PROPOSAL PENELITIAN GAMBUT

Potensi Isolat Bakteri dari Cairan Kantong Tumbuhan Nepenthes spp. di Hutan Rawa Gambut Desa Teluk Bakung, Kecamatan Sungai Ambawang,

Sebagai Penghasil Antibiotik

Tendi Wijaya

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Tanjungpura

Tahun 2019

DESKRIPSI PENELITIAN

Topik yang dipilih

Potensi diversifikasi dan peningkatan nilai tambah produk-produk dari lahan gambut (sektor pangan maupun non-pangan).

Judul

Potensi Isolat Bakteri dari Cairan Kantong Tumbuhan Nepenthes spp. di Hutan Rawa Gambut Desa Teluk Bakung, Kecamatan Sungai Ambawang, Sebagai Penghasil Antibiotik

Latar Belakang

Antibiotik merupakan zat kimia yang dihasilkan mikroorganisme yang dalam jumlah amat kecil

atau rendah bersifat merusak atau menghambat mikroorganisme lain (Pelezar & Chan, 1988).

Antibiotik mempunyai nilai ekonomi yang tinggi terutama di bidang kesehatan, karena kegunaanya

dalam mengobati berbagai penyakit infeksi. Penggunaan antibiotik yang sama secara terus

menerus dapat menyebabkan bakteri patogen menjadi resisten terhadap antibiotik itu sendiri.

Resistensi mikroba terhadap antibiotik menimbulkan masalah yang serius pada pengobatan

penyakit infeksi. Mikroba resisten menjadi sulit diobati dengan antibiotik yang ada, sehingga

menyebabkan penyakit menjadi semakin parah dan bahkan menyebabkan kematian pasien. Oleh

karena itu, pencarian antibiotik baru merupakan hal yang harus dilakukan untuk mengatasi hal

tersebut.

Eksplorasi bakteri penghasil antibiotika khususnya dalam bidang mikrobiologi hingga saat ini

masih terus dilakukan untuk mendapatkan isolat-isolat penghasil antibiotika yang baik. Hingga saat

ini sudah banyak substansi antibiotika yang diisolasi, namun baru sedikit diantaranya yang terbukti

bermanfaat dengan baik terutama dalam bidang kesehatan (Pelezar & Chan, 1998). Bakteri yang

berhasil menghasilkan antibiotika diperoleh dari berbagai jenis tanaman, salah satunya adalah

kantong semar atau Nepenthes sp.

Cairan kantong bersifat asam dan mengandung senyawa-senyawa seperti kinin, plumbagin,

nepentesin dan lainya. Namun cairan kantong tidak membunuh semua organisme yang memasuki

perangkap, setidaknya beberapa organisme seperti bakteri dapat bertahan dan berkembang biak

dalam perangkap kantong (Adlassniget al., 2011). Analisis komunitas bakteri dalam cairan kantong

beberapa tanaman kantong semar yang dikoleksi di daerah Kalimantan Timur, Bangka dan

Yogyakarta, diperoleh isolat bakteri dengan jumlah yang relatif tinggi. Hal ini menggambarkan

bahwa cairan kantong merupakan suatu reservoir yang baik bagi kehidupan bakteri (Yogiara, 2004).

Kalimantan merupakan pusat penyebaran kantong semar (Nepenthes spp.) terbesar di dunia.

