Produksi Metabolit Sekunder I-2

33
PRODUKSI METABOLIT SEKUNDER DENGAN KULTUR JARINGAN TANAMAN DR. GEMINI ALAM, MSi, Apt.

description

presentasi ttg metabolit

Transcript of Produksi Metabolit Sekunder I-2

Page 1: Produksi Metabolit Sekunder I-2

PRODUKSI METABOLIT SEKUNDER DENGAN KULTUR JARINGAN

TANAMAN

DR. GEMINI ALAM, MSi, Apt.

Page 2: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Arti judul kuliah

• PRODUKSI : Membuat produk dengan metode tertentu

• METABOLIT SEKUNDER: Produk sekunder yang dibiosintesis oleh tumbuhan tertentu

• KULTUR JARINGAN TANAMAN: Teknologi penumbuhan sel, kumpulan sel, jaringan, atau organ pada/dalam media tertentu secara aseptis.

Page 3: Produksi Metabolit Sekunder I-2

LINGKUP KJT

PROPAGASI

KULTUR JARINGAN TANAMAN

PRODUKSI BIOKEMIKAL

DE NOVO SINTESIS

PERBAIKAN GENETIK

HIBRIDISASI SOMATIK

BIOKONVERSI

KRIOPRESERVASI

TANAMAN BEBAS PATOGEN

SINTESIS DARI PRAZAT

Page 4: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Menurut Dodds dan Roberts (1982) salah satu syarat keberhasilan pada kultur jaringan:

• Pemilihan media, baik komposisi maupun jumlahnya.

• Apabila media yang dipakai sesuai, jaringan yang ditanam akan berkembang dan membentuk kalus.

Kalus adalah massa sel yang tidak terdiferensiasi, terdiri dari sel-sel parenkim yang muncul dari sel-sel jaringan induk yang sedang membelah, dan biasanya terjadi di tempat irisan untuk menutup luka dalam media

Page 5: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Penggunaan teknik KJT kemungkinan dapat diperoleh:

• Metabolit sekunder yang identik atau berbeda dengan metabolit sekunder tanaman asal

• kadang-kadang tidak mampu menghasilkan senyawa spesifik dari tanaman asalnya

• Kadar yang dihasilkan dapat sama, lebih besar ataupun lebih kecil dari kadar tanaman asalnya

Page 6: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Beberapa senyawa yang sudah berhasil diproduksi

dengan KJT • Sikonin• Antrakinon• Diosgenin• Asam rosmarinat• Reserpina• Atropina• Capsaisin• Artemisinin

• Lithospermum erythrorrhizon

• Morinda citrifolia• Dioscorea deltoidea• Coleus blumei• Catharanthus roseus• Coptis japonicum• Capsicum frutescens• Artemisia annua

Page 7: Produksi Metabolit Sekunder I-2

• Alam dkk. (1995) tidak menemukan adanya kuasinoid bruseolid (ZAT PAHIT) dalam kultur suspensi sel Brucea javanica (L.) Merr., tetapi justru menemukan alkaloid indol tipe kantina 6-on, dimana senyawa ini tidak didapatkan dalam tanaman asal. Demikian halnya morfin, tidak diperoleh dalam kultur jaringan Papaver somniferum (Kamo dkk. dalam Staba, 1982), solasodin dalam kultur jaringan Solanum mammosum (Isnaeni dkk., 1986).

SINTESIS DE NOVO PADA KJT

Page 8: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Hormon tumbuh

NH

COOH

Indole-3-Acetic Acid (IAA)

O COOH

Cl

Cl

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

COOH

α-Naphtaleneacetic acid (NAA)

N

N NH

N

NH2

AdeninKinetin sintesis

N

N NH

N

HN O

Page 9: Produksi Metabolit Sekunder I-2

• Dalam upaya produksi metabolit sekunder lebih disukai apabila digunakan kultur suspensi sel, yaitu mendispersikan sejumlah kalus yang meremah (friable) ke dalam media cair. Sel-sel dalam media cair tersebut, selanjutnya melakukan kontak dan berinteraksi dengan bahan kimia yang terdapat dalam media.

