PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17660/2/088114029_Full.pdf ·...

i

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-

DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KLORAMFENIKOL

DAN LIDOKAIN HCl SEBAGAI ZAT AKTIF DI DALAM OBAT TETES

TELINGA COLME®

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Regina Clarissa

NIM : 088114029

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2011

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)-

DENSITOMETRI PADA PENETAPAN KADAR KLORAMFENIKOL

DAN LIDOKAIN HCl SEBAGAI ZAT AKTIF DI DALAM OBAT TETES

TELINGA COLME®

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Regina Clarissa

NIM : 088114029

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2011


iii


iv


v

HALAMAN PERSEMBAHAN

Untuk yang tersayang,

Mami, Papa, Vania, Rio

Sahabat-sahabatku, serta

Almamaterku


vi


vii


viii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

segala berkat dan anugerah yang telah diberikan-Nya, sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi yang berjudul Validasi Metode Kromatografi Lapis Tipis

(KLT)-Densitometri pada Penetapan Kadar Kloramfenikol dan Lidokain HCl

Sebagai Zat Aktif di dalam Obat Tetes Telinga Colme®. Skripsi ini disusun

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm).

Selama perkuliahan, penelitian, dan penyusunan skrispsi ini, penulis

mendapat banyak bantuan dari berbagai pihak yang berupa bimbingan,

dukungan, semangat, kritik, dan saran yang membangun. Oleh karena itu, pada

kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-

besarnya kepada:

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma.

2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing atas segala

bimbingan, perhatian, semangat, kritik, dan saran selama penelitian dan

penyusunan naskah.

3. Ibu Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen penguji atas segala arahan,

masukan, kritik, dan saran yang telah diberikan kepada penulis.

4. Ibu Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si., selaku dosen penguji atas segala

arahan, masukan, kritik, dan saran yang telah diberikan kepada penulis.


ix

5. Ibu Rini Dwiastuti, M.Sc., Apt., selaku Kepala Laboratorium Universitas

Sanata Dharma atas ijin yang diberikan untuk melakukan penelitian di

laboratorium Kimia Analisis Intrumental.

6. Ibu dr. Fenty, M.Kes., Sp.PK, selaku dosen pembimbing akademik atas

pendampingannya dari semester satu.

7. Segenap dosen dan karyawan atas ilmu dan pengalaman yang diberikan,

sehingga berguna dalam penyusunan skripsi ini.

8. Bapak Siswanto Tanuatmojo, selaku Manager Research and Development

PT. Interbat atas pemberian baku kloramfenikol, baku lidokain HCl, dan

sampel obat tetes telinga Colme®.

9. Mas Bimo, Mas Parlan, Mas Kunto, selaku laboran yang telah banyak

membantu penulis selama penelitian di laboratorium.

10. Pak Otok, atas bantuannya dalam pengadaan bahan-bahan yang diperlukan

selama penelitian.

11. Lele dan Felicia sebagai teman seperjuangan satu judul dalam penyelesaian

penelitian ini, atas kebersamaan, semangat, keceriaan, nasehat, dan

dukungannya selama ini di laboratorium dan kuliah.

12. Sari, Tere, Wiwie sebagai teman satu kelompok skripsi kloram-lido atas

kebersamaan, semangat, dan keceriaan selama di laboratorium maupun

kuliah.

13. Novi, Cure, Citra, Susan, Susi, Nona, Ayesa, Amel, Dina, sebagai teman

satu bimbingan skripsi atas kebersamaan, semangat, dan keceriaan selama

ini.


x

14. Rika, Meimei, Bravo, Lala, Elya, Widi, Metri, Lisu untuk kebersamaan,

keceriaan dan semangat selama ini.

15. Apostolos Family atas kebersamaan, keceriaan, dan persekutuan di PMK

selama ini.

16. Teman-teman kelompok praktikum A, khususnya kelompok A2, dan teman-

teman angkatan 2008 atas semangat, kerja sama, dan kebersamaannya

selama ini.

17. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh penulis, terima

kasih atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, sehingga penulis

dapat menyelesaikan skrispi ini.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan di dalam penulisan

skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang

membangun untuk perkembangan selanjutnya.

Penulis


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL………………………………………….................. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………….....…... iii

HALAMAN PENGESAHAN……………………………………..…….. iv

HALAMAN PERSEMBAHAN………….………………………..…….. v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA…………………………..……... vi

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA………….………… vii

PRAKATA…………………………………………………….………… viii

DAFTAR ISI…………………………………………………….………. xi

DAFTAR TABEL…………………………………………….…………. xv

DAFTAR GAMBAR………………………………………….……….... xvi

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………..…….... xviii

INTISARI………………………………………………….…….....…..... xx

ABSTRACT………………………………………………………..…....... xxi

BAB I PENGANTAR………………………………………….…...….... 1

A. Latar Belakang……………………………………………………… 1

1. Permasalahan……………………………………………….…... 3

2. Keaslian Penelitian……………………………………………… 3

3. Manfaat Penelitian……………………………………………… 4

B. Tujuan………………………………………………………………. 4

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA………………………..………..…. 5

A. Kloramfenikol………………………………………………............. 5


xii

B. Lidokain HCl……………………………………………….……….. 6

C. Obat Tetes Telinga………………………………………………….. 7

D. Obat Tetes Telinga Colme®………………………………………… 7

E. Kromatografi Lapis Tipis…………………………………………… 8

1. Tinjauan umum……………………………………….………… 8

2. Sistem kromatogfrafi lapis tipis……....……………..………….. 12

F. Densitometer…………………………………………….………….. 15

G. Validasi Metode……………………………………….………......... 16

1. Tinjauan umum……………………………………….………… 16

2. Parameter validasi……………………………………….……… 18

H. Landasan Teori……………………………………………………... 21

I. Hipotesis……………………………………………………………. 22

BAB III METODE PENELITIAN…………………....………….. 23

A. Jenis dan Rancangan Penelitian……………………………………. 23

B. Variabel Penelitian…………………………………………………. 23

C. Definisi Operasional………………………………………………... 23

D. Bahan Penelitian……………………………………………………. 24

E. Alat Penelitian……………………………………………………… 24

F. Tata Cara Penelitian………………………………………………… 25

1. Pembuatan fase gerak................................................................... 25

2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol........................................ 25

3. Pembuatan larutan baku lidokain HCl.......................................... 25

4. Pembuatan larutan baku campuran kloramfenikol:lidokain HCl


xiii

(1:10)............................................................................................ 25

5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan

lidokain HCl................................................................................. 26

6. Pembuatan kurva baku.................................................................. 26

7. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) baku tunggal... 27

8. Penentuan recovery dan KV baku campuran

kloramfenikol:lidokain HCl 300:3000 ng, 600:6000 ng, dan

900:9000 ng.................................................................................. 27

9. Penentuan recovery dan KV adisi baku dalam sampel................. 28

G. Analisis Hasil...................................................................................... 30

1. Selektivitas.................................................................................... 30

2. Linearitas....................................................................................... 30

3. Akurasi.......................................................................................... 30

4. Akurasi adisi baku dalam matriks sampel..................................... 30

5. Presisi............................................................................................ 30

6. Range............................................................................................. 31

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN................................................... 32

A. Pembuatan Fase Gerak........................................................................ 32

B. Pembuatan Larutan Baku.................................................................... 32

C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan...................................... 33

D. Analisis Kualitatif............................................................................... 36

E. Pembuatan Kurva Baku Kloramfenikol dan Lidokain HCl................ 41

F. Validasi Metode Analisis.................................................................... 44


xiv

1. Selektivitas.................................................................................... 44

2. Linearitas....................................................................................... 45

3. Akurasi.......................................................................................... 46

4. Presisi............................................................................................ 48

5. Range............................................................................................ 50

6. Akurasi dan presisi adisi baku kloramfenikol dan lidokain HCl

dalam sampel................................................................................. 51

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................... 56

A. Kesimpulan......................................................................................... 56

B. Saran.................................................................................................... 56

DAFTAR PUSTAKA................................................................................ 57

LAMPIRAN............................................................................................... 60

BIOGRAFI PENULIS............................................................................... 101


xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut.................................................. 14

Tabel II. Parameter analisis validasi metode......................................... 18

Tabel III. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima....................... 19

Tabel IV. Kriteria KV yang dapat diterima............................................ 20

Tabel V. Data replikasi kurva baku kloramfeikol................................. 42

Tabel VI. Data replikasi kurva baku lidokain HCl................................. 42

Tabel VII. Nilai Rs sampel....................................................................... 45

Tabel VIII. Data recovery baku tunggal.................................................... 46

Tabel IX. Data recovery baku campuran kloramfenikol:lidokain HCl

(1:10)...................................................................................... 47

Tabel X. Data koefisen variasi (KV) baku tunggal............................... 48

Tabel XI. Data Koefisien Variasi (KV) baku campuran

kloramfenikol:lidokain HCl (1:10)......................................... 49

Tabel XII. Recovery dan KV adisi baku kloramfenikol dalam sampel.... 54

Tabel XIII. Recovery dan KV adisi baku lidokain HCl dalam sampel..... 54


xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur kloramfenikol........................................................... 5

Gambar 2. Struktur lidokain HCl............................................................. 6

Gambar 3. Obat tetes telinga Colme®...................................................... 8

Gambar 4. Retardation Factor (Rf)......................................................... 12

Gambar 5. Struktur silika gel................................................................... 13

