PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk filevi LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...

i

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOLIK BUAH CABAI

RAWIT MERAH (Capsicum frutescens L.) DENGAN METODE DPPH (1,1–

difenil-2-pikrilhidrazil) DAN PENETAPAN KADAR KAPSAISIN SECARA

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) – DENSITOMETRI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Christina

NIM : 098114089

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2013

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN


v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarism dalam naskah ini,

maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-undangan

yang berlaku.

Yogyakarta, 18 Maret 2013

Penulis

(Christina)


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Christina

Nomor mahasiswa : 098114089

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOLIK BUAH CABAI

RAWIT MERAH (Capsicum frutescens L.) DENGAN METODE DPPH (1,1–

difenil-2-pikrilhidrazil) DAN PENETAPAN KADAR KAPSAISIN SECARA

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT) – DENSITOMETRI

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan

dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,

mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain

untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan

royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal :

Yang Menyatakan

(Christina)


vii

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan atas berkat rahmat dan anugerah-Nya, sehingga

penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan

Ekstrak Etanolik Buah Cabai Rawit Merah (Capsicum frutescens L.) dengan

Metode DPPH (1,1–difenil-2-pikrilhidrazil) dan Penetapan Kadar Kapsaisin

secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) – Densitometri”. Skripsi ini disusun

untuk memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

Universitas Sanata Dharma.

Penulisan skripsi yang dilakukan oleh penulis dapat terselesaikan dengan

baik atas bimbingan, bantuan, dukungan, dan doa dari berbagai pihak. Pada

kesempatan in penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bapak Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah

banyak membantu serta memberikan bimbingan kepada Penulis mulai pada

saat penyusunan proposal, penelitian hingga penyelesaian skripsi ini.

3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah bersedia

menguji skripsi ini, serta memberikan pengarahan dan saran.

4. Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah bersedia

menguji skripsi ini, serta memberikan pengarahan dan saran.


viii

5. Ibu Agustina Setiawati, S. Farm, Apt, M.Sc., selaku dosen pembimbing

akademik yang telah memberikan bimbingan.

6. Segenap laboran, Mas Wagiran, Mas Bimo, Mas Kayat, Pak Parlan atas

segala bantuan selama penulis melakukan penelitian di laboratorium.

7. Kakakku, Sony Wibowo atas doa dan dukungan yang diberikan selama ini.

8. Sahabat-sahabat seperjuanganku, Vanny Christy dan Yenny atas

kebersamaan, keceriaan dan bantuan selama penyelesaian skripsi ini.

9. Teman sepermainanku tercinta Kak Umi, Kak Nina, Adel, Riza, Evy untuk

setiap dukungan dan semangat yang diberikan.

10. Sahabat LC JOY, yang telah mendukung dalam doa selama ini.

11. Teman-teman kelas B 2009, kelompok praktikum B, dan seluruh angkatan

2009 yang lain, terima kasih untuk kebersamaan, keceriaan, keseruan yang

telah dilalui selama ini.

12. Semua pihak yang tidak dapat Penulis sebutkan satu persatu yang telah

memberikan dukungan dan bantuan sehingga skripsi ini dapat terselesaikan.

Penulis menyadari masih adanya kekurangan dalam penyusunan skripsi ini

karena keterbatasan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran

yang membangun dari semua pihak. Penulis berharap skripsi ini dapat memberikan

manfaat dan sumbangan dalam perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAAN KARYA ................................................................ v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................................ vi

PRAKATA ................................................................................................................ vii

DAFTAR ISI ............................................................................................................. ix

DAFTAR TABEL ..................................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. xvi

INTISARI ................................................................................................................. xviii

ABSTRACT ............................................................................................................... xix

BAB I PENGANTAR ............................................................................................... 1

A. Latar belakang ..................................................................................................... 1

1. Permasalahan................................................................................................. 3

2. Keaslian penelitian ........................................................................................ 3

3. Manfaat penelitian ......................................................................................... 4

B. Tujuan ................................................................................................................. 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA........................................................................ 6


x

A. Cabai rawit .......................................................................................................... 6

1. Klasifikasi tanaman ....................................................................................... 6

2. Nama tanaman ............................................................................................... 6

3. Morfologi tanaman ........................................................................................ 7

4. Kegunaan dan kandungan kimia ................................................................... 7

B. Kapsaisin ............................................................................................................. 8

C. Radikal bebas ...................................................................................................... 9

D. Antioksidan ......................................................................................................... 10

E. DPPH .................................................................................................................. 11

F. Ekstraksi .............................................................................................................. 12

G. Validasi metode ................................................................................................... 15

H. Spektrofotometri visible ...................................................................................... 17

I. KLT Densitometri ............................................................................................... 18

J. Landasan teori ..................................................................................................... 20

K. Hipotesis ............................................................................................................. 21

BAB III METODE PENELITIAN............................................................................ 22

A. Rancangan penelitian .......................................................................................... 22

B. Variabel penelitian .............................................................................................. 22

C. Definisi operasional ............................................................................................ 22

D. Bahan dan alat penelitian .................................................................................... 23

E. Tata cara penelitian ............................................................................................. 24

1. Determinasi tanaman ..................................................................................... 24


xi

2. Pengumpulan bahan ...................................................................................... 24

3. Pembuatan ekstrak cabai rawit merah ........................................................... 24

4. Pengujian aktivitas antioksidan ..................................................................... 24

a. Pembuatan larutan DPPH ........................................................................ 24

b. Pembuatan larutan stok kapsaisin ........................................................... 25

c. Pembuatan larutan pembanding .............................................................. 25

d. Pembuatan larutan uji .............................................................................. 25

e. Uji pendahuluan ...................................................................................... 25

f. Penentuan panjang gelombang maksimum ............................................. 25

g. Penentuan OT .......................................................................................... 26

h. Uji aktivitas antioksidan .......................................................................... 26

i. Validasi metode ....................................................................................... 27

j. Estimasi aktivitas antioksidan ................................................................. 27

5. Penetapan kadar kapsaisin............................................................................. 27

a. Pembuatan fase gerak .............................................................................. 27

b. Pembuatan larutan stok kapsaisin ........................................................... 27

c. Pembuatan seri jumlah baku kapsaisin ................................................... 27

d. Pembuatan larutan uji .............................................................................. 27

e. Pembuatan kurva baku ............................................................................ 27

f. Penentuan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik ................................. 28

F. Analisis hasil ....................................................................................................... 28

1. Uji aktivitas antioksidan ................................................................................ 28


xii

2. Penetapan kadar kapsaisin............................................................................. 29

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................. 30

A. Hasil determinasi tanaman .................................................................................. 30

B. Hasil pengumpulan bahan ................................................................................... 31

C. Hasil preparasi sampel ........................................................................................ 31

D. Hasil uji pendahuluan .......................................................................................... 33

E. Hasil optimasi metode uji aktivitas antioksidan ................................................. 34

1. Penentuan panjang gelombang maksimum ................................................... 34

2. Penentuan Operating time ............................................................................. 35

F. Hasil validasi metode uji aktivitas antioksidan ................................................... 36

1. Linieritas ....................................................................................................... 38

2. Akurasi .......................................................................................................... 39

3. Presisi ............................................................................................................ 42

4. Spesifitas ...................................................................................................... 43

G. Hasil estimasi aktivitas antioksidan .................................................................... 43

H. Penetapan kadar kapsaisin................................................................................... 47

1. Analisis kualitatif .......................................................................................... 48

2. Analisis kuantitatif ........................................................................................ 49

I. Hasil analisis statistik ............................................................................................ 51

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................................... 53

A. Kesimpulan ................................................................................................... 53

B. Saran ............................................................................................................. 53


xiii

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 54

LAMPIRAN .............................................................................................................. 58

BIOGRAFI PENULIS .............................................................................................. 84


xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Kriteria akurasi yang dapat diterima .............................................. 15

Tabel II. Nilai presisi yang dapat diterima .................................................... 16

Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang maksimum

DPPH .............................................................................................. 35

Tabel IV. Hasil pengukuran %IC seri baku kapsaisin .................................... 37

Tabel V. Hasil pengukuran %IC seri larutan ekstrak etanolik

cabai rawit merah ............................................................................ 37

Tabel VI. Hasil perolehan kembali uji aktivitas antioksidan

kapsaisin ......................................................................................... 40

Tabel VII. Hasil perolehan kembali uji aktivitas antioksidan

ekstrak etanolik buah cabai rawit merah ........................................ 41

Tabel VIII. Nilai CV uji aktivitas antioksidan kapsaisin ................................... 42

Tabel IX. Nilai CV uji aktivitas antioksidan ekstrak etanolik

cabai rawit merah ............................................................................ 42

Tabel X. Nilai IC50 kapsaisin dan ekstrak etanolik buah cabai

rawit merah ..................................................................................... 46

Tabel XI. Hasil penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak

etanolik buah cabai rawit merah ..................................................... 51


xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Tanaman cabai rawit ................................................................. 7

Gambar 2. Struktur kapsaisin ...................................................................... 9

Gambar 3. Reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH ............................. 12

Gambar 4. TLC scanner ............................................................................ 20

Gambar 5. Varietas buah cabai rawit ........................................................ 30

Gambar 6. Alat soxhlet ............................................................................. 32

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan .............................................................. 34

Gambar 8. Operating time kapsaisin......................................................... 36

Gambar 9. Kurva persamaan regresi linier aktivitas

antioksidan kapsaisin .............................................................. 39

Gambar 10. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan

ekstrak etanolik buah cabai rawit merah ................................. 39

Gambar 11. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH ................................. 44

Gambar 12. Reaksi DPPH dengan antioksidan ........................................... 44

Gambar 13. Mekanisme penghambatan radikal bebas

DPPH oleh kapsaisin ............................................................... 45

Gambar 14. Interaksi kapsaisin dengan fase diam ...................................... 48

Gambar 15. Interaksi kapsaisin dengan fase gerak ..................................... 49

Gambar 16. Kurva baku kapsaisin .............................................................. 50


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Sertifikat analisis kapsaisin .......................................................... 59

Lampiran 2. Foto buah cabai rawit merah ........................................................ 60

Lampiran 3. Perhitungan rendemen ekstrak etanol ........................................... 61

Lampiran 4. Data penimbangan pengujian aktivitas

antioksidan .................................................................................... 61

Lampiran 5. Perhitungan konsentrasi bahan pengujian

aktivitas antioksidan ..................................................................... 62

Lampiran 6. Hasil scanning larutan pengoreksi untuk pengujian

aktivitas antioksidan ..................................................................... 67

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan.................................... 69

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan dengan

menggunakkan DPPH................................................................... 74

Lampiran 9. Perhitungan %recovery, CV uji aktivitas

antioksidan .................................................................................... 77

Lampiran 10. Perhitungan IC50 kapsaisin dan ekstrak

etanolik cabai rawit merah ............................................................ 78

Lampiran 11. Perhitungan jumlah kapsaisin untuk kurva baku .......................... 79

Lampiran 12. Hasil kromatogram untuk penetapan

kadar kapsaisin ............................................................................. 80

Lampiran 13. Perhitungan persamaan kurva baku kapsaisin .............................. 82


xvii

Lampiran 14. Perhitungan kadar kapsaisin dalam ekstrak

etanolik buah cabai rawit merah ................................................... 82

Lampiran 15. Hasil analisis statistik ................................................................... 83


xviii

INTISARI

Antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menyumbangkan

elektronya pada radikal bebas. Cabai rawit merah mengandung kapsaisin yang dapat

digunakan sebagai antioksidan.

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan dan kadar

kapsaisin dalam ekstrak etanolik buah cabai rawit merah. Ekstrak etanolik buah cabai

rawit merah diuji aktivitas antioksidan dengan metode 1,1-difenil-2-pikril-hidrazil

(DPPH), yang dinyatakan dalam IC50. IC50 adalah konsentrasi ekstrak yang dapat

mengikat DPPH sebanyak 50%. Adanya senyawa antioksidan yang mengikat radikal

bebas akan ditunjukkan dengan adanya pemudaran warna ungu DPPH. Absorbansi

DPPH diukur dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang

gelombang maksimum 517,5 nm. Penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik

buah cabai rawit merah dilakukan dengan metode KLT Densitometri. Fase gerak

yang digunakan adalah toluen : kloroform : aseton (45:25:30) dan fase diam yang

digunakan adalah silka gel 60 F254

Hasil penelitian menunjukkan IC50 dari kapsaisin sebesar 15,99 ± 4,18 µg/ml

dan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah sebesar 107,75 ± 12,25 µg/ml, yang

didapatkan dengan ekstrapolasi. Serta kadar kapsaisin yang diperoleh sebesar 0,135 ±

0,002 % b/b, dengan catatan metode analisis kuantitatif belum tervalidasi.

Kata kunci : cabai rawit merah (Capsicum frutescens L.), DPPH, aktivitas

antioksidan, kapsaisin, KLT Densitometri.


xix

ABSTRACT

Antioxidants are substance that donate electrons to the free radical. Red chili

pepper (Capsicum frutescens) contain capsaicin compound that can be used as

antioxidant.

This research was conducted to determine antioxidant activity and capsaicin

concentration in red chili pepper ethanolic extract. The antioxidant activity of red

chili pepper ethanolic extract is tested with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

method, that is expressed as IC50. IC50 is concentration that can scavange 50% of free

radical. The presence of antioxidant compounds that scavenge free radicals is

indicated by DPPH discoloration. Absorbance of DPPH is measured by

spectrophotometer visible at maximum wavelength of 517,5 nm. Assay of capsaicin

is performed by thin layer chromatography (TLC) densitometry method. The mobile

phase used is toluene : chloroform : acetone (45:25:30) and the stationary phase used

is silica gel 60 F254.