• Selain itu Kultur tunas (Shoot Culture) dan Kultur akar (Root culture) dpt digunakan untuk produksi ms tertentu

Page 10: Produksi Metabolit Sekunder I-2

ALUR KERJA PEMBUATAN KULTUR SUSPENSI SEL

EKSPLAN KULTUR KALUS

SUBKULTUR KALUS SUBKULTUR KALUS

KULTUR SUSPENSI SEL

SUBKULTUR SUSPENSI SEL

PENGERINGAN PEMANENAN BIOMASSA

ISOLASI ANALISIS KUALITATIF & KUANTITATIF

Page 11: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Eksplan

1 minggu 2 minggu

Sterilkan :

•Clorox/Bayclean (NaOCl 5,25%)

•Ethanol 70%

•HgCl2

Page 12: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Ruang Inkubasi Kultur

Lampu TL 40 W

(25 ± 3)°C

Page 13: Produksi Metabolit Sekunder I-2

INISIASI KULTUR SUSPENSI SEL

Page 14: Produksi Metabolit Sekunder I-2

PEMBUATAN KULTUR KALUSPEMBUATAN KULTUR KALUS

BUAHsterilisasi

Bayclin 30 %

Bilas

H2O steril

5' 15'3'

MS-A2,4-D 1 mg/lKin 0,1mg/l

MS-B MS-D MS-E MS-F2,4-D 1 mg/lKin 1mg/l Kin 0,1mg/l Kin 0,5 mg/l Kin 1mg/l

NAA 1 mg/lNAA 1 mg/l NAA 1 mg/l

Pertambahanbobot tertinggi

MS-C2,4-D 2 mg/l

inkubasi8 minggu

BIJI STERIL

Page 15: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Tr-0 Tr-10 Tr-20 Tr-40 Tr-80 A1N2 A2N2 A3N1 A4 A1N3 N4

Praperlakuan

subkulturtiap 10 hari

2,4-D 0,2 mg/lMedia suspensi

MS-C2,4-D 2 mg/l KULTUR SUSPENSI SEL

dicampur homogen

25 ml biomasa sel

25 mlbiomasa sel

inokulum

Media cair perlakuan

PEMBUATAN KULTUR SUSPENSI SELPEMBUATAN KULTUR SUSPENSI SEL

Page 16: Produksi Metabolit Sekunder I-2

INISIASI KULTUR SUSPENSI SEL

• Bahan awal adalah kalus yang meremah (friable).

• Media yang digunakan adalah media cair (tanpa agar).

• Wadah berupa labu erlenmeyer .

• Labu erlenmeyer yang digunakan hanya diisi media seperlima kapasitas.

• Zat pengatur tumbuh (mis,

2,4-D) ditambahkan sebanyak sepersepuluh kadar dalam media padat.

Page 17: Produksi Metabolit Sekunder I-2

Eksplan hingga suspensi sel

Page 18: Produksi Metabolit Sekunder I-2

KONDISI KULTUR SUSPENSI SEL

• Digojog berputar pada penggojog-berpusing (gyrotory shaker), disebut aerasi.

• Kecepatan berpusing 80-100 rpm, dengan simpangan ± 3 cm.

• Suhu ruang inkubasi (25 ± 3)°C.

• Pencahayaan dengan lampu TL-day light 40 w atau gelap.

• Subkultur dilakukan setiap sekitar 7 hari, setelah diketahui kurva pertumbuhannya.

• Pengukuran tinggi enapan dengan alat tertentu.

Page 19: Produksi Metabolit Sekunder I-2

ROTARY SHAKER

Page 20: Produksi Metabolit Sekunder I-2

ALAT PENGUKUR TINGGI ENAPAN SUSPENSI SEL

(GAMBAR SKEMATIS)

Page 21: Produksi Metabolit Sekunder I-2

SUBKULTUR SUSPENSI SEL

• Suspensi sel dienapkan, bila tidak terjadi kontaminasi cairan di atas enapan jernih.

• Secara aseptis media lama dituang, kemudian diganti dengan media segar sebanyak 2 kali volum media yang dituang, dipindah dalam wadah dengan kapasitas 2xlipat.

• Wadah media ditutup kembali dan diinkubasikan pada penggojog-berpusing.

• Subkultur diulang sampai diperoleh biomassa yang dikehendaki.

Page 22: Produksi Metabolit Sekunder I-2

PEMBUATAN KURVA PERTUMBUHAN

• Diukur tinggi enapan pada saat inisiasi kultur suspensi sel

• Diukur tinggi enapan setelah setiap 3-5 hari.

• Disarankan agar kultur suspensi sel sudah dalam wadah dengan kapasitas 250-300 ml.

• Pengukuran endapan dengan alat, dihitung sampai mm saja.

• Buat poligon antara waktu versus tinggi enapan.

