Prens Hibah DrI

44
Penelitian Hibah Doktor (Sebagian dari Penelitian Disertasi) Tri Dewanti W- S3 MIPA Aktifitas Ekstrak Air Cincau Hitam (Mesona palustris BL) Sebagai Immunomodulator dan Kemoterapi Kanker Fibrosarkoma Pada Mencit Secara in vivo

Transcript of Prens Hibah DrI

Page 1: Prens Hibah DrI

Penelitian Hibah Doktor(Sebagian dari Penelitian Disertasi)

Tri Dewanti W- S3 MIPA

Aktifitas Ekstrak Air Cincau Hitam (Mesona palustris BL) Sebagai Immunomodulator

dan Kemoterapi Kanker Fibrosarkoma

Pada Mencit Secara in vivo

Page 2: Prens Hibah DrI

LATAR BELAKANG Cincau hitam (Mesona palustris

BL) adlh makanan tradisional yg biasa digunakan untuk minuman es campur

Secara empiris cincau hitam dipercaya berkhasiat untuk :

Hipertensi Diare Sariawan/Panas Dalam Diabetes

Pembuktian/penelitian secara ilmiah masih sangat terbatas.

Page 3: Prens Hibah DrI

Hasil penelitian di Cina-Taiwan Hsian tsao (Sejenis cincau hitam Cina ) = Mesona procumbens Hemsl, bersifat antioksidanSenyawa antioksidan hsian tsao terdiri dari : fenol, stigmasterol, β-sitosterol, oleanolic acid dan ursolic acid (Hung dan Yen, 2001) ekstrak etil asetat hsian tsao aktf. Antioksidannya lebih tinggi dari pd α-tokoferol dan BHA (Hung dan Yen,2002)

Senyawa fenol hsian tsao terdiri dari : protocatechuic acid, β-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, caffeic acid dan syringic acid (Hung and Yen, 2002).

Page 4: Prens Hibah DrI

Senyawa fenol mempunyai efek positif terhadap respon proliferatif dan sitolitik sel limfosit tetapi bersifat anti-proliferatif dan toksik terhadap sel kanker (Tang dan Eisenbrand, 1992).

Yen and Hsieh (2000), bahwa ekstrak hsian tsao mampu melindungi sel limfosit dari kerusakan DNA akibat terpapar hidrogen peroksida dan UV.

Yen et al (2001), kandungan fenol dan senyawa bioaktif lain pada ekstrak air hsian-tsao terbukti mempunyai aktiv. antimutagenik

Page 5: Prens Hibah DrI

Caffeic acid selain bersifat antioksidan juga bersifat antikarsinogenik, antivirus dan imunomodulator pada sistim imun mencit (Park et al. 2004) .

Caffeic acid senyawa fenol yg dominan pd hsian-tsao (Hung & Yen, 2002)

water extract of hsian-tsao ternyata juga dpt melindungi kerusakan hati tikus yang diinduksi dengan tert-Butyl Hydroperpxide (Yen et al. (2004)

water extract of hsian-tsao sebagai antihipertensi dan antidiabetes pada tikus dgn dosis 0,1 ; 0,5; dan 1,0 g/kg BB (Yeh et al. 2008; Yang et al. 2008) Bagaimana dengan cincau hitam

(Mesona palustris BL) dari Indonesia ?

Page 6: Prens Hibah DrI

Herba meniran (Phyllanthus niruri) mengandung senyawa alkaloid, triterpen

atau steroid, flavonoid, dan polifenol bersifat sebagai imunostimulator pada penderita TB Paru (Suprapto Maat, 1997).

Pemberian meniran (Phyllanthus niruri) berfungsi sbg imunostimulator dapat meningkatkan status imunologi penderita dengan kenaikan kadar IFN-γ ( Amin, 2007).