The result showed that IC50 of capsaicin is 15,99 ± 4,18 µg/ml and red chili

pepper ethanolic extract is 107,75 ± 12,25 µg/ml, that obatained by extrapolating and

the capsaicin content is 0,135 ± 0,002 % b/b, with record of quantitative analysis

method has not been validated.

Keyword : red chili pepper (Capsicum frutescens L.), DPPH, antioxidant activity,

capsaicin, TLC - Densitometry


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Banyak faktor yang dapat menyebabkan terganggunya kesehatan

sehingga memicu timbulnya penyakit, seperti ketidakseimbangan gizi. Selain

faktor gizi, faktor lingkungan juga dapat menjadi faktor yang dapat menggangu

kesehatan seperti paparan asap rokok dan kendaraan, radiasi, poluasi udara dan

bahan kimia toksik. Salah satu hal yang menyebabkan faktor lingkungan dapat

mengganggu kesehatan dan menimbulkan penyakit, yaitu adanya radikal bebas.

Beberapa penyakit degeneratif seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi,

kanker, diabetes melitus, dan serosis hati disebabkan oleh adanya radikal bebas

(Simanjuntak, 2007).

Radikal bebas dibentuk ketika oksigen dimaetabolisme di dalam tubuh.

Radikal bebas merupakan molekul yang memiliki elektron tidak berpasangan

pada kulit terluar molekul, dan menjadi tidak stabil. Radikal bebas bersifat reaktif

sehingga akan cepat bereaksi dengan molekul di dalam tubuh seperti karbohidrat,

protein, lipid, dan DNA sehingga menyebabkan stres oksidatif (Badarinath,

Mallikarjuna, Chetty, Ramkanth, Rajan, Gnanaprakash, 2010). Stres oksidatif

merupakan salah satu yang menjadi penyebab penyakit degeneratif (Rohdiana,

2001). Stres oksidatif dapat terjadi ketika konsentrasi radikal bebas lebih tinggi

dari konsentrasi sistem antioksidan (Simanjuntak, 2007).

Penggunaan antioksidan semakin pesat dikarenakan semakin luasnya

pengetahuan tentang radikal bebas yang dapat menyebabkan beberapa penyakit


2

degeneratif seperti penyakit jantung dan kanker (Boer, 2000). Antioksidan

merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi dari molekul lain.

Tubuh telah memiliki sistem pertahanan antioksidatif, tetapi ketika konsentrasi

radikal bebas itu berlebihan, diperlukan adanya antioksidan eksogen (Rohdiana,

2001). Antioksidan yang diproduksi dalam tubuh antara lain Reduced Glutathione

(GSH), Superoxide Dismutase (SOD), Catalase and Glutathione Peroxidase

(GPx) (Musa, 2008). Antioksidan sintetik yang banyak digunakan dalam produksi

makanan, seperti BHA (Butil Hidroksi Anisol), BHT (Butil Hidroksi Toluen), dan

TBHQ (tert-butil Hidrokuinon), tetapi antioksidan tersebut dapat menjadi

karsinogenik sehingga penggunaan antioksidan alami mulai meningkat

(Amarowicz, Naczk, and Shahidi, 2000). Antioksidan alami dapat ditemukan pada

tanaman. Antioksidan eksogen dari tanaman lebih aman dibandingkan dengan

antioksidan sintetik (Musa, 2008).

Penggunaan cabai rawit di masyarakat biasanya sebagai sayuran dan

obat tradisional. Cabai rawit memiliki khasiat antara lain sebagai stimulan,

antireumatik, antikoagulan, antitrombosis, stomakikum, antihaemoroidal, dan

antiseptik. Khasiat yang ditimbulkan tersebut sebagian besar karena kandungan

kapsaisin dalam cabai rawit (0,1-1,5%) (Widianti dan Suhardjono, 2010).

Kapsaisin merupakan senyawa yang menyebabkan rasa pedas pada

cabai. Kapsaisin juga dapat memiliki aktivitas antioksidan karena adanya gugus

fenol pada strukturnya, seperti yang ditemukan pada antioksidan sintetik BHT

(Handerson dan Slickman, 1999). Adanya gugus fenol dapat menyumbangkan

satu elektronnya pada radikal bebas sehingga dapat menangkap radikal bebas


3

tersebut. Banyak bahan alam dapat memberikan aktivitas antioksidan karena

adanya kandungan senyawa fenolik.

Pada penelitian ini uji aktivitas antioksidan akan dilakukan dengan

metode DPPH. Metode ini mengukur kemampuan suatu senyawa antioksidan

dalam menangkap radikal bebas. Jika suatu senyawa antioksidan bereaksi dengan

radikal bebas DPPH, maka senyawa tersebut akan menetralkan radikal bebas dari

DPPH. Senyawa dapat menetralkan radikal bebas, secara kualitatif akan terlihat

adanya pemudaran warna DPPH dari ungu menjadi kuning (Merck, 2012). Pada

penetapan kadar kapsaisin akan dilakukan dengan metode KLT-Densitometri.

1. Permasalahan

a. Berapakah nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit

merah dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan dengan

IC50?

b. Berapakah kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik buah cabai rawit merah

dengan menggunakan metode KLT-Densitometri?

2. Keaslian penelitian

Penelitian tentang aktivitas antioksidan cabai rawit dan penetapan

kadar kapsaisin yang pernah dilakukan, antara lain :

a. Penelitian yang dilakukan oleh Talcott, Brenes, dan Villalon (2000)

mengenai aktivitas antioksidan pada berbagai spesies Capsicum

dengan metode β-karoten – linoleat.


4

b. Penelitian dari Sukrasno dan Kusmardiyani (1997) meneliti

kandungan kapsaisin pada berbagai buah Capsicum menggunakan

metode KCKT.

c. Penelitian oleh Henderson dan Slickman (1999) tentang Quantitative

HPLC Determination of the Antioxidant Activity of Capsaicin on the

Formation of Lipid Hydroperoxides of Linoleic Acid: A Comparative

Study against BHT and Melatonin.

Perbedaan penelitian ini dengan penelitian yang telah dilakukan, yaitu

pada penelitian ini melakukan uji aktivitas antioksidan pada cabai rawit merah

(Capsicum frutescens L.) dengan menggunakan DPPH dan penetapan kadar

kapsaisin dilakukan dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) –

Densitometri. Sejauh penelusuran peneliti, penelitian ini belum pernah

dilakukan.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis : Penelitian ini diharapkan dapat menambah

pengetahuan tentang aktivitas antioksidan dalam ekstrak etanolik buah

cabai rawit merah dengan menggunakan metode DPPH yang dinyatakan

dengan IC50.

b. Manfaat praktis : Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

tentang aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah

sehingga dapat dimanfaatkan menjadi suatu bentuk sediaan farmasi

untuk pemeliharaan kesehatan.


5

B. Tujuan

1. Tujuan umum

Mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah

dengan metode DPPH.

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit

merah dengan metode DPPH yang dinyatakan dengan IC50.

b. Mengetahui kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik buah cabai rawit

merah dengan metode KLT-Densitometri.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Cabai Rawit

1. Klasifikasi tanaman

Klasiafikasi tanaman cabai rawit sebagai berikut

Kingdom : Plantae (tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (tumbuhan berpembuluh)

Super Divisi : Spermatophyta (tumbuhan berbiji)

Divisi : Magnoliophyta (biji berkeping dua)

Kelas : Magnoliopsida

Sub kelas : Asteridae

Ordo : Solanales

Famili : Solanaceae (suku terung-terungan)

Genus : Capsicum

Spesies : Capsicum frutescens L. (Plantamor, 2008).

2. Nama tanaman

Indonesia : cabai rawit, cabe rawit, lombok rawit, cengek (Sunda)

(Plantamor, 2008). Nama daerah : lada limi (Nias), cabhi letek (Madura), tabia

krinyi (Bali), malita diti (Gorontalo), lombok jempling, lombok jemprit,

lombok rawit, lombok gambir (Jawa) (Agromedia, 2008).


7

Gambar 1. Tanaman cabai rawit (Jurnalkesehatan, 2011)

3. Morfologi tanaman

Cabai rawit merupakan tanaman perdu tahunan. Tinggi batang 50-100

cm. berbuku-buku, bagian atasnya bersudut, dan percabangan banyak. Daun

tunggal, berbentuk bulat telur, bertangkai, letak tumbuhnya berseling, ujung

meruncing, dan pangkal menyempit (Agromedia, 2008).

Bunga tunggal, terdiri dari 2-3 bunga, panjang 1-3 cm, dan lebar 2,5-12

cm. bunga berwarna putih, putih kehijauan, atau kadang-kadang ungu.

Mahkota bunga berbentuk bintrang. Buah buni berbenruk bulat telur, ujung

meruncing, bertangkai panjang, muncul tegak. Buah muda berwarna hijau tua,

putih kehijauan, atau putih (Agromedia, 2008).

4. Kegunaan dan kandungan kimia

Kandungan dalam buah cabai rawit antara lain kapsaisin, kapsantin,

karotenoid, alkaloid asiri, resin, minyak menguap, vitamin (A dan C).

Kapsaisin merupakan senyawa yang memberikan rasa pedas pada cabai, yang

berkhasiat untuk melancarkan aliran darah serta pemati rasa kulit. Pada biji


8

cabai rawit mengandung alkaloid, antara lain solanina, solamidina,

solamargina, solasodina, solasomina, dan steroid saponin (kapsisidin).

Kapsisidin dapat berkhasiat sebagai antibiotik (Ipteknet, 2008).

Buah Capsicum frutescens memiliki manfaat antara lain efek tonik,

stimulan kuat untuk jantung dan aliran darah, antirheumatik, antikoagulan,

antitrombosis, stomakikum, rubefacient (mengakibatkan inflamasi dan

kemerahan pada kulit sehingga sering digunakan sebagai campuran obat

gosok), anastetik, antihaemorroidal, dan antiseptik. Efek tersebut sebagian

besar disebabkan oleh kapsaisin yang terkandung di dalam buah Capsicum

frutescens (0,1- 1,5%) (Widianti dan Suhardjono, 2010).

B. Kapsaisin

Kapsaisinoid merupakan senyawa yang memberikan rasa pedas pada

cabai. Kandungan utama dalam kapsaisinoid adalah kapsaisin, kemudian

dihidrokapsaisin, nordihidrokapsaisin, homodihidrokapsaisin, dan homokapsaisin.

Kapsaisin dan dihidrokapsaisin terkadung sebanyak 90% dari kapsaisinoid pada

cabai (Reyes, Escodigo, Gonzalez, Mondragon, Vazquez, Tzompantzi, 2011).

Kapsaisin (8-methyl–N–vanillyl–6-nonenamida) merupakan suatu

alkaloid lipofilik, tidak berwarna, tidak berbau dengan bobot molekul 305,40

g/mol. Kapsaisin memiliki kelarutan dalam lemak, alkohol, dan minyak (Reyes,

Escodigo, Gonzalez, Mondragon, Vazquez, Tzompantzi, 2011). Kapsaisin

merupakan komponen aktif yang menghasilkan rasa panas dalam cabai. Kapsaisin

bersifat iritan terhadap mamalia termasuk manusia, dan menimbulkan rasa panas


9

pada jaringan manapun yang tersentuh. Kapsaisin dan senyawa-senyawa lain yang

terkait strukturnya disebut dengan kapsaisinoid, diproduksi sebagai metabolit

sekunder dari cabai. Tingkatan rasa panas suatu cabe bergantung pada dua faktor,

yaitu genetika tumbuhan dan lingkungan pertumbuhannya, yang meliputi kondisi

lingkungan, jumlah air, dan tingkat suhu tempat pertumbuhan (Supalkova,

Stavelikova, Krizkova, Adam, Horna, Havel, et al, 2007).

Gambar 2. Struktur Kapsaisin (Chemspider , 2008)

C. Radikal bebas

Pada dasarnya di dalam tubuh terjadi suatu proses oksidasi yang setiap

saat peristiwa ini terjadi. Radikal bebas ini sangat reaktif dan dapat merusak sel-

sel tubuh sehingga terjadi kerusakan jaringan dan gangguan fungsional anatomi

(Winarsi, 2007). Radikal bebas adalah molekul yang memiliki elektron yang tidak

berpasangan pada orbit terluarnya, sehingga bersifat reaktif dan tidak stabil,

sehingga cenderung untuk berikatan dengan senyawa lain untuk membentuk

molekul yang stabil (Setiati, 2003).

Radikal bebas dapat dihasilkan dari dalam tubuh (endogen) dan juga dari

luar tubuh (eksogen). Radikal bebas endogen merupakan radikal yang dihasilkan

dari dalam tubuh misalnya radikal dari mitokondria, xantin oksidase, NADPH


10

oksidase, mikrosom, membran inti sel dan peroksisom, sedangkan radikal bebas

eksogen adalah radikal yang dihasilkan dari lingkungan luar seperti, asap rokok,

radiasi UV, bahan kimia toksik (Setiati, 2003).

Autooksidasi lipid merupakan proses radikal yang terlibat dalam reaksi

berantai, termasuk didalamnya terdapat tiga tahap, yaitu induksi, propagasi, dan

terminasi. Tahap induksi merupakan tahap pembentukan radikal alkil dan

peroksil. Pada tahap propagasi terbentuk hidroperoksid (ROOH). Tahap terakhir,

yaitu terminasi yang merupakan proses penggabungan dua radikal untuk

membentuk produk yang stabil (Bondet, Williams-Brand, Berset, 1997).

Radikal bebas merupakan salah satu faktor penyebab timbulnya suatu

penyakit. Radikal bebas dapat dihasilkan melalui metabolisme makanan dan juga

faktor lingkungan luar. Penyakit degeneratif yang disebabkan oleh radikal bebas

antara lain penyakit kardiovaskular, tekanan darah tinggi, diabetes mellitus, dan

kanker. Radikal bebas dapat merusak makromolekul seperti merusak lipid

membran sel, DNA, protein yang menyebabkan stres oksidatif sel (Simanjuntak,

2007).