Page 23: Produksi Metabolit Sekunder I-2

GAMBARGAMBAR KURVA PERTUMBUHANKURVA PERTUMBUHAN

Biomasa (g bbkBiomasa (g bbk) )

stationary phasestationary phase

lag phase lag phase

death phasedeath phase

log phaselog phase

Waktu (hari)Waktu (hari)

Page 24: Produksi Metabolit Sekunder I-2

PENDEKATAN UNTUK PENDEKATAN UNTUK MENINGKATKAN PRODUK MENINGKATKAN PRODUK

Optimisasi kondisi kulturOptimisasi kondisi kultur Seleksi galur sel unggulSeleksi galur sel unggul Penambahan prekursor (prazat)Penambahan prekursor (prazat) ElisitasiElisitasi Penerapan sel amobilPenerapan sel amobil Sekresi produkSekresi produk MutagenesisMutagenesis Kultur organ dan kultur akar berambutKultur organ dan kultur akar berambut

Page 25: Produksi Metabolit Sekunder I-2

OPTIMISASI KONDISI KULTUROPTIMISASI KONDISI KULTUR

1. MEDIUM1. MEDIUM a. manipulasi nutrien (makro dan/ mikro)a. manipulasi nutrien (makro dan/ mikro) b. manipulasi zat pengatur pertumbuhanb. manipulasi zat pengatur pertumbuhan c. manipulasi zat organik tambahanc. manipulasi zat organik tambahan

2. SUHU, pH, CAHAYA, OKSIGEN2. SUHU, pH, CAHAYA, OKSIGEN 3.KULTUR DNG KERAPATAN SEL TINGGI3.KULTUR DNG KERAPATAN SEL TINGGI 4. PENJERAPAN PRODUK (misalnya 4. PENJERAPAN PRODUK (misalnya

dengan XAD-7)dengan XAD-7)

Page 26: Produksi Metabolit Sekunder I-2

SELEKSI GALUR SEL YANG SELEKSI GALUR SEL YANG PRODUKTIVITAS TINGGIPRODUKTIVITAS TINGGI

DENGAN PENERAPAN KLONING SELDENGAN PENERAPAN KLONING SEL DENGAN DENGAN AGAR PLATINGAGAR PLATING

SELEKSI DAPAT DILAKSANAKAN SECARA SELEKSI DAPAT DILAKSANAKAN SECARA MANUAL ATAU INSTRUMENTALMANUAL ATAU INSTRUMENTAL

a. Manual: melihat warna dan bentuk agregat a. Manual: melihat warna dan bentuk agregat atau koloni sel untuk penghasil m.s. bewarna.atau koloni sel untuk penghasil m.s. bewarna.

b. Dengan alat yang peka, misalnya dengan b. Dengan alat yang peka, misalnya dengan metode RIA dan ELISA. metode RIA dan ELISA.

Page 27: Produksi Metabolit Sekunder I-2

PENAMBAHANAN PRAZAT dan PENAMBAHANAN PRAZAT dan BIOTRANSFORMASIBIOTRANSFORMASI• Berdasarkan biosintesis ms dapat Berdasarkan biosintesis ms dapat

diumpankan prazat untuk menjadi produk diumpankan prazat untuk menjadi produk yang lebih cepat dengan kultur suspensi yang lebih cepat dengan kultur suspensi sel.sel.

• Mengubah senyawa awal menjadi Mengubah senyawa awal menjadi senyawa baru yang lebih bermanfaat senyawa baru yang lebih bermanfaat dengan pertolongan suspensi sel.dengan pertolongan suspensi sel.

• Mengubah senyawa tertentu menjadi Mengubah senyawa tertentu menjadi senyawa lain untuk menggantikan reaksi senyawa lain untuk menggantikan reaksi dengan kultur suspensi sel.dengan kultur suspensi sel.

Page 28: Produksi Metabolit Sekunder I-2

PERLAKUAN DENGAN ELISITOR PERLAKUAN DENGAN ELISITOR (ELISITASI)(ELISITASI)

• Elisitor adalah senyawa asing yang Elisitor adalah senyawa asing yang bila dikenakan pada sel tumbahan bila dikenakan pada sel tumbahan maka sel tersebut akan maka sel tersebut akan menghasilkan fitoaleksin.menghasilkan fitoaleksin.

• Senyawa tersebut dapat berasal dari Senyawa tersebut dapat berasal dari dinding sel kapang.dinding sel kapang.

• Pembuatan elisitor dapat dengan Pembuatan elisitor dapat dengan autoclaving kapang atau homogenat autoclaving kapang atau homogenat kapang.kapang.

