buah jika masak berwarna merah jingga, kuning atau krem, berserabut atau tidak, manis sampai masam dengan banyak air dan berbau kuat sampai lemah. Biji berwarna putih, gepeng memanjang tertutup endokarp yang tebal, mengayu dan berserat. Biji ini terdiri dari dua keping, ada yang monoembrional dan ada pula yang poliembrional (Anonim, 2010).

12

2.1.1.3 Sinonim Indonesia Inggris Melayu Vietnam Thailand Filipina : Mangga, pelem, pelem kecik : Mango : Ampelam, mangga : Xoi : Mamuang (Ma muang, Mak mouang) : Mangang kalabau, mangga (Indrawatie, 2010).

2.1.1.4 Kandungan Kimia Buah mangga mengandung vitamin C, karoten, dan flavonoid (Stefani, 2010). Daun mangga mengandung sejumlah besar polifenol seperti mangiferin dan beberapa macam flavonoid (katekin, epikatekin, kuersetin) (Masibo dan He, 2009, Sanchez et al., 2000). 2.1.1.4 Khasiat dan Kegunaan Tanaman Buah mangga digunakan untuk pengobatan asma, bronkitis, flu berat, penghilang bau badan, desinfektan, dan menurunkan demam (Stefani, 2010). Kulit batang mangga sebagai antihelmintik (obat cacing) dan antialergi (Garcia, et al., 2003). Menurut beberapa jurnal penelitian, daun mangga dapat berpotensi sebagai antidiabetes, antikanker, dan antimikroba.

2.1.2 Senyawa Fenol Istilah senyawa fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari tumbuhan, yang mempunyai ciri sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua penyulih hidroksil. Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air

13

karena umumnya mereka sering kali berikatan dengan gula sebagai glikosida dan biasanya terdapat dalam vakuola sel (Harborne,1987 : 47). Beberapa ribu senyawa fenol alam telah diketahui strukturnya. Flavonoid merupakan golongan terbesar, tetapi fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoid, dan kuinon fenolik juga terdapat dalam jumlah besar. Beberapa bahan polimer penting dalam tumbuhan seperti lignin, melanin, dan tanin adalah senyawa polifenol (Harborne,1987 : 47). Bagi biokimiawan tumbuhan, senyawa fenol tumbuhan dapat menimbulkan gangguan besar karena kemampuannya membentuk kompleks dengan protein melalui ikatan hidrogen. Bila kandungan sel tumbuhan bercampur dan membran menjadi rusak selama proses isolasi, senyawa fenol cepat sekali membentuk kompleks dengan protein. Akibatnya, sering terjadi hambatan terhadap kerja enzim pada ekstrak tumbuhan kasar. Sebaliknya, fenol sendiri sangat peka terhadap oksidasi enzim dan mungkin hilang pada proses isolasi akibat kerja enzim fenolase yang terdapat pada tumbuhan. Ekstraksi senyawa fenol tumbuhan dengan etanol mendidih biasanya mencegah terjadinya oksidasi enzim (Harborne,1987 : 48). Semua senyawa fenol berupa senyawa aromatik sehingga semuanya menunjukkan serapan kuat di daerah spektrum UV. Selain itu, secara khas senyawa fenol menunjukkan geseran batokrom pada spektrumnya bila ditambahkan basa. Karena itu, cara spektrofotometri penting terutama untuk identifikasi dan analisis kuantitatif senyawa fenol (Harborne, 1987 : 49).

14

2.1.3 Senyawa Flavonoid 2.1.3.1 Pengertian dan Struktur Flavonoid Flavonoid adalah sekelompok besar senyawa polifenol tanaman yang tersebar luas dalam berbagai bahan makanan dan dalam berbagai konsentrasi. Komponen tersebut pada umumnya terdapat dalam keadaan terikat atau terkonjugasi dengan senyawa gula. Lebih dari 4000 jenis flavonoid telah diidentifikasi dan beberapa di antaranya berperan dalam pewarnaan bunga, buah, dan daun (de Groot & Rauen, 1998). Dalam tumbuhan, aglikon flavonoid (yaitu flavonoid tanpa gula terikat) terdapat dalam berbagai bentuk struktur. Semua flavonoid mengandung 15 atom karbon dalam inti dasar yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Agar mudah, cincin diberi tanda A, B, dan C, atom karbon dinomori menurut sistem penomoran yang menggunakan angka biasa untuk cincin A dan C, serta angka beraksen untuk cincin B (gambar 1).

Gambar 1. Struktur Flavonoid (Markham, 1988 : 3)

15

2.1.3.2 Sifat Kelarutan Flavonoid Aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa, tetapi bila dibiarkan dalam larutan basa dan di samping itu terdapat oksigen, banyak yang akan terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih, atau suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, air, dan lain-lain (Markham, 1988 : 15). Adanya gula yang terikat pada flavonoid (bentuk umum yang ditemukan) cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas dengan air merupakan pelarut yang baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988 : 15). 2.1.3.3 Kromatogram Flavonoid Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka dapat diekstraksi dengan etanol 70 % dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah basa atau amonia, jadi mereka mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan (Harborne, 1987 : 70).

16

Tabel 1. Warna Flavonoid dengan Sinar Tampak dan Lembayung Warna Warna dengan sinar UV Sendiri Dengan amonia Jingga redup, merah Biru atau merah senduduk Fluoresensi merah, kuning atau merah jambu Biru Petunjuk Antosianidin 3glikosida Kebanyakan antosianidin 3,5diglikosida 6-hidroksi flavonol dan flavon; beberapa khalkon glikosida Kebanyakan khalkon Auron Kebanyakan flavonol glikosida Kebanyakan flavon glikosida, biflavonil, dan flavon yang tersulih tak biasa Kebanyakan isoflavon dan flavonol Flavanon dan flavanonol 7glikosida 5desoksiisoflavon dan 7,8 dihidroksi flavanon

Jingga, Merah, merah senduduk

Coklat tua atau hitam Kuning murup

Coklat tua atau hitam Merah tua atau jingga murup Jingga murup atau merah Kuning murup atau coklat kuning

Kuning murup atau hijau kuning

Kuning pucat

Coklat tua Kuning kunyithijau coklat tua

Coklat lemah Merah senduduk tua Nihil Kuning pucat atau hijau kuning

Biru lemah

Biru kuat

(Harborne, 1987 : 70)

17

Penyemprot kromatografi umum : AlCl3 5% dalam etanol dengan hasil fluorosensi hijau kuning dengan sinar UV; FeCl3-K3Fe(CN)6 (1:1) dengan hasil biru pada latar belakang kuning; pereaksi Folin dengan hasil (+NH3) biru pada latar belakang putih (Harborne, 1987 : 70). 2.1.3.4 Spektrum Flavonoid Umum Spektroskopi serapan lembayung dan serapan sinar tampak digunakan untuk membantu mengidentifikasi jenis flavonoid dan menentukan pola oksigenasi. Di samping itu, kedudukan gugus hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan dengan menambahkan pereaksi (pereaksi geser) ke dalam larutan cuplikan dan mengamati pergeseran puncak serapan yang terjadi. Cara ini berguna untuk menentukan kedudukan gula atau metil yang terikat pada salah satu gugus hidroksil fenol (Markham, 1988 : 38). Spektrum flavonoid (gambar 2) biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut metanol atau etanol. Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada rentang 240-285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I). Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksimal tersebut memberikan informasi yang berharga mengenai sifat flavonoid dan pola oksigenasinya. Spektrum khas jenis flavonoid utama dengan pola oksigenasi yang setara (5,7,4) adalah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon. Ciri nisbi ini tidak berubah, bahkan bila pola oksigenasi berubah, sekalipun rentang maksimal serapan pada jenis flavonoid (tabel 2) yang berlainan tumpang tindih sebagai keseragaman pola oksigenasi. Keseragaman dalam rentang maksimal ini akan bergantung pada pola hidroksilasi dan pada derajat substitusi gugus hidroksil (Markham, 1988 : 39).