Keadaan stres oksidatif dapat terjadi jika jumlah radikal bebas dalam

tubuh lebih tinggi dari jumlah sistem antioksidan. Stres oksidatif yang

ditimbulkan oleh radikal bebas dapat ditentukan dengan mengukur salah satu

parameter berupa malondialdehid (MDA). Bila kadar MDA tinggi di dalam

plasma, maka dapat dipastikan sel mengalami stres oksidatif (Simanjuntak, 2007).


11

D. Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan.

Senyawa antioksidan dapat menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi,

dengan cara mencegah terbentuknya radikal bebas. Selain itu, antioksidan juga

menghambat reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang

sangat reaktif, sehingga kerusakan sel dapat dihambat. Antioksidan dapat berupa

enzim (misalnya superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation

peroksidase), vitamin (vitamin E, A, C, dan B karoten), dan senyawa lain

(flavonoid, albumin, bilirubin, dll) (Winarsi, 2007).

Antioksidan enzimatis merupakan sistem pertahanan utama (primer)

terhadap kondisi stres oksidatif. Enzim-enzim tersebut merupakan suatu

metaloenzim sehingga aktivitasnya tergantung pada adanya ion logam. Enzim ini

bekerja dengan menghambat terbentuknya radikal bebas baru. Jenis antioksidan

lain, yaitu antioksidan non enzimatis atau antioksidan sekunder karena diperoleh

dari asupan makanan seperti vitamin C, E, A, dan beta karoten. Senyawa ini

menangkap senyawa oksidan serta mencegah terjadinya reaksi berantai (Winarsi,

2007).

E. DPPH

Molekul 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) merupakan suatu

radikal bebas yang stabil dengan adanya delokalisasi elektron bebas pada molekul

tersebut. Delokalisasi ini menyebabkan peningkatan warna violet, yang

ditunjukkan dengan pita absorpsi dalam larutan etanol pada panjang gelombang


12

517 nm. Saat larutan DPPH dicampurkan dengan substansi yang dapat

memberikan hidrogen radikal, akan menyebabkan terjadinya bentuk tereduksi

dengan pemudaran warna violet (Molyneux, 2003).

Metode DPPH menggunakan 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl sebagai

sumber radikal bebas. Prinsipnya adalah reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH

dari zat antioksidan dengan reaksi sebagai berikut: (Prakash, Rigelhof, Miller

2010).

Gambar 3. Reaksi penangkapan hidrogen oleh DPPH (Prakash, Rigelhof, Miller 2010).

Harga EC umum digunakan untuk menyatakan aktivitas antioksidan

suatu bahan uji dengan metode peredaman radikal bebas DPPH. EC50 adalah

bilangan yang menunjukkan konsentrasi ekstrak yang mampu menghambat proses

oksidasi sebesar 50%. Semakin kecil nilai EC50 berarti semakin tinggi aktivitas

antioksidan. Secara spesifik, suatu senyawa dinyatakan sebagai antioksidan sangat

kuat jika nilai EC50 kurang dari 50, kuat untuk EC50 bernilai 50-100, sedang jika

EC50 bernilai 100-150, dan lemah jika EC50 bernilai 151-200 (Mardawati, 2008).

F. Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau hewani dengan menggunakan pelarut yang sesuai


13

kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan, massa atau serbuk yang

tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan

(Depkes RI, 1995).

Ekstraksi merupakan penarikan kandungan kimia yang dapat larut dalam

pelarut cair sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut. Senyawa aktif

yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam minyak atsiri,

alkaloid, flavonoid dan lain-lain. Struktur kimia yang berbeda-beda akan

mempengaruhi kelarutan serta stabilitas senyawa-senyawa tersebut terhadap

pemanasan, udara, cahaya, logam berat, dan derajat keasaman (Depkes RI, 2000).

Macam-macam metode ekstraksi antara lain :

1. Maserasi

Proses yang dilakukan dengan cara direndam sampai meresap dan

melunakkan susunan sel, sehingga zat-zat yang mudah larut dapat melarut.

Maserasi dilakukan dengan menggunakan wadah bermulut lebar, dan dilakukan

pengocokan berulang-ulang yang lamanya berkisar 2-14 hari. Pengocokan

memungkinkan pelarut untuk masuk ke seluruh permukaan obat yang sudah

halus. Ekstrak dipisahkan dari ampasnya dengan cara menyaring seluruh ekstrak

(Ansel, 1989).

2. Perkolasi

Obat dimampatkan dalam alat ekstraksi khusus yang disebut dengan

perkolator, dengan ekstrak yang telah dikumpulkan disebut perkolat (Ansel,

1989). Cairan pengekstraksi yang dimasukkan secara kontinyu akan mengalir

lambat dari atas melewati bahan yang diekstraksi. Jika pada maserasi sederhana


14

ekstraksi sempurna tidak dapat terjadi karena ada suatu keseimbangan konsentrasi

antara larutan dalam sel dan cairan disekelilingnya dapat diatur, maka pada

perkolasi melalui pemasukan bahan pealrut yang baru dan dengan demikian suatu

ekstraksi total adalah mungkin karena perbedaan konsentrasi pada posisi yang

baru (Voigt, 1994).

3. Penyarian dengan alat Soxhlet

Soxhletasi adalah ekstraksi dengan menggunakan alat khusus yang mana

pelarut yang digunakan untuk menyari selalu baru sehingga ekstraksi yang

kontinyu dapat terjadi. Pelarut yang selalu baru tersebut didapat dengan

menguapkan pelarut yang ada dan diembunkan kembali oleh pendingin balik

(Depkes RI, 2000).

Bahan yang akan diekstraksi dimasukkan dalam sebuah kantung

ekstraksi di dalam sebuah alat ekstraksi dari gelas yang bekerja secara kontinyu.

wadah gelas yang berisi kantung diletakkan diantara labu suling dan suatu

pendingin balik yang dihubungkan melalui pipa pipet. Labu tersebut berisi bahan

pelarut yang akan menguap dan mencapai kedalam pendingin balik melalui pipa,

dan berkondensasi didalamnya kemudian akan menetes kedalam bahan yang

diekstraksi. Pelarut akan berkumpul dalam wadah gelas dan setelah mecapai

tinggi maksimal, pelarut akan ditarik kembali kedalam labu, dengan demikian zat

yang terekstraksi tertimbun melalui penguapan yang kontinyu dari bahan pelarut

murni (Voigt, 1994).


15

G. Validasi metode analisis

Validasi metode analisis merupakan suatu tidakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan

parameter tersebut memenuhi persyaratan (Harmita, 2004). Validasi metode

menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk menjamin bahwa

suatu metode bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit

yang dianalisis. Tujuan utama validasi metode adalah untuk menghasilkan hasil

analisis yang paling baik. Untuk memperoleh hasil tersebut, semua variabel terkait

harus dipertimbangkan meliputi prosedur pengambilan sampel, tahap penyiapan

sampel, jenis fase diam, fase gerak, dan sistem deteksi (Rohman, 2009).

Parameter validasi metode analisis antara lain adalah akurasi, presisi,

dan linearitas. Akurasi merupakan keterdekatan nilai pengukuran dengan nilai

sebenarnya dari analit dalam sampel (Mulja dan Hanwar, 2003). Akurasi

dinyatakan dalam persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambnahkan.

Kriteria akurasi tergantung pada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada

keseksamaan metode (RSD). Vanderwielen, dkk menyatakan bahwa selisih kadar

pada berbagai penentuan (Xd) harus 5% atau kurang pada setiap konsentrasi analit

(Harmita, 2004).

Tabel I. Kriteria Akurasi yang Dapat Diterima (Harmita, 2004)

Analit pada matrik

sampel (%)

Rata-rata yang diperoleh

(%)

100 98-102

>10 98-102

>1 97-103

>0,1 95-105

0,01 90-107


16

0,001 90-107

0,0001 (1 ppm) 80-110

0,00001 (100 ppb) 80-110

0,000001 (10 ppb) 60-115

0,0000001 (1 ppb) 40-120

Presisi merupakan sejumlah ukuran hasil yang diperoleh dari

analisis yang dilakukan berulangkali pada suatu sampel homogen. Presisi

dinyatakan dalam standar deviasi atau koefisien variasi (Mulja dan Hanwar,

2003).

Tabel II. Nilai presisi yang dapat diterima (APVMA, 2004)

Kadar analit (%) Presisi (%)

≥ 10 ≤ 2

1 - 10 ≤ 5

0,1 - 1 ≤ 10

< 0,1 ≤ 20

Linieritas pada suatu metode analisis merupakan kemampuannya untuk

mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi

analit di dalam sampel. Persyaratan data linieritas yang bisa diterima dengan nilai

koefisien korelasi (r) > 0,999. Spesifisitas merupakan kemampuan suatu metode

untuk mengukur dengan akurat respon analit diantara seluruh komponen sampel

potensial yang mungkin ada dalam matriks sampel (Mulja dan Hanwar, 2003).

H. Spektrofotometri visibel

Spektrofotometer merupakan alat yang terdiri dari spektrometer dan

fotometer. Spektometer merupakan alat yang menghasilkan sinar dengan panjang


17

gelombang tertentu sedangkan fotometer merupakan alat yang mengukur

intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorpsi (Khopkar, 1990). Spektrum

visibel merupakan korelasi absorban dan panjang gelombang tidak merupakan

garis spektrum, akan tetapi terjadinya eksitasi elektronik lebih dari satu macam

pada gugus molekul yang kompleks. Spektrum ini dapat dibaca dengan alat

spektrofotometer UV-Vis dengan menggunakan sumber radiasi elektromagnetik

antara 380 nm – 780 nm. Daerah ini disebut visibel karena merupakan daerah

nampak, daerah pada panjang gelombang tersebut akan nampak berwarna

terhadap pandangan mata manusia (Mulya, 1995).

Dasar dari spektrofotometer visible ini adalah serapan oleh senyawa

yang tergantung pada struktur senyawa elektronik dari molekul. Spektra visibel

dari senyawa organik berkaitan dengan transisi di antara tingkatan-tingkatan

tenaga elektronik (Sastrohamidjojo, 2001). Bagian-bagian dalam

spektrofotometer, yaitu :

1. Sumber. Sumber cahaya yang biasa digunakan pad spektroskopi absorbsi

adalah lampu wolfarm. Pada daerah UV digunakan lampu deuterium atau

lampu hidrogen sebagai sumber. Kelebihan dari lampu wolfarm adalah energi

yang dihasilkan tidak bervariasi pada berbagai panjang gelombang.

2. Monokromator untuk mendapatkan sinar monokromatis. Alatnya berupa

prisma dan untuk mengarahkan sinar monokromayis yang diinginkan dapat

digunakan celah. Jika celah pada posisi tetap maka prisma dirotasikan untuk

mendapatkan panjang gelombang yang diinginkan.


18

3. Sel absorpsi. Pada penggunaan sinar tampak dapat digunakan kuvet kaca

tetapi pada sinar UV digunakan kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada

daerah ini.

4. Detektor, digunakan untuk memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai

panjang gelombang (Khopkar, 1990).

Bila cahaya UV-Vis dikenakan pada senyawa maka sebagian cahaya

akan diserap molekul yang mempunyai tingkatan energi yang spesifik. Sinar yang

diserap akan menaikkan elektron ikatan tingkat energi eksitasi dari ground state.

Panjang gelombang utnuk transisi elektronik adalah spesifik yang disebut dengan

λ maks. Panjang gelombang maksimum merupakan panjang gelombang yang

akan memberikan absorbansi maksimum dan dasar dari analisa kuantitatif yang

ditentukan dengan membuat kurva antara A lawan λ (Sitorus, 2009).

I. KLT Densitometri

KLT (Kromatografi Lapis Tipis) merupakan suatu metode analisis

pemisahan senyawa campuran. Sistem yang digunakan merupakan sistem

kapilaritas, jadi suatu sorben atau fase diam diletakkan dalam suatu lempengan,

yang kemudian senyawa yang akan dipisahkan diteteskan pada batas tertentu.

Senyawa ini akan terpisahkan berdasarkan kesamaan karakteristik dengan fase

geraknya. Fase gerak akan membawa senyawa melalui proses kapilaritas dan akan

terpisah membentuk bercak-bercak. Terdapat 25 jenis material berbeda yang dapat

digunakan sebagai sorben. Untuk mendapatkan hasil yang baik pemisahannya

perlu diperhatikan pemilihan sorben yang tepat. Yang perlu diperhatikan adalah


19

karakteristik dari senyawa seperti polaritas, kelarutan, ionisasi, ukuran, bentuk

partikel, dan berat molekul analit sehingga dapat ditentukan tipe sorben untuk

mendapatkan hasil yang maksimal dan optimum (Wall, 2005).

KLT dapat digunakan untuk analisis kualitatif, kuantitatif, dan

preparatif. Pada analisis kualitatif, parameter yang digunakan adalah nilai Rf. Jika

dua senyawa memiliki nilai Rf yang sama pada kondisi KLT yang sama, maka

dapat dikatakan kedua senyawa tersebut identik. Pada analisis kuantitatif terdapat

dua cara, yaitu dengan mengukur bercak langsung pada lempeng dengan ukuran

luas atau dengan teknik densitometri. Cara lain dengan mengerok bercak

kemudian dianalisis dengan metode lain, misalnya spektrofotometri. Analisis

preparatif bertujuan untuk memisahkan analit dalam jumlah banyak kemudian

senyawa yang telah dipisahkan, dianalisis lebih lanjut (Rohman, 2007).

Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap yang

berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Penjerap yang paling

sering digunakan antara lain silika, serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi

yang utama adalah partisi dan adsorbsi. Fase gerak pada KLT sering dikenal

sebagai pelarut pengembang yang akan bergerak sepanjang fase diam karena

pengaruh kapiler pada pengembangan secara mekanik (ascending) atau karena

pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar

dan Rohman, 2007).