Sebanyak 32 jenis Nepenthes spp. telah ditemukan di pulau Kalimantan (Borneo), 29 jenis di pulau

Sumatera, 10 jenis di Sulawesi, 9 jenis di Papua New Guinea, 4 jenis di Maluku dan hanya 2 jenis

yang ditemukan di pulau Jawa (Mansur, 2006). Berdasarkan survei yang telah dilakukan oleh

beberapa peneliti, Kalimantan Barat merupakan salah satu daerah yang memiliki tingkat keragaman

Nepenthes yang tinggi. Clarke (1997) melaporkan telah menemukan Nepenthes hirsuta di hutan

kerangas Kalimantan Barat. Tubali (2006) melaporkan telah menemukan 4 jenis Nepenthes spp. di

Taman Wisata Baning yaitu Nepenthes ampullaria, Nepenthes bicalcarata, Nepenthes rafflesiana

dan Nepenthes reinwardtiana. Sementara itu, Baloari et al., (2013) telah menemukan 3 spesies

Nepenthes di Gunung Semahung yaitu Nepenthes ampullaria, Nepenthes mirabilis dan Nepenthes

gracilis. Hutan rawa gambut menjadi habitat yang baik bagi berbagai jenis Nepenthes. Salah satu

habitatnya di hutan rawa gambut Desa Teluk Bakung, Kecamatan Sungai Ambawang, Kalimantan

Barat, namun belum ada informasi mengenai keberadaan bakteri penghasil antibiotik pada cairan

kantong Nepenthes spp.. Maka dari itu dilakukan penelitian ini.

Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut di dapatkan rumusan masalah yaitu bagaimana aktifitas bakteri

yang dapat diisolasi dari cairan kantong tumbuhan Nephentes spp. di hutan rawa gambut Desa

Teluk Bakung, Kecamatan Sungai Ambawang, Kalimantan Barat yang berpotensi menghasilkan

antibiotik ?

Tujuan Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah, tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui aktifitas bakteri yang

dapat diisolasi dari cairan kantong tumbuhan Nephentes spp. di hutan rawa gambut Desa Teluk

Bakung, Kecamatan Sungai Ambawang, Kalimantan Barat yang berpotensi menghasilkan antibiotik.

Temuan Baru Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh isolat lokal yang dijadikan dasar dalam upaya

identifikasi bakteri dari cairan kantong tumbuhan Nephentes spp. di hutan rawa gambut Desa Teluk

Bakung, Kecamatan Sungai Ambawang, Kalimantan Barat sebagai potensi penghasil antibiotik

secara alami yang dapat dijadikan sebagai alternatif antibiotik yang baru.

Metodologi

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan selama 3 bulan mulai dari bulan Mei hingga Juli 2019. Sampel cairan

kantong tumbuhan kantong semar Nepenthes spp. dikoleksi dari hutan rawa gambut Desa Teluk

Bakung, Kecamatan Sungai Ambawang, Kalimantan Barat. Kegiatan laboratorium dilaksanakan di

Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Tanjungpura, Pontianak, Kalimantan Barat.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah autoklaf, batang L, bunsen, botol coklat, cawan

petri, colony counter, cover glass, erlenmeyer, gelas arloji, gelas beker, gelas objek, gelas ukur,

gunting, hot plate, inkubator, jarum ose, Laminar Air Flow (LAF), lemari pendingin, magnetic stirer,

mikroskop, mikropipet, neraca analitik, pH meter digital, penjepit tabung reaksi, pinset, pipet tetes,

pipet ukur, plastik wayang, rak tabung, sentrifuges, shaker, skalpel, spuit, tabung Durham, tabung

reaksi, tabung sentrifuge, tabung ulir, termometer, termos, timbangan analitik, dan vortex.

Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel cairan kantong tumbuhan Nepenthes spp.,

akuades, alkohol 70%, ammonium hidroksida, asam asetat, biakan murni bakteri yaitu Escherichia

coli dan Staphylococcus aureus, hydrogen peroksida 3% , Iodium, Kristal violet, medium Methyl

Red, medium Nutrien Agar (NA), medium Nutrien Broth (NB), medium Simmon Citrate Agar (SCA),

medium Sulfit Indol Motility (SIM), medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA), medium cair Tripton 1%,

medium Urea Christensen Agar, reagen Kovacs dan safranin.