18

Gambar 2. Spektrum Serapan UV-Tampak Jenis Flavonoid yang Berbeda tetapi Pola Hidroksilasinya Sama (Markham, 1988 : 40) Tabel 2. Rentangan Serapan Spektrum UV-Tampak Flavonoid Pita II (nm) 250 280 250 280 250 280 245 275 275 295 230 270 (kekuatan rendah) 230 270 (kekuatan rendah) 270 280 (Markham, 1988 : 39) Pita I (nm) 310 350 330 360 350 385 310 330 bahu kira-kira 320 puncak 300 330 bahu 340 390 380 430 465 560 Jenis flavonoid Flavon Flavonol (3-OH tersubstitusi) Flavonol (3-OH bebas) Isoflavon Isoflavon (5-deoksi-6, 7-dioksigenasi) Flavonon dan dihidroflavanol Khalkon Auron Antosianidin dan antosianin

19

Langkah

pertama

ialah

menentukan

jenis

flavonoid

dengan

memperhatikan bentuk umum spektrum metanol (gambar 2) dan panjang gelombang pita serapan (tabel 2). Langkah kedua ialah mempertimbangkan arti perubahan spektrum yang disebabkan oleh berbagai pereaksi geser. Penafsiran perubahan ini dapat dilihat pada tabel yang didasarkan pada jenis flavonoid disertakan untuk setiap pereaksi geser (tabel 3,4,5, dan 6). Tabel 3. Penafsiran Spektrum NaOMeJenis Flavonoid Pergeseran yang tampak Pita I Pita II kekuatan menurun terus (artinya Penguraian ) Flavon Flavonol Petunjuk Interpretasi 3,4 OH, o-di OH pada cincin A ; pada cincin B: 3 - OH yang berdampingan

Isoflavon Flavanon Dihidroflavonol

Khalkon Auron

Antosianidin Antosianin

Mantap + 45 sampai 65 4 OH nm kekuatan tak menurun Mantap +45 sampai 65 3-OH, tak ada 4 OH nm kekuatan menurun bebas Pita baru ( bandingkan dengan MeOH), 3207-OH 335 nm tak ada tak ada OH pada cincin A pergeseran Kekuatan o-diOH pada cincin A menurun dengan (penurunanya lambat : oberjalannya diOH pada cincin B waktu isoflavon) Bergeser dari 280 Flavanon dan nm ke 325 nm, dihidroflavonol dengan kekuatan naik tetapi 5,7-OH 7-OH, tanpa 5-OH ke 330-340 nm bebas + 80 sampai 95 nm 4-OH (auron) (kekuatan naik) 6-OH tanpa oksigenasi +60 sampai 70 nm pada 4 (auron) (kekuatan naik) 6-OH dengan oksigenasi pergeseran lebih kecil pada 4 (auron) + 60 sampai 100 nm 4-OH (khalkon) (kekuatan naik) (Tanpa 2-OH atau 4 OH dan kenaikan kekuatan) tanpa 4-OH 4-OH (2-OH + 40 sampai 50 nm atau 4 OR juga ada) Semuanya teruarai kecuali Nihil 3-deoksiantosianidin

(Markham, 1988 : 44)

20

Tabel 4. Penafsiran Spektrum NaOAc Jenis Flavonoid Pergeseran yang tampak Pita I Pita II +5 sampai 20 nm (berkurang bila ada oksigenasi pada 6 atau 8) Kekuatan berkurang dengan bertambahnya waktu + 35 nm +60 Kekuatan berkurang dengan bertambahnya waktu Khalkon Auron Pergeseran batokromik atau bahu pada panjang gelombang yang lebih panjang Petunjuk Interpretasi 7-OH Gugus yang peka terhadap basa, mis, 6,7 atau 7,8 atau 3,4 di OH 7-OH (dengan 5-OH) 7-OH (tanpa 5-OH) Gugus yang peka terhadap basa, mis 6,7 atau 7,8diOH 4 dan/atau 4-OH (khalkon) 4 dan/atau 6-OH (auron)

Flavon Flavonol Isoflavon

Flavanon Dihidroflavonol

(Markham, 1988 : 45) Tabel 5. Penafsiran Spektrum NaOAc / H3BO3 Pergeseran yang tampak Pita I Pita II +12 sampai 36 nm Flavon (nisbi terhadap Flavonol Auron spektrum MeOH) Khalkon pergeseran lebih kecil +10 sampai 15 Isoflavon nm (nisbi Flavonon terhadap Dihidroflavonol spektrum MeOH) (Markham, 1988 : 45) Jenis Flavonoid Petunjuk Interpretasi o-diOH pada cincin B

o-diOH pada cincin A (6,7 atau 7,8) o-diOH pada cincin A (6,7 atau 7,8)

21

Tabel 6. Penafsiran Spektrum AlCl3 dan AlCl3 / HClJenis Flavonoid Flavon dan Flavonol (AlCl3/HCl) (AlCl3) Pergeseran yang tampak Pita I Pita II + 35 sampai 55 nm + 17 sampai 20nm Tak berubah + 50 sampai 60 Pergeseran AlCl3/HCl tambah 30 sampai 25 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 20 sampai 25 nm Isoflavon, Flavanon, dan Dihidroflavonol (AlCl3/HCl) (AlCl3) +10 sampai 14 nm +20 sampai 26 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 11 sampai 30 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 30 sampai sampai 38 nm (peka) terhadap NaOAc) + 48 sampai 64 nm + 40 nm + 60 sampai 70 nm Pergeseran AlCl3/HCl tambah 40 sampai 70 nm Penambahan lebih kecil + 25 sampai 35 nm (pada pH 2-4) Pergeseran lebih besar Petunjuk Interpretasi 5-OH 5-OH dengan Oksigenasi pada 6 Mungkin 5-OH dengan gugus prenil pada 6 Mungkin 3-OH (dengan atau tanpa 5-OH) o-diOH pada cincin B o-diOH pada cincin A (tambahan pada pergeseran o-diOH pada cincin B) 5-OH (isoflavon) 5-OH (flavonon, dihidroflavonol) o-diOH pada cincin A (6,7 dan 7,8)

dihidroflavonol tanpa 5-OH (tambahan pada sembarang pergeseran o-diOH) 2-OH (khalkon) 2-OH (khalkon) dengan oksigenasi pada 3 4-OH (auron) o-diOH pada cincin B Mungkin o-diOH pada cincin A o-diOH Banyak o-diOH atau o-diOH (3-deoksi antosianidin)

Auron Khalkon (AlCl3/HCl) (AlCl3)

Antosianidin Antosianin (AlCl3)

(Markham, 1988 : 46)