Gambar 6. Densitometer.......................................................................... 16

Gambar 7. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol (A)

dan lidokain HCl (B).............................................................. 34

Gambar 8. Spektra kloramfenikol (300, 600, dan 900 ng) dan lidokain

HCl (3000, 6000, dan 9000 ng)............................................. 36

Gambar 9. Perbandingan nilai Rf baku kloramfenikol dan lidokain HCl

dengan Rf sampel................................................................... 38

Gambar 10. Interkasi kloramfenikol dengan fase diam silika gel............. 39

Gambar 11. Interkasi lidokain dengan fase diam silika gel....................... 39

Gambar 12. Interaksi kloramfenikol dengan fase gerak toluena:

n-heksana:metanol:dietilamin (19,75;3,75;5;1,5).................. 40

Gambar 13. Interaksi lidokain dengan fase gerak toluena:

n-heksana:metanol:dietilamin (19,75;3,75;5;1,5).................. 40

Gambar 14. Kurva hubungan antara jumlah kloramfenikol (ng) dan

AUC (replikasi II hasil modifikasi)....................................... 43

Gambar 15. Kurva hubungan antara jumlah lidokain HCl (ng) dan AUC


xvii

(replikasi II)........................................................................... 43

Gambar 16. Kromatogram sampel............................................................. 45

Gambar 17. Range jumlah kloramfenikol................................................. 50

Gambar 18. Range jumlah lidokain HCl................................................... 51

Gambar 19. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku

kloramfenikol......................................................................... 52

Gambar 20. Kromatogram sampel dengan penambahan baku

kloramfenikol......................................................................... 52

Gambar 21. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku lidokain

HCl......................................................................................... 53

Gambar 22. Kromatogram sampel dengan penambahan baku lidokain

HCl......................................................................................... 53


xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. CoA kloramfenikol........................................................... 60

Lampiran 2. CoA lidokain HCl............................................................. 61

Lampiran 3. Sistem densitometer.......................................................... 62

Lampiran 4. Data penimbangan bahan.................................................. 62

Lampiran 5. Spektra kloramfenikol (300, 600, 900 ng) dan lidokain

HCl (3000, 6000, 9000 ng)............................................... 64

Lampiran 6. Kromatogram baku kloramfenikol 300 ppm (replikasi

2)....................................................................................... 66

Lampiran 7. Kromatogram baku lidokain HCl 3000 ppm (replikasi

2)....................................................................................... 68

Lampiran 8. Data kurva baku kloramfenikol dan lidokain HCl............ 70

Lampiran 9. Kromatogram sampel dan perhitungan nilai resolusi

sampel............................................................................... 70

Lampiran 10. Kromatogram presisi dan akurasi baku tunggal

kloramfenikol.................................................................... 71

Lampiran 11. Kromatogram presisi dan akurasi baku tunggal lidokain

HCl.................................................................................... 75

Lampiran 12. Presisi dan akurasi baku tunggal kloramfenikol............... 78

Lampiran 13. Presisi dan akurasi baku tunggal lidokain HCl................. 80

Lampiran 14. Kromatogram presisi dan akurasi baku campuran

kloramfenikol:lidokain HCl (1:10)................................... 82


xix

Lampiran 15. Presisi dan akurasi baku campuran

kloramfenikol:lidokain HCl (1:10)................................... 87

Lampiran 16. Kromatogram sampel tanpa penambahan baku................ 89

Lampiran 17. Kromatogram sampel dengan penambahan baku............. 93

Lampiran 18. Presisi akurasi adisi baku kloramfenikol dalam sampel... 97

Lampiran 19. Presisi akurasi adisi baku lidokain HCl dalam sampel..... 99


xx

INTISARI

Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan validasi metode yang akan

digunakan untuk melakukan penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain HCl

yang merupakan zat aktif di dalam obat tetes telinga Colme®. Penelitian ini

merupakan penelitian non-eksperimental deskriptif. Metode yang digunakan

adalah Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-densitometri dengan fase diam silika gel

60 F254 dan fase gerak hasil optimasi yaitu toluena:n-heksana:metanol:dietilamin

(19,75:3,75:5:1,5).

Parameter validasi yang diteliti meliputi selektivitas, linearitas, akurasi,

presisi, dan range. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode KLT-

densitometri telah memenuhi parameter selektivitas dengan nilai Rs = 2,95,

linearitas dengan nilai r = 0,9998 (kloramfenikol) dan 0,9997 (lidokain HCl).

Recovery untuk kloramfenikol 300 dan 600 ng masing-masing adalah 92,39-

103,01% dan 91,29-1-3,13% , serta lidokain HCl 6000 ng dengan recovery

95,97-104,38% telah memenuhi parameter akurasi. KV untuk kloramfenikol

300, 600, dan 900 ng masing-masing adalah 4,66; 5,08; dan 4,92%, serta

lidokain HCl 6000 ng dengan KV 3,78% telah memenuhi parameter presisi.

Range 300-600 ng untuk kloramfenikol dan tidak ditemukan range untuk

lidokain HCl, namun hanya pada satu titik yaitu 6000 ng untuk lidokain HCl.

Kata kunci: kloramfenikol, lidokain HCl, KLT-densitometri, validasi metode


xxi

ABSTRACT

The purpose of this study is to validate the method which will be used

to perform the assay of chloramphenicol and lidocaine HCl which are the active

substances in the Colme® ear drop. This study is a non-experimental descriptive

study. The method that is used is Thin Layer Chromatography (TLC)-

densitometry using silica gel 60 F254 for the stationary phase and the

optimization of mobile phase toluene:n-hexane:methanol:diethylamine

(19,75:3,75:5:1,5).

Validation parameters which are examined in this study are selectivity,

linearity, accuracy, precision, and range. The results showed that TLC-

densitometry method has complied selectivity with Rs value = 2,95 and linearity

with r = 0,9998 (chloramphenicol) and r = 0,9997 (lidocaine HCl). Recovery for

chloramphenicol 300 and 600 ng are 92,39-103,01% and 91,29-1-3,13%, and

recovery for lidocaine HCl 6000 ng is 95,97-104,38% have complied the

parameter of accuracy. CV values for chloramphenicol 300, 600, 900 ng are

4,66; 5,08; and 4,92%, and CV for lidocaine HCl 6000 ng is 3,78% have

complied the parameter of precision. Range 300-600 ng for chloramphenicol and

range for lidocaine HCl is not found, but there is just one point 6000 ng for

lidocaine HCl.

Key words: chloramphenicol, lidocaine HCl, TLC-densitometry, method

validation


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Antibiotik merupakan obat antiinfeksi yang secara drastis telah berhasil

menurunkan morbiditas dan mortalitas berbagai penyakit infeksi, sehingga

penggunaan antibiotik meningkat secara tajam. Salah satu penyakit infeksi yang

cukup tinggi prevalensinya di Indonesia adalah Otitis Media Supuratif Kronik

(OMSK) yaitu 3%. Angka ini termasuk tinggi menurut WHO karena ada di

kisaran 2-4% (Anonima, 2010).

Pengobatan penyakit infeksi telinga biasanya menggunakan obat tetes

telinga. Obat tetes telinga adalah obat tetes yang digunakan dengan cara

meneteskan ke dalam telinga. Kecuali dinyatakan lain, dibuat dengan

menggunakan pembawa bukan air (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan

Makanan RI, 1995).

Obat tetes telinga yang akan dianalisis adalah Colme®. Di dalam

penelitian ini, penulis akan melakukan penjaminan mutu terhadap obat tetes

telinga Colme®

. Penjaminan mutu dapat dilakukan dengan menetapkan kadar

senyawa-senyawa yang terdapat di dalam obat tetes telinga Colme®, yaitu

kloramfenikol dan lidokain HCl, sehingga diperoleh jaminan bahwa kadar yang

terukur sama dengan kadar yang tertera di dalam kemasan.

Kloramfenikol sukar larut dalam air, mudah larut dalam etanol,

propilenglikol, aseton, dan etil asetat. Kloramfenikol memiliki pH antara 4,5


2

dan 7,5 (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

Kloramfenikol memiliki pKa 5,5; log P sebesar 1,1; dan panjang gelombang

maskimum kloramfenikol di dalam air adalah 278 nm ( =298) (Clarke,

1986).

Lidokain HCl memiliki pH antara 5 dan 7 (Direktorat Jendral

Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). PKa lidokain HCl adalah 7,86 dan

panjang gelombang maskimun di larutan asam adalah 263 nm ( =19). Satu

bagian lidokain HCl larut dalam 0,7 bagian air, 1,5 bagian etanol, 40 bagian

kloroform, dan tidak larut dalam eter (Clarke, 1986).

Secara umum, penggunaan kromatografi untuk analisis kualitatif dan

kuantitatif teridiri dari kromatografi kolom, gas, kertas, lapis tipis, dan KCKT

(United States Pharmacopeial Convention, 1995). Di dalam penelitian ini,

metode yang dipilih adalah Kromatografi Lapis Tipis (KLT)-densitometri karena

dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif, serta memiliki beberapa

keuntungan dibandingkan dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

atau kromatografi gas, yaitu pemilihan fase gerak lebih fleksibel, lebih mudah,

terdapat beberapa macam teknik optimasi pemisahan seperti pengembangan dua

dimensi, pengembangan bertingkat, dan pembaceman fase diam dapat dilakukan

pada KLT, serta semua komponen dalam sampel dapat terdeteksi (Rohman,

2009).