Senyawa polifenol bersifat sbg imunomodulator yaitu dpt menghambat mitogen dan menstimulasi proliferasi peripheral blood mononuclear cells (PBMC), produksi Ig , IL-2 dan IFN-γ (Vinardell & Mitjaans ,2008)

Page 7: Prens Hibah DrI

Imunomodulator sistem imun tubuh lebih aktif dalam menjalankan fungsinya. Sistem imun tubuh penting dlm pencegahan dan penghambatan thdp pnykt kanker.

Secara teoritis, meningkatnya produksi IFN- γ meningkatkan komponen immune surveillance yaitu aktivitas sel NK yang berfungsi sebagai pertahanan lini terdepan terhadap kanker, juga peningkatan fungsi sel T sitotoksis (CD 8+) dan makrofage.

Peningkatan IFN- γ selain membantu dalam menekan pertumbuhan sel kanker maupun mencegah terjadinya kanker juga memiliki efek antiproliferasi pada sel termasuk proses replikasi virus yang dapat menyebabkan kanker (Oppenheim & Ruscett, 1997; Backman & Guyre, 1994 dalam Purwanto dkk. 2005).

Page 8: Prens Hibah DrI

Apakah mungkin ekstrak air Cincau Hitam (Mesona palustris BL)

bersifat Imunomodulator dan kemoterapi pada kanker?

Imunomodulator = cara memperbaiki fungsi sistim imun tubuh dengan menggunakan bahan yang merangsang atau meningkatkan kerja sistem imun tubuh

Kemoterapi = Kemoterapi merupakan cara pengobatan kanker dengan jalan memberikan zat/obat yang mempunyai khasiat menghambat/membunuh sel kanker dan diberikan secara sistematik.

Page 9: Prens Hibah DrI

Berdasarkan hal-hal tsb perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui peranan dr ekstrak air cincau hitam (Mesona palustris BL) sbg imunomodulator yg mungkin juga dpt bersifat kemoterapi kanker.

Penelitian yang dilakukan meliputi :1) Skrining ekstrak Mesona palustris BL

2) Pengujian Imunomodulator3) Pengujian Kemoterapi KankerFibrosarkoma

Page 10: Prens Hibah DrI

1. Tujuan UmumMembuktikan peranan dan kemampuan ekstrak air cincau

hitam ( Mesona palustris BL) sebagai imunomodulator pada mencit sehat maupun kemoterapi pada mencit yang diinduksi dengan benzo(a)pirene .

2 Tujuan Khusus Mengetahui kandungan senyawa bioaktif apa saja yang

terdapat pada ekstrak cincau hitam ( Mesona palustris BL) Membuktikan peranan dan kemampuan ekstrak air cincau

hitam ( Mesona palustris BL) bersifat imunomodulator terhadap peningkatan ekspresi IFN-γ dan komponen immunosurveillence (sel NK, sel T sitotoksik /CD 8+ dan makrofag) pada mencit sehat, dan mencit yang menderita kanker karena induksi benzo(a)pirena

Page 11: Prens Hibah DrI

Manfaat Penelitian1) Memberikan landasan ilmiah tentang khasiat cincau hitam

( Mesona palustris BL) yang secara empiris diyakini berkhasiat terhadap kesehatan

2) Memberi informasi cincau hitam merupakan bahan pangan yang bersifat imunomodulator,kemopreventif dan kemoterapi terhadap kanker sehingga bermanfaat untuk kesehatan

3) Menggali kekayaan bahan pangan tradisional Indonesia untuk dikembangkan lebih lanjut sbg produk pangan fungsional yang bermanfaat bagi peningkatan daya tahan tubuh dan pencegahan/ penghambatan penyakit kanker serta untuk kesejahteraan masyarakat yang lebih luas.