Objek yang Diamati

Objek yang diamati dalam penelitian ini yaitu semua jenis bakteri antibiotik sampel cairan

kantong tumbuhan kantong semar Nepenthes spp. di hutan rawa gambut Desa Teluk Bakung,

Kecamatan Sungai Ambawang, Kalimantan Barat yang akan dilakukan pengujian untuk mengetahui

potensinya sebagai antibiotik.

Prosedur Penelitian

Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel cairan kantong semar dilakukan berdasarkan metode purposif sampling.

Pengambilan sampel cairan Nepenthes spp. dilakukan dengan penuangan langsung cairan kantong

ke dalam botol sampel hingga tetes terakhir.

Isolasi Bakteri

Sampel cairan setiap kantong dihomogenkan dan dipipetkan sebanyak 1 ml ke medium

Nutrien Agar (NA) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24-48 jam, dilanjutkan dengan

pemurnian isolat bakteri dan pengamatan morfologi koloni bakteri. Produksi metabolit antibiotika

oleh bakteri hasil isolasi dilakukan dengan menumbuhkan dalam medium produksi antibakteri.

Hasil isolasi cairan kantong diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasikan ke dalam 25 mL medium

NA dan diinkubasi selama 24 jam, pre culture diambil sebanyak 10 ml isolat dan dipindahkan

kedalam tabung erlemeyer yang berisi 100 ml medium produksi antimikroba (main culture) dan

difermentasi selama 3 hari di atas pengocok orbital dengan kecepatan 150 rpm. Cairan hasil

fermentasi dimasukkan ke tabung sentrifuge 1,5 mL, lalu disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm

selama 1 menit. Supernatannya dipindahkan ke tabung baru, sedangkan endapan sel bakteri

dibuang.

Uji Pewarnaan Gram

Isolat aktif diletakkan di atas gelas objek lalu diratakan, fiksasi di atas lampu spiritus,

setelah dingin diteteskan cat Gram A (Kristal violet) 2-3 tetes selama 1 menit, kemudian dicuci

dengan air mengalir dan dikeringanginkan, ditetesi dengan Gram B (Iodium) selama 1 menit, dicuci

dengan air mengalir dan dikeringkananginkan, ditetesi dengan Gram C (Alkohol 70%) selama 30

detik, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Terakhir ditetesi dengan Gram D (Safranin)

selama 45 detik, lalu dicuci dengan air mengalir. Pengamatan ini dilakukan dengan melihat bentuk

dan warna sel di bawah mikroskop.

Uji Biokimia

a. Uji motilitas

Isolat murni biakan mikroba ditusukkan ke medium SIM (Sulfid Indol Motility) diinkubasikan

selama 24 jam, pada suhu 37°C, Bakteri motil ditandai dengan bakteri yang menyebar di sekitar

daerah tusukan berarti motilitas positif (Waluyo, 2008).

b. Uji katalase

Teteskan beberapa tetes larutan hydrogen peroksida 3% di atas gelas objek tersebut. Ambil

sedikit biakan isolat murni biakan bakteri dengan ose, diletakkan dalam tetesan hydrogen

peroksida diamati adanya gelembung-gelembung udara di dalam tetesan hydrogen peroksida di

bawah mikroskop, lakukan hal yang sama pada masing-masing isolat lainnya (Waluyo, 2008).

c. Uji Indol

Isolat bakteri diinokuasi pada medium cair Tripton 1% yang dimasukkan ke tabung reaksi

sebanyak 10 ml ,diinkubasikan selama 48 jam, pada suhu 37°C, diamati terjadinya Indol dengan

menambahkan 0,2-0,3 ml reagen Kovac ke dalam setiap tabung. Adanya Indol dapat diketahui

dengan timbulnya warna merah tua pada lapisan atas permukaan medium (Waluyo, 2008).