22

Spektrum NaOMe merupakan spektrum flavonoid yang gugus hidroksil fenolnya sampai batas tertentu terionisasi. Spektrum ini biasanya merupakan petunjuk sidik jari pola hidroksilasi dan juga bermanfaat untuk mendeteksi gugus hidroksil yang lebih asam dan tidak tersubstitusi. Degradasi atau pengurangan kekuatan spektrum setelah waktu tertentu merupakan petunjuk baik akan adanya gugus yang peka terhadap basa (Markham, 1988 : 43). Spektrum NaOAc , Natrium asetat hanya menyebabkan pengionan yang berarti pada gugus hidroksil flavonoid yang paling asam. Jadi, natrium asetat digunakan terutama untuk mendeteksi adanya gugus 7-hidroksil bebas (atau yang setara) (Markham, 1988 : 43). Spektrum NaOAc/H3BO3 menjembatani kedua gugus hidroksil pada gugus o-dihidroksi dan digunakan untuk mendeteksinya (Markham, 1988 : 43). Spektrum AlCl3 dan AlCl3 / HCl, terbentuknya kompleks tahan asam antara gugus hidroksil dan keton yang bertetangga dan membentuk kompleks tak tahan asam dengan gugus o-dihidroksil, maka pereaksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi kedua gugus tersebut. Spektrum AlCl3 merupakan penjumlahan pengaruh semua kompleks terhadap spektrum, sedangkan spektrum AlCl 3/ HCl hanya merupakan pengaruh kompleks hidroksi-keto (Markham, 1988 : 47). 2.1.3.5 Flavonoid sebagai Antioksidan Berbagai sayuran dan buah-buahan yang dapat dimakan mengandung sejumlah flavonoid. Konsentrasi yang lebih tinggi berada pada daun dan kulit kupasannya dibandingkan dengan jaringan yang lebih dalam. Stavric dan Matula (1992) melaporkan bahwa di negara-negara Barat, konsumsi komponen flavonoid

23

bervariasi dari 50 mg sampai 1 g per hari dengan 2 jenis flavonoid terbesar berupa quersetin dan kaempferol. Sebagai antioksidan, flavonoid dapat menghambat penggumpalan kepingkeping sel darah, merangsang produksi nitrit oksida yang dapat melebarkan (relaksasi) pembuluh darah, dan juga menghambat pertumbuhan sel-sel kanker. Flavonoid juga memiliki beberapa sifat seperti hepatoprotektif, antitrombotik, antiinflamasi, dan antivirus (Stavric dan Matula, 1992). Sifat antiradikal flavonoid terutama terhadap radikal hidroksil, anion superoksida, radikal peroksil, dan alkoksil (Huguet, et al., 1990; Sichel, et al., 1991). Senyawa flavonoid ini memiliki afinitas yang sangat kuat terhadap ion Fe (Fe diketahui dapat mengkatalisis beberapa proses yang menyebabkan terbentuknya radikal bebas). Aktivitas antiperoksidatif flavonoid ditunjukkan melalui potensinya sebagai pengkelat Fe (Afanasav, et al., 1989 ; Morel, et al., 1993).

2.1.4 Radikal Bebas Istilah radikal bebas merujuk ke atom atau gugus atom apa saja yang memiliki satu atau lebih elektron tak berpasangan. Karena jumlah elektron ganjil, maka tidak semua elektron dapat berpasangan. Meskipun suatu radikal bebas tidak bermuatan positif atau negatif, spesi semacam ini sangat reaktif karena adanya elektron tak berpasangan. Suatu radikal bebas biasanya dijumpai sebagai zat antara yang tak dapat diisolasi usia pendek, sangat reaktif, dan berenergi tinggi (Fessenden, 1997 : 223).

24

Radikal bebas bisa terbentuk, misal ketika komponen makanan diubah menjadi bentuk energi melalui proses metabolisme. Pada proses metabolisme ini sering kali terjadi kebocoran elektron. Dalam kondisi demikian, mudah sekali terbentuk radikal bebas, seperti anion superoksida, hidroksil, dan lain-lain. Radikal bebas juga dapat terbentuk dari senyawa lain yang sebenarnya bukan radikal bebas, tetapi mudah berubah menjadi radikal bebas. Misal, hidrogen peroksida (H2O2), ozon, dan lain-lain. Kedua kelompok senyawa tersebut sering diistilahkan sebagai Senyawa Oksigen Reaktif (SOR) atau Reactive Oxygen Species (ROS) (Winarsi, 2011 : 12). Sementara Supari (1996) berpendapat bahwa pada dasarnya radikal bebas dapat terbentuk melalui 2 cara, yaitu secara endogen (sebagai respon normal proses biokimia intrasel maupun ekstrasel) dan secara eksogen (polusi, makanan). Secara biokimia, proses pelepasan elektron dari suatu senyawa disebut oksidasi. Sementara, proses penangkapan elektron disebut reduksi. Senyawa yang dapat menarik atau menerima elektron disebut oksidan atau oksidator, sedangkan senyawa yang dapat melepaskan atau memberikan elektron disebut reduktan atau reduktor (Winarsi, 2011 : 12). Elektron yang tidak berpasangan dalam senyawa radikal memiliki

kecenderungan untuk mencari pasangan. Caranya, menarik atau menyerang elektron dari senyawa lain. Hal ini mengakibatkan terbentuknya senyawa radikal baru.

X : H + O-H

X + H-O-H

25

Menurut Soeatmaji (1998), yang dimaksud radikal bebas adalah suatu senyawa atau molekul yang mengandung satu atau lebih elektron tidak berpasangan pada orbital luarnya. Adanya elektron yang tidak berpasangan menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan dengan cara menyerang atau mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya. Jika elektron yang terikat oleh senyawa radikal bebas tersebut bersifat ionik, dampak yang timbul memang tidak begitu berbahaya. Akan tetapi, bila elektron yang terikat radikal bebas berasal dari senyawa yang berikatan kovalen, maka akan sangat berbahaya karena ikatan digunakan secara bersama-sama pada orbital terluarnya. Umumnya, senyawa yang memiliki ikatan kovalen adalah molekulmolekul besar (biomakromolekul) seperti lipid, protein, maupun DNA (Winarsi, 2011 : 15). Target utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari ketiga molekul target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh (Winarsi, 2011 : 17). Sadikin (2011) berpendapat bahwa serangan radikal bebas terhadap molekul sekelilingnya akan menyebabkan terjadinya reaksi berantai yang kemudian menghasilkan senyawa radikal baru. Dampak reaktivitas senyawa radikal bebas bermacam-macam, mulai dari kerusakan sel atau jaringan, penyakit autoimun, penyakit degeneratif, hingga kanker. Secara umum, tahapan reaksi pembentukan radikal bebas mirip dengan rancidity oxidative, yaitu melalui 3 tahapan berikut :

26

1. Tahap inisiasi, yaitu awal pembentukan radikal bebas. Misalnya : Fe++ + H2O2 R1-H + OH Fe+++ + OH R1 -

+ OH

+ H2O

2. Tahap propagasi, yaitu pemanjangan rantai radikal. R2-H + R1 R3-H + R2 R2 R3

+ R1-H + R2-H

3. Tahap terminasi, yaitu bereaksinya senyawa radikal dengan radikal lain atau dengan penangkap radikal, sehingga potensi propagasinya rendah. R1 R2 R2

+ R1 + R1 + R2

R1-R1 R2-R1 R2-R2 , dst (Winarsi, 2011 : 18).