Penelitian ini merupakan suatu rangkaian penelitian dalam rangka

penjaminan mutu obat tetes telinga Colme® yang terdiri dari optimasi, validasi

metode, dan penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain HCl dalam obat tetes


3

telinga Colme®

. Di dalam penelitian ini, penulis mengambil bagian pada tahap

validasi metode. Validasi metode adalah proses mendokumentasikan atau

membuktikan metode analisis yang digunakan dapat memberikan data analisis

yang acceptable untuk penggunaan yang dimaksudkan (Christian, 2004).

Validasi ini bertujuan untuk memberikan jaminan bahwa metode

analisis dengan sistem yang telah dioptimasi sebelumnya, yaitu fase gerak

toluena:n-heksana:metanol:dietilamin (19,75:3,75:5:1,5) dan fase diam silika gel

60 F254 (Hernat, 2011), telah memenuhi parameter-parameter validasi yaitu

selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range, sehingga dapat memberikan

hasil analisis yang valid. Oleh karena itu, tahap validasi metode KLT-

densitometri ini sangat penting untuk dilakukan sebelum melakukan

penetepakan kadar kloramfenikol dan lidokain HCl dalam obat tetes telinga

Colme®.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang di atas maka diperoleh permasalahan yaitu

apakah metode KLT-densitometri untuk penetapan kadar kloramfenikol dan

lidokain HCl sebagai zat aktif di dalam obat tetes telinga Colme®

memenuhi

parameter-parameter validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi,

presisi, dan range?

2. Keaslian penelitian

Penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain HCl yang pernah

dilakukan adalah penetapan kadar secara tunggal. Di dalam jurnal karya Vovk

dan Simonovska (2005), pengembangan dan validasi metode KLT-densitometri


4

untuk menetapkan kadar residu kloramfenikol di peralatan farmasetika

menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana:etil asetat (35:65

v/v). Pada penelitian yang dilakukan oleh Kiszka dan Madro (2002), pemisahan

lidokain dilakukan menggunakan KLT dengan fase gerak

hexana:toluena:dietilamin dengan perbandingan 65:20:5.

Penelitian yang dilakukan oleh penulis adalah melakukan validasi

metode KLT-densitometri untuk menetapkan kadar kloramfenikol dan lidokain

HCl di dalam campuran yang belum pernah dilakukan pada penelitian

sebelumnya.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

sumbangan ilmiah tentang penggunaan metode KLT-densitometri pada

penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain HCl dalam campuran.

b. Manfaat praktis. Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan

informasi mengenai selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range metode

KLT-densitometri untuk penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain HCl dalam

obat tetes telinga Colme®

.

B. Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa metode KLT-

densitometri telah memenuhi parameter-parameter validasi yaitu selektivitas,

linearitas, akurasi, presisi, dan range, sehingga dapat digunakan untuk penetapan

kadar kloramfenikol dan lidokain HCl dalam obat tetes telinga Colme®.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kloramfenikol

Kloramfenikol mengandung tidak kurang dari 97,0% dan tidak lebih

dari 103,0% C11H12Cl2N2O5. Obat tetes telinga kloramfenikol mengandung tidak

kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 130,0% C11H12Cl2N2O5 dari yang tertera

pada etiket. Pemerian dari kloramfenikol adalah hablur halus berbentuk jarum

atau lempeng memanjang, putih hingga putih kelabu atau putih kekuningan,

larutan praktis netral terhadap lakmus P, dan stabil dalam larutan netral atau

larutan agak asam. Kloramfenikol memiliki pH antara 4,5 dan 7,5 (Direktorat

Jendral pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995). Kloramfenikol memiliki pKa

5,5; log P sebesar 1,1; dan panjang gelombang maskimum kloramfenikol di

dalam air adalah 278 nm ( =298) (Clarke, 1986). Kloramfenikol larut dalam

air, sangat larut dalam alkohol, dan di dalam propilenglikol (The British

Pharmacopoeia Commission, 2011).

Gambar 1. Struktur kloramfenikol (Anonim

a, 2011)

Kloramfenikol merupakan antibiotik yang semula berasal dari sejenis

Streptomyces, namun kemudian dibuat secara sintesis. Kloramfenikol dapat

berkhasiat sebagai bakteriostatis dan bakterisida. Mekanisme kerjanya dengan

menghambat sintesis protein pada bakteri (Tjay Tan dan Rahardja, 2010).


6

B. Lidokain HCl

Lidokain HCl mengandung tidak kurang dari 97,5% dan tidak lebih dari

102,5% C14H22N2O.HCl, dihitung terhadap zat anhidrat. Larutan topikal lidokain

HCl mengandung C14H22N2O.HCl tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari

105,0% dari jumlah yang tertera pada etiket. Pemerian dari lidokain HCl adalah

serbuk hablur putih, tidak berbau, dan rasa sedikit pahit. Lidokain HCl sangat

mudah larut dalam air dan dalam etanol, larut dalam kloroform, dan tidak larut

dalam eter (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1995). Lidokain

HCl memiliki pH 4,5-5 dan titik leleh 74-79 o

C (The British Pharmacopoeia

Commission, 2011). Lidokain HCl memiliki pKa 7,9 dan panjang gelombang

maskimun di larutan asam yaitu 263 nm ( =19) (Clarke, 1986).

Gambar 2. Struktur lidokain HCl (Anonim

b, 2010)

Lidokain (otopain) adalah zat pemati rasa lokal yang pada kulit dan

selaput lendir mampu menghalangi rasa nyeri, perasaan terbakar, dan gatal.

Terdapat dalam tetes telinga 0,5%, tetapi tidak digunakan pada perforasi selaput

gendang dan pada radang telinga atau congek. Berhubung tidak mengakibatkan

hipersensitasi, lidokain banyak digunakan dalam banyak sediaan topikal (Tjay

Tan dan Rahardja, 2010).


7

C. Obat Tetes Telinga

Tetesan (guttae) adalah sediaan cair yang mengandung bahan obat atau

obat atau bahan obat dan obat terlarut, teremulsi atau tersuspensi, ditakar

berdasar jumlah tetesan, digunakan untuk diminum, dan diisikan ke dalam

wadah bertakaran ganda. Untuk tetesan tertentu yang digunakan di telinga,

dinamakan tetes telinga (otoguttae) (Voigt, 1994).

Obat tetes telinga adalah obat tetes yang digunakan dengan cara

meneteskan ke dalam telinga. Kecuali dinyatakan lain, dibuat dengan

menggunakan pembawa bukan air. Cairan pembawa yang digunakan harus

mempunyai kekentalan yang cocok agar obat mudah menempel pada dinding

telinga, umumnya digunakan gliserol dan propilenglikol, dapat juga digunakan

etanol, heksilenglikol, dan minyak lemak nabati (Direktorat Jendral Pengawasan

Obat dan Makanan RI, 1974).

D. Obat Tetes Telinga Colme®

Obat tetes telinga Colme® kemasan botol 8 mL yang diproduksi oleh

PT. Interbat mengandung kloramfenikol 10% dan lidokain HCl 4%. Indikasi

untuk pengobatan otitis ekterna dan media dan dosis pemakaian 1-2 tetes, 3-4

kali sehari untuk anak-anak dan dewasa (Anonimb, 2011). Kontra indikasi bagi

penderita yang hipersensitif terhadap kloramfenikol dan lidokain HCl, serta

perforasi membran timpani. Colme® disimpan dalam kondisi tertutup, di bawah

25oC, jangan disimpan dalam lemari pembeku, terlindung dari cahaya matahari,


8

hindari terjadinya kontaminasi, dan jauhkan dari jangkauan anak-anak

(Anonimc, 2011).

Gambar 3. Obat tetes telinga Colme

® (Anonim

c, 2011)

E. Kromatografi Lapis Tipis

1. Tinjauan umum

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut

oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua

fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam

arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas

disebabkan adanya perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap,

ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Dengan demikian masing-masing

zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (Direktorat

Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995).

Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi

diantara dua fase, satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase

gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat

terlarut lainnya, yang terelusi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlarut

dibawa melalui media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau

gas yang disebut eluen. Fase diam dapat berfungsi sebagai penjerap, seperti


9

halnya penjerap alumina yang diaktifkan, silika gel, resin penukar ion,

atau dapat bertindak melarutkan zat terlarut, sehingga terjadi partisi antara fase

diam dan fase gerak. Dalam proses terakhir ini, suatu lapisan cairan pada suatu

penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam. Partisi merupakan

mekanisme pemisahan yang utama dalam kromatografi cair-gas, kromatografi

kertas, dan bentuk kromatografi kolom yang disebut kromatografi cair-cair.

Dalam praktek, sering kali pemisahan disebabkan oleh suatu kombinasi efek

adsorpsi dan partisi (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI,

1995).

Kromatografi digunakan secara luas untuk mengenali ada atau tidak

adanya komponen dalam campuran yang mengandung senyawa dalam jumlah

terbatas yang telah diketahui identitasnya. Kromatografi kuantitatif didasarkan

pada perbandingan tinggi atau area puncak analit dengan satu atau lebih standar.

Jika kondisi dikendalikan dengan benar, kedua parameter ini bervariasi secara

linear dengan konsentrasi (Skoog, West, and Holler, 1994).