d. Uji Metil Merah

Medium Metil Merah dimasukkan ke dalam sebanyak 10 ml, tabung diisi dengan isolat

murni biakan mikroba, diinkubasikan selama 5-7 hari pada suhu 37°C, ditambahkan 5 tetes

pereaksi metil merah, diamati perubahan yang terjadi. Bila terjadi warna merah berarti bakteri

tersebut memproduksi asam (Waluyo, 2008).

e. Uji Sitrat

Isolat biakan murni diinokulasi pada media SCA (Simmons Citrat Agar) dengan inokulum

tipis, diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C, diamati perubahan yang terjadi. Bila hasilnya

positif medium berubah warna dari hijau menjadi biru (Waluyo, 2008).

f. Produksi H2S

Isolat murni ditusuk secara lurus dan digores ke medium miring Triple Sugar Iron Agar

(TSIA), diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C, diamati terjadinya produksi H2S yang

ditunjukkan oleh adanya warna hitam di sepanjang tusukan pada medium (Waluyo, 2008).

g. Hidrolisis Urea

Isolat bakteri dimasukkan ke dalam medium Medium Urea Christensen Agar,

diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C. Bila positif menghidrolisis urea maka terjadi

perubahan warna menjadi (Waluyo, 2008).

h. Uji Pertumbuhan Pada Beberapa Variasi Suhu

Isolat murni biakan bakteri diinokulasi ke medium Nutrien Broth (NB), diinkubasikan selama

24 jam di dalam lemari es pada suhu 4°C, dilakukan hal yang sama untuk suhu inkubasi 25°C dan

37°C, di dalam inkubator (Waluyo, 2008).

i. Uji Pertumbuhan Pada Beberapa Variasi pH

Isolat biakan bakteri diinokulasi ke dalam medium Nutrien Broth (NB) yang ditambahkan

asam asetat hingga pH 3, diinkubasikan selama 24 jam dalam inkubator, dilakukan hal yang sama

dengan penambahan ammonium hidroksida hingga pH 10 dan pada masing-masing isolat lainnya.

Bila hasil positif terjadi kekeruhan pada medium dan dibandingkan dengan kontrol (Waluyo, 2008).

Uji Antibiotik Isolat Bakteri

Pengujian kemampuan antibiotika isolat hasil isolasi, mengacu kepada metode kertas

cakram. Masing-masing 1 mL suspensi (10-7 sel/ml) bakteri E. coli dan S. aureus ditebarkan pada

permukaan 15 mL medium NA dalam cawan petri (spread plate). Tempatkan kertas cakram yang

telah direndam dengan supernatan bakteri hasil isolasi di atas medium NA. Proses inkubasi

dilakukan pada suhu 37oC (sesuai dengan suhu optimum bakteri uji) selama 24 jam. Bakteri yang

memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa antibiotika menunjukkan adanya zona bening

(zona hambatan) di sekitar koloni bakteri uji. Kemudian, dilakukan pengukuran diameter daerah

bebas bakteri (zona bening) yang terbentuk di sekitar kertas cakram.

Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif berdasarkan hasil yang diperoleh, seperti

perhitungan diameter zona hambat.

Luaran Publikasi

Hasil penelitian ini diharapkan dapat dipublikasikan pada jurnal internasional berdasarkan atas

keanekaragaman lokal dari hutan rawa gambut Desa Teluk Bakung, Kecamatan Sungai Ambawang,

Kalimantan Barat.

Pustaka

Adlassnig, W., M. Peroutka & T. Lendl. 2011. Traps of carnivorous pitcher plants as a habitat:

composition of the fluid, biodiversity and mutualistic activities. J. Annals of Botany. 107;

181–194

Baloari, G., R. Linda dan Mukarlina. 2013. Keanekaragaman Jenis dan Pola Distribusi Nepenthes

spp di Gunung Semahung Kecamatan Sengah Temila Kabupaten Landak. Protobiont 2

(1): 1-6

Clarke, C. 1997. Nepenthes of Borneo. Sabah: Natural History Publish

Pelczar, M.J. and E.C.S. Chan. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Univ. Indonesia. Jakarta