Inisiator radikal bebas ialah zat apa saja yang dapat mengawali suatu reaksi radikal bebas. Terdapat beberapa macam senyawa yang dapat ditambahkan ke dalam suatu campuran reaksi untuk mengawali reaksi radikal bebas. Kadangkadang secara keliru senyawa ini disebut katalis radikal bebas. Senyawa ini bukan benar-benar katalis karena seringkali terpakai habis dalam reaksi itu. Salah satu contoh inisiator radikal bebas ialah peroksida (ROOR) (Fessenden, 1997 : 239). Inhibitor radikal bebas menghambat suatu reaksi radikal bebas. Sebuah inhibitor kadang-kadang dirujuk sebagai suatu perangkap radikal bebas. Kerja yang lazim suatu inhibitor radikal bebas ialah bereaksi dengan radikal bebas

27

reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif atau relatif stabil (Fessenden, 1997 : 240). Suatu inhibitor yang digunakan untuk menghambat auto-oksidasi disebut antioksidan. Fenol-fenol, senyawa dengan suatu gugus OH yang terikat pada karbon cincin aromatik merupakan antioksidan yang efektif, produk radikal bebas senyawa-senyawa ini terstabilkan secara resonansi dan karena itu tak reaktif dibandingkan dengan kebanyakan radikal bebas lain (Fessenden, 1997 : 240).

2.1.5 Antioksidan Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi, dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Akibatnya, kerusakan sel akan dihambat (Winarsi, 2011 : 20). Tubuh manusia memiliki sistem antioksidan untuk menangkal reaktivitas radikal bebas, yang secara kontinyu dibentuk sendiri oleh tubuh. Bila jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah antioksidan dalam tubuh, kelebihannya akan menyerang komponen lipid, protein, maupun DNA sehingga mengakibatnya kerusakan-kerusakan yang disebut stres oksidatif. Namun demikian, reaktivitas radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara berikut : 1. Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru. 2. Menginaktivasi atau menangkap radikal dan memotong propagasi (pemutusan rantai).

28

3. Memperbaiki kerusakan oleh radikal. (Winarsi, 2011 : 20) Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase atau SOD, katalase, dan glutation peroksidase), vitamin (misalnya vitamen E, C, A, dan -karoten), dan senyawa lain (misalnya flavonoid, albumin, bilirubin, seruloplsmin, dan lain-lain) (Winarsi, 2011 : 21). Secara umum, antioksidan dikelompokkan menjadi 2, yaitu antioksidan enzimatis dan non-enzimatis. Antioksidan enzimatis misalnya enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase. Antioksidan non-enzimatis masih dibagi dalam 2 kelompok lagi, yaitu : 1. Antioksidan larut lemak, seperti -tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan bilirubin. 2. Antioksidan larut air, seperti asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein pengikat heme. (Winarsi, 2011 : 78) Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi 3 kelompok, yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier (Winarsi, 2011:79). Antioksidan primer disebut juga antioksidan enzimatis. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada senyawa radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah menjadi senyawa yang lebih stabil. Antioksidan primer meliputi enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase (GSH-Px).

29

Belleville-Nabet (1996) menyebutkan bahwa antioksidan primer bekerja dengan cara mencegah pembentukan radikal bebas baru, atau mengubah radikal bebas yang telah terbentuk menjadi molekul yang kurang reaktif dengan cara memutus reaksi berantai (polimerisasi), kemudian mengubahnya menjadi molekul yang lebih stabil. Antioksidan dalam kelompok ini disebut juga chain-breakingantioxidant. Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau nonenzimatis. Antioksidan dalam kelompok ini juga disebut sistem pertahanan preventif. Dalam sistem pertahanan ini, terbentuknya senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara pengkelatan metal, atau dirusak pembentukannya. Antioksidan non-enzimatis dapat berupa komponen non-nutrisi dan komponen nutrisi dari sayuran dan buah-buahan. Kerja sistem antioksidan non-enzimatis yaitu dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas atau dengan cara menangkapnya. Akibatnya, radikal bebas tidak akan bereaksi dengan komponen seluler (Lampe, 1999). Menurut Lampe (1999), antioksidan sekunder meliputi vitamin E, vitamin C, -karoten, flavonoid, asam urat, bilirubin, dan albumin. Antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini berfungsi dalam perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas.

30

2.1.6 Pengujian Aktivitas Antioksidan dengan Metode Linoleat Tiosianat Aktivitas antioksidan tidak dapat diukur secara langsung, melainkan melalui efek antioksidan dalam mengontrol proses oksidasi. Banyak metode yang bisa digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan. Pada pengukuran aktivitas antioksidan, perlu diperhatikan sumber radikal bebas dan substrat. Salah satu metode pengujian aktivitas antioksidan adalah dengan metode linoleat-tiosianat di mana digunakan asam linoleat sebagai sumber radikal. Asam linoleat merupakan asam lemak tak jenuh dengan 2 buah ikatan rangkap yang mudah mengalami oksidasi membentuk peroksida. Peroksida ini selanjutnya mengoksidasi ion fero menjadi ion feri yang kemudian bereaksi dengan ammonium tiosianat membentuk kompleks feri tiosianat (Fe(SCN)3) yang berwarna merah. Intensitas warna merah ini diukur absorbansinya pada panjang gelombang 490 nm. Semakin intens warna merahnya menunjukkan bahwa semakin banyak peroksida yang terbentuk (Rohman dan Riyanto, 2005).

2.1.7 Proses Pembuatan Ekstrak 2.1.7.1 Cairan Pelarut Cairan pelarut dalam proses pembuatan ekstrak adalah pelarut yang baik (optimal) untuk senyawa kandungan yang berkhasiat atau yang aktif, dengan demikian senyawa tersebut dapat terpisahkan dari bahan dan dari senyawa kandungan lainnya, serta ekstrak hanya mengandung sebagian besar senyawa kandungan yang diinginkan. Dalam hal ekstrak total, maka cairan pelarut dipilih yang melarutkan hampir semua metabolit sekunder yang terkandung.

31

Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan cairan penyari adalah sebagai berikut : 1. Selektivitas 2. Kemudahan bekerja dan proses dengan cairan tersebut 3. Ekonomis 4. Ramah lingkungan 5. Keamanan Sampai saat ini berlaku aturan bahwa pelarut yang diperbolehkan adalah air dan alkohol (etanol) serta campurannya. Jenis pelarut lain seperti metanol dll. (alkohol turunannya), heksana dll. (hidrokarbon aliphatik), toluen dll.

(hidrokarbon aromatik), kloroform (dan segolongannya), aseton, umumnya digunakan sebagai pelarut untuk tahap separasi dan tahap pemurnian (fraksinasi). Khusus metanol, dihindari penggunaannya karena sifatnya yang toksik akut dan kronik, namun demikian jika dalam uji ada sisa pelarut dalam ekstrak menunjukkan negatif, maka metanol sebenarnya pelarut yang lebih baik dari etanol (Depkes RI, 2000 : 9). 2.1.7.2 Maserasi Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinu (terus-menerus). Remaserasi berarti dilakukan

32

pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Depkes RI, 2000 : 10).

2.1.8 Kromatografi Kromatografi adalah suatu metode pemisahan fisik, di mana komponenkomponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut di sepanjang landasan stasioner. Fasa stasioner bisa berupa padatan maupun cairan, sedangkan fasa gerak bisa berupa cairan maupun gas (Day, 2002 : 487). Metode kromatografi juga dapat digolongkan berdasarkan jenis pemisahan zat yang berlangsung (prinsip pemisahan) atau berdasarkan fase yang digunakan. Kromatografi kertas dinamakan berdasarkan bahan yang digunakan untuk fiksasi fase stasioner. Kromatografi lapis tipis mendapatkan namanya dari bentuk luar bahan adsorpsi yang digunakan sebagai fase stasioner yang difiksasikan sebagai lapis tipis pada penyangga seperti kaca atau gelas atau lembar aluminium. Untuk melakukan kromatografi kolom, bahan adsorpsi padat diisikan ke dalam kolom gelas (Roth, 1994 : 411). Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel (Roth, 1994 : 411).