20

Gambar 4. TLC scanner (Abo, 2010)

Densitometri merupakan metode analisis instrumental yang

mendasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan

bercak pada KLT. Evaluasi bercak KLT dilakukan dengan scanning dengan sinar

dalam bentuk celah yang dapat dipilih baik panjangnya atau lebarnya. Sinar yang

dipantulkan diukur dengan sensor cahaya. Perbedaan signal optik daerah yang

tidak mengandung bercak dengan yang mengandung bercak dihubungkan dengan

banyaknya analit yang ada melalui kurva kalibrasi yang telah disiapkan dalam

lempeng yang sama (Rohman, 2009).

J. Landasan Teori

Radikal bebas merupakan suatu molekul yang memiliki elektron tidak

berpasangan, bersifat sangat reaktif, dan tidak stabil. Radikal bebas dapat merusak

sel dan jaringan, sehingga radikal bebas dapat menyebabkan berbagai penyakit

degenaratif antara lain jantung, tekanan darah tinggi, dan kanker. Adanya radikal

bebas dapat menyebabkan stres oksidatif, maka diperlukan suatu antioksidan.

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat terjadinya oksidasi

dengan menyumbangkan elektron kepada radikal bebas, sehingga kerusakan sel


21

dapat dihambat. Cabai rawit merah merupakan tanaman yang mengandung

senyawa yang disebut kapsaisin. Kapsaisin dapat berfungsi sebagai antioksidan,

maka dilakukan pengujian aktivitas antioksidan pada cabai rawit merah dengan

menggunakan metode DPPH.

Metode DPPH merupakan salah satu metode untuk menguji aktivitas

suatu antioksidan. DPPH merupakan suatu radikal bebas yang berwana violet,

dengan adanya antioksidan yang akan menyumbangkan hidrogen, maka akan

terjadi pemudaran warna violet. Pengukuran pemudaran warna yang terjadi

dilakukan dengan spektrofotometri visibel, yang dinyatakan dalam suatu

absorbansi. Aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dinyatakan dengan harga

IC (Inhibition Concentration). Konsentrasi ekstrak yang dapat menghambat

proses oksidasi sebesar 50%, dinyatakan dengan IC50. Harga yang semakin kecil

menujukkan semakin besarnya aktivitas antioksidan. Kadar kapsaisin akan

ditentukan dengan metode KLT Densitometri. Hasil analisis kualitatif dinyatakan

dalam Rf dan untuk analisis kuantitatif dinyatakan dalam AUC. Pemisahan dapat

terjadi karena adanya interaksi senyawa dengan fase gerak dan fase diam.

K. Hipotesis

Ekstrak etanolik buah cabai rawit merah memiliki aktivitas antioksidan

yang dinyatakan sebagai IC50 dan memiliki kandungan kapsaisin yang

mempengaruhi aktivitas antioksidan sehingga ditetapkan kadarnya secara KLT

Densitometri.


22

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan penelitian

Penelitian yang berjudul uji aktivitas antioksidan pada cabai rawit

merah (Capsicum frutescens L.) dengan metode DPPH dan penetapan kadar

kapsaisin secara kromatografi lapis tipis (KLT) – densitometri merupakan jenis

penelitian eksperimental murni.

B. Variabel penelitian

1. Variabel bebas : konsentrasi ekstrak etanolik buah cabai rawit merah.

2. Variabel tergantung : %IC, kadar kapsaisin.

3. Variabel pengacau adalah sebagai berikut

a. Variabel pengacau terkendali : tempat tumbuh, umur tanaman, cara

pemanenan, waktu pemanenan, lokasi pengambilan sampel, bobot sampel.

b. Variabel pengacau tak terkendali : suhu, kelembaban, cuaca.

C. Definisi operasional

1. Cabai rawit merah merupakan buah yang sudah matang dari tanaman cabai

rawit yang diperoleh dari Pasar Beringharjo, Yogyakarta.

2. Ekstrak etanolik buah cabai rawit merah adalah ekstrak kental yang diperoleh

dari hasil penyarian dengan alat soxhlet dengan pelarut etanol.


23

3. IC50 (Inhibition Concentration 50) adalah nilai konsentrasi ekstrak etanolik

buah cabai rawit merah yang menghasilkan penangkapan 50% radikal DPPH.

4. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan

kemampuan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah untuk menangkap radikal

DPPH.

D. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

Sampel yang digunakan pada penelitian ini buah cabai rawit merah

(Capsicum frutescens L.) yang berasal dari Pasar Bringharjo, Yogyakarta. Bahan

kima kualitas farmasetis berupa akuades. Bahan kimia kualitas pro analitik

meliputi etanol 96% (E.Merck), kloroform, toluena, aseton, kapsaisin (Sigma),

DPPH, silikagel 60 F254. Bahan kualitas teknis, yaitu aluminium foil, kertas saring,

etanol 96%.

2. Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa vortex (Vortex-2

Genie), spektrofotometer UV-VIS (UVmini-1240 Shimadzu), blender, oven,

mikropipet 10-1000 µL, neraca analitik (Ohaus), vacuum rotary evaporator

(Junke & Kunkel), waterbath, alat Soxhlet, KLT Densitometer, bejana

kromatografi, tabung reaksi bertutup, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di

laboratorium analisis (Pyrex dan Iwaki).


24

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi buah cabai rawit merah dilakukan menurut Bosland,

Bailey, and Iglesias-Olivas (1996) dengan melakukan pengamatan morfologi.

2. Pengumpulan bahan

Cabai rawit merah diperoleh dari Pasar Bringharjo, Yogyakarta.

3. Pembuatan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah

Cabai rawit merah sebanyak 1 kg yang masih segar dibersihkan, dicuci

kemudian dibuang tangkainya. Cabai rawit merah dikeringkan menggunakan oven

pada suhu 50ºC kemudian dihaluskan menggunakan blender. Serbuk yang

diperoleh ditimbang sebanyak 25 gram dan dibungkus menggunakan kertas

saring. Simplisia yang telah dibungkus dimasukkan dalam alat soxhlet kemudian

tambahkan etanol 96% sebanyak 350 ml. Soxhletasi dilakukan pada suhu 70ºC,

sampai larutan jernih, selama 8 jam. Filtrat hasil ekstraksi dipekatkan dengan

menggunakan vacuum rotary evaporator.

4. Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah

a. Pembuatan larutan DPPH, sejumlah 15,8 mg serbuk DPPH dilarutkan ke

dalam etanol p.a sampai 100 ml, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan

konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan

selalu dibuat baru.

b. Pembuatan larutan stok kapsaisin, sebanyak 2,5 mg kapsaisin dilarutkan

dengan etanol p.a sampai 10,0 mL.


25

c. Pembuatan larutan pembanding, diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan

5,0 mL larutan stok kapsaisin, kemudian ditambahkan etanol p.a sampai

10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kapsaisin sebesar

25,0; 50,0; 75,0; 100; dan 125 μg/mL.

d. Pembuatan larutan uji, sejumlah 25 mg ekstrak ditimbang dan

ditambahkan etanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0;

4,0; dan 5,0 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan etanol p.a

sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100;

200; 300; 400; 500 μg/mL.

e. Uji pendahuluan, sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam

masing-masing tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1

mL etanol p.a, larutan pembanding kapsaisin 75 μg/mL, dan larutan uji

120,0 μg/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL

etanol p.a. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30

menit, amati perubahan warna yang terjadi pada larutan tersebut.

f. Penentuan panjang gelombang maksimum, pada 3 labu ukur 10 mL,

dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL larutan DPPH. Ditambahkan

larutan tersebut dengan etanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi

DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian

divortex selama 30 detik. Lalu dilakukan scanning panjang gelombang

serapan maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang

gelombang 400-600 nm.


26

g. Penentuan OT, sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-

masing tiga labu ukur 5 mL, ditambahkan masing-masing dengan 1 mL

larutan pembanding kapsaisin 25,0; 75,0; 125 μg/mL. Selanjutnya larutan

tersebut ditambahkan dengan etanol p.a hingga tanda batas. Larutan

tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca

absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang

maksimum setiap 5 menit selama 1 jam.

h. Uji aktivitas antioksidan

i) Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol), pada labu

ukur 5 mL, dimasukan sebanyak 1 mL larutan DPPH. Ditambahan larutan

tersebut dengan etanol p.a hingga tanda batas. Kemudian larutan tersebut

dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang maksimum.

Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai

kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.

ii) Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji ,

sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi 5 ml

bertutup kemudian ditambah dengan 1 mL larutan pembanding dan uji

pada berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut

ditambah dengan etanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian

divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca

absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang

maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakukan dengan tiga kali replikasi.


27

i. Validasi metode uji aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h i dan ii,

divalidasi akurasi (% recovery), presisi (%CV) spesifisitas (spektra

kontrol), dan linearitas (nilai r).

konsentrasi standar kapsaisin terukur

konsentrasi standar kapsaisin teoritis 100

Standar eviasi S konsentrasi kapsaisin terukur

rata rata konsentrasi kapsaisin terukur 100

j. Estimasi aktivitas antioksidan, hasil dari prosedur 4h i dan ii dihitung nilai

% IC dan IC50 untuk kapsaisin ekstrak etanolik buah cabai rawit merah.

5. Penetapan kadar kapsisin dengan KLT Densitometri

a. Pembuatan fase gerak, fase gerak yang digunakan, yaitu campuran toluena

– kloroform – aseton (45 : 25 : 30), v/v.

b. Pembuatan larutan stok kapsaisin, ditimbang kapsaisin sebanyak 5,2 mg

kemudian dilarutkan dalam metanol sampai 10 ml.

c. Pembuatan larutan uji, sejumlah 60 mg ekstrak etanolik buah cabai rawit

merah ditimbang kemudian ditambahkan methanol sebanyak 500 µl,

kemudian divortex selama 30 detik. Larutan uji dibuat replikasi sebanyak

3 kali.

d. Pembuatan kurva baku kapsaisin, larutan baku kapsaisin dengan kadar 520

µg/ml ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254 dengan jarak totolan 1

cm sejumlah 1; 2; 4 dan 8 μL sehingga diperoleh seri jumlah 0,52; 1,04;

2,08; dan 4,16 µg, kemudian segera dikembangkan dalam bejana

kromatografi yang telah dijenuhkan dengan fase gerak. Pengembangan

dilakukan setinggi 10 cm. Lempeng silika gel 60 F254 segera dikeluarkan


28

dan dikeringkan setelah pengembangan selesai, kemudian discanning pada

panjang gelombang 228 nm dengan densitometri.

e. Penentuan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik, sebanyak 10,0 μL

larutan ekstrak ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254, replikasi

sebnyak tiga kali kemudian dikembangkan dalam bejana kromatografi

yang telah dijenuhkan dengan fase gerak. Pengembangan dilakukan

setinggi 10 cm. lempeng silika kemudian dikeluarkan, dikeringkan, dan

discanning pada panjang gelombang 228 nm dengan densitometri.

F. Analisis Hasil

1. Uji aktivitas antioksidan

Aktivitas penangkapan radikal (%) dapat dihitung dengan

menggunakan rumus :

Absorbansilarutan kontrol – Absorbansilarutan baku/uji

Absorbansilarutan kontrol 100

Data aktivitas tersebut dianalisis dan dihitung nilai IC50 menggunakan

persamaan regresi linear dengan sumbu x adalah konsentrasi larutan uji maupun

larutan baku kapsaisin, sedangkan sumbu y adalah % IC, Lalu dianalisis secara

statistik Mann-Whitney untuk menentukan ada atau tidak adanya perbedaan

bermakna antara IC50 larutan baku kapsaisin dan larutan uji.

2. Penetapan kadar kapsaisin

Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan Rf larutan uji

dengan nilai Rf larutan baku kapsaisin. Analisis kuantitatif yang dilakukan adalah


29

penetapan kadar kapsaisin berdasarkan AUC dari baku sehingga diperoleh

persamaan regresi linier y = bx + a, yang merupakan hubungan antara kadar

dengan luas area yang dihasilkan. Data AUC larutan uji kemudian dimasukkan

dalam persamaan regresi masing-masing baku sebagai y sehingga diperoleh kadar

kapsaisin dalam %b/b.

Parameter yang digunakan untuk melihat reprodusibilitas kadar dalam

ekstrak etanolik buah cabai rawit merah adalah nilai CV. Nilai CV dapat dihitung

dengan cara :


30

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Buah

Pada penelitian dengan menggunakan sampel berupa buah maka sampel

yang akan digunakan terlebih dahulu dilakukan determinasi. Determinasi

bertujuan untuk memastikan kebenaran identitas buah serta menghindari

terjadinya kesalahan dalam pengambilan sampel pada suatu penelitian.

Determinasi buah cabai rawit merah dilakukan dengan acuan Bosland,

Bailey, and Iglesias-Olivas (1996) dengan melakukan pengamatan morfologi dan

didapatkan hasil, yaitu panjang 2,5 - 3 cm, lebar kurang lebih 1 cm, bentuk tegak

lurus, dan warna merah ketika masak. Morfologi sampel dibandingkan terhadap

gambar 5, sehingga diperoleh bahwa sampel yang digunakan merupakan Tabasco

(Capsicum frutescens).

Gambar 5. Varietas buah cabai rawit

Keterangan : beberapa gambar telah dihilangkan karena morfologinya berbeda.


31

B. Hasil Pengumpulan Bahan

Buah cabai rawit merah diperoleh dari pasar Bringharjo, Yogyakarta

pada bulan September 2012. Pengumpulan bahan dilakukan pada satu tempat

dengan tujuan untuk mengurangi variasi waktu pemanenan yang dapat

menyebabkan variasi kandungan senyawa aktif dalam buah. Pemanenan

dilakukan umumnya pada umur 2,5 - 4 bulan setelah ditanam. Buah yang dipilih

untuk digunakan sebagai sampel adalah buah yang sudah masak, masih segar dan

berwarna merah cerah pada seluruh bagian buah. Pemilihan berdasarkan kriteria

tersebut dimaksudkan untuk mendapatkan sampel yang baik untuk penelitian.