Page 12: Prens Hibah DrI

UJI

IMMUNOMODULATOR

UJI

IMMUNOMODULATOR

SIMPLISIA JANGGELAN

EKSTRAKSI

Ekstrak Air Cincau Hitam

skrining • Kadar fenol

• Aktv.Antioksidan

UJI KEMOPREVENTIFTHD KANKER

UJI KEMOTERAPITHD KANKER

Page 13: Prens Hibah DrI

• Tahap-tahap PenelitianTahap penelitian I : Pembuatan Ekstrak air Cincau

Hitam (Mesona palustris BL)Tahap penelitian II : Penyiapan Larutan Ekstrak air

Cincau hitam dan Dosis UjiTahap penelitian III : Perlakuan pada Hewan Coba

dan AnalisisDosis

Ekstrak air Cincau hitam

g/kgBB)

0 IM0 KM00,1 IM1 KM1

0,5 IM2 KM2

1,0 IM3 KM3

Obatkanker

OK

Pengelompokan Hewan Coba

Imunomo-dulator Kemoterapi

Page 14: Prens Hibah DrI

• Bahan Penelitian1. Simplisia cincau hitam (Mesona palustris BL) dr

petani di dari Magetan2. Mencit jantan galur BALB-C berumur 2 – 2,5

bulan dengan BB antara 20 – 30 gram dari Laboratorium PUSVETMA Surabaya. Mencit dalam keadaan sehat berdasarkan pengamatan visual.

3. Reagen kimia untk skrining fitokimia, aktif. Antioksd dan kadar fenol

4. Antibodi monoklonal (probe) untk analisis dgn Flowcytometry , Mouse IFN-γ ELISA Kit dari Bender MedSystems

Page 15: Prens Hibah DrI

Skrening senyawa bioaktif Sampel

• Skrening dgn KLT mengetahui jenisSenyawa Bioaktif yanng berperan

Page 16: Prens Hibah DrI

III. Pemeliharaan hewan coba (mencit) untuk Perlakuan Imunomodulator dan induksi kanker dengan benzo(a)pirena 2,5 bln

Mencit Kanker

Page 18: Prens Hibah DrI

Analisis :IFN-γ ELISA Kit Komponen immunosurveillance yaitu : Aktivitas sel T sitotoksik (CD 8+); sel NK & makrofag Flow Cytometer

• Sampel yang digunakan darah dan limfe

• Pengambilan darah mencit

Page 19: Prens Hibah DrI

Pengambilan Limfe

Preparasi untuk analisis dengan Flowcytometer

Page 20: Prens Hibah DrI

Pengujian Imunomodulatora. Pd mencit sehat @ 5 ekorb. Dosis ekstrak air CH : 0; 0,1; 0,5 dan 1,0 g/kgBBc. Satu kali sehari sebanyak 0,2 ml/30 g BB mencit

selama 8 mingg dgn disonded. Analisis kadar IFN-γ dg metode ELISAe. Uji aktivitas Sel T sitotoksik, sel Natural Killer

dan Makrofag Flowcytometry

Page 21: Prens Hibah DrI

HASIL PENELITIAN

Hasil Analisis Ekstrak air Cincau Hitam (Mesona palustris BL)

Keterangan Ekstrak

Kadar Air (%) 99,3290

Kadar Abu (%) 0,1845

Kadar serat kasar (%) 0,4293

Total Fenol (ppm) 372,074

Aktivitas Antioksidan (%) 86,89

Rendemen sebagai Bubuk (%) 16,18

Page 22: Prens Hibah DrI

Hasil Rendemen Ekstrak Cincau Hitam (Mesona palustris BL)

No. Pelarut Persen (%)

1. Etanol 4,1

2. Etil Asetat 4,5

3. Air 16,42

Page 23: Prens Hibah DrI

Hasil Skrining Senyawa Bioaktif Ekstrak Cincau Hitam (Mesona palustris BL)

Senyawa yang Diidentifikasi Uji Ekstrak Etanol Ekstrak Etil Asetat Ekstrak Aquades