Tubali. 2006. Eksplorasi Sumber Daya Alam Kalimantan Barat. http://www.borneo.com/explor

asi/abs_1023. diakses 29 September 2015

Yogiara. 2004. Analisis komunitas bakteri cairan kantong semar (Nepenthes spp.) menggunakan

teknik TerminalRestriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) dan

AmplifiedRibosomal DNA Analysis (ARDRA). Tesis. Instistut Pertanian Bogor. Bogor

Waluyo. 2008. Metode Analisis Mikrobiologi. Universitas Muhammadiyah Malang Press. Malang

RENCANA ANGGARAN BELANJA (RAB)

Anggaran Biaya

No Jenis Pengeluaran Biaya (Rp)

1. Peralatan penunjang 7.412.000

2. Bahan habis pakai 1.165.000

3. Perjalanan 400.000

4. Lain-lain 3.100.000

Jumlah 12.077.000

Rincian RAB

1. Peralatan Penunjang

Material Justifikasi

Pemakaian Volume

Harga

Satuan (Rp)

Jumlah

Biaya (Rp)

Tabung

reaksi

Tempat

pengenceran

sampel

30 unit

9.000

270.000

Tabung ulir Tempat suspense

bakteri 20 unit 30.000 600.000

Jarum ose Memindahkan

bakteri 5 unit 15.000 75.000

Rak tabung

reaksi

Tempat tabung

reaksi 3 unit 30.000 90.000

Cawan petri Tempat isolate

bakteri 30 unit 35.000 1.050.000

Penjepit

tabung reaksi

Untuk menjepit

tabung reaksi saat

fiksasi

10 unit

9.000

90.000

Gelas beker

50 ml

Tempat larutan

dan pembuatan

media

3 unit

26.000

78.000

Gelas beker

500 ml

Tempat larutan

dan pembuatan

media

2 unit

90.000

180.000

Bunsen Untuk

mensterilisasi alat 2 unit 82.000 82.000

Plastic

wayang

Untuk

membungkus

isolate bakteri

4 pack

30.000

120.000

Vortex Untuk

menghomogenkan

suspensi

1 unit

100.000

100.000

Pinset Pengambilan

Isolat 3 unit 10.000 30.000

Skalpel

Pengambilan Isolat

3 unit 15.000 45.000

Gunting Memotong alat

dan bahan 3 unit 5.000 15.000

LAF

(Laminar Air

Flow)