Pengambilan sampel dilakukan pada pagi hari dan dipilih yang baru diperoleh dari

perkebunan sehingga diperoleh buah yang masih segar.

C. Hasil Preparasi Sampel

Sampel berupa buah cabai rawit merah diekstraksi dengan etanol 96%

menggunakan alat Soxhlet untuk mendapatkan senyawa kapsaisin yang diduga

memiliki aktivitas antioksidan. Sampel yang akan diekstraksi terlebih dahulu

dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 50°C, tidak digunakan siar

matahari karena adanya UV dapat mengurangi efektifitas antioksidan sampel.

Kemudian setelah kering, sampel dihaluskan dengan diblender untuk

memperkecil ukuran sehingga kontak dengan cairan penyari semakin banyak, zat

yang tersari juga semakin banyak dan diayak agar didapatkan derajat kehalusan

yang sama.


32

Kapsaisin diekstraksi dengan menggunakan etanol 96% karena kapsaisin

dapat terlarut dalam etanol. Kapsaisin dapat larut dalam pelarut alkohol,

digunakan etanol karena lebih aman dan memiliki efek toksik yang lebih rendah

dibandingkan dengan metanol. Proses ekstrasi dilakukan dengan membungkus

serbuk simplisia dalam kertas saring kemudian dimasukkan kedalam alat Soxhlet,

selanjutnya etanol dituang kedalamnya, yang kemudian pelarut akan turun

kedalam labu alas bulat, setelah itu diberikan pemanasan pada suhu 70°C.

Pemanasan ini berfungsi untuk menguapkan pelarut dalam labu, kemudian pelarut

akan diembunkan kembali dengan pendingin balik, dan akan menetes kemabali

kedalam bagian Soxhlet yang berisi simplisia sehingga ekstraksi dilakukan

dengan pelarut yang selalu baru. Adanya pelarut yang selalu baru akan

memberikan ekstraksi yang sempurna karena tidak terjadi suatu kesetimbangan

konsentrasi antara cairan dalam sel dengan cairan luar sel.

Gambar 6. Alat Soxhlet (Cremonatools, 2012).


33

Proses ekstraksi dilakukan selama sekitar 8 jam, sampai cairan dalam

tabung yang berisi simplisia berwarna bening, yang menunjukkan bahwa senyawa

telah terekstraksi. Hasil ekstraksi yang didapatkan berupa larutan berwarna merah.

Larutan tersebut kemudian dibuat menjadi ekstrak kental. Pemekatan ekstrak

dilakukan dengan menguapkan pelarut dalam ekstrak. Pengupan pelarut dilakukan

dengan menggunakan Vacuum Rotary Evaporator pada suhu 60°C. Prinsip dari

alat tersebut adalah penguapan dengan mengurangi tekanan udara sehingga akan

menurunkan titik didihnya. Penurunan titik didih akan mepercepat penguapan

etanol karena pelarut akan mendidih dibawah titik didih normal (78,5°C). Adanya

rotary, yaitu pemutar labu alas bulat yang berisi ekstrak, akan memperluas luas

permukaan ekstrak, sehingga proses penguapan akan menjadi lebih cepat.

Bobot ekstrak yang diperoleh sebesar 4,5926 g, sehingga didapatkan

rendemen sebesar 15,3%.

D. Hasil Uji Pendahuluan

Uji pendahuluan merupakan pengujian untuk mengetahui aktivitas

antioksidan secara kualitatif. Pengujian ini hanya untuk mengetahui ada atau

tidaknya aktivitas antioksidan dari ekstrak, yang dibandingkan dengan kontrol.

Uji ini dilakukan dengan mereaksikan radikal bebas DPPH dengan senyawa uji.

Adanya aktivitas antioksidan pada senyawa uji akan ditunjukkan dengan

pemudaran warna ungu, yang merupakan warna DPPH (Molyneux, 2003).

Pemudaran terjadi karena adanya penangkapan elektron radikal bebas oleh

senyawa antioksidan.


34

Uji pendahuluan dilakukan dengan menggunakan kontrol negatif berupa

larutan DPPH, kontrol positif berupa kapsaisin, dan ektrak etanolik buah cabai

rawit merah. Kontrol positif dan ekstrak ditambahkan larutan DPPH yang

kemudian didiamkan selama 30 menit, yang merupakan OT teoritis. Hasil

pengujian menunjukkan hasil positif karena adanya pemudaran warna ungu,

dibandingkan terhadap larutan kontrol. Hal ini menujukkan bahwa ekstrak

etanolik buah cabai rawit merah memiliki aktivitas antioksidan melalui

penangkapan radikal bebas DPPH.

Gambar 7. Hasil uji pendahuluan (Ekstrak etanolik buah cabai rawit merah (A), Blangko

(B), Kapsaisin (C))

E. Hasil Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

1. Penentuan panjang gelombang maksimum

Pententuan panjang gelombang maksimum DPPH bertujuan agar

didapatkan absorbansi maksimal dan kepekaan analisis yang maksimal, dimana

adanya perubahan konsentrasi akan memberikan perubahan absorbansi yang besar

(Gandjar dan Rohman, 2007). Panjang gelombang DPPH secara teori adalah 517


35

nm (Molyneux, 2003). DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki

kromofor dan auksokrom, serta adanya delokalisasi elektron pada DPPH sehingga

memberikan warna ungu.

Scanning panjang gelombang dilakukan pada kisaran panjang

gelombang 400-600 nm pada larutan kontrol DPPH dengan tiga konsentrasi.

Tabel III. Hasil scanning panjang gelombang maksimum DPPH

Konsentrasi

DPPH (mM)

λ maksimum hasil scanning

(nm) Rata-rata λ maksimum

0,02 517,5

517,5 nm 0,04 517,0

0,08 518,0

Dari hasil scanning 3 konsentrasi, didapatkan rata-rata panjang

gelombang maksimum DPPH 517,5 nm. Pajang gelombang ini yang akan

digunakan untuk pengukuran selanjutnya.

2. Penentuan Operating Time

Operting time (OT) merupakan waktu yang diperlukan agar senyawa

dapat bereaksi secara optimal sehingga dapat memberikan absorbansi yang stabil.

Penentuan operating time dilakukan pada larutan baku kapsaisin konsentrasi 25,

75, dan 125 µg/ml. Pengukuran dilakukan tiap 5 menit selama 60 menit dengan

menggunakan spektrofotometer visibel. Pengukuran dilakukan pada panjang

gelombang maksimal yang telah ditentukan, yaitu 517,5 nm. Hasil pengukuran

tidak didapatkan absorbansi yang stabil atau tetap karean terjadi penurunan terus

menerus. Oleh karena itu, penentuan dilakukan dengan melihat selisih absorbansi

tiap waktu pengukuran, sehingga dapat diketahui waktu yang memiliki selisih


36

absorbansi yang lebih kecil. Penurunan absorbansi kemudian dibuat dalam suatu

grafik sehingga dapat diketahui waktu dimana absorbansi mendekati stabil.

Gambar 8. Operating Time Kapsaisin

Pada grafik diatas menunjukkan penurunan yang cukup besar, jika

dilihat dari selisihnya, dari menit 0 – 30. Mulai dari menit ke-30 ke bawah terlihat

absorbansi yang mulai stabil, sehingga OT ditentukan pada menit ke-30.

F. Hasil Validasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan

Validasi metode perlu dilakukan untuk menilai suatu metode atau

parameter yang digunakan memenuhi persyaratan untuk pengujian tersebut

(Harmita, 2004). Parameter validasi yang digunakan dalam pengujian ini, yaitu

akurasi, presisi, linieritas, dan spesifisitas.

Pengujian validasi metode dilakukan dengan menggunakan baku

kapsaisin dan ektrask etanolik cabai rawit merah, masing-masing sebanyak tiga

kali replikasi. Hasil pengujian akan didapatkan tiga persamaan regresi linier

antara konsentrasi larutan baku kapsaisin dan larutan uji dengan %IC. Dari ketiga

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Selis

ih a

bso

rban

si

Waktu (menit)

Penentuan Operating Time Baku Kapsaisin

25 µg/mL

75 µg/mL

125 µg/mL


37

replikasi akan dipilih nilai linearitas (r) yang paling baik, yaitu yang mendekati 1

atau -1, untuk digunakan dalam menghitung CV dan recovery.

Tabel IV. Hasil pengukuran %IC seri baku kapsaisin

Replikasi Konsentrasi

(µg/ml) %IC Persamaan regresi linier

I

5 31,8907

y = 1,6332x + 23,7418

r = 0,9999

10 40,0911

15 48,4055

20 56,1503

25 64,6925

II

5,008 31,6629

y = 1,6193x + 23,508

r = 0,9990

10,016 39,0661

15,024 48,6333

20,032 56,1503

25,04 63,6674

III

5,016 32,3462

y = 1,7007x + 23,5765

r = 0,9992

10,032 39,9061

15,048 49,8826

20,064 57,5117

25,08 66,1972

Tabel V Hasil pengukuran %IC seri larutan ektrak etanolik cabai rawit merah

Replikasi Konsentrasi

(µg/ml) %IC Persamaan regresi linier

I

19,92 13,7637

y = 0,3858x + 5,9074

r = 0,9998

39,84 21,3155

59,76 28,5018

79,68 36,7844

99,6 44,4580


38

II

20,8 13,1915

y = 0,5023x + 2,9756

r = 0,9999

40,16 23,2624

60,24 33,6170

80,32 43,1206

100,4 53,3333

III

21,28 12,8859

y = 0,3901x + 5,0734

r = 0,9994

42,52 22,1476

63,84 30,4698

85,12 37,8523

106,4 46,4429

1. Linieritas

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk dapat

memberikan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit

di dalam sampel. Menurut Mulja dan Hanwar (2003), data linieritas yang bisa

diterima, yaitu dengan nilai koefisien korelasi (r) > 0,999. Hasil pengujian

linearitas untuk larutan baku kapsaisin, untuk ketiga replikasi telah memiliki

linearitas yang baik sesuai dengan persyaratan tersebut. Linearitas yang paling

baik didapatkan pada replikasi pertama, yaitu 0,9999. Oleh karena itu, metode ini

dikatakan dapat memberikan linieritas yang baik untuk pengujian larutan baku

kapsaisin dengan DPPH.

Pada pengujian ektrak etanolik cabai rawit merah, ketiga replikasi juga

telah memenuhi persyaratan linearitas yang dapat diterima menurut Mulja dan

Hanwar (2003), dimana nilai koefisien korelasi paling baik diperoleh pada

replikasi kedua, yaitu 0,9999. Pada pengujian ektrak etanolik cabai rawit merah,

metode ini juga memiliki linearitas yang baik.


39

2. Akurasi

Akurasi menujukkan kedekatan antara kadar analit hasil analisis dengan

kadar analit sebenarnya. Kadar analit sebenarnya dihitung dengan menggunakan

regresi linier yang paling baik diantara tiga replikasi.

Gambar 9. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kapsaisin

Gambar 10. Kurva regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit

merah

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30

%IC

(%

)

konsentrasi (µg/ml)

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan Kapsaisin

y = 1,6332x + 23,7418 r = 0,9999

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6

%IC

(%

)

konsentrasi (µg/ml)

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan ekstrak etanolik cabai rawit merah

y = 0,5023x + 2,9756 r = 0,9999


40

Akurasi dinyatakan dalam bentuk persen perolehan kembali (recovery)

(Harmita, 2004). Persen recovery yang dapat diterima untuk analit dengan kadar

0,01%, sebesar 90-107% (Harmita, 2004).

Tabel VI. Hasil perolehan kembali uji aktivitas antioksidan kapsaisin

Replikasi

Konsentrasi

sebenarnya

(µg/ml)

Konsentrasi

terukur

(µg/ml)

% Recovery (%)

I

5 4,9895 99,79

10 10,0106 100,11

15 15,014 100,68

20 19,8436 99,22

25 25,0739 100,3

II

5,008 4,8500 96,85

10,016 9,3830 93,68

15,024 15,2409 101,44

20,032 19,8436 99,06

25,04 24,4463 97,63

III

5,016 5,2685 105,03

10,032 9,8973 98,66

15,048 16,0059 106,37

20,064 20,6772 103,06

25,08 25,9952 103,65

Berdasarkan data pada Tabel VI, menunjukkan bahwa nilai recovery

untuk kapsaisin berkisar antara 93,68% - 105,03%, yang telah memenuhi syarat

persen recovery yang dapat diterima (90 – 107%). Hal ini menunjukkan bahwa

metode yang digunakan telah memberikan akurasi yang baik.


41

Tabel VII. Hasil perolehan kembali uji aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah

cabai rawit merah

Replikasi

Konsentrasi

sebenarnya

(µg/ml)

Konsentrasi terukur

(µg/ml)

% Recovery

(%)

I

19,92 21,4774 107,82

39,84 36,5118 91,65

59,76 50,8186 85,04

79,68 67,3080 84,48

99,6 82,5849 82,92

II

20,8 20,3382 97,78

40,16 40,3878 100,57

60,24 61,0022 101,27

80,32 79,9224 99,50

100,4 100,2542 99,85

III

21,28 19,7298 92,72

42,52 38,1686 89,77

63,84 54,7366 85,74

85,12 69,4340 81,57

106,4 86,5367 81,33

Pada ekstrak etanolik buah cabai rawit merah diperoleh recovery sekitar

81,33 – 107,82%. Nilai recovery tersebut telah memenuhi syarat untuk kadar

analait sebesar 0,1 %, yaitu 80 – 120% (APVMA, 2004). Oleh karena itu, dapat

dikatakan bahwa metode ini memiliki akurasi yang baik untuk uji aktivitas

antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah.