Gol. Alkaloid KLT - - -

Glikosida Saponin Uji Buih + + +Sapogenin

steroid/triterpenoid KLT + + +Terpenoid/steroid

bebas KLT + + +

KLT + + +

Uji Wilstater + (sedikit) + +Gol. Polifenol

dan Tanin KLT - - +

Uji FeCl3 + Gelatin + + +

Gol. Antrakinon KLT + + + (sedikit)

Gol. flavonoid

Page 24: Prens Hibah DrI

Pertambahan Berat Badan Mencit• Kenaikkan berat badan yang menyolok terjadi

pada minggu pertama pada dosis 0,1 ; 0,5; dan 1.0 g/kg BB.

• Peningkatan berat badan sampai perlakuan 8 minggu mencapai 85 %

• Tanpa pemberian ekstrak air cincau hitam pertambahan berat badan hanya 41 %.

• Pertambahan berat badan kemungkinan juga berhubungan dengan kondisi sistim pertahanan tubuh.

Page 25: Prens Hibah DrI

Data Lengkap Hasil Analisis IFN-γ dan Komponen Immunoasurveillen

Dosisg/KgBB Sampel Imunomodulator Kemoterapi

IFN-γ Sel CD 8+ Sel NK Mac IFN-γ Sel CD 8+ Sel NK Mac

0

1. 1.307 77,19 75,22 75.33 1.608 60,72 41,31 54,96

2. 1.146 74,25 76,07 74.75 1.422 68,23 46,25 58,24

3. 1.091 73,21 78,33 83,71 1.359 61,25 44,38 56,26

0,1

1. 6.101 480.32 217,31 329,26 3.535 151,16 93,45 143,17

2. 6.046 474,83 213,21 331,51 2.954 158,35 97,26 144,25

3. 5.873 481,41 203,14 322,64 2.566 150,35 92,51 145,36

0,5

1. 8.010 483,24 226,31 330,66 4.083 152,07 96,66 157,11

2. 7.434 493,42 231,11 341,21 3.854 153,65 95,36 159,24

3. 6.877 485,83 241,17 339,23 3.727 158,26 97,65 158,22

1,0

1. 8.687 521,22 281,15 390,29 4.740 186,38 107,28 172,06

2. 8.366 521,34 290,33 398,32 4.935 188,24 106,25 174,29

3. 8.191 530,45 288,43 397,41 4.173 187,56 110,56 170,35

Page 26: Prens Hibah DrI

Hasil Aktivitas Imunomodulator dan Kemoterapi Kanker

• Kadar IFN-γ ditentukan dengan ELISA Kit (Bender Med Systems)

• Kurva standar antara kadar IFN- γ standar dan absorbansi diperoleh hubungan dengan persamaan : Y = 0,202 X + 0,269 dan nilai R2 = 0,89.

Hal ini menunjukkan bahwa koefisien korelasi (R) diperoleh sebesar 89 %.

Penentuan kadar IFN-γ pada limfa (splenosit) dihitung dari persamaan regresi yang diperoleh.

Page 27: Prens Hibah DrI

• Interferon gama termasuk keluarga limfokin karena IFN ini dihasilkan oleh limfosit T.

• IFN-γ berperan dalam meningkatkan respon imun tubuh. Pemberian ekstrak air cincau hitam dosis 0,1 ;0,5 dan 1,0 g/kg BB selama 8 minggu pada mencit sehat dapat meningkatkan kadar IFN-γ secara bermakna ( p < 0,05).