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada

pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi

dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c)

kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e) kromatografi

eksklusi ukuran; dan (f) kromatografi afinitas. Berdasarkan pada alat yang

digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a) kromatografi kertas; (b)

kromatografi lapis tipis, yang keduanya disebut dengan kromatografi planar; (c)


10

kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT); dan (d) kromatografi gas (KG)

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Kromatografi lapis tipis adalah bagian dari kromatografi planar yang

secara luas digunakan untuk analisis kualitatif dan dapat juga digunakan untuk

analisis kuantitatif (Christian, 2004). Kromatografi lapis tipis adalah suatu teknik

pemisahan dengan fase diam yang mengandung material tertentu yang tersebar

secara merata sebagai suatu lapisan yang tipis di pelat yang berupa gelas, logam,

atau plastik. (The British Pharmacopoeia Commission, 2011).

Ismailoff dan Schraiber mengembangkan teknik kromatografi lapis tipis

(KLT) pada tahun 1983 yang disebut juga sebagai kromatografi kolom terbuka.

Metode ini sederhana, pemisahannya cepat, dan sensitif. Kelebihan lain adalah

mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan. Untuk

analisa kuantitatif dapat digunakan plot fotodensitometer (Khopkar, 1990).

Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh

hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil mungkin dan

sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika

sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih

daripada penotolan secara manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan

lebih dari 15 μL. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebakan bercak

yang menyebar dan puncak ganda (Gandjar dan Rohman, 2007).

Sampel ditotolkan di atas pelat dengan mikropipet dan dikembangkan

dengan meletakkan bagian bawah dari pelat, bukan totolan sampel, dan di dalam


11

fase gerak yang sesuai. Fase gerak akan terelusi dengan adanya gaya kapilaritas,

dan senyawa-senyawa yang terdapat dalam sampel akan bergerak naik dengan

kecepatan yang berbeda sesuai dengan kelarutannya dan afinitasnya terhadap

fase diam (Pecsok, Shields, Cairns, and McWilliam, 1976).

Pelat dengan indikator fluoresensi memfasilitasi untuk visualisasi

senyawa yang mengabsorbsi sinar UV. Fluoresensi hijau diproduksi oleh zinc

silikat teraktifasi mangan dan fluoresensi biru dihasilkan oleh magnesium

tungstat yang terkandung di fase diam. Bagaimanapun, hanya magnesium

tungstat yang stabil terhadap asam. Beberapa pelat memiliki kode “F” untuk

fluoresensi dan menjadi indikasi panjang gelombang eksitasi (Spangenberg,

Poole, and Weins, 2010).

Gambar 4. Retardation Factor (Rf) (Anonim

c, 2010)

A. Jarak yang ditempuh zat terlarut B. Jarak yang ditempuh fase gerak

Perbandingan antara jarak yang ditempuh zat terlarut dan jarak yang

ditempuh oleh fase gerak disebut dengan Retardation factor (Rf), dengan rumus

sebagai berikut:

(1) (Dean, 1995)


12

2. Sistem kromatografi lapis tipis

a. Fase diam. Silika gel adalah fase diam yang paling sering digunakan

daripada fase diamnya lainnya. Lapisan silika gel terdiri dari partikel yang

sangat kecil, sangat rapat, ukuran partikelnya yang seragam (6-13 μm), halus,

dan homogen. Bahan pengikat untuk serbuk silika gel adalah 5-20% kalisum

sulfat hemihidrat dan gipsum (silika gel G) yang berfungsi untuk meningkatkan

kohesi dari partikel adsorben dan meningkatkan adesi lapisan adsorben ke pelat

(Dean, 1995).

Semua silika gel adalah silikon dioksida dari sudut pandang kimia.

Masing-masing atom silikon dikelilingi oleh empat atom oksigen dengan bentuk

tetrahedron. Pada permukaan silika gel, elektron valensi dari oksigen

terhubungkan dengan hidrogen (Si-OH, gugus silanol) atau dengan atom silikon

lainnya (Si-O-Si, gugus siloksan). Semua silika gel memiliki densitas yang

seragam pada gugus silanol yaitu sekitar 8 μmoles/m2. Gugus silanol mewakili

pusat permukaan adosorpsi-aktif yang mampu berinteraksi dengan molekul

sampel. Oleh karena itu, silika gel cocok sebagai fase diam di dalam

kromatografi. Kemampuan gugus silanol untuk bereaksi secara kimia dengan

reagen yang sesuai dapat digunakan untuk modifikasi permukaan silika gel

(Kowalska, 1996).

Partikel silika gel mengandung gugus hidroksi pada permukaannya

yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul yang polar. Adanya air

yang teradsorbsi akan mencegah molekul polar untuk membentuk ikatan

hidrogen, sehingga silika gel harus diaktifkan dengan pemanasan untuk


13

menghilangkan air yang teradsorbsi (Christian, 2004). Kandungan air yang ideal

adalah antara 11-12 % b/b (Rohman, 2009).

Gambar 5. Struktur silika gel (Hauck and Mack, 1996)

b. Fase gerak. Pemilihan sistem fase gerak untuk menyempurnakan

pemisahan yang dikehendaki mungkin melibatkan sejumlah percobaan, tetapi

pemilihan fase gerak tidak terlalu dibatasi dengan pertimbangan adanya

gangguan respon detektor atau kemungkinan buruknya fase diam. Sistem fase

gerak biasanya terdiri dari dua campuran komponen dari air dan pelarut organik

polar yang larut air (Dean, 1995). Berikut adalah beberapa petunjuk dalam

memilih dan mengoptimasi fase gerak:

1) Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT

merupakan teknik yang sangat sensitif.

2) Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa, sehingga harga Rf terletak

antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

3) Untuk memisahkan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas

fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga

mentukan harga Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti

dietil eter ke dalam pelarut seperti metal benzen akan meningkatkan harga Rf

secara signifikan.


14

4) Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut

sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan

perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam metanoat atau ammonia

masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan asam

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Di dalam kromatografi adsorbsi, kekuatan elusi fase gerak meningkat

seiring dengan meningkatnya polaritas (misalnya dari heksana ke aseton ke

alkohol ke air). Fase gerak tunggal, atau paling banyak dua atau tiga larutan

dapat digunakan jika memungkinkan. Fase gerak harus memiliki kemurnian

yang tinggi. Keberadaan sejumlah kecil pengotor dapat menghasilkan

kromatogram yang tidak reprodusibel (Christian, 2004).

Semakin besar nilai indeks polaritas yang dimiliki oleh pelarut maka

pelarut tersebut semakin bersifat non polar (Snyder and Kirkland, 1997). Berikut

ini merupakan tabel beberapa nilai indeks polaritas dari beberapa pelarut yang

sering digunakan:

Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut (Snyder and Kirkland, 1997)

Solvent Indeks

Polaritas

Nilai Eluotropik UV Cut off

(nm) Alumina C18 Silika

Heksana 0,1 0,01 - 0,00 195

Sikloheksana 0,2 0,04 - - 200

Toluena 2,4 0,29 - 0,22 284

Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212

Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256

Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330

Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205

Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190

Dimetilformamida 6,4 - 7,6 - 268

Dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268

Air 10,2 - - - 190


15

Pergerakan fase gerak melintasi fase diam dipengaruhi oleh gaya

kapilaritas. Fase diam (baik di dalam kromatografi adsorpsi, size-exclusion,

maupun pertukaran ion) dan pendukungnya (di dalam kromatografi partisi)

teridiri dari partikel solid yang mikroporus dengan luas permuakaan area yang

besar (berkisar antara 50 m2/g untuk selulosa dan sampai 500 m

2/g untuk silika)

(Kowalska, 1996).

F. Densitometri

Pengukuran secara in situ suatu area dengan scanning densitometer

adalah teknik yang digunakan untuk kuantitatif KLT. Relatif standar deviasi dari

densitometri dapat diperoleh di bawah 2%, hal ini membuat alat ini reliabel

untuk pengukuran secara kuantitatif (Sherma, 1996).

Senyawa yang telah dipisahkan menggunakan KLT atau High

Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) diukur secara kuantitatif

menggunakan pengukuran in situ dari absorbsi sinar tampak atau lampu

ultraviolet atau fluoresensi. Absorbsi sinar UV diukur baik di pelat biasa ataupun

pelat yang mengandung fosfor, hasilnya ditunjukkan dengan zona yang gelap di

atas latar yang berpendar (Sherma, 1996).

Pada densitometri absorbsi, bercak pada KLT discan oleh seberkas

sinar monokromatik selanjutnya di ubah menjadi gambar slit dengan panjang slit

yang dipilih sesuai dengan diameter dari bercak yang paling luas. Karena respon

dari scan reflektansi-serapan tidak linear dengan konsentrasi, standar kalibrasi

disertakan ketika sampel running. Akibatnya, semua sampel, baik standar dan


16

senyawa yang tidak diketahui, ditempatkan pada kondisi kromatografi yang

sama, dan kesalahan sistematik masih sangat minimal. Tingkat deteksi minimum

untuk pengukuran pada sinar tampak atau ultraviolet dari 100 pg sampai 100 ng

per totolan (Dean, 1995).

Gambar 6. Densitometer (Jaenchen, 1996)

G. Validasi Metode

1. Tinjauan umum

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya

(Harmita, 2004).

Menurut Adamovics (cit., Gandjar dan Rohman, 2007), tujuan utama

validasi metode adalah untuk menghasilkan hasil analisis yang paling baik.