33

Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal. Penamaan harga Rf ini diturunkan dari Ratio of fronts atau Related to front (Roth, 1994 : 411). Rf =Jarak titi k tengah noda dari awal Jarak tepi muka pelarut dari awal

2.1.9 Spektrofotometri 2.1.9.1 Pengertian Spektrofotometri Istilah spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya pengabsorpsian energi cahaya oleh suatu sistem kimia sebagai fungsi dari panjang gelombang radiasi, demikian pula pengukuran pengaborpsian yang menyendiri pada suatu panjang gelombang tertentu (Day, 2002 : 382). Radiasi elektromagnetik merupakan energi yang dipancarkan menembus ruang dalam bentuk gelombang-gelombang. Tipe-tipe radiasi elektromagnet (gelombang radio, ultraviolet, inframerah, nampak, dan lain-lain) dicirikan oleh panjang gelombangnya ( ), yakni jarak antara puncak panjang gelombang yang satu ke puncak panjang gelombang berikutnya (Fessenden, 1997 : 311). Panjang gelombang dari cahaya nampak berkisar antara 400 nm sampai 750 nm, namun daerah nampak ini hanyalah bagian sangat kecil dari seluruh spektrum elektromagnetik. Panjang gelombang yang sedikit lebih pendek daripada panjang gelombang cahaya nampak jatuh dalam daerah ultraviolet, sedangkan yang sedikit lebih panjang termasuk dalam daerah inframerah (Fessenden, 1997 : 311). Di samping dicirikan oleh panjang gelombangnya, radiasi dapat dicirikan oleh frekuensinya (v), yang didefinisikan sebagai banyaknya daur (lingkar)

34

lengkap tiap detik (cps, cycle per second), yang juga disebut Hertz. Radiasi dengan frekuensi lebih tinggi mengandung lebih banyak gelombang per detik, oleh karena itu panjang gelombang itu haruslah pendek. v=C

di mana v = frekuensi dalam Hz, c = 3 x 1010 cm/detik (laju rambat cahaya), dan = panjang gelombang (cm) (Fessenden, 1997 : 312). Radiasi elektromagnetik dipancarkan dalam bentuk paket-paket energi yang menyerupai partikel yang disebut foton atau kuantum. Energi suatu foton berbanding terbalik dengan panjang gelombangnya (E = hc/ dengan h= tetapan Planck). Radiasi dengan panjang gelombang lebih pendek mempunyai energi yang lebih tinggi, oleh karena itu sebuah foton cahaya ultraviolet berenergi lebih tinggi daripada sebuah foton cahaya nampak. Sebaliknya, energi sebuah foton suatu radiasi berbanding langsung dengan frekuensinya (E = hv) (Fessenden, 1997 : 313). ultraviolet nampak inframerah radio

Bertambahnya atau berkurangnya v berarti energi berkurang

Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi dari panjang gelombang disebut spektrometer atau spektrofotometer. Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliputi :

1. Sumber tenaga radiasi yang stabil. 2. Sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, celah-celah, dan lain-lain.

35

3. Monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal. 4. Tempat cuplikan yang transparan. 5. Detektor radiasi yang dihubungkan dengan sistem meter atau pencatat. Diagram sederhana dari spektrofotometer adalah sebagai berikut : Sumber Monokro mator Sel penyerap detektor Meter atau pencatat

Gambar 4. Diagram sederhana dari spektrofotometer (Sastrohamidjojo, 2001 : 39) 2.1.9.2 Spektrofotometri Ultraviolet-Cahaya Tampak (UV-VIS) Kebanyakan penerapan spektrofotometri ultraviolet dan cahaya tampak pada senyawa organik didasarkan pada transisi n-* ataupun -* dan karenanya memerlukan hadirnya gugus kromoforat dalam molekul itu. Transisi ini terjadi dalam daerah spektrum (sekitar 200 hingga 700 nm) yang praktis untuk digunakan dalam eksperimen. Spektrofotometer UV-VIS yang komersial biasanya beroperasi dari sekitar 175 atau 200 hingga 1000 nm. Identifikasi kualitatif senyawa organik dalam daerah ini jauh lebih terbatas daripada dalam daerah inframerah. Ini karena pita absorpsi terlalu lebar dan kurang rinci. Tetapi, gugus-gugus fungsional tertentu seperti karbonil, nitro, dan sistem terkonjugasi, benar-benar menunjukkan puncak karakteristik, dan sering dapat diperoleh informasi yang berguna mengenai ada tidaknya gugus semacam itu dalam molekul tersebut (Day, 2002 : 391). Bagian molekul yang yang mengabsorpsi dalam daerah ultraviolet dan daerah sinar tampak dinyatakan sebagai kromofor dan dalam satu molekul dapat

36

dikandung beberapa kromofor (Roth, 1994 : 368). Perkataan kromofor digunakan untuk menyatakan gugus tak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerah-daerah ultraviolet dan terlihat (Sastrohamidjojo, 2001 : 22). Auksokrom adalah gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum (Sastrohamidjojo, 2001 : 23). Gugus auksokrom mengandung pasangan elektron bebas yang disebabkan oleh terjadinya mesomeri kromofor (Roth, 1994 : 371). Yang termasuk gugus auksokrom ini adalah substituen seperti OH, -NH2, -NHR, NR2 (Roth, 1994 :371), serta OCH3 dan Cl (Sastrohamidjojo, 2001 : 23). 2.1.9.3 Spektrofotometri Inframerah Spektrofotometer inframerah merupakan alat rutin untuk mendeteksi gugus fungsional, mengidentifikasi senyawa, dan menganalisis campuran (Day, 2002 : 387). Absorpsi cahaya ultraviolet (radiasi berenergi tinggi) mengakibatkan pindahnya sebuah elektron ke orbital dengan energi yang lebih tinggi. Radiasi inframerah tidak cukup mengandung energi untuk mempromosikan elektron semacam itu, absorpsi radiasi inframerah hanya mengakibatkan membesarnya amplitudo getaran atom-atom yang terikat satu sama lain (Fessenden, 1997 : 313).

37

Tabel 7. Serapan khas beberapa gugus fungsi Gugus Senyawa C-H Alkana C-H Alkena C-H Aromatik C-H Alkuna C=C Alkena C=C Aromatik (cincin) C-O Alkohol, eter, asam karboksilat, ester C=O Aldehida, keton, asam karboksilat, ester O-H Alkohol, fenol (monomer) O-H Alkohol, fenol (ikatan H) O-H Asam karboksilat N-H Amina C-N Amina -NO2 Nitro (Siverstein, 2002) Daerah serapan (cm-1) 2850-2960, 1350-1470 3020-3080, 675-870 3000-3100, 675-870 3300 1640-1680 1500-1600 1080-1300 1690-1760 3610-3640 2000-3600 (lebar) 3000-3600 (lebar) 3310-3500 1180-1360 1515-1560, 1345-1385

2.2 Hipotesis Berdasarkan uraian di atas dapat dibuat suatu hipotesis bahwa ekstrak dan isolat flavonoid dari daun mangga (Mangifera indica L.) mempunyai potensi sebagai antioksidan.

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Obyek Penelitian Obyek dari penelitian ini adalah senyawa flavonoid yang terkandung dalam isolat daun mangga serta aktivitas antioksidan dari isolat flavonoid dan ekstrak etanol daun mangga.

3.2 Sampel dan Teknik Sampling Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah daun mangga yang diperoleh dari daerah Tlogosari, Semarang. Teknik sampling dengan sampel acak atau random sampling terhadap daun mangga.