Page 28: Prens Hibah DrI

Pengaruh dosis perlakuan ekstrak air cincau hitam terhadap kadar interferon gama Limfa mencit sehat dan Kanker

Page 29: Prens Hibah DrI

Jumlah Rerata IFN-γ Limfa Mencit Sehat dan Kanker Perlakuan dengan Ekstrak Air Cincau Hitam

DosisEkstrak Air CH

(g/kg BB)

Immunomodulator KemoterapiRerata IFN-γ ± SD (ng/ml)

KenaikanIFN-γ

Rerata IFN-γ ± SD (ng/ml)

KenaikanIFN-γ

0 1.18133 ± 0,112251

- 1,46300 ± 0,129464

-

0,1 6.00667 ± 0,118980

5,08 kali 3,01833 ± 0,487693

2,06 kali

0,5 7.44033 ± 0,566527

6,29 kali 3,88800 ± 0,180419

2,65 kali

1,0 8.41467 ± 0,251556

7,12 kali

4,61600 ± 0,395845

3,15 kali

Page 30: Prens Hibah DrI

• Immune surveillance adalah respon imun yang melindungi tubuh. Immune surveillance merupakan kegiatan imunologik yang melindungi tubuh dari penyakit, seperti halnya pada reaksi imunopatologik yang lain.

• Sel yang terlibat dalam immune surveillance terutama sel NK, sel T sitotoksik (CD 8+), dan makrofag

• Interferon gama adalah limfokin yang dapat mengaktivasi komponen Immune surveillance seperti sel NK, sel CD8+, makrofag dan sel LAK

Page 31: Prens Hibah DrI

• Hubungan ini dapat dilihat dengan koefisien korelasi yang cukup kuat antara IFN-γ dengan sel NK (0,982); IFN-γ dengan CD8+ (0,968); IFN-γ dengan makrofag (0,980).

• Korelasi diantara variable IFN-γ dengan sel NK, sel CD8+, makrofag sangat nyata .

• Persamaan regresi = -1.221 +0.023x1 – 0,067 x2 + 0,057 x3.

• Hal ini membuktikan bahwa IFN-γ berpengaruh terhadap aktivasi dan kenaikkan sel NK, sel CD8+ dan makrofag.

Page 32: Prens Hibah DrI

• Telah terbukti bahwa senyawa bioaktif pada beberapa ekstrak herba dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit atau sel T.

• Perlakuan ekstrak air cincau hitam ternyata juga terbukti dapat meningkatkan jumlah sel NK, sel CD8+ dan makrofag.

Page 33: Prens Hibah DrI

Pengaruh dosis Ekstrak Air Cincau Hitam terhadap Komponen Immune surveillance

0

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000

600,000

0 0,1 0,5 1,0

jum

lah

sel

Dosis g/kg BB

sel NK

Sel CD 8

Makrofag

Page 34: Prens Hibah DrI

Jumlah Rerata Sel NK Limfa Mencit Sehat dan Kanker Perlakuan dengan Ekstrak Air Cincau Hitam

DosisEkstrak Air CH

(g/kg BB)

Immunomodulator Kemoterapi

Rerata Sel NK ± SD

Kenaikan Sel NK

RerataSel NK

KenaikanSel NK

076,5400

±1,60739-

43,9800 ± 2,49417 -

0,1211,2400 ±

7,316692,75 kali

94,4067 ± 2,51536 2,14 kali

0,5232,8633 ±

7,583573,04 kali

96,5567 ± 1,14849 2,19 kali

1,0286,6367 ±

4,84563 3,74 kali

108,0300 ± 2,25076 2,45 kali

Page 35: Prens Hibah DrI

Jumlah Rerata Sel CD 8+ Limfa Mencit Sehat dan Kanker Perlakuan dengan Ekstrak Air Cincau Hitam

DosisEkstrak Air CH

(g/kg BB)

Immunomodulator KemoterapiRerata CD 8+

± SDKenaikan

CD 8+RerataCD 8+

KenaikanCD 8+

0 74,8833 ± 2,06420

- 63,4000 ± 4,19129

-

0,1 478,8533 ±3,52667

6,39 kali 153,2867 ± 4,40364

2,41 kali

0,5 487,4967 ± 5,29069

6,51 kali 154,6600 ± 3,21622

2,43 kali

1,0 524,3367 ± 5,29464

7,00 kali 187,3933 ± 0,94113

2,95 kali

Page 36: Prens Hibah DrI

Jumlah Rerata Makrofag Limfa Mencit Sehat dan Kanker Perlakuan dengan Ekstrak Air Cincau Hitam