Page 29: Produksi Metabolit Sekunder I-2

CONTOH ELISITASI DALAM CONTOH ELISITASI DALAM KULTUR SUSPENSI SELKULTUR SUSPENSI SEL

• Peningkatan produksi diosgenin dengan Peningkatan produksi diosgenin dengan ekstrak khamir (ekstrak khamir (yeast extractyeast extract) dalam kss ) dalam kss Dioscorea deltoidea.Dioscorea deltoidea.– Peningkatan produksi alkaloid dengan Peningkatan produksi alkaloid dengan

homogenat kapang homogenat kapang Botyris sp. Botyris sp. dalam dalam kss kss Papaver somniferum. Papaver somniferum.

• Peningkatan kadar asam rosmarinat Peningkatan kadar asam rosmarinat dengan ekstrak khamir dalam kss dengan ekstrak khamir dalam kss Lithospermum erythrorhizon.Lithospermum erythrorhizon.

Page 30: Produksi Metabolit Sekunder I-2

PENJERAPAN SEL AMOBILPENJERAPAN SEL AMOBIL

• Bahan awal adalah kultur suspensi sel yang Bahan awal adalah kultur suspensi sel yang seragam.seragam.

• Sel-sel dibuat amobil dengan teknik Sel-sel dibuat amobil dengan teknik penjerapan.penjerapan.

• Dalam bentuk matriks, sel-sel akan mengalami Dalam bentuk matriks, sel-sel akan mengalami hambatan untuk reorganisasi dan diferensiasi.hambatan untuk reorganisasi dan diferensiasi.

• Dalam keadaan dijerap sel mengalami Dalam keadaan dijerap sel mengalami hambatan dalam transfer massa.hambatan dalam transfer massa.

• Amobilisasi sel dapat digunakan sebagai Amobilisasi sel dapat digunakan sebagai alternatif dalam mengatasi problem dalam alternatif dalam mengatasi problem dalam produksi ms dalam sekala besar dengan tenik produksi ms dalam sekala besar dengan tenik kss.kss.

Page 31: Produksi Metabolit Sekunder I-2

SEKRESI PRODUKSEKRESI PRODUK

• Kebanyakan ms dihasilkan dalam kss Kebanyakan ms dihasilkan dalam kss diakumulasi intraselular.diakumulasi intraselular.

• Hal ini menghambat produksi ms selanjutnya.Hal ini menghambat produksi ms selanjutnya.• Perlu dicari upaya untuk mengsekresi produk Perlu dicari upaya untuk mengsekresi produk

ke medium.ke medium.• Caranya: Caranya:

– Menambahkan DMSO atau Triton X-100Menambahkan DMSO atau Triton X-100– ElektroporasiElektroporasi– UltrasonifikasiUltrasonifikasi– Mengungkapkan mekanisme akumulasi produk Mengungkapkan mekanisme akumulasi produk

dalam sel.dalam sel.

Page 32: Produksi Metabolit Sekunder I-2

MUTAGENESISMUTAGENESIS• Seleksi mutan dilakukan dengan Seleksi mutan dilakukan dengan

pengumpanan dengan senyawa yang pengumpanan dengan senyawa yang bukan metabolit (antimetabolit).bukan metabolit (antimetabolit).

• Sel yang tahan (tetap hidup) Sel yang tahan (tetap hidup) terhadap antimetabolit dipilih dan terhadap antimetabolit dipilih dan dianggap sebagai mutan.dianggap sebagai mutan.

• Mutan digunakan sebagai sel awal Mutan digunakan sebagai sel awal yang diharapkan dapat memproduksi yang diharapkan dapat memproduksi ms tinggi. ms tinggi.

Page 33: Produksi Metabolit Sekunder I-2

KULTUR ORGAN DAN KULTUR KULTUR ORGAN DAN KULTUR AKAR BERAMBUT (HAIRY ROOT AKAR BERAMBUT (HAIRY ROOT CULTURES)CULTURES)• KULTUR ORGAN: AKAR DAN TUNAS (KULTUR ORGAN: AKAR DAN TUNAS (SHOOTSHOOT))

• KULTUR AKAR BERAMBUT: KULTUR AKAR BERAMBUT:

- dengan menggunakan - dengan menggunakan Agrobacterium Agrobacterium rhizogenesrhizogenes

- - diharapkan akan memproduksi ms diharapkan akan memproduksi ms tinggitinggi

- ingat tentang “Dinamika Sel” - ingat tentang “Dinamika Sel”

TotipotenTotipoten