Untuk memperoleh hasil tersebut, semua variabel yang terkait dengan metode

analisis harus dipertimbangkan seperti prosedur pengambilan sampel, tahap

penyiapan sampel, jenis penjerap yang digunakan pada kromatografi, fase gerak,


17

dan sistem deteksinya. Banyaknya parameter yang harus divalidasi tergantung

pada tujuan analisis.

Menurut Swartz dan Krull (cit., Gandjar dan Rohman, 2007), suatu

metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-

parameter kinerjanya cukup mampu mengatasi problem analisis, karenanya

suatu metode harus divalidasi ketika:

a. Metode baru dikembangkan untuk mengatasi problem analisis tertentu.

b. Metode yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan, atau

karena munculnya suatu masalah yang mengarahkan bahwa metode baku

tersebut harus direvisi.

c. Penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah

seiring dengan berjalannya waktu.

d. Metode baku digunakan di laboratorium yang berbeda dikerjakan oleh analis

berbeda, atau dikerjakan dengan alat yang berbeda.

e. Untuk mendemonstrasikan kesetaraan antara dua metode, seperti antara

metode baru dan metode baku.

Menurut The United States Pharmacopeia 30th

tahun 2007, metode

analisis dapat dibedakan menjadi 4 kategori, yaitu:

a. Kategori I. Mencakup prosedur analisis kuantitatif, untuk menetapkan kadar

komponen utama bahan obat atau zat aktif dalam sediaan farmasi.

b. Kategori II. Mencakup prosedur analisis kualitatif dan kuantitatif yang

digunakan untuk menganalisis impurities dalam sediaan farmasi.


18

c. Kategori III. Mencakup prosedur analisis yang digunakan untuk menentukan

karakteristik penampilan suatu sediaan farmasi, misalnya disolusi dan

pelepasan obat.

d. Kategori IV (tes identifikasi).

Tabel II. Parameter analisis validasi metode (United States

Pharmacopeial Convention, 2007)

Parameter

kinerja

analisis

Kategori

I

Kategori II Kategori

III

Kategori

IV Kuantitatif Batas tes

Akurasi Ya Ya * * Tidak

Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak

Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya

LOD Tidak Tidak Ya * Tidak

LOQ Tidak Ya Tidak * Tidak

Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak

Range Ya Ya * * Tidak

*mungkin diperlukan (tergantung sifat spesifik tes)

2. Parameter validasi

a. Selektifitas. Selektivitas suatu metode adalah kemampuannya yang

hanya mengukur zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya

komponen lain yang mungkin ada dalam matrik sampel (Harmita, 2004). Harga

Rs > I,5 disebut baseline resolution, yaitu pemisahan sempurna dari dua puncak

dengan ukuran yang sama. Dalam prakteknya, pemisahan dengan harga Rs = 1,0

(kedua puncak berhimpit < 2%) dianggap memadai untuk tujuan analisis

(Pecsok et al, 1976).

b. Linearitas. Linearitas dari suatu prosedur analisis merupakan

kemampuan (pada rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara

langsung proporsional dengan konsentrasi (jumlah) analit di dalam sampel.

Persyaratan data linearitas yang bisa diterima jika memenuhi nilai koefisien

korelasi (r) > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003). Linearitas dapat diukur dengan


19

melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang berbeda-beda. Data yang

diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat terkecil, selanjutnya dapat

ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan keofisien korelasinya. Kisaran

konsentrasi yang digunakan untuk linearitas harus cukup luas untuk memenuhi

kisaran metode yang diharapkan. Minimal 5 kisaran konsentrasi harus diamati

dan suatu plot antara respon detektor dengan konsentrasi sampel harus

dihasilkan (Rohman, 2009).

c. Akurasi. Akurasi dari suatu metode adalah kedekatan nilai yang

diperoleh dengan nilai sebenarnya (true value) dari sampel. Akurasi ini mungkin

merupakan parameter validasi yang paling sulit dan yang perlu diperhatikan

adalah sampling dan perlakuan terhadap sampel (Christian, 2004).

Tabel III. Kriteria rentang recovery yang dapat diterima (Harmita, 2004)

Analit pada matriks sampel (%) Rentang recovery yang diperoleh (%)

100 98-102

>10 98-102

>1 97-103

>0,1 95-105

0,01 90-107

0,001 90-107

0,0001 (1 ppm) 80-110

0,00001 (100 ppb) 80-110

0,000001 (10 ppb) 60-115

d. Presisi. Presisi atau keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan

derajat kesesuaian antara hasil uji individual dari rata-rata jika prosedur

diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran

yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan

baku relatif (koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai


20

keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Kriteria seksama

diberikan jika metode memberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi

2% atau kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada

konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium.

(Harmita, 2004).

Tabel IV. Kriteria KV yang dapat diterima (Harmita, 2004)

Kadar analit KV(%)

≥ 1% 2,5

> 0,1% 5

1 ppm 16

1 ppb 32

e. Range. Range dalam metode analisis adalah interval antara

konsentrasi paling atas dan konsentrasi paling bawah dari analit yang sudah

memenuhi prosedur analisis yang meliputi akurasi, presisi, dan linearitas (The

British Pharmacopoeia Commission, 2011).

f. Batas deteksi (Limit of Detection atau LOD). Menurut Swartz dan

Krull (cit., Gandjar dan Rohman, 2007), batas deteksi didefinisikan sebagai

konsentrasi analit terendah yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu

dapat dikuantifikasi. LOD merupakan batas uji yang secara spesifik menyatakan

apakah analit di atas atau di bawah nilai tertentu. Sebagai contoh, batas deteksi

merupakan banyaknya sampel yang menunjukkan respon (S) 3 kali terhadap

derau (N) atau LOD = 3 S/N.

g. Batas kuantifikasi (Limit of Quantification atau LOQ). Batas

kuantifikasi didefinisikan sebagai analit terendah dalam sampel yang dapat

ditentukan dengan presisi akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional


21

metode yang digunakan. Sebagaimana LOD, LOQ juga diekspresikan sebagai

konsentrasi (dengan akurasi dan presisi juga dilaporkan) dan kadang-kadang

rasio signal to noise 10:1 digunakan untuk menentukan LOQ (Gandjar dan

Rohman, 2007).

H. Landasan Teori

Kloramfenikol dan lidokain HCl merupakan salah satu kombinasi obat

yang digunakan untuk mengobati infeksi telinga luar dan tengah. Obat tetes

telinga yang memiliki komposisi kloramfenikol dan lidokain HCl adalah

Colme®. Kloramfenikol larut dalam air, sangat larut dalam alkohol, dan di dalam

propilenglikol. Kloramfenikol memiliki pH 4,5-7,5; pKa 5,5; log P sebesar 1,1;

dan panjang gelombang maskimum kloramfenikol di dalam air adalah 278 nm

( =298). Lidokain HCl sangat mudah larut dalam air dan etanol, larut dalam

kloroform, dan tidak larut dalam eter. Lidokain HCl memiliki pH 4,5-5,5; titik

leleh 74-79oC; pKa 7,9; dan panjang gelombang maksimun di larutan asam

adalah 263 nm ( =19).

Salah satu metode yang dapat digunakan untuk memisahkan suatu

campuran menjadi senyawa-senyawa tunggal dan melakukan analisis kuantitatif

adalah KLT-densitometri. Metode KLT dapat digunakan untuk memisahkan

campuran senyawa menjadi senyawa-senyawa tunggal karena adanya perbedaan

afinitas dan interaksi senyawa terhadap fase diam dan fase gerak. Bercak yang

muncul setelah dilakukan elusi dapat dianalisis kuantitatif menggunakan

densitometer, sehingga dapat diperoleh nilai Rf dan AUC.


22

Suatu metode yang akan digunakan untuk analisis harus memiliki

validitas yang baik agar data yang diperoleh dapat dipercaya. Parameter validasi

meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan range. Suatu metode

analisis dikatakan memiliki validitas yang baik apabila memenuhi parameter-

parameter validasi tersebut.

I. Hipotesis

Metode KLT-densitometri untuk penetapan kadar kloramfenikol dan

lidokain HCl sebagai zat aktif di dalam obat tetes telinga Colme®

memenuhi

parameter-parameter validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi,

presisi, dan range.


23

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang dilakukan bersifat non-eksperimental deskriptif karena

tidak terdapat manipulasi dan perlakuan terhadap subjek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas adalah sistem KLT yang telah dioptimasi, yaitu jenis dan

komposisi fase gerak.

2. Variabel tergantung adalah parameter-parameter validasi yaitu selektivitas,

linearitas, akurasi, presisi, dan range.

3. Variabel pengacau terkendali adalah pelarut, bahan baku yang digunakan,

dan kejenuhan bejana kromatografi, untuk mengatasinya digunakan pelarut

pro analisis yang memiliki kemurnian tinggi, menggunakan bahan baku

yang memiliki Certificate of Analysis (CoA), dan menggunakan kertas saring

sebagai indikator kejenuhan bejana kromatografi.

C. Definisi Operasional

1. Sistem KLT yang digunakan adalah KLT fase normal dengan fase diam yang

berupa silika gel 60 F254 dan fase gerak berupa campuran toluena:n-

heksana:metanol:dietilamin (19,75:3,75:5:1,5).


24

2. Jumlah kloramfenikol dan lidokain HCl dinyatakan dalam satuan nanogram

(ng).

3. Parameter validasi yang digunakan adalah selektivitas, akurasi, presisi, dan

range.

D. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku

kloramfenikol dari Chemo Lugano Branch dengan nomor batch 80002250001

dan baku lidokain HCl dari Megafine Pharma dengan nomor batch ALH/449/10,

pelat KLT silika gel 60 F254 (E. Merck), etanol p.a (E. Merck), toluena p.a (E.

Merck), n-heksana p.a (E. Merck), metanol p.a (E. Merck), aquadest, obat tetes

telinga Colme®

kemasan botol 8 mL produksi PT. Interbat dengan nomor batch

D 016004.

E. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat

densitometer (Camag TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No.160602)

autosampler (Linomat 5 No.170610), neraca analitik (OHAOUS Carat Series

PAJ 1003, max 60/120 g, min 0,0001 g, d = 0,01/0,1 mg, e = 1 mg), neraca

analitik (Scaltec SBC 22 max 60/210 g; min 0,001 g; d = 0,01/0,1mg; e = 1mg),

mikropipet 1-5 mL (Scorex), mikropipet 100-1000 µL (Scorex), bejana

kromatografi (Camag), alat-alat gelas (Pyrex).


25

F. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan fase gerak

Fase gerak yang dibuat adalah fase gerak yang telah didapat dari hasil

optimasi pada penelitian sebelumnya yaitu toluena:n-heksana:metanol:dietilamin

(19,75:3,75:5:1,5). Volume masing-masing pelarut diukur menggunakan buret

dan ditampung ke dalam labu takar 50 mL lalu digojog agar homogen.

2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol

Baku kloramfenikol ditimbang seksama lebih kurang 10 mg,

dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, dan dilarutkan dengan etanol sampai

batas tanda, sehingga diperoleh larutan stok kloramfenikol 1000 ppm. Larutan

stok diambil 1,5 menggunakan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 5

mL, dan diencerkan dengan etanol hingga batas tanda. Larutan digojog, sehingga

diperoleh larutan baku kloramfenikol 300 ppm. Larutan ini siap untuk

ditotolkan.

3. Pembuatan larutan baku lidokain HCl

Baku lidokain HCl ditimbang seksama lebih kurang 15 mg, dimasukkan

ke dalam labu takar 5 ml, dan dilarutkan dengan etanol sampai batas tanda.

Larutan digojog, sehingga diperoleh larutan baku lidokain HCl 3000 ppm.

Larutan ini siap untuk ditotolkan.

4. Pembuatan larutan baku campuran kloramfenikol:lidokain HCl (1:10)

Baku lidokain HCl ditimbang seksama lebih kurang 15 mg dan

dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Baku kloramfenikol ditimbang seksama

lebih kurang 10 mg, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, dan dilarutkan


26

dengan etanol sampai batas tanda (larutan stok kloramfenikol). Larutan stok

kloramfenikol diambil 1,5 menggunakan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu

takar 5 mL yang berisi 15 mg lidokain HCl, diencerkan dengan etanol sampai

tanda batas, dan digojog, sehingga diperoleh larutan baku campuran

kloramfenikol:lidokain HCl 300:3000 ppm (1:10).

5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan

lidokain HCl

Larutan baku kloramfenikol 300 ppm dan lidokain HCl 3000 ppm

masing-masing ditotolkan sebanyak 1, 2 dan 3 µL pada pelat silika gel dengan

jarak antar totolan 1 cm. Setelah totolan kering, pelat dikembangkan di dalam

bejana kromatografi yang telah dijenuhi dengan fase gerak. Setelah mencapai

jarak pengembangan 10 cm, pelat dikeluarkan, dan dikeringkan. Penentuan

panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan merekam pola spektra

absorbsi masing-masing seri jumlah pada daerah panjang gelombang 200-400

nm menggunakan densitometer. Overlapping spektra kloramfenikol dan lidokain

HCl ditentukan secara berturut-turut pada seri jumlah kloramfenikol 300, 600,

900 ng dan lidokain HCl 3000, 6000, 9000 ng.

6. Pembuatan kurva baku

Larutan baku tunggal kloramfenikol 300 ppm dan lidokain HCl 3000

ppm masing-masing ditotolkan dengan volume penotolan 1; 1,5; 2; 2,5; dan 3

µL pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan 1 cm. Setelah totolan kering,

pelat dikembangkan di dalam bejana kromatografi yang telah jenuh oleh fase

gerak. Pelat dikeluarkan dari bejana setelah mencapai jarak pengembangan 10


27

cm, dikeringkan, dan diukur AUC-nya dengan densitometer pada panjang

gelombang pengamatan. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Dibuat kurva baku

hubungan antara jumlah analit (ng) dan AUC, sehingga didapatkan persamaan

kurva baku masing-masing senyawa. Dipilih persamaan kurva baku yang

memiliki nilai r > 0,999 untuk kloramfenikol dan lidokain HCl.

7. Penentuan recovery dan Koefisien Variasi (KV) baku tunggal

Larutan baku tunggal kloramfenikol 300 ppm dan lidokain HCl 3000

ppm masing-masing ditotolkan sebanyak 1, 2 dan 3 µL pada pelat silika gel

dengan jarak antar totolan 1 cm. Setelah totolan kering, pelat dikembangkan

dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhi oleh fase gerak. Setelah

mencapai jarak pengembangan 10 cm, pelat dikeluarkan, dikeringkan, dan

discanning menggunakan densitometer pada panjang gelombang pengamatan.

Nilai AUC yang didapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku yang telah

dibuat pada poin 5, sehingga didapatkan jumlah kloramfenikol dan lidokain HCl.

Berdasarkan data yang diperoleh maka recovery dan KV-nya dapat dihitung.

Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.

8. Penentuan recovery dan KV baku campuran kloramfenikol:lidokain

HCl 300:3000 ng, 600:6000 ng, dan 900:9000 ng

Larutan baku campuran kloramfenikol:lidokain HCl 1:10 ditotolkan

sebanyak 1, 2, dan 3 µL pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan 1 cm.

Setelah totolan kering, pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang

telah dijenuhi oleh fase gerak. Setelah mencapai jarak pengembangan 10 cm,

pelat dikeluarkan, dikeringkan, dan discanning menggunakan densitometer pada


28

panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC yang didapat dimasukkan ke dalam

persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin 5, sehingga didapatkan

jumlah kloramfenikol dan lidokain HCl. Berdasarkan data yang diperoleh maka

recovery dan KV-nya dapat dihitung. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.

9. Penentuan recovery dan KV adisi baku dalam sampel

a. Penyiapan larutan stok sampel. Dua sampel obat tetes telinga

Colme® dikeluarkan isinya dan dihomogenkan. Sebanyak 1 ml larutan sampel

diambil dengan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, dilarutkan

dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar homogen (LSA). Sebanyak 2

mL larutan sampel diambil dengan mikropipet, dimasukkan ke dalam labu takar

10 mL, dilarutkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar homogen

(LSB). Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.

b. Penyiapan larutan sampel tanpa penambahan baku kloramfenikol

(LSK). Sebanyak 0,4 mL LSA diambil dengan mikropipet, dimasukkan ke dalam

labu takar 10 mL, diencerkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog

agar homogen. Larutan ini siap untuk ditotolkan. Replikasi dilakukan sebanyak

5 kali.

c. Penyiapan larutan sampel tanpa penambahan baku lidokain HCl.

(LSL). Sebanyak 2,5 mL LSB diambil dengam mikropipet, dimasukkan ke dalam

labu takar 5 mL, diencerkan dengan etanol sampai batas tanda, dan digojog agar

homogen. Larutan ini siap untuk ditotolkan. Replikasi dilakukan sebanyak 5

kali.


29

d. Penyiapan larutan sampel dengan penambahan baku kloramfenikol

(LSAK). Sebanyak 0,4 mL LSA dan 2 mL larutan baku kloramfenikol 1000 ppm

dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan etanol sampai batas

tanda, dan digojog agar homogen. Larutan ini siap untuk ditotolkan. Replikasi

dilakukan sebanyak 5 kali.

e. Penyiapan larutan sampel dengan penambahan baku lidokain HCl

(LSAL). Sebanyak 5 mL LSB diambil dengan mikropipet, dimasukkan ke dalam

labu takar 10 mL yang berisi 20 mg lidokain HCl, diencerkan dengan etanol

sampai batas tanda, dan digojog agar homogen. Larutan ini siap untuk

ditotolkan. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali.

f. Pengembangan dan pengukuran. LSK, LSL, LSAK, dan LSAL ditotolkan

sebanyak 1 µL pada pelat silika gel dengan jarak antar totolan 1 cm. Setelah

totolan kering, pelat dikembangkan dalam bejana kromatografi yang telah

dijenuhi oleh fase gerak. Setelah mencapai jarak pengembangan 10 cm, pelat

dikeluarkan, dikeringkan, dan discanning menggunakan densitometer pada

panjang gelombang pengamatan. Nilai AUC yang didapat dimasukkan ke dalam

persamaan kurva baku yang telah dibuat pada poin 5, sehingga didapatkan

jumlah kloramfenikol dan lidokain HCl yang ditambahkan. Berdasarkan data

yang diperoleh maka recovery dan KV-nya dapat dihitung.


30

G. Analisis hasil

1. Selektivitas

Selektivitas ditunjukkan dengan nilai resolusi > 1,5. Resolusi dapat

dihitung dengan cara berikut:

(2) (Watson, 1999).