3.3 Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Konsentrasi isolat flavonoid dan ekstrak etanol daun mangga, masingmasing 25 ppm, 50 ppm, dan 100 ppm. 2. Variabel Terikat Aktivitas antioksidan dari isolat flavonoid daun mangga dan ekstrak etanol daun mangga. 3. Variabel Terkontrol Waktu maserasi (5 hari) dan waktu pengukuran absorbansi (setiap 1 jam selama 4 jam).

39

40

3.4 Teknik Pengumpulan Data 3.4.1 Alat dan Bahan 3.4.1.1 Alat yang Digunakan 1. Alat untuk pembuatan ekstrak kental terdiri dari : nampan, kain hitam, blender, ayakan 30/40, bejana, gelas ukur 100 ml, shaker, dan rotary evaporator. 2. Alat untuk uji kualitatif senyawa aktif ekstrak etanol meliputi tabung reaksi, pipet tetes, pipa kapiler, plat tetes, chamber, lempeng kaca, lempeng KLT, lampu UV 366 nm, lampu UV 254 nm, waterbath, stopwatch. 3. Alat untuk isolasi senyawa flavonoid terdiri dari : timbangan analitik, kolom, corong pisah, vial, statif, dan klem. 4. Alat untuk uji kualitatif isolat flavonoid yaitu lempeng KLT 2 dimensi dan lempeng KLT. 5. Alat untuk identifikasi struktur kimia isolat flavonoid yaitu spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-vis mini 1240) dan spektrofotometer IR (Shimadzu tipe FTIR 8201-PC). 6. Alat untuk uji aktivitas antioksidan antara lain : labu takar (25 ml dan 10 ml), pipet mikro 200l, pipet volum 10 ml, tabung reaksi, kuvet, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV-vis mini 1240). 3.4.1.2 Bahan yang Digunakan 1. Bahan utama yang digunakan adalah simplisia daun mangga (Mangifera indica L.). 2. Bahan untuk pembuatan ekstrak kental yaitu etanol 70% dan kertas saring.

41

3. Bahan untuk uji kualitatif senyawa aktif ekstrak yaitu FeCl3, gelatin, amonia, indikator pH, serbuk Zn, HCl, fase gerak BAA (n-butanol-asam asetat glasialair), pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, fase gerak toluen-etil asetat, anisaldehid-asam sulfat. 4. Bahan untuk isolasi senyawa flavonoid yaitu fase gerak BAA (4:1:5). 5. Bahan untuk uji kualitatif isolat flavonoid yaitu fase gerak BAA, amonia, asam asetat. 6. Bahan untuk identifikasi struktur kimia isolat flavonoid yaitu etanol, metanol, NaOH, serbuk Na asetat anhidrat, serbuk H3BO3 anhidrat, AlCl3, HCl. 7. Bahan untuk uji aktivitas antioksidan yaitu asam linoleat, vitamin E, etanol, buffer fosfat pH 7, ammonium tiosianat, FeCl2.

3.4.2 Prosedur Kerja 3.4.2.1 Determinasi Tanaman Determinasi dilakukan terlebih dahulu untuk memperoleh kepastian bahwa tanaman yang digunakan pada penelitian berasal dari tanaman yang dimaksud, sehingga kemungkinan timbulnya kesalahan dalam pengumpulan bahan penelitian dapat dihindari. Identifikasi dan determinasi tanaman mangga (Mangifera indica L.) dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi Tumbuhan Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi (STIFAR) Yayasan Pharmasi Semarang. 3.4.2.2 Penyiapan Simplisia Dipilih daun yang masih utuh atau tidak rusak, kemudian daun dibersihkan. Daun dicuci dengan menggunakan air mengalir, setelah itu daun dikeringkan.

42

Daun dikeringkan di bawah sinar matahari dengan ditutup kain hitam. Daun yang sudah kering dihancurkan menggunakan blender, kemudian diayak dengan ayakan no.30/40. 3.4.2.3 Penyarian Simplisia Serbuk simplisia yang sudah diayak ditimbang kurang lebih 50 gram lalu dimasukkan dalam bejana tertutup. Kemudian ditambahkan 400 ml etanol 70% sebagai cairan penyari hingga serbuk simplisia terendam seluruhnya. Diaduk selama 3-4 jam dengan shaker lalu disaring. Filtrat yang diperoleh disimpan. Kegiatan tersebut dilakukan berulang selama 5 hari. Seluruh filtrat yang diperoleh dijadikan satu dan dienapkan selama 1 hari kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh lalu dipekatkan dengan rotary evaporator suhu 800C sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak yang diperoleh digunakan untuk uji kualitatif senyawa aktif ekstrak etanol dan isolasi senyawa flavonoid. 3.4.2.4 Uji Kualitatif Senyawa Aktif Ekstrak Etanol 1. Identifikasi Fenolik Larutan ekstrak etanol kurang lebih 1 ml ditambah 1 ml larutan besi (III) klorida membentuk warna hijau, merah, ungu, biru, atau hitam yang berarti positif mengandung senyawa fenolik dalam ekstrak (Trevor, 1995 : 209). 2. Identifikasi Tanin Larutan ekstrak etanol kurang lebih 1 ml ditambah dengan larutan gelatin 0,5 %. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin dalam ekstrak (Trevor, 1995 : 78).

43

3. Identifikasi Fenilpropanoid Larutan ekstrak etanol ditempatkan dalam dua tabung reaksi yang berbeda, kemudian salah satu tabung ditambahkan 0,5 ml amonia encer sampai alkalis. Tabung yang lain berisi larutan ekstrak tanpa penambahan amonia encer untuk pembanding. Terjadinya fluoresensi biru atau hijau kuat di bawah sinar UV 254 nm menunjukkan positif kumarin dan derivatnya dalam ekstrak (Trevor, 1995). 4. Identifikasi Flavonoid Ditambahkan 2 ml larutan ekstrak etanol dengan sedikit serbuk Zn dan 2 ml HCl 2N. Senyawa flavonoid akan menimbulkan warna jingga sampai merah. Identifikasi flavonoid dapat juga dilakukan dengan menggunakan uji KLT, yaitu dengan cara cuplikan larutan ekstrak etanol ditotolkan pada lempeng KLT silika gel GF 254, lalu dielusi dengan eluen n-butanol : asam asetat glasial : air (4:1:5). Setelah elusi selesai, lempeng dikeringkan, kemudian lempeng tersebut diuapi dengan menggunakan uap amonia pekat. Terbentuknya warna kuning

menunjukkan adanya kandungan flavonoid (Trevor, 1995). 5. Identifikasi Alkaloid Larutan ekstrak etanol kurang lebih 10 ml diuapkan. Sisanya dilarutkan dalam 1,5 ml asam klorida P 2 %. Larutan tersebut dibagi menjadi 3 sama banyak dalam tabung. Tabung reaksi I sebagai pembanding, tabung reaksi II ditambah dengan 2-3 tetes larutan Dragendorff LP, tabung reaksi III ditambah dengan 2-3 tetes pereaksi Mayer. Ekstrak yang positif terdapat alkaloid ditunjukkan dengan terjadinya kekeruhan atau endapan jingga kecoklatan untuk pereaksi Dragendorff dan endapan putih kekuningan untuk pereaksi Mayer (Depkes RI, 1987).