DosisEkstrak Air CH

(g/kg BB)

Immunomodulator KemoterapiRerata

Makrofag± SD

KenaikanMakrofag

RerataMakrofag

± SD

KenaikanMakrofag

0 77,9300 ± 5,01402

- 56.4867 ± 1.65171

-

0,1 328,033 ± 4,61093 4,2

144.2600 ± 1.09503

2,33 kali

0,5 337,0333 ± 5,60755

4.32 158.1900 ± 1.06532

2,80 kali

1,0 395,3400 ± ,.39703

5,07 172.2333 ± 1.97571

3.04 kali

Page 37: Prens Hibah DrI

Contoh Hasil Analisa dg Flowcytometry

Page 38: Prens Hibah DrI

Contoh Hasil Analisa dg Flowcytometry

Page 39: Prens Hibah DrI

Peningkatan Komponen immune surveillance (sel CD8+, sel NK dan Makrofag) berdasarkan perlakuan pemberian dosis ekstrak air cincau hitam

pada mencit sehat (sebagai Imunomodulator)

0

100,000

200,000

300,000

400,000

500,000

600,000

0 0,1 0,5 1,0

jum

lah se

l

Dosis g/kg BB

Jml Sel NK, CD 8 + dan Makrofag vs Dosis pada Imunomodulator

sel NK

Sel CD 8

Makrofag

Page 40: Prens Hibah DrI

Peningkatan Komponen immune surveillance (sel CD8+, sel NK dan Makrofag) berdasarkan perlakuan pemberian dosis ekstrak air cincau hitam

pada mencit kanker (sebagaiKemoterapi)

0

50,000

100,000

150,000

200,000

0 0,1 0,5 1,0

Jml

sel

Dosis g/kg BB

Jumlah sel NK, CD 8+, dan Makrofag Vs Dosis pd Kemoterapi

sel CD 8

Sel NK

Makrofag

Page 41: Prens Hibah DrI

• KESIMPULAN• Hasil analisis ekstrak air cincau hitam (Mesona

palustris BL) menunjukkan aktifitas antioksidan yang cukup tinggi 86,89 % dan total senyawa fenol 372,074 ppm. Rendemen sebagai bubuk 16.18 %.

• Hasil analisis IFN-γ dan komponen immune surveillance sel NK, sel CD8+ dan makrofag dari limfa mencit sehat dan mencit kanker yang diberi perlakuan ekstrak air cincau hitam mengalami kenaikan yang sangat signifikan bila dibandingkan dgn yang tanpa perlakuan ekstrak cincau hitam

Page 42: Prens Hibah DrI

• Terjadi perbedaan yng signifikan antara dosis ekstrak 0,1 ; 0,5 dan 1,0 g/kg BB. Peningkatan tertinggi pada dosis ekstrak air cincau hitam 1,0 g/kg BB

• Ekstrak air cincau hitam terbukti bersifat imunomodulator karena berhasil meningkat-kan IFN-γ dan komponen immune surveillance sel NK, sel CD8+ dan makrofag sehingga status imun tubuh atau daya imun tubuh meningkat.

Page 43: Prens Hibah DrI

• Ekstrak air cincau hitam terbukti bersifat meningkatkan sistem imun penderita kanker

• Sedangkan sebagai kemoterapi kanker harus dibuktikan lebih lanjut dengan imunohisto atau apoptosis yang sampai laporan ini dibuat belum selesai preparatnya.

Saran• Untuk lebih mayakinkan perlu analisa parameter

sitokin lain juga diuji cobakan pada mencit yang sedang sakit

Page 44: Prens Hibah DrI

Matur Nuwun