42

3. Presisi

Presisi menunjukkan keterulangan tiap repilkasi, yang dinyatakan dalam

CV (Coevicient variation). Semakin kecil nilai CV maka presisi metode tersebut

semakin baik.

Tabel VIII. Nilai CV uji aktivitas antioksidan kapsaisin

Kadar terukur (µg/ml) SD CV (%)

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

4,9895 4,8500 5,2685 0,2131 4,2313

10,0106 9,3830 9,8973 0,3345 3,4257

15,014 15,2409 16,0059 0,4870 3,1520

19,8436 19,8436 20,6772 0,4813 2,3919

25,0739 24,4463 25,9952 0,7791 3,0950

Menurut APVMA (2004) presisi yang dapat diterima untuk kadar analit

< 0,1%, yaitu ≤ 20%. Data pada Tabel VIII menujukkan nilai CV telah memenuhi

syarat. Hal ini menujukkan bahwa metode yang digunakan mempunyai presisi

yang baik.

Tabel IX. Nilai CV uji aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit

merah

Seri

larutan

Kadar terukur (µg/ml)

SD CV (%) Replikasi

I

Replikasi

II

Replikasi

III

1 21,4774 20,3382 19,7298 0,8871 4,3243

2 36,5118 40,3878 38,1686 1,9448 5,0704

3 50,8186 61,0022 54,7366 5,1367 9,2521

4 67,3080 79,9224 69,4340 6,7534 9,3509

5 82,5849 100,2542 86,5367 9,2735 10,3278


43

Berdasarkan data yang tercantum pada Tabel IX, seluruh replikasi

memenuhi rentang presisi yang diijinkan untuk analit dengan kadar < 0,1%, yaitu

≤ 20% (APVMA, 2004), sehingga dapat disimpulkan bahwa metode yang

digunkan telah memiliki presisi yang baik.

4. Spesifitas

Spesifitas merupakan kemampuan untuk mengukur dan membedakan

suatu analit dengan keberadaan komponen-komponen lain, meliputi

ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen lain (Bievre and Gunzler,

2005). Spesifisitas juga dapat diperiksa dengan melakukan penentuan terhadap zat

yang diduga mengganggu analit (Fajgelj and Ambrus, 2000).

Pengujian spesifisitas dilakukan dengan mengukur larutan etanol yang

digunakan sebagai pelarut, kapsaisin, larutan ekstrak etanolik buah cabai rawit

merah pada panjang gelombang 517,5 nm, yang merupakan panjang gelombang

maksimum DPPH. Hasil scanning ketiga larutan tersebut (Lampiran 6), tidak

menunjukkan adanya serapan pada panjang gelombang 517,5 nm. Hal ini

menunjukkan bahwa metode yang digunakan telah spesifik untuk pengukuran

DPPH, sehingga yang terbaca hanya absorbansi DPPH.

G. Hasil Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal DPPH

Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan radikal bebas

DPPH. Pengujian dilakukan dengan mereaksikan senyawa antioksidan dengan

DPPH, kemudian diukur dengan spektofotometer. Pengukuran dengan metode

spektrofotometri berdasarkan penurunan absorbansi dari DPPH karena


44

keberadaan antioksidan (Pisoschi, Cheregi, and Danet, 2009). Antioksidan akan

mendonorkan elektron untuk radikal bebas DPPH, sehingga konsentrasi radikal

bebas DPPH akan berkurang diikuti dengan penurunan absorbansi.

Gambar 11. Gugus kromofor dan auksokrom DPPH (Prakash et al, 2001).

Pada DPPH terjadi delokalisasi elektron yang menyebabkan

terbentuknya warna ungu sehingga DPPH dapat diukur pada panjang gelombang

520 nm. Selain itu, adanya kromofor dan auksokrom juga yang menyebabkan

DPPH dapat diukur pada panjang gelombang visibel. Ketika DPPH direaksikan

dengan senyawa yang dapat mendonorkan atom hidrogen, maka DPPH akan

berubah menjadi bentuk tereduksi. Perubahan menjadi bentuk tereduksi ini akan

mengakibatkan pemudaran warna ungu atau berubah menjadi kuning (Molyneux,

2003).

Gambar 12. Reaksi DPPH dengan antioksidan (Pisoschi, et al., 2009)


45

OH3C N

H

CH3

CH3

O

OH

R

OH3C N

H

CH3

CH3

O

O

OH3C N

H

CH3

CH3

O

O

OH3C N

H

CH3

CH3

O

O

OH3C N

H

CH3

CH3O

OH3C N

H

CH3

CH3

O

O

+ RH

O

Gambar 13. Mekanisme penghambatan radikal bebas DPPH oleh kapsaisin


46

Dalam buah cabai rawit mengandung kapsaisin, kapsantin, karotenoid,

alkaloid, resin, minyak menguap, vitamin A, dan vitamin C (Ipteknet, 2008).

Aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh cabai rawit dikarenakan adanya

kandungan kapsaisin sebesar 0,1-1,5%. Kapsaisin memliki aktivitas antioksidan

disebabkan adanya gugus fenol, sehingga dapat mendonorkan elektron pada

radikal bebas DPPH (gambar 13). Vitamin C hanya akan sedikit mempengaruhi

karena vitamin C akan rusak akibat adanya pemanasan yang digunakan saat

ekstraksi. Pada penelitian ini, digunakan kapsaisin sebagai pembanding karena

telah diketahui bahwa aktivitas antioksidan yang ditimbulkan karena senyawa

kapsaisin serta kandungannya yang lebih dominan dalam kapsaisinoid.

Parameter aktivitas antioksidan dengan metode penangkapan radikal

bebas DPPH ditentukan dengan IC50. IC50 menujukkan konsentrasi yang mampu

menagkap radikal bebas sebesar 50%. Semakin kecil nilai IC50 maka semakin kuat

atau tinggi aktivitas antioksidan (Mardawati, 2008).

Tabel X. Nilai IC50 Kapsaisin dan Ekstrak etanolik buah cabai rawit merah

Larutan

uji

IC50 (µg/ml)

SD CV

(%) Replikasi

I

Replikasi

II

Replikasi

III

Rata-

rata

(µg/ml)

Kapsaisin 16,0778 16,3601 15,5368 15,99 0,42 2,62

Ekstrak

etanolik

114,2887 93,6181 115,3377 107,75 12,25 11,37

Berdasarkan data yang tercantum pada Tabel X menujukkan nilai CV

yang didapat untuk kapsaisin dan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah telah

memenuhi syarat CV yang dapat diterima, yaitu ≤20 untuk kadar analit <0,1%

(APVMA, 2004).


47

Hasil IC50 untuk kapsaisin, yaitu 15,99 ± 4,18 µg/ml dan untuk ekstrak

etanolik diperoleh sebesar 107,75 ± 12,25 µg/ml, yang artinya besarnya

konsentrasi tersebut yang dibutuhkan untuk mengurangi 50% radikal bebas

DPPH. Penggolongan kekuatan aktivitas antioksidan berdasarkan nilai IC50, yaitu

sangat kuat (<50 µg/ml), kuat (50-100 µg/ml), sedang (100-150 µg/ml), dan

lemah (151-200 µg/ml). berdasarkan penggolongan tersebut maka aktivitas

antioksidan kapsaisin pada tingkat sangat kuat, dan untuk ekstrak etanolik buah

cabai rawit merah pada tingkat sedang.

H. Penetapan kadar kapsaisin

Kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik ditetapkan dengan metode

Kromatografi lapis tipis (KLT) - Densitometri. Prinsip pemisahan dengan metode

kromatografi lapis tipis, yaitu berdasarkan perbedaan interaksi antara analit

dengan fase diam dan fase gerak. Sistem kromatografi yang digunakan pada

penelitian ini merupakan sistem dengan fase normal, yaitu fase gerak yang

digunakan lebih non polar dibandingkan fase diam. Adapun fase gerak yang

digunakan, yaitu campuran toluena-kloroform-aseton (45:25:30),v/v dan fase

diam yang digunakan, yaitu silika gel 60 F254. Fase gerak yang digunakan

memiliki nilai indeks polaritas sebesar 3,635. Berdasarkan sifat “lik diss l

lik ” maka fase gerak yang digunakan yang sudah cukup non polar untuk dapat

mengelusi senyawa kapsaisin. Pemisahan terjadi dengan adanya sistem adsorpsi

karena fase diam yang digunakan padat dengan fase gerak cair. Kelebihan dari

metode KLT-densitometri, yaitu metode yang sederhana dan mudah dilakukan.


48

serta analisis kualitatif dan kuantitatif campuran dapat dilakukan dalam waktu

yang bersamaan.

1. Analisis kualitatif

Sistem kromatografi yang digunakan merupakan sistem dengan fase

normal sehingga analit yang lebih non polar akan terelusi lebih dulu, sedangkan

yang polar akan tertahan di fase diam. Pemisahan ini terjadi karena adanya

interaksi antara analit dengan fase diam dan fase gerak yang digunakan. Silika gel

60 F254 yang digunakan sebagai fase diam, banyak memiliki gugus hidroksil pada

permukaannya. Gusus hidroksil tersebut akan berinteraksi dengan molekul yang

polar sehingga molekul polar akan tertahan di silika. Dilihat dari interaksi pada

gambar 13 dan 14, kapsaisin lebih kuat berinteraksi dengan fase gerak

dibandingkan dengan fase diam, sehingga kapsaisin dapat terelusi.

O

O

H3C N

CH3

CH3

Si O Si O Si

O

H

O

H

H

H

O

H

interaksi hidrogen

O

Gambar 14. Interaksi kapsaisin dengan fase diam


49

O

O

H3C

H

N

CH3

O

CH3

CH3 H3C

O

CH3

H CCl3

CH3 H3C

O

CH3

H

Cl Cl

Cl

CH3

H3C

O

CH3

H CCl3

Interaksi Van Der Waal Interaksi hidrogen

H

H3C

H3C

O

CH3

H CCl3

CH3 H3C

O

CH3

H

Cl

Cl

Cl

Interaksi dipol-dipol

Gambar 15. Interaksi kapsaisin dengan fase gerak

Analisis kualitatif digunakan untuk mengatahui ada atau tidaknya senyawa

kapsaisin dalam sampel. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan

nilai Rf baku dan sampel. Jika dua senyawa memiliki Rf yang hampir sama maka

dikatakan kedua senyawa tersebut identik. Pada larutan baku didapatkan nilai Rf

Kapsaisin sebesar 0,61. Nilai Rf pada pemisahan kapsaisin dalam sampel juga

diperoleh sebesar 0,61. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa dalam sampel

ekstrak terdapat senyawa kapsaisin.

2. Analisis kuantitatif

Persamaan kurva baku merupakan hubungan linier konsentrasi analit

dengan AUC (Area Under Curve). Persamaan kurva baku yang diperoleh

digunakan untuk menetapkan kadar kapsaisin dalam ekstrak.


50

Gambar 16. Kurva baku kapsaisin

Kurva baku kapsaisin didapatkan koefisien relasi sebesar 0,9994

sehingga telah memenuhi parameter linieritas yang baik, yaitu r >0,999. Pada

penelitian ini validasi metode untuk penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak

belum dilakukan. Oleh karena itu, perlu dilakukan validasi meliputi akurasi dan

presisi, sehingga didapatkan hasil yang valid. Akurasi merupakan kedekatan hasil

analisis dengan kadar sebenarnya, yang dinyatakan dalam recovery. Pada validasi

metode analisis untuk penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak, penentuan akurasi

dilakukan dengan adisi baku kedalam sampel. Hasil AUC yang diperoleh

merupakan AUC campuran baku dan sampel, sehingga untuk mendapatkan kadar

campuran baku dan sampel, nilai AUC dimasukkan kedalam persamaan regresi

linier sebagai y. Nilai AUC sampel dimasukkan kedalam persamaan regresi linier,

sehingga didapatkan kadar. Kadar terukur dari baku ditentukan dengan cara kadar

terukur campuran baku dan sampel dikurangi dengan kadar dalam sampel. Kadar

terukur dibandingkan dengan kadar sebenarnya dikalikan 100% maka akan

didapatkan persen recovery. Parameter presisi dinyatakan dalam CV yang

ditentukan dengan melakukan replikasi adisi baku dalam sampel.

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0 1 2 3 4 5

AU

C

jumlah kapsaisin (µg)

Kurva baku kapsaisin

Y = 63313,1955x - 20950,4187 r = 0,9994


51

Pada penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak dilakukan sebanyak tiga

kali replikasi. Nilai AUC pada sampel dimasukkan dalam persamaan kurva baku

y= 25066,8x – 174,5978, sehingga akan diperoleh kadar kapsaisin dalam ekstrak.

Tabel XI. Hasil penetapan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik buah cabai rawit merah

Replikasi Area

Kapsaisin

dalam sampel

(µg)

Kadar

kapsaisin

(%)

1 75530 1,5239 0,134

2 76328,9 1,5365 0,137

3 78757,8 1,5748 0,134

Rata-rata 0,135

SD 0,002

CV 1,283

Berdasarkan data pada tabel XI, kadar kapsaisin dalam ekstrak

didapatkan sebsesar 0,135% dan CV yang diperoleh sebsesar 1,283% telah

memenuhi persyaratan CV yang dapat diterima, yaitu ≤ 2 untuk kadar ≥10

(APVMA, 2004). Oleh karena itu, metode penetapan kadar kapsaisin dapat

dikatakan telah memiliki presisi yang baik.

I. Hasil Analisis Statistik

Hasil uji aktivitas antioksidan yang diperoleh, dianalisis secara statistik.

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan program SPSS 16.0. Hasil %IC

dianalisis untuk melihat distribusi data apakah normal atau tidak normal.