44

6. Identifikasi Saponin Sebanyak 0,5 ml ekstrak etanol dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambah air panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama sepuluh detik. Terbentuknya buih yang mantap setinggi 1 sampai 10 cm, tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1989). 7. Identifikasi Minyak Atsiri Cuplikan larutan ekstrak etanol ditotolkan pada lempeng KLT silika gel GF 254, lalu dielusi dengan fase gerak toluen : etil asetat dengan perbandingan 93:7. Setelah elusi selesai, lempeng dikeringkan, kemudian lempeng KLT disemprot dengan penampak bercak anisaldehid-H2SO4 (p) lalu dipanaskan pada suhu 1100C selama 5 sampai 10 menit. Terbentuknya noda berwarna biru, hijau, merah atau coklat menunjukkan adanya minyak atsiri (Trevor, 1995). 3.4.2.5 Isolasi Senyawa Flavonoid Ditimbang ekstrak yang diperoleh kurang lebih sebanyak 5 gram. Ekstrak dilarutkan dengan menggunakan fase gerak BAA. Isolasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom, fase diam digunakan silika gel G60 F254, dan fase gerak yaitu n-butanol : asam asetat glasial : air (4:1:5). Sampel yang akan difraksinasi dimasukkan dalam kolom, kemudian fase gerak dialirkan sedikit demi sedikit. Hasil fraksinasi berupa isolat ditampung dalam vial tiap 10 ml dan dihentikan sampai isolat jernih atau tidak berwarna. Isolat yang berwarna diuapkan sedemikian rupa hingga diperoleh isolat kental. Dilakukan uji kemurnian isolat flavonoid secara kualitatif.

45

3.4.2.6 Uji Kualitatif Isolat Flavonoid 1. Uji kromatografi Lapis Tipis Fase diam : silika gel GF 254

Fase gerak : BAA (n-butanol : asam asetat glasial : air) 4:1:5 Deteksi :

a. Uap amonia b. Lampu UV 366 nm 2. Uji Kromatografi Lapis Tipis 2 Dimensi Fase diam : silika gel GF 254

Fase gerak : a. BAA (n-butanol : asam asetat glasial : air) 4:1:5 b. Asam asetat 15 % Deteksi :

a. Uap amonia b. Lampu UV 366 nm 3.4.2.7 Identifikasi Struktur Flavonoid 3.4.2.7.1 Metode Spektrofotometri UV-Vis Tahap I Isolat flavonoid dalam metanol (disebut sebagai larutan cuplikan) dimasukkan ke dalam kuvet. Metanol murni digunakan sebagai pembanding. Dilakukan scanning dengan panjang gelombang 200-450 nm, kemudian diukur spektrumnya. Tahapan selanjutnya dilakukan perlakuan terhadap larutan cuplikan yang telah dimasukkan kuvet.

46

Tahap II Larutan cuplikan ditambahkan 3 tetes pereaksi NaOH 2 N, dihomogenkan, kemudian diukur spektrumnya. Pembuatan dan pembacaan spektrum dilakukan kembali setelah 5 menit untuk mengetahui kemungkinan terjadinya dekomposisi senyawa. Tahap III Serbuk Na asetat anhidrat ditambahkan ke dalam larutan cuplikan sedemikian rupa sehingga terdapat kira-kira 2 mm lapisan Na asetat anhidrat pada dasar kuvet. Campuran dikocok kemudian diukur spektrumnya. Tahap IV Serbuk H3BO3 anhidrat ditambahkan ke dalam larutan pada tahap III sedemikian rupa sehingga terdapat kira-kira 1 mm lapisan H3BO3 anhidrat pada dasar kuvet, lalu dicampur dan diukur spektrumnya. Tahap V Tiga tetes pereaksi AlCl3 5 % yang dibuat dengan jalan melarutkan 0,5 g kristal AlCl3 dalam 10 ml metanol, ditambahkan ke dalam larutan cuplikan kemudian diukur spektrumnya. Tahap VI Tiga tetes pereaksi HCl yang dibuat dengan melarutkan 1 ml HCl pekat ke dalam 10 ml air, ditambahkan ke dalam cuplikan yang telah ditambah dengan pereaksi AlCl3 pada tahap V, kemudian diukur spektrumnya.

47

3.4.2.7.2 Metode IR (Infra Merah) Isolat flavonoid diencerkan dengan sedikit pelarut etanol, kemudian dihomogenkan dengan pelat KBr hingga membentuk lapisan tipis dan dianalisa dengan menggunakan gelombang IR. 3.4.2.8 Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode Linoleat Tiosianat 3.4.2.8.1 Penyiapan Larutan Uji Diambil masing-masing 500 l larutan ekstrak konsentrasi 25 ppm, 50 ppm, dan 100 ppm dan isolat flavonoid konsentrasi 25 ppm, 50 ppm, dan 100 ppm. Masing-masing larutan dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah berturut-turut 2,5 ml larutan buffer fosfat 0,2 M (pH 7); 2,5 ml larutan asam linoleat (1,3% b/v); 1,0 ml aquadest; dan 0,25 ml larutan AAPH 46,6 mM dalam etanol 40%. Disiapkan pula kontrol negatif yaitu larutan yang tidak mengandung sampel uji maupun pembanding vitamin E. Selanjutnya diinkubasi dalam keadaan gelap pada suhu 500C. Pengambilan sampel dilakukan setiap satu jam selama 4 jam. 3.4.2.8.2 Penentuan Operating Time Diambil seri larutan ekstrak konsentrasi 50 ppm (konsentrasi tengah) yang telah diinkubasi bersama dengan asam linoleat pada suhu 500C. Diambil 0,1 ml larutan ekstrak tersebut, dimasukkan dalam labu takar 10,0 ml, kemudian ditambah berturut-turut dengan 0,1 ml larutan FeCl2 20 mM dalam HCl 3,5%; 0,1 ml larutan ammonium tiosianat 10% dan dicukupkan volumenya dengan etanol 75% menjadi 10 ml. Dihomogenkan dengan vortex. Diukur serapannya pada menit ke 0 sampai menit ke 15 pada 500 nm.

48

3.4.2.8.3 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Setelah pendiaman yang sesuai dengan operating time, larutan uji diukur pada 450-550 nm. 3.4.2.8.4 Penentuan Aktivitas Antioksidan Diambil seri ekstrak, isolat flavonoid, dan baku pembanding yang telah diinkubasi bersama dengan asam linoleat pada suhu 500C. Setiap 1 jam selama 4 jam, masing-masing larutan diambil 0,1 ml dan dimasukkan dalam labu takar 10,0 ml, kemudian ditambah berturut-turut dengan 0,1 ml larutan FeCl2 20 mM dalam HCl 3,5%; 0,1 ml larutan ammonium tiosianat 10% dan dicukupkan volumenya dengan etanol 75% menjadi 10 ml. Dihomogenkan dengan vortex, kemudian diukur serapannya pada maksimum.

3.5 Analisis Data Analisis data dikerjakan dengan cara menginterpretasikan hasil yang diperoleh dari : 1. Spektrofotometri UV-Vis berupa spektrum UV-Vis. 2. Spektrofotometri Infra Merah berupa spektrum IR. 3. Penentuan aktivitas antioksidan. Persentase aktivitas antioksidan yang diperoleh dibandingkan dengan uji statistik anava. Perhitungan persen aktivitas antioksidan menggunakan rumus sebagai berikut : % aktivitas antioksidan =A kontrol - A sampel A kontrol

Keterangan : A Kontrol = Absorbansi larutan asam linoleat tanpa penambahan antioksidan. A Sampel = Absorbansi ekstrak etanol, isolat, dan vitamin E.