Tempat perlakuan

isolate bakteri

1 unit

100.000

100.000

Inkubator Penyimpan isolate

bakteri 1 unit (Sewa) 100.000 100.000

Colony

counter

Menghitung

jumlah koloni

bakteri

1 unit

100.000

100.000

Hot plate Memanaskan

bahan dan media 1 unit 100.000 100.000

Magnetic

stirer

Menghomogenkan

media 1 unit 50.000 50.000

Mikropipet Memindahkan

suspensi 1 unit 50.000 50.000

Pipet ukur Mengukur dan

memindahkan

larutan

1 kotak

90.000

90.000

Pipet tetes Pengambil larutan 1 kotak 80.000 80.000

Labu

Erlenmeyer

Pyrex 50 ml

Tempat

penyimpanan

media

3 unit

60.000

180.000

Labu

Erlenmeyer

Pyrex 100 ml

Tempat

penyimpanan

media

2 unit

75.000

150.000

Labu

Erlenmeyer

Pyrex 250 ml

Tempat

penyimpanan dan

pembuatan media

3 unit

85.000

255.000

Labu

Erlenmeyer

Pyrex 500 ml

Tempat

penyimpanan dan

pembuatan media

2 unit

140.000

280.000

Labu

Erlenmeyer

Pyrex 1000

ml

Tempat

penyimpanan dan

pembuatan media

2 unit

160.000

320.000

Neraca

analitik

Menimbang

media 1 unit 100.000 100.000

Autoklaf Sterilisasi alat dan

bahan 1 unit (Sewa) 100.000 100.000

Shaker Menghomogenkan

larutan 1 unit 100.000 100.000

Gelas ukur 10

ml

Mengukur larutan 3 unit 60.000 180.000

Gelas ukur

500 ml

Mengukur larutan 1 unit 230.000 230.000

Tabung

Durham

Untuk uji H2S 20 unit 5.000 100.000

Batng L-

Pyrex

Menyebarkan

cairan

dipermukaan

media

2 unit

25.000

50.000

Gelas arloji

150 mm

Menimbang

media 2 unit 55.000 110.000

pH meter

digital

Mengukur pH

pada lingkungan 1 unit 420.000 420.000

Termos Tempat

pengambilan

sampel

3 unit

120.000

360.000

Termometer Mengukur suhu di

lokasi

pengambilan

sampel

1 unit

30.000

30.000

Spuit 2 cc Memindahkan

cairan 10 unit 4.000 40.000

Mikroskop Biaya perawatan 1 unit 100.000 100.000

Cover glass Perlakuan fiksasi

isolat 1 kotak 80.000 80.000

SUB TOTAL (Rp) 7.412.000

2. Bahan Habis Pakai

Material Justifikasi

Pemakaian Volume

Harga

Satuan (Rp)

Jumlah

Biaya (Rp)

NA (Nutrient

Agar)

Media

pertumbuhan bakteri

100 gram

3.500

350.000

Alkohol 70%

Untuk aseptis di Laboratorium dan

5 Liter 27.000 135.000

uji pewarnaan gram

Spiritus Bahan bakar bunsen

2 botol 35.000 70.000

Kristal Violet

Untuk uji pewarnaan gram

10 ml 1.000 10.000

Iodium Uji pewarnaan gram

10 ml 1.000 10.000

Safranin Untuk uji pewarnaan gram

10 ml 1.500 15.000

TSIA (Triple Iron

Sugar

Agar)

Uji H2S 10 gram

4.000

40.000

SIM ( Sulfide

Indol

Motility )

Untuk uji

motilitas

10 gram

6.000

60.000

NB (Nutrien Broth)

Untuk uji pertumbuhan bakteri

10 gram 2.500 25.000

SCA

(Simmon

Citrate

Agar)

Media untuk uji

Sitrat

20 gram

6.000

120.000

Media Methyl Red

Untuk uji metil merah

10 ml

5.000

50.000

Tripton Untuk uji Indol

10 ml

20.000

200.000

Medium Urea Christensen Agar

Untuk uji Hidrolisis Urea

20 gram

2.500

50.000

Kapas Penyerap larutan

atau sisa

akuades yang

berlebihan

2 kotak

15.000

30.000

SUB TOTAL (RP) 1.165.000

3. Perjalanan

Material Justifikasi

Pemakaian Volume

Harga Satuan

(Rp)

Jumlah

Biaya (Rp)

Perjalanan pergi ke

wilayah hutan rawa

gambut desa Teluk

Bakung,

kecamatan Sungai

Ambawang,

Kalimantan Barat

Survei

lokasi

sekaligus

pelaksanaan

penelitian

1 Orang 200.000 200.000

Perjalanan pulang ke

Pontianak,

Kalimantan Barat

Pulang ke

kediaman

1 Orang 200.000 200.000

SUB TOTAL (Rp) 400.000

4. Lain-lain

Material Justifikasi

Pemakaian Volume

Harga Satuan

(Rp)

Jumlah

Biaya (Rp)

Alat tulis Untuk menulis 1 unit 50.000 50.000

Print Pembuatan

print out

laporan

1 rangkap 50.000 50.000

Biaya Publikasi Untuk

Menerbitk

an Jurnal

1 unit 3.000.000 3.000.000

SUB TOTAL (Rp) 3.100.000

Total (Keseluruhan) 12.077.000