Perhitungan dilakukan dengan analisis statistik deskriptif menggunakan uji

Shapiro-Wilk. Hipotesis yang digunakan, yaitu Hipotesis alternatif, yaitu data

%IC berdistribusi tidak normal dan hipotesis null, yaitu data %IC berdistribusi

normal. Hasil uji yang diperoleh menunjukkan nilai p untuk kapsaisin dan ekstrak


52

etanolik sebesar 0,209 dan 0,551. Nilai p yang didapat dibandingkan dengan nilai

signifikansi yang ditentukan, yaitu 0,05 (taraf kepercayaan 95%). Dari data

didapatkan bahwa nilai p untuk kapsaisin dan ekstrak etanolik, keduanya lebih

besar daripada nilai signifikansi yang ditentukan, sehingga Hnull diterima, yaitu

data %IC mengikuti distribusi normal.

Uji selanjutnya, yaitu uji parametrik berupa uji T tidak berpasangan

sebagai parameter statistik induktif. Uji T tidak berpasangan digunakan karena

nilai IC50 antara kapsaisin dan ekstrak etanolik tidak saling berhubungan. Uji ini

digunakan untuk melihat signifikansi nilai IC50 antara kapsaisin dengan ekstrak

etanolik. Hipotesis alternatif yang digunakan adalah nilai IC50 kapsaisin dan

ekstrak etanolik berbeda bermakna dan hipotesis null (Hnull), yaitu nilai IC50

kapsaisin dan ekstrak etanolik berbeda tidak bermakna. Hasil nilai signifikansi

yang diperoleh, yaitu 0,000 antara kapsaisin dan ekstrak etanolik. Hasil tersebut

kemudian dibandingkan dengan nilai signifikansi yang ditentukan, yaitu 0,05,

didapatkan bahwa Hnull ditolak karena nilai signifikansi yang dihasilkan lebih

kecil daripada nilai signifikansi yang ditentukan. Oleh karena itu, disimpulkan

bahwa nilai IC50 kapsaisin dan ekstrak etanolik berbeda bermakna.


53

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Nilai aktivitas antioksidan ekstrak etanolik buah cabai rawit merah dengan

menggunakan radikal bebas DPPH yang dinyatakan sebagai IC50 sebesar

(107,75±12,25) µg/ml, yang didapatkan dengan ekstrapolasi.

2. Kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik buah cabai rawit merah sebesar

(0,135±0,002)% b/b, dengan catatan bahwa metode analisis kuantitatif yang

digunakan belum tervalidasi.

B. Saran

1. Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan terhadap senyawa lain yang

terkandung dalam cabai rawit merah.

2. Perlu dilakukan validasi metode analisis untuk penetapan kadar kapsaisin

dalam ekstrak etanolik cabai rawit merah.

3. Perlu dilakukan uji korelasi antara kadar kapsaisin dengan uji aktivitas

antioksidan.

4. Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan ekstrak buah cabai rawit merah

dengan metode lain.


54

DAFTAR PUSTAKA

Afo, 2010, Instrumentation, http://web.abo.fi/fak/mnf/bkf/research/slotte/

instrumentation.html, diakses tanggal 5 Januari 2013.

Agromedia, R., 2008, Tanaman Obat, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal.50-51.

Amarowicz, R., Naczk, M., and Shahidi, F., 2000, Antioxidant Activity of Crude

Tannins of Canola and Rapeseed Hulls, JAOCS, 77, 957-961.

Ansel, H. C., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, edisi IV, UI-Press,

Jakarta, hal.607-605.

APVMA, 2004, Guidelines for the Validation of Analytical Methods for Active

Constituent, Agricultural, and Veterinary Chemical Products,

http://www.apvma.gov.au, diakses tanggal 9 Desember 2012.

Badarinath, A. V., Mallikarjuna K., Chetty C. M. S., Ramkanth S., Rajan T. V. S.,

and Gnanapraskash K., 2010, A Riview on In-vitro Antioxidan Methods

: Comparisions, Correlations and Considerations, IJPRIF, 2 (2), 1276.

Bievre, P.D., and Gunzler, H., 2005, Validation in Chemical Measurement,

Springer Berlin Heiderberg, New York, p.2.

Boer, Y., 2000, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Buah Kandis (Garcinia

parvifolia Miq), Jurnal Matematika dan IPA, 1(1), 26-33.

Bondet, V., Williams-Brand, W., Berset, C., 1997, Kinetics and Mechanisms of

Antioxidant Activity using the PPH• Free Radical Method, Academic

Press Limited, 609.

Bosland, P.W., Bailey, A.L., and Iglesias-Olivas, 1996, Capsicum Pepper

Varieties and Classification, New Mexico State University, USA, pp. 1-

16.

Chemspider. 2012, Capsaicin, http://www.chemspider.com/Chemical-

Structure.1265957.html, diakses tanggal 13 November 2012.

Chremonatools, 2012, Soxhlet extractor apparatus, http://www.cremonatools.com/index.php?cPath=367, diakses tanggal 5

Januari 2013.

Depkes RI, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan

pertama, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, hal. 6, 13-38.


http://web.abo.fi/fak/mnf/bkf/research/slotte/%20instrumentation.html

http://web.abo.fi/fak/mnf/bkf/research/slotte/%20instrumentation.html

http://www.apvma.gov.au/

http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.1265957.html

http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.1265957.html

http://www.cremonatools.com/index.php?cPath=367

55

Fajgelj, A., and Ambrus, A., 2000, Principle and Practices of Method Validation,

The Royal of Chemistry, Cambridge, p. 264.

Gandjar dan Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,Yogyakarta,

hal. 253-255, 366-368.

Handerson, D. E., and Slickman, A. M., 1999, Quantitative HPLC Determination

of the Antioxidant Activity of Capsaicin on the Formation of Lipid

Hydroperoxides of Linoleic Acid: A Comparative Study against BHT

and Melatonin, J. Agric. Food Chem., 47(7), 2563.

Harmita, 2004, Petunjuk pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian, 1(3), 117-122.

Ipteknet, 2008, Cabai Rawit (Capsicum frutescens L.)

http://www.iptek.net.id/ind/pd_tanobat/view.php?id=213, diakses

tanggal 12 Mei 2012.

Jurnalkesehatan, 2012, Khasiat dan manfaat Cabai Merah dan Rawit,

http://www.jurnalkesehatan.info/khasiat-dan-manfaat-cabai-merah-dan-

rawit/, diakses tanggal 5 Januari 2013.

Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Analitik, UI Press, Jakarta, hal. 215-217.

Mardawati, E., 2008, Kajian Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kulit Manggis

(Garcinia mangostana L.) Dalam Rangka Pemanfaatan Limbah Kulit

Manggis di `Kecamatan Pusphiang Kabupaten Tasikmalaya,

http://pustaka.unpad.ac.id/wp-

content/uploads/2009/12/kajian_aktivitas_antioksidan_ekstrak_kulit_ma

nggis.pdf, diakses tanggal 19 Mei 2012.

Merck, 2012, Uji Senyawa Antioksidan dengan Metode Difenilpikril Hidrazil,

http://www.merckmillipore.co.id/life-science-research/uji-senyawa-

antioksidan-dengan-metode-dpph-difenilpikril-

hidrazil/c_H5yb.s1OVf8AAAEumQxQn72P, diakses tanggal 28 April

2012.

Molyneux, P., 2003, The Use of Stable Free Radical Diphenylpicryl

Hydrazyl(DPPH) for Estimating Antioxidant Activity, Songklanakarin J.

Sci. Technol., 26(2), 211-219.

Mulja, M., Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip dan Cara Berlaboratorium yang

Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, 3(2),

71 – 76.


http://www.jurnalkesehatan.info/khasiat-dan-manfaat-cabai-merah-dan-rawit/

http://www.jurnalkesehatan.info/khasiat-dan-manfaat-cabai-merah-dan-rawit/

http://pustaka.unpad.ac.id/wp-content/uploads/2009/12/kajian_aktivitas_antioksidan_ekstrak_kulit_manggis.pdf



56

Mulya, 1995, Analisis Intrumental, Airlangga University Press, Surabaya, hal. 26-

28.

Musa, A. A., 2008, Antioxidant and Antibacterial Activity of Commiphora

kerstingii Engl. Stem Bark Extract, Research Journal of Phytochemistry,

2(2), 106.

Pisoschi, A. M., Cheregi, M. C., and Danet, A. F., 2009, Total Antioxidant

Capacity of Some Commercial Fruit Juices : Electrochemical and

Spectrophotometrical Approaches, Molecules, 14, 481-482.

Plantamor, 2008, Cabai Rawit (Capsicum frutescens L.),

http://www.plantamor.com/index.php?plant=273, diakses tanggal 5 Mei

2012.

Prakash, A., Rigelhof, F., and Miller, E., 2010, Antioxidant Activity, Medalliaon

Laboratories.

Reyes, M.L., Escodigo, Gonzalez, E.G., Mondragon, Vazquez, E., Tzompantzi,

2011, Chemical and Pharmacological aspects of Capsaicin, Molecules,

16, 1253-1254.

Rohdiana, D., 2001, Radical Scavengers Activity of Tea Polyphenol, Majalah

Farmasi Indonesia, 12(1), 53 – 58.

Rohman, A., 2009, Kromatografi Untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta,

hal. 53,54, 217,218

Sastrohamidjojo, 2001, Spektroskopi, Liberty, Yogyakarta, hal. 11.

Setiati, S., 2003, Radikal Bebas, Antioksidan, dan Proses Menua, Majalah

Medika, Jakarta, 6 (19), 366-368.

Simanjuntak, K., 2007, Radikal Bebas dari Senyawa Toksik karbon Tetraklorida

(CCl4), Fakultas Kedektoran UPN “ t an”, 25,26.

Sitorus, M., 2009, Spektroskopi : Elusidasi Struktur Molekul Organik, Graha

Ilmu, Yogyakarta, hal. 8,16.

Supalkova V., Stavelikova H., Krizkova S., Adam V., Horna A., Havel L., et al.,

2007, “Study of Kapsaisin Content in Various Parts of Pepper Fruit by

Liquid Chromatography with Electrochemical Detection”, Acta Chim,

Slovakia, 54–59.

Voigt, R., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, edisi 5, Gajah Mada

University Press, hal. 570-573.


57

Wall, P. E., 2005, Thin Layer Chromatography: a Modern Practical Approach,

The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 2-7.

Widianti, A. dan Suhardjono, 2010, Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah

Cabai Rawit (Capsicum frutescens) Terhadap Larva Artemia salina

Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST), Fakultas

Kedokteran Universitas Diponegoro, Semarang.

Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal, Kanisius, Yogjakarta, hal.

5,20,21.


58

LAMPIRAN


59

Lampiran 1. Sertifikat Analisis Kapsaisin


60

Lampiran 2. Foto Buah Cabai Rawit Merah (matang)


61

Lampiran 3. Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol

a. Penimbangan simplisia

Berat beker = 48,4286 g

Berat beker+simplisia = 78,4482 g

Berat beker+sisa = 48,4331 g

Berat simplisia = 30,0171 g

b. Penimbangan ekstrak etanol

Berat cawan = 36,0745 g

Berat cawan+ekstrak = 40,6671 g

Berat ekstrak = 4,5926 g

Rendemen ekstrak etanol =

=

x 100%

= 15,3%

Lampiran 4. Data Penimbangan Pengujian Aktivitas Antioksidan

a. Penimbangan DPPH

Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g)

Berat kertas 0,19737 0,20027 0,20865

Berat kertas+zat 0,20141 0,20423 0,21025

Berat kertas+sisa 0,19747 0,20029 0,20867

Berat zat 0,00394 0,00394 0,00158


62

b. Penimbangan Kapsaisin


Berat kertas 0,20167 0,20189 0,21345

Berat kertas+zat 0,20793 0,20822 0,21975

Berat kertas+sisa 0,20168 0,20196 0,21348

Berat sisa 0,00625 0,00626 0,00627

c. Penimbangan Ekstrak Cabai Rawit Merah


Berat cawan 13142,8 14234,2 13142,8

Berat cawan+zat 13171 14262,5 13171,8

Berat cawan+sisa 13146,1 14237,4 13145,2

Berat zat 24,9 25,1 26,6

Lampiran 5. Perhitungan Konsentrasi Bahan Pengujian Aktivitas Antiokidan

a. Konsentrasi DPPH

Replikasi I

BM = 394,33

Mol =

= 0,00999 mmol

M =

Replikasi II

BM = 394,33

Mol =

= 0,00999 mmol


63

M =

Replikasi III

BM = 394,33

Mol =

= 0,004 mmol

M =

b. Konsentrasi Kapsaisin

1) Konsentrasi larutan induk

Replikasi I

C induk =

,25 mg/ml = 250 µg/ml

Replikasi II

C induk =

,2504 mg/ml = 250,4 µg/ml

Replikasi III

C induk =

,2508 mg/ml = 250,8 µg/ml

2) Konsentrasi larutan intermediet

Replikasi I

a) C1.V1 = C2.V2

250.1 = C2.10

C2 = 25 µg/ml

b) C1.V1 = C2.V2

250.2 = C2.10

C2 = 50 µg/ml


64

c) C1.V1 = C2.V2

250.3 = C2.10

C2 = 75 µg/ml

d) C1.V1 = C2.V2

250.4 = C2.10

C2 = 100 µg/ml

e) C1.V2 = C2.V2

250.5 = C2.10

C2 = 125 µg/ml

Larutan Replikasi II (µg/ml) Replikasi III (µg/ml)

Seri 1 25,04 25,08

Seri 2 50,08 50,16

Seri 3 75,12 75,24

Seri 4 100,16 100,32

Seri 5 125,2 125,4

3) Konsentrasi seri baku

Replikasi I

a) C1.V1 = C2.V2

25.1 = C2.5

C2 = 5 µg/ml

b) C1.V1 = C2.V2

50.1 = C2.5

C2 = 10 µg/ml

c) C1.V1 = C2.V2

75.1 = C2.5

C2 = 15 µg/ml

d) C1.V1 = C2.V2

100.1 = C2.5

C2 = 20 µg/ml


65

e) C1.V2 = C2.V2

125.1 = C2.5

C2 = 25 µg/ml


Seri 1 5,008 5,016

Seri 2 10,016 10,032

Seri 3 15,024 15,048

Seri 4 20,032 20,064

Seri 5 25,04 25,08

c. Konsentrasi Ekstrak etanol cabai rawit merah

1) Larutan induk

Replikasi I

C induk =

0,996 mg/ml = 996 µg/ml

Replikasi II

C induk =

mg/ml = 1004 µg/ml

Replikasi III

C induk =

mg/ml = 1064 µg/ml

2) Larutan intermediet

Replikasi I

a) C1.V1 = C2.V2

996.1 = C2.10

C2 = 99,6 µg/ml

b) C1.V1 = C2.V2

996 . 2 = C2.10

C2 = 199,2 µg/ml


66

c) C1.V1 = C2.V2

996 . 1 = C2.10

C2 = 298,8 µg/ml

d) C1.V1 = C2.V2

996 . 4 = C2.10

C2 = 398,4 µg/ml

e) C1.V2 = C2.V2

996 . 1 = C2.10

C2 = 498 µg/ml


Seri 1 100,4 106,4

Seri 2 200,8 212,6

Seri 3 301,2 319,2

Seri 4 100,16 425,6

Seri 5 502 532

3) Seri pengenceran

Replikasi I

a) C1.V1 = C2.V2

99,6 . 1 = C2. 5

C2 = 19,92 µg/ml

b) C1.V1 = C2.V2

199,2 . 1 = C2.5

C2 = 39,84 µg/ml

c) C1.V1 = C2.V2

298,8 . 1 = C2.5

C2 = 59,76 µg/ml

d) C1.V1 = C2.V2

398,4.1 = C2.5

C2 = 79,68 µg/ml


67

e) C1.V2 = C2.V2

498 . 1 = C2.5

C2 = 99,6 µg/ml


Seri 1 20,08 21,28

Seri 2 40,16 42,52

Seri 3 60,24 63,84

Seri 4 80,32 85,12

Seri 5 100,4 106,4

Lampiran 6. Hasil scanning larutan pengoreksi untuk pengujian aktivitas

antioksidan

a. Scanning Kapsaisin


68

b. Scanning etanol

c. Scanning ekstrak etanolik cabai rawit merah


69

Lampiran 7. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

1. Penentuan λ maksimum

Konsentrasi 25 µg/ml


70



71



72

2. Penentuan Operating Time

a. Konsentrasi 25 µg/mL

Waktu

(menit)

Absorbansi Rata-rata

Absorbansi

Selisih

absorbansi Replikasi I Replikasi II Replikasi III

5 0,496 0,350 0,630 0,492 -

10 0,477 0,316 0,610 0,468 0,024

15 0,463 0,294 0,598 0,452 0,016

20 0,455 0,276 0,586 0,439 0,013

25 0,446 0,259 0,577 0,427 0,012

30 0,438 0,251 0,570 0,420 0,008

35 0,433 0,242 0,565 0,413 0,006

40 0,427 0,234 0,559 0,407 0,007

45 0,422 0,226 0,555 0,401 0,006

50 0,417 0,217 0,551 0,395 0,006

55 0,413 0,214 0,550 0,392 0,003

60 0,411 0,208 0,546 0,388 0,004

b. Konsentrasi 75 µg/mL

Waktu

(menit)


absorbansi

Selisih


5 0,441 0,397 0,614 0,484 -

10 0,415 0,365 0,583 0,454 0,030

15 0,396 0,344 0,563 0,434 0,020

20 0,377 0,329 0,544 0,417 0,018

25 0,365 0,316 0,53 0,404 0,013

30 0,351 0,306 0,516 0,391 0,013

35 0,340 0,297 0,506 0,381 0,010

40 0,329 0,288 0,495 0,371 0,010

45 0,320 0,28 0,486 0,362 0,009

50 0,312 0,273 0,477 0,354 0,008

55 0,301 0,268 0,469 0,346 0,008

60 0,294 0,261 0,462 0,339 0,007


73

c. Konsentrasi 125 µg/mL

Waktu

(menit)


absorbansi

Selisih


5 0,322 0,321 0,53 0,391 -

10 0,284 0,281 0,479 0,348 0,043

15 0,261 0,26 0,421 0,314 0,034

20 0,243 0,244 0,401 0,296 0,018

25 0,229 0,228 0,384 0,280 0,016

30 0,218 0,221 0,369 0,269 0,011

35 0,208 0,212 0,355 0,258 0,011

40 0,199 0,205 0,345 0,250 0,009

45 0,192 0,198 0,334 0,241 0,008

50 0,186 0,191 0,325 0,234 0,007

55 0,180 0,185 0,317 0,227 0,007

60 0,175 0,181 0,31 0,222 0,005

Operating time yang digunakan adalah 30 menit.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Selis

ih a

bso

rban

si

Waktu (menit)

Penentuan Operating Time Baku Kapsaisin

25 µg/mL

75 µg/mL

125 µg/mL


74

Lampiran 8. Uji aktivitas antioksidan menggunakan DPPH

1. Kapsaisin

a. Replikasi I

Konsentrasi

(µg/ml)

Absorbansi

Kontrol

Absorbansi

Larutan pembanding %IC

Persamaan regresi

linier

5

0,878

0,598 31,8907

y = 1,6332x + 23,7418

r = 0,9999

10 0,526 40,0911

15 0,453 48,4055

20 0,385 56,1503

25 0,310 64,6925


100% = 31,8907%


100% = 40,0911%


100% = 48,4055%


100% = 56,1503%


100% = 64,6925%


75

b. Replikasi II

Konsentrasi

(µg/ml)

Absorbansi

Kontrol

Absorbansi


Persamaan regresi

linier

5,008

0,878

0,622 31,6629

y = 1,6193x + 23,508

r = 0,9990

10,016 0,535 39,0661

15,024 0,451 48,6333

20,032 0,385 56,1503

25,04 0,319 63,6674

c. Replikasi III

Konsentrasi

(µg/ml)

Absorbansi

Kontrol

Absorbansi


Persamaan regresi

linier

5,016 0,878 0,594 32,3462

y = 1,7007x + 23,5765

r = 0,9992

10,032

0,852

0,512 39,9061

15,048 0,427 49,8826

20,064 0,362 57,5117

25,08 0,288 66,1972

2. Ekstrak cabai rawit merah

Repilkasi I

Konsentrasi

(µg/ml)

Absorbansi

Kontrol

Absorbansi

Larutan uji %IC

Persamaan regresi

linier

19,92

0,821

0,708 13,7637 y = 0,3858x + 5,9074

r = 0,9998

39,84 0,646 21,3155

59,76 0,587 28,5018

79,68 0,519 36,7844

99,6 0,456 44,4580

a. Konsentrasi 19,92 µg/ml

100% = 13,7637%


76

b. Konsentrasi 39,84 µg/ml

100% = 21,3155%

c. Konsentrasi 59,76 µg/ml

100% = 28,5018%

d. Konsentrasi 79,68 µg/ml

100% = 36,7844%

e. Konsentrasi 99,6 µg/ml

100% = 44,4580%

Repilkasi II

Konsentrasi

(µg/ml)

Absorbansi

Kontrol

Absorbansi

Larutan uji %IC

Persamaan regresi

linier

20,8

0,705

0,612 13,1915

y = 0,5023x + 2,9756

r = 0,9999

40,16 0,541 23,2624

60,24 0,468 33,6170

80,32 0,401 43,1206

100,4 0,329 53,3333

Repilkasi III

Konsentrasi

(µg/ml)

Absorbansi

Kontrol

Absorbansi

Larutan uji %IC

Persamaan regresi

linier

21,28

0,745

0,649 12,8859

y = 0,3901x + 5,07334

r = 0,9994

42,52 0,580 22,1476

63,84 0,518 30,4698

85,12 0,463 37,8523

106,4 0,399 46,4429


77

Lampiran 9. Perhitungan %recovery, CV uji aktivitas antioksidan

1. Kapsaisin

a. Konsentrasi terukur dihitung dengan persamaan regersi linier

y = 1,6332x + 23,7418

y = %IC

x = konsntrasi terukur

b. %Recovery =

c. %CV =

(Rata-rata merupakan rata-rata C terukur)

C teoritis

(µg/ml) %IC

C terukur

(µg/ml)

Rata-rata

(µg/ml) SD %CV % Recovery

Seri 1

5 31,8907 4,9895

5,0360 0,2131 4,2313

99,79

5,008 31,6629 4,8500 96,86

5,016 32,3462 5,2685 105,03

Seri 2

10 40,0911 10,0106

9,7639 0,3345 3,4257

100,11

10,016 39,0661 9,3820 93,68

10,032 39,9061 9,8973 98,66

Seri 3

15 48,4055 15,1014

15,4494 0,4870 3,1520

100,68

15,024 48,6333 15,2409 101,44

15,048 49,8826 16,0059 106,37

Seri 4

20 56,1503 19,8436

20,1215 0,4813 2,3919

99,22

20,032 56,1503 19,8436 99,06

20,064 57,5117 20,6772 103,06

Seri 5

25 64,6925 25,0739

25,1718 0,7791 3,0950

100,30

25,04 63,6674 24,4463 97,63

25,08 66,1972 25,9952 103,65


78

Lampiran 10. Perhitungan IC50 kapsaisin dan ekstrak etanolik cabai rawit

merah

1. Kapsaisin

Replikasi I

y = 1,6332x + 23,7418

50 = 1,6332x + 23,7418

x =

Replikasi Persamaan regresi linier IC50 (µg/ml)

II y = 1,6193x + 23,508 16,3601

III y = 1,7007x + 23,5765 15,5368

2. Ekstrak etanolik cabai rawit merah

Replikasi I

y = 0,3858x + 5,9074

50 = 0,3858x + 5,9074

x =

Replikasi Persamaan regresi linier IC50 (µg/ml)

II y = 0,5023x + 2,9756 93,6181

III y = 0,3901x + 5,0734 115,1169


79

Lampiran 11. Perhitungan jumlah kapsaisin untuk kurva baku

C induk =

Perhitungan konsentrasi:

Seri 1 =

Seri 2 =

Seri 3 =

Seri 4 =

Seri baku (µL) Jumlah kapsaisin (µg)

1 0,51

2 1,04

4 2,08

8 4,16


80

Lampiran 12. Hasil kromatogram untuk penetapan kadar kapsaisin

1. Kurva baku kapsaisin


81

2. Ekstrak etanolik cabai rawit


82

Lampiran 13. Perhitungan persamaan kurva baku kapsaisin

Standar (µg) Area Persamaan regresi linier

0,52 8948,54

Y = Bx+A

Y = 63313,1955x – 20950,4187

r = 0,9994

1,04 45095,01

2,08 115733,3

4,16 240264,4

Lampiran 14. Perhitungan kadar kapsaisin dalam ekstrak etanolik cabai rawit

merah

Replikasi

Berat

sampel

(g)

Volume

spoting

(µl)

Jumlah

spoting

sampel

(µg)

Area

Kapsaisin

dalam sampel

(µg)

Kadar

kapsaisin

(%)

1 0,0567 10 1134 75530 1,5239 0,134

2 0,0559 10 1118 76328,9 1,5365 0,137

3 0,0589 10 1178 78757,8 1,5748 0,134

Rata-rata 0,135

Contoh perhitungan :

Jumlah spoting sampel :

Kapsaisin dalam sampel =

Y = 63313,1955x – 20950,4187

75530 = 63313,1955x – 20950,4187

x = 1,5239 µg

Kadar kapsaisin =


83

Lampiran 16. Hasil analisis statistik

Tests of Normality

Kolmogorov-Smirnov

a Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

%IC_Kapsaisin .154 15 .200* .922 15 .209

%IC_Ekstrak .119 15 .200* .952 15 .551

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

Independent Samples Test

Levene's

Test for

Equality

of

Variances t-test for Equality of Means

F Sig. t df

Sig.

(2-

tailed

)

Mean

Difference

Std.

Error

Differenc

e

95% Confidence Interval of

the Difference

Lower Upper

IC50 Equal

variances

assumed

14.7

11 .019 -12.968 4 .000 -91.7566000

7.07564

42 -111.4017376 -72.1114624

Equal

variances

not

assumed

-12.968 2.00

5 .006 -91.7566000

7.07564

42 -122.1328217 -61.3803783


84

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan

pada Cabai Rawit Merah (Capsicum frutescens)” dengan

Metode DPPH (1,1–difenil-2-pikrilhidrazil) dan Penetapan

Kadar Kapsaisin dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) –

Densitometri” memiliki nama lengkap Christina. Penulis

dilahirkan di Surakarta pada tanggal 17 Maret 1991, yang

merupakan anak kedua dari pasangan Liem Sing Bien dan

Tan Kwie Nyo. Pendidikan formal yang pernah ditempuh

oleh penulis yaitu TK Widyapura (1996 – 1997), SD

Tegalmulyo (1997 - 2003), SMP N 9 Surakarta (2003 -

2006), SMK Farmasi Nasional Surakarta (2006 - 2009) dan

melanjutkan kuliah di Fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada

tahu 2009. Selama kuliah penulis aktif dalam berbagai kegiatan seperti International

Pharmaceutical Student Federation (IPSF) sebagai Student Exchange Officer (SEO),

Student Exchange Programme (SEP) sebagai sie transportasi, Panitia pelepasan

wisuda sebagai bendahara. Selain itu penulis juga pernah menjadi asisten dalam

praktikum FTS Solid, praktikum Bentuk Sediaan Farmasi, dan praktikum Bioanalisa.


PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk filevi LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk filevi LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...