49

Ditimbang 50 g serbuk daun mangga kering Dimaserasi dengan etanol 70 %

Filtrat I

Ampas Dimaserasi kembali dengan etanol 70%

Filtrat II, III, IV, V

Sisa serbuk

Semua fitrat dikumpulkan, kemudian dipekatkan dengan rotary vacum evaporator

Diperoleh ekstrak kental

Uji kualitatif

Isolasi senyawa flavonoid

Gambar 5. Skema Kerja Penyarian Simplisia Daun Mangga

Ekstrak etanol daun mangga identifikasi

fenolik

tanin

fenilpropanoid flavonoid

alkaloid

saponin

minyak atsiri

Gambar 6. Skema Kerja Uji Kualitatif Ekstrak

50

Ditimbang seksama 5 g ekstrak etanol daun mangga, kemudian dilarutkan dengan fase gerak BAA (n-butanol : asam asetat glasial : air) 4:1:5

Difraksinasi dalam kolom dengan fase diam silica G 60 F 254

Isolat ditampung dalam vial

Gambar 7. Skema Kerja Isolasi Flavonoid

Isolat flavonoid

Uji KLT Fase diam : silika gel GF 254 Fase gerak : BAA (4:1:5) Deteksi : uap amonia, UV 366 nm

Uji KLT 2 dimensi Fase diam : silika gel GF 254 Fase gerak : -BAA (4:1:5) -Asam asetat 15% Deteksi : uap amonia, UV 366 nm

Gambar 8. Skema Kerja Uji Kualitatif Isolat Flavonoid

Isolat flavonoid Identifikasi struktur

spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri IR

Gambar 9. Skema Kerja Identifikasi Struktur Flavonoid

51

500 l ekstrak etanol dan isolat flavonoid daun mangga (@ konsentrasi 25, 50, dan 100 ppm) dan vitamin E 1% (baku), @ dimasukkan dalam tabung reaksi

+ 2,5 ml buffer fosfat 0,2 M pH 7 + 2,5 ml asam linoleat 1,3% + 1,0 ml aquadest + 0,25 ml AAPH 46,6 mM dalam etanol 40%

Diinkubasi dalam keadaan gelap pada suhu 500C

Setiap 1 jam @ diambil 0,1 ml, dimasukkan labu takar 10 ml

+ 0,1 ml FeCl2 20 mM dalam HCl 3,5% + 0,1 ml ammonium tiosianat 10% + etanol 75% dicukupkan sampai 10 ml

Diambil konsentrasi tengah (50 ppm), diukur serapannya pada menit ke 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 pada 500 nm (penentuan operating time)

Setelah pendiaman yang sesuai dengan operating time, larutan uji diukur pada 450-550 nm (penentuan maks.)

Semua larutan uji diukur pada maks. sesuai dengan operting time

Pengukuran dilakukan setiap 1 jam selama 4 jam Gambar 10. Skema Kerja Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Metode Linoleat Tiosianat

DAFTAR PUSTAKA Afanasev, I.B., A.I. Dorozkho, A.V. Brodskii, V.A. Kostyuk, dan A.I Potapovitch. 1989. Chelating and Free Radical Scavening Mechanisms of Inhibitory Action of Rutin and Quercetin in Lipid Peroxidation. dalam : Biochemistry of Pharmacology. 38 (11) : 1736-1739. Bajpai, P. Dan P. K. Bajpai. 1993. Eicosapentaenoic acid production from microorganism : a review. J. of Biotechnol. 30 : 161-183. Belleville-Nabet, F. 1996. Zat Gizi Antioksidan Penangkal Senyawa Radikal Pangan dalam Sistem Biologis. dalam : Prosiding Seminar Senyawa Radikal dan Sistem Pangan : Reaksi Biomolekuler, Dampak terhadap Kesehatan dan Penangkalan. Pusat Studi Pangan dan Gizi IPB dan Kedubes Prancis-Jakarta. Day Jr., R.A. and Underwood, A.L. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. Diterjemahkan oleh Sopyan,I. Edisi keenam. Jakarta : Erlangga. Deman, J.M. 1997. Kimia Makanan. Diterjemahkan oleh Padmawinata, K. Edisi kedua. Bandung : ITB. Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta : Depkes RI. Fessenden, R.J and Fessenden, J.S. 1997. Kimia Organik. Diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, A.H. Jilid I. Edisi ketiga. Jakarta : Erlangga. Hanani, E., Munim, A., Sekarini, R., dan Wiryowidagdo.2005. Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons Callyspongia Sp Dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian. Vol II. (3). 127-133. Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Terbitan kedua. Bandung : ITB. Huguet, A.L., S. Manez, dan M.J. Alacaraz. 1990. Superoxide Scavening Properties of Flavonoids in Non-Enzymic System. dalam : Z.Naturforsch. 45c : 19-24. Lampe, J.W. 1999. Health Effects of Vegetables and Fruit : Assessing Mechanisms of Action in Human Experimental Studies. dalam : The American Journal of Clinical Nutrition. 70 Suppl : 475S-490S. Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Diterjemahkan oleh Padmawinata, K. Bandung : ITB. Masibo, M. And He, Q. 2008. Major Mango Polyphenols and Their Potential Significance to Human Health. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. (7). 309-319.

52

53

Masibo, M. And He, Q. 2009. In Vitro Antimicrobial Activity and The Major Polyphenol in Leaf Extract of Mangifera indica L. Malaysian Journal of Microbiology. Vol 5 (2). 73-80. Morel, I., et al. 1993. Antioxidant and Iron-Chelating Activities of The Flavonoids Catechin, Quercetin and Diosmetin on Iron-Loaded Rat Hepatocyte Cultures. dalam : Biochemistry and Pharmacology. 45 : 1319. Roth, H.J. and Blaschke, G. 1994. Analisis Farmasi. Diterjemahkan oleh Kisman, S. Dan Ibrahim, S. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press. Sadikin, M. 2001. Pelacakan Dampak Radikal Bebas terhadap Makromolekul. dalam : Kumpulan Makalah Pelatihan : Radikal Bebas dan Antioksidan dalam Kesehatan. Jakarta : Fakultas Kedokteran UI. Sichel, G., C. Corsaro, M. Scalia, A.J. DiBilio, dan R. Bonomo. 1991. In Vitro Scavenger Activity of Some Flavonoids and Melanins Against O2. dalam : Free Radical Biology and Medicine. 11 : 1-8. Silverstein. 2002. Identification of Organic Compund, 3rd Edition. John Wiley & Sons Ltd. New York. Soeatmaji, D.W. 1998. Peran Stress Oksidatif dalam Patogenesis Angiopati Mikro dan Makro DM. dalam : Medica. 5 (24) : 318-325. Stavric, B. Dan T.I. Matula.1992. Flavonoids in Foods: Their Significance of Nutrition and Health. dalam : Lipid-Soluble Antioxidance : Biochemistry and Clinical Applications. A.S.H. Ong and Packer (Eds.). Basel/Switzerland : Birkhauser Verlag. Stefani, G. 2010. Tanaman Obat Indonesia Mangifera indica. file:///D:/daunmangga/TanamanObatIndonesiaMangiferaindica.htm. (24 November 2011). Supari,F. 1996. Radikal Bebas dan Patofisiologi Beberapa Penyakit. dalam : Prosiding Seminar Senyawa Radikal dan Sistem Pangan : Reaksi Biomolekuler, Dampak terhadap Kesehatan dan Penangkalan. Pusat Studi Pangan dan Gizi IPB dan Kedubes Prancis-Jakarta. Trevor, R., 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Diterjemahkan oleh Padmawinata, K. Bandung : ITB. Winarno, F.G. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Winarsi, H. 2008. Antioksidan Alami & Radikal Bebas Potensi dan Aplikasinya dalam Kesehatan. Yogyakarta : Kanisius.