Keterangan :

RfA dan RfB = nilai Rf dari peak A dan B

wA dan wB = lebar peak A dan B

2. Linearitas

Jumlah baku kloramfenikol dan lidokain HCl (ng) masing-masing

diplotkan dengan AUC yang diperoleh, sehingga didapatkan persamaan kurva

baku y = bx + a dan nilai koefisien korelasi (r). Suatu metode dapat dikatakan

memiliki linearitas yang baik jika r > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003).

3. Akurasi

Akurasi metode analisis dinyatakan dengan recovery yang dapat

dihitung dengan cara berikut:

(3) (Harmita, 2004).

4. Akurasi adisi baku dalam matriks sampel

Nilai recovery adisi baku dalam matriks sampel dapat dihitung dengan

cara berikut:

(4)

(Harmita, 2004).


31

5. Presisi

Presisi metode analisis dinyatakan dengan KV (koefisien variasi) yang

dapat dihitung dengan cara berikut:

(5) (Harmita, 2004).

6. Range

Range merupakan interval jumlah analit yang memenuhi persyaratan

linearitas, akurasi, dan presisi (The British Pharmacopoeia Commission, 2011).


32

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah fase gerak yang

telah didapat dari hasil optimasi pada penelitian sebelumnya, yaitu toluena:n-

heksana:metanol:dietilamin (19,75:3,75:5:1,5) (Hernat, 2011). Fase gerak

tersebut merupakan fase gerak yang dapat memisahkan kloramfenikol dan

lidokain HCl secara optimal. Penggunaan dietilamin pada fase gerak bertujuan

untuk memberikan suasana basa agar lidokain HCl dapat menjadi lidokain basa.

Dietilamin memiliki pKb sebesar 2,9 (Quin, 2000). Penggunaan n-heksana

bertujuan untuk menurunkan kepolaran dari campuran fase gerak, sedangkan

toluena dan metanol berfungsi untuk mengelusi lidokain lebih cepat, sehingga

pemisahan lidokain dan kloramfenikol dapat berlangsung dengan baik.

Fase gerak yang digunakan bersifat lebih non polar dengan indeks

polaritasnya yaitu 2,53; sedangkan fase diam yang digunakan adalah silika gel

yang bersifat lebih polar. Oleh karena itu sistem KLT yang digunakan adalah

sistem KLT fase normal, di mana fase diam yang digunakan bersifat lebih polar

dibandingkan dengan fase gerak yang digunakan.

B. Pembuatan Larutan Baku

Larutan baku yang dibuat adalah larutan baku kloramfenikol tunggal

dan larutan baku lidokain HCl tunggal, serta larutan baku campuran


33

kloramfenikol:lidokain HCl. Pada penelitian ini, larutan baku tunggal

yang akan ditotolkan adalah larutan baku kloramfenikol 300 ppm dan larutan

baku lidokain HCl 3000 ppm, serta larutan baku campuran

kloramfenikol:lidokain HCl dengan perbandingan 300:3000 ppm (1:10).

Perbandingan kloramfenikol:lidokain HCl 1:10 didapatkan dari hasil

optimasi. Lidokain HCl memiliki perbandingan yang sangat besar dikarenakan

lidokain HCl memiliki =19, sehingga serapan lidokain HCl sangat kecil dan

lidokain HCl harus dalam jumlah yang besar agar dapat terdeteksi, sedangkan

kloramfenikol memiliki =298, sehingga dengan jumlah yang kecil,

kloramfenikol sudah dapat terdeteksi.

Di dalam penelitian ini tidak menggunakan seri konsentrasi tetapi

menggunakan seri jumlah analit yang didapatkan dari volume penotolan yaitu 1;

1,5; 2; 2,5; dan 3 µL, sehingga didapatkan seri jumlah masing-masing analit,

yaitu kloramfenikol adalah 300, 450, 600, 750, dan 900 ng, sedangkan untuk

lidokain HCl adalah 3000, 4500, 6000, 7500, dan 9000 ng. Penggunaan seri

jumlah analit akan mengurangi kesalahan dalam pengenceran apabila

menggunakan seri konsentrasi dan proses preparasi larutan baku menjadi lebih

singkat.

C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan

Penentuan panjang gelombang pengamatan bertujuan untuk mengetahui

panjang gelombang di mana kloramfenikol dan lidokain HCl dapat memberikan

serapan yang optimal ketika dilakukan scanning secara bersamaan. Larutan yang


34

digunakan untuk menentukan panjang gelombang pengamatan adalah larutan

baku kloramfenikol 300 ppm dan larutan baku lidokain HCl 3000 ppm dengan

volume penotolan 1, 2, dan 3 µL. Penggunaan 3 volume totolan ini untuk

mendapatkan jumlah analit pada level bawah, sedang, dan tinggi yang dapat

mewakili kesulurahan jumlah analit pada seri jumlah analit yang digunakan.

Pengukuran panjang gelombang pengamatan diukur pada rentang panjang

gelombang 200-400 nm karena rentang tersebut merupakan rentang panjang

gelombang daerah UV dan panjang gelombang teoritis dari kloramfenikol dan

lidokain HCl berada pada rentang tersebut.

Suatu senyawa dapat diukur serapaannya pada daerah UV jika memiliki

gugus kromofor dan auksokrom yang dapat menyerap radiasi sinar pada daerah

UV. Pada densitometer, detektor yang digunakan adalah lampu D2 yang

menghasilkan sinar UV, sehingga pengukuran panjang gelombang pengamatan

dapat langsung dilakukan menggunakan densitometer. Berikut ini adalah gambar

struktur kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol dan lidokain.

Gambar 7. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol (A) dan lidokain (B)

Panjang gelombang maksimum dapat diperoleh dengan melihat bentuk

spektra kloramfenikol dan lidokain HCl. Perbedaan panjang gelombang yang

A B


35

didapatkan dari hasil penelitian dan panjang gelombang teoritis yang

diperbolehkan adalah sebesar 2 nm (Direktorat Jendral pengawasan Obat dan

Makanan RI, 1995). Panjang gelombang maksimum kloramfenikol yang

didapatkan adalah 281 nm, sedangkan panjang gelombang maksimum

kloramfenikol dalam air secara teoritis adalah 278 nm. Panjang gelombang

maksimum lidokain HCl yang didapatkan adalah 263 nm, sama seperti panjang

gelombang maksimum lidokain HCl dalam larutan asam secara teoritis. Adanya

perbedaan sebesar 3 nm antara panjang gelombang maksimum kloramfenikol

yang didapatkan dengan panjang gelombang teoritisnya disebabkan karena

adanya perbedaan instrumen yang digunakan.

Panjang gelombang pengamatan didapatkan dengan

menumpangtindihkan spektra kloramfenikol dan lidokain HCl seperti yang

terlihat pada gambar 8. Panjang gelombang pengamatan yang didapatkan adalah

sebesar 242 nm. Selanjutnya, panjang gelombang tersebutlah yang digunakan

selama penelitian untuk mendapatkan serapan yang optimal dari kloramfenikol

dan lidokain HCl ketika dilakukan scanning secara bersamaan menggunakan

densitometer.


36

Gambar 8. Spektra kloramfenikol (300, 600, dan 900 ng) dan lidokain HCl (3000,

6000, dan 9000 ng)

D. Analisis Kualitatif

Pengamatan nilai Rf dilakukan di dalam penelitian ini berfungsi sebagai

parameter analisis kualitatif untuk mengetahui ada tidaknya analit dalam sampel

dengan membandingkan nilai Rf sampel dengan nilai Rf baku. Larutan yang

digunakan adalah larutan baku tunggal kloramfenikol 300 ppm dan larutan baku

tunggal lidokain HCl 3000 ppm yang masing-masing ditotolkan sebanyak 2 μL

serta larutan sampel yang ditotolkan sebanyak 1 μL.

Preparasi dan penotolan sampel dilakukan sebanyak dua kali yaitu pada

tahap pertama untuk melihat peak lidokain HCl, di mana jumlah lidokain

berdasarkan perhitungan adalah 4000 ng, sedangkan kloramfenikol sebanyak

kloramfenikol

Lidokain HCl

242 nm


37

10000 ng. Pada penotolan pertama ini, bercak kloramfenikol akan mengalami

tailing setelah pengembangan karena jumlah kloramfenikol sangat banyak yang

membuat fase gerak tidak mampu membawa keseluruhan kloramfenikol,

sehingga menyebabkan bercak kloramfenikol menjadi tailing. Pada tahap yang

kedua bertujuan untuk melihat peak kloramfenikol, sehingga dilakukan

pengenceran larutan sampel dan didapatkan jumlah kloramfenikol adalah 400

ng, sedangkan jumlah lidokain HCl adalah 160 ng. Pada penotolan yang kedua

ini, bercak lidokain HCl tidak akan tampak setelah pengembangan karena

jumlah lidokain HCl sangat kecil, sehingga lidokain HCl tidak akan terdeteksi

ketika dilihat di bawah sinar UV. Berikut ini adalah gambar kromatogram

sampel, baku lidokain HCl, dan baku kloramfenikol:

A

lidokain HCl


38

Gambar 9. Perbandingan nilai Rf baku kloramfenikol dan lidokain HCl dengan Rf sampel

A. Rf lidokain HCl dalam sampel = 0,47

B. Rf baku lidokain HCl (3000 ng) = 0,47

C. Rf kloramfenikol dalam sampel = 0,25

D. Rf baku kloramfenikol (300 ng) = 0,25

B

kloramfenikol

C

kloramfenikol

lidokain HCl

D


39

Dari gambar 9.A dan 9.B dapat dilihat bahwa Rf sampel yaitu 0,47 sama

dengan Rf baku lidokain HCl, sedangkan pada gambar 9.C dan 9.D dapat dilihat

bahwa Rf sampel 0,25 sama seperti Rf baku kloramfenikol. Persamaan nilai Rf ini

menunjukkan bahwa di dalam sampel benar terdapat kloramfenikol dan lidokain

HCl.

