Petunjuk Praktikum Biokimia II

27
PETUNJUK PRAKTIKUM OLEH : Irma Ratna Kartika, M.Sc.Tech LABORATORIUM KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA BIOKIMIA II

Transcript of Petunjuk Praktikum Biokimia II

  • PETUNJUK PRAKTIKUM

    OLEH :

    Irma Ratna Kartika, M.Sc.Tech

    LABORATORIUM KIMIA

    FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

    UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

    BIOKIMIA II

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    i

    TATA TERTIB PRAKTIKUM

    LABORATORIUM KIMIA

    FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

    A. Bila hendak praktikum, praktikkan diwajibkan :

    1. Datang tepat waktu. Keterlambatan 15 menit tanpa alasan yang

    sah dianggap tidak hadir dan tidak diizinkan mengikuti praktikum.

    2. Menyiapkan laporan awal, bagan prosedur percobaan dan laporan

    praktikum.

    3. Menyimpan tas pada tempat yang telah disediakan (dibawah meja

    kerja).

    4. Mengisi form kehadiran tiap kali mengikuti praktikum.

    5. Membawa alat-alat yang diperlukan selama praktikum berlangsung

    (handuk kecil, untuk lap, gunting, lem, korek api, sabun cuci

    tangan).

    6. Meminjam dan memeriksa ulang alat kaca yang diperlukan selama

    praktikum kepada laboran, jika terdapat ketidaklengkapan dan

    kerusakan, maka praktikan diberikan waktu minimal satu jam untuk

    menukarnya.

    B. Selama praktikum berlangsung, praktikan diwajibkan :

    1. Berpakaian sopan dan memakai jas laboratorium.

    2. Tidak makan, minum, dan merokok di dalam laboratorium.

    3. Tidak bercanda dan bertindak yang dapat menimbulkan kecelakaan

    terhadap orang lain.

    4. Tidak mereaksikan sembarang bahan kimia tanpa ada petunjuk

    praktikum yang jelas dan tanpa seizing dosen dan asisten dosen.

    5. Tidak membuang sampah atau bahan sisa percobaan kedalam

    wastafel.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    ii

    6. Menjaga kebersihan, ketertiban, dan keamanan laboratorium

    secara bersama.

    C. Setelah praktikum selesai, praktikan diwajibkan :

    1. Mencuci dan membersihkan semua alat kaca yang digunakan

    selama praktikum dengan sabun cair/tepol yang telah disediakan.

    2. Memeriksa kembali kelengkapan dan keutuhan alat yang dipinjam

    kemudian mengembalikannya kepada laboran.

    3. Memberihkan meja praktikum masing-masing tanpa mengandalkan

    mahasiswa yang piket.

    4. Lapor diri apabila selama praktikum memecahkan alat kaca.

    5. Menyerahkan data/laporan sementara kepada asisten dosen untuk

    di paraf oleh dosen pembimbing.

    6. Meninggalkan laboratorium dengan seizin dosen pembimbing atau

    asisten dosen.

    Jakarta, Januari 2013 Kepala Laboratorium Kimia Drs. Zulhipri, M.Si. NIP. 19580703 198903 1 001

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    iii

    DAFTAR ISI

    TATA TERTIB PRAKTIKUM i

    DAFTAR ISI iii

    I. UJI KUANTITATIF KARBOHIDRAT 1

    A. Penentuan Gula Pereduksi dengan Metode Somogyi-Nelson 2

    B. Penentuan Karbohidrat dengan Metode Anthrone 2

    II. UJI KUANTITATIF PROTEIN 4

    A. Penentuan Protein dengan Metode Lowry 5

    B. Penentuan Protein dengan Metode Biuret 5

    III. UJI KUANTITATIF LIPID 7

    A. Penentuan Angka Asam 7

    B. Penentuan Angka Iodium 8

    C. Penentuan Angka Peroksida 9

    D. Penentuan bilangan TBA (Asam Tiobarbiturat) 9

    IV. DARAH 11

    A. Penentuan Kolesterol dalam Darah 11

    B. Penentuan Glukosa dalam Darah 12 V. URINE 14 A. Penentuan Sifat Fisik dari Urine 14 B. Penentuan Beberapa Komponen yang Terdapat dalam Urine 15 C. Penentuan Beberapa Senyawa pada Urine tidak Normal 16 VI. ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMID-SDS 19

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    1

    UJI KUANTITATIF KARBOHIDRAT

    I. TUJUAN

    1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi karbohidrat.

    2. Mahasiswa dapat membandingkan metode Somogyi-Nelson dan

    metode Anthrone.

    II. TEORI SINGKAT

    Pada percobaan ini digunakan metode penentuan gula pereduksi

    dengan metode Somogyi-Nelson, dimana gula pereduksi bila dipanaskan

    dengan larutan tembaga tartrat yang bersifat basa akan menghasilkan

    tembaga oksida (Cu2O). Tembaga oksida ini akan bereaksi dengan

    larutan arsenomolibdat menghasilkan warna biru molibdenum dan

    intensitas warnanya diukur dengan spektrofotometer. Pada penentuan ini

    perlu ditambahkan natrium sulfat ke dalam larutan yang berwarna biru

    untuk mencegah oksigen dari udara yang dapat mengoksidasi kembali

    Cu2O. Penentuan ini tidak dapat digunakan untuk campuran gula-gula

    pereduksi. Selain itu protein perlu dipisahkan terlebih dahulu dengan

    menambahkan Zn(OH)2 sebagai pengendap protein.

    Reaksi anthrone merupakan metode yang baik dan cepat untuk

    menentukan heksosa, aldopentosa, dan asam heksuronat, juga untuk

    mengetahui adanya polisakarida. Larutan yang berwarna kehijauan ini

    memiliki absorpsi maksimum 620nm, namun beberapa karbohidrat dapat

    memberikan warna lain. Reaksi tidak sesuai jika terdapat protein yang

    mengandung banyak gugus triptofan, karena akan memberikan warna

    merah.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    2

    III. PROSEDUR KERJA

    A. Penentuan Gula Pereduksi dengan Metode Somogyi-Nelson

    1. Pipet 0,1 mL larutan standar gula pereduksi yang mengandung 50 -

    250 g/mL, masukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1,5 mL air

    kemudian aduk sampai homogen.

    2. Pindahkan campuran ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 mL

    pereaksi Ba(OH)2 0,3 M dan 0,2 mL larutan ZnSO4. Kemudian kocok

    dan sentrifugasi selama beberapa menit.

    3. Pindahkan 1 mL supernatan ke dalam tabung reaksi lain selanjutnya

    tambahkan 1 mL pereaksi Somogyi-Nelson (tembaga alkali).

    4. Pasang penutup pada tabung, kemudian panaskan tabung di dalam

    penangas air selama 15 menit.

    5. Dinginkan tabung dan tambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat.

    Biarkan larutan beberapa saat sampai tidak timbul gelembung-

    gelembung udara.

    6. Encerkan larutan yang berwarna biru hingga volume 10 mL dan ukur

    absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm.

    7. Sampel dan blanko diperlakukan sama dengan larutan standar

    (prosedur dimulai dari nomor 1 6).

    8. Hitung kadar gula pereduksi yang didapat dari kurva absorbansi vs

    konsentrasi standar.

    B. Penentuan Karbohidrat dengan Metode Anthrone

    1. Tambahkan 4 ml reagen anthrone (0,2 % anthrone dalam H2SO4

    pekat) kedalam 1 ml larutan karbohidrat (yang tidak mengandung

    protein) kocok dengan cepat (awas asam kuat).

    2. Letakkan tabung-tabung tersebut diatas penangas air yang sedang

    mendidih tutup mulut tabung dengan kelereng untuk mengurangi

    penguapan larutan tersebut.

    3. Dinginkan dan setelah 20 menit, ukur absorbansinya pada panjang

    gelombang 620 nm.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    3

    4. Larutan standar dan blanko diperlakukan sama dengan sampel

    (prosedur dimulai dari nomor 1 3).

    5. Hitung kadar karbohidrat yang didapat dari kurva absorbansi vs

    konsentrasi standar.

    6. Konsentrasi karbohidrat standar yang dibuat adalah 5, 10, 15, 20 dan

    25 mg/100mL.

    IV. PUSTAKA

    Harrow, B., et al. 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., W. B. Sanders Comp., New York, 1-4. Frais, F. 1971. Practical Biochemistry in Introductory Course, 1st ed., Butterworth & Co., Ltd., London, 23-25. Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005. Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005. Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    4

    UJI KUANTITATIF PROTEIN

    I. TUJUAN

    1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi protein.

    2. Mahasiswa dapat membandingkan metode Lowry dan metode

    Biuret.

    II. TEORI SINGKAT

    Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin

    digunakan dalam kerja Biokimia. Ada beberapa metode yang biasa

    digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi protein, yaitu metode

    Biuret, Lowry, dan Bradford. Masing-masing metode mempunyai

    kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang terbaik untuk suatu

    pengukuran bergantung pada beberapa faktor misalnya; banyaknya

    material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan

    pengukuran, alat spektrofotometri yang tersedia (VIS atau UV) dan lain

    sebagainya.

    Prinsip metode Lowry adalah mempertajam warna yang dihasilkan

    pada metode Biuret. Pada metode ini, setelah protein direaksikan dengan

    pereaksi Biuret, ditambahkan pereaksi fosfomolibdat-fosfotungstat. Pada

    reaksi lanjutan ini akan terjadi reaksi oksidasi-reduksi dengan gugus

    tirosin dan triptofan yang ada pada protein. Batas deteksi untuk metoda ini

    adalah 20-200 g protein.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    5

    II. PROSEDUR KERJA

    A. Penentuan Protein dengan Metode Lowry

    1. Sediakan alat-alat gelas dan ikuti prosedur seperti tabel dibawah ini.

    Zat Blanko Standar Sampel

    1 2 3 4 5 6 7 8

    BSA 400 ppm (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Sampel (mL) 0,2 0,4 H2O (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,3 0,1 Pereaksi Lowry (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

    Kocok, diamkan 10 menit dan langsung ditambahkan

    Folin-Ciocalteu 1 N (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

    2. Inkubasi semua larutan pada suhu kamar selama 30 menit, baca

    absorbansinya pada = 700 nm. Waktu inkubasi ini dapat dimulai

    (start) setelah penambahan/pencampuran reagen Folin-Ciocalteu ke

    dalam tabung terakhir.

    3. Konsentrasi sampel dihitung dari kurva absorbansi vs. konsentrasi

    standar.

    B. Penentuan Protein dengan Metode Biuret

    1. Sediakan alat-alat gelas dan ikuti prosedur seperti tabel dibawah ini.

    Zat Blanko Standar Sampel

    1 2 3 4 5 6 7 8

    BSA 10 mg/mL (mL) 0,2 0,6 1 1,4 1,8 Sampel (mL) ? ? H2O (mL) 2 1,8 1,4 1 0,6 0,2 ? ?

    Pereaksi Biuret (mL) 8 8 8 8 8 8 8 8

    2. Kocok semua larutan, diamkan pada suhu kamar selama 30 menit dan

    baca absorbansinya pada = 550 nm.

    3. Konsentrasi protein dalam sampel dihitung dari kurva absorbansi vs.

    konsentrasi standar.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    6

    Pertanyaan:

    1. Apakah kelebihan dan kelemahan kedua metode tersebut diatas?

    2. Jelaskan sedikitnya dua metode lain (secara spektrofotometri) dalam

    menentukan konsentrasi protein berikut kelebihan dan kekurangannya

    dibandingkan dengan kedua metode diatas.

    IV. TUGAS PENDAHULUAN

    1. Mengapa metode Lowry lebih peka dibandingkan Biuret dalam

    menganalisa protein?

    2. Beri penjelasan mengenai metode lain untuk menentukan konsentrasi

    protein berikut kelebihan dan kekurangannya

    IV. PUSTAKA

    Colowick, S. P. dan Kaplan, N. O. 1957. Methods in Enzymology, Vol. V, Acad. Press Inc., New York, halaman 448-450. Holme, D. J. dan Peck, H. 1993. Analytical Biochemistry, 2nd ed., Longman Scientific and Technical, New York. Alexander, R. R. dan Griffiths, J. M. 1993. Basic Biochemical Methods, 2nd ed., A. John Wiley & Sons, Inc., New York.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    7

    UJI KUANTITATIF LIPID

    I. TUJUAN

    1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi lipid.

    2. Mahasiswa dapat membandingkan berbagai metode penentuan

    lipid

    II. TEORI SINGKAT

    Lipid merupakan komponen jaringan yang heterogen dan

    penggolongannya didasarkan atas kelarutannya di dalam pelarut-palarut

    lemak, seperti eter dan lain-lain. Sedangkan komponen-kompnen

    campuran lipid dapat difraksinasi lebih lanjut dengan menggunakan

    perbedaan kelarutannya di dalam berbagai pelarut organik. Sebagai

    contoh; fosfolipid dapat dipisahkan dari sterol dan lemak netral atas dasar

    ketidak larutannya di dalam aseton.

    III. PROSEDUR KERJA

    A. Penentuan Angka Asam

    Selama disimpan, minyak atau lemak dapat menjadi tengik karena

    adanya asam lemak bebas dan senyawa aldehid sebagai akibat terjadinya

    pemutusan ikatan