Perbedaan nilai Rf kloramfenikol dan lidokain HCl dikarenakan adanya

perbedaan afinitas masing-masing senyawa terhadap fase diam dan fase gerak.

Berikut ini adalah gambar interaksi kloramfenikol dan lidokain HCl terhadap

fase diam dan fase gerak:

Gambar 10. Interaksi kloramfenikol dengan fase diam silika gel

- - - - - interaksi hidrogen

Gambar 11. Interaksi lidokain dengan fase diam silika gel

- - - - - interaksi hidrogen


40

Gambar 12. Interaksi kloramfenikol dengan fase gerak toluena:

n-heksana:metanol:dietilamin (19,75;3,75;5;1,5)

Gambar 13. Interaksi lidokain dengan fase gerak toluena:n-

heksana:metanol:dietilamin(19,75;3,75;5;1,5)


41

Kloramfenikol memiliki lebih banyak interaksi dengan fase diam

melalui interaksi hidrogen dibandingkan dengan lidokain, sehingga

kloramfenikol akan tertahan lebih lama di fase diam dan lidokain akan terelusi

lebih dahulu. Selain itu, lidokain akan terelusi lebih dahulu karena adanya

interaksi van der Waals yang lebih banyak dari gugus non polar lidokain dengan

gugus non polar dari toluena yang merupakan komponen terbanyak dalam fase

gerak dan adanya interaksi dipol-dipol, sehingga lidokain akan terelusi lebih

cepat dibandingkan dengan kloramfenikol.

Kepolaran dari suatu senyawa juga memiliki peran penting dalam

penentuan nilai Rf senyawa tersebut. Kloramfenikol yang memiliki sifat lebih

polar daripada lidokain akan tertahan di fase diam lebih lama, sedangkan

lidokain yang sifatnya lebih non polar dibandingkan kloramfenikol akan terelusi

lebih dahulu oleh fase gerak yang sifatnya juga non polar dengan indeks

polaritas fase gerak adalah 2,53.

E. Pembuatan Kurva Baku Kloramfenikol dan Lidokain HCl

Pembuatan kurva baku kloramfenikol dan lidokain HCl masing-masing

dilakukan sebanyak 3 kali replikasi untuk memperoleh nilai koefisien korelasi

(r) yang paling baik. Nilai r merupakan hubungan antara dua besaran yang

diukur, dalam hal ini adalah jumlah analit (ng) dan nilai AUC. Volume totolan

yang ditotolkan sebanyak 1, 2, 3, 4, dan 5 μL agar diperoleh seri jumlah untuk

kloramfenikol adalah 300, 450, 600, 750, dan 900 ng, sedangkan untuk lidokain

HCl adalah 3000, 4500, 6000, 7500, dan 9000 ng.


42

Tabel V. Data replikasi kurva baku kloramfenikol

Tabel VI. Data replikasi kurva baku lidokain HCl

Replikasi

I II III

Jumlah

(ng) AUC

Jumlah

(ng) AUC

Jumlah

(ng) AUC

2980 3371,9 3000 4021,1 2980 3468,7

4470 4682,4 4500 5419,9 4470 5242,5

5960 5988,9 6000 6840,6 5960 6512,9

7450 7082,4 7500 8064,5 7450 7985,9

8940 8348,5 9000 9529,2 8940 9291,6

A 953,54 A 1310,74 A 744,64

B 0,8291 B 0,9107 B 0,9657

r 0,9995 r 0,9997 r 0,9984

α 39,66° Α 42,32° α 44,00°

Berdasarkan data yang diperoleh dari 3 replikasi kurva baku maka

diperoleh kurva baku kloramfenikol dan lidokain HCl yang paling baik yang

dilihat dari nilai r > 0,999 (Mulja dan Hanwar, 2003). Kurva baku yang dipilih

adalah kurva baku replikasi II, baik untuk kloramfenikol maupun lidokain HCl.

Persamaan kurva baku kloramfenikol yang didapatkan adalah y = 3,8641 x +

392,5 dengan nilai r = 0,9998, sedangkan persamaan kurva baku untuk lidokain

HCl adalah y = 0,9107 x + 1310,74 dengan nilai r = 0,9997.

Replikasi

I II III

Jumlah

(ng) AUC

Jumlah

(ng) AUC

AUC

Modifikasi

Jumlah

(ng) AUC

300 1731,8 300 1535,4 383,85 300 1347,9

450 2210,3 450 2142,4 535,6 450 1967,0

600 2671,1 600 2724,3 681,075 600 2400,7

750 3132,9 750 3296,2 824,05 750 2981,6

900 3682,5 900 3856,6 964,15 900 3604,2

A 756,12 A 392,5 98,125 A 249,4

B 3,216 B 3,8641 0,966 B 3,6848

r 0,9994 r 0,9998 0,9998 r 0,9984

α 72,73° α 75,49° 44,01° α 74,82°


43

Kurva baku untuk kloramfenikol dilakukan modifikasi agar α

mendekati 45° sehingga penampilan kurva baku kloramfenikol menjadi lebih

baik, namun persamaan kurva baku yang digunakan untuk perhitungan jumlah

kloramfenikol tetap menggunakan persamaan kurva baku yang tidak

dimodifikasi.

Gambar 14. Kurva hubungan antara jumlah kloramfenikol (ng) dan AUC

(replikasi II hasil modifikasi)

Gambar 15. Kurva hubungan antara jumlah lidokain HCl (ng) dan AUC (replikasi II)

Kurva baku kloramfenikol (gambar 14) dan lidokain HCl (gambar 15)

menunjukkan garis yang linear dengan korelasi positif, yaitu adanya hubungan


44

antara jumlah analit (ng) dengan AUC, apabila terdapat perubahan jumlah analit

(ng) maka akan diikuti dengan perubahan nilai AUC secara proporsional.

F. Validasi Metode Analisis

Validasi metode sangat penting dilakukan untuk membuktikan bahwa

metode analisis yang digunakan telah memenuhi parameter-parameter validasi

yang telah ditentukan, sehingga hasil atau data yang didapat ketika

menggunakan metode ini dapat dipercaya. Di dalam penelitian ini, validasi

dilakukan menggunakan larutan baku tunggal yaitu larutan baku kloramfenikol

300 ppm dan lidokain HCl 3000 ppm, serta menggunakan larutan baku

campuran kloramfenikol:lidokain HCl (1:10). Volume penotolan yang dilakukan

adalah 1, 2, dan 3 µL untuk mendapatkan seri jumlah analit pada level rendah,

sedang, dan tinggi.

Validasi yang dilakukan menggunakan larutan baku tunggal bertujuan

untuk memvalidasi metode analisis yang digunakan yaitu KLT-densitometri,

sedangkan validasi yang dilakukan menggunakan baku campuran dan adisi baku

untuk memvalidasi metode analisis pada saat pengaplikasian metode ini untuk

penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain HCl dalam sampel. Parameter-

parameter validasi yang digunakan dalam penelitian ini meliputi selektivitas,

linearitas, akurasi, presisi, dan range.

1. Selektivitas

Pengukuran parameter selektivitas menggunakan larutan sampel yang

telah dipreparasi dan ditotolkan sebanyak 1 µL. Selektivitas digunakan untuk


45

melihat apakah metode yang digunakan dapat memisahkan dan membedakan

senyawa yang satu dengan senyawa yang lain ketika berada dalam suatu

campuran. Selektifitas dapat dilihat dari nilai resolusi, di mana nilai resolusi

yang baik adalah > 1,5.

Tabel VII. Nilai Rs sampel

Replikasi Rf kloramfenikol Rf lidokain HCl Rs

1 0,21 0,47 3,06

2 0,21 0,47 2,89

3 0,21 0,47 2,89

Rata-rata 0,21 0,47 2,95

Dari hasil yang diperoleh, metode ini dapat membedakan 2 senyawa

yang berbeda dalam suatu campuran yang ditandai dengan terdeteksinya 2 peak

pada nilai Rf yang berbeda yaitu kloramfenikol 0,21 dan lidokain HCl 0,47.

Selain itu, nilai resolusi dari peak kloramfenikol dan lidokain HCl yang

didapatkan adalah sebesar 2,95; sehingga metode ini memiliki selektifitas yang

baik karena Rs yang dihasilkan > 1,5. Gambar di bawah adalah gambar

kromatogram sampel yang memperlihatkan dengan jelas bahwa peak

kloramfenikol dan peak lidokain HCl telah memisah dengan baik.

Gambar 16. Kromatogram sampel

kloramfenikol

lidokain HCl


46

2. Linearitas

Linearitas ditunjukkan dengan nilai koefisien korelasi (r) yang didapat

dari kurva baku. Di dalam penelitian ini, nilai r menunjukkan hubungan antara

jumlah analit (ng) terhadap AUC yang didapatkan. Dari data yang diperoleh,

didapatkan nilai r untuk kurva baku kloramfenikol adalah 0,9998 dan nilai r

untuk kurva baku lidokain HCl adal

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17660/2/088114029_Full.pdf ·...

Documents

Transcript of PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIrepository.usd.ac.id/17660/2/088114029_Full.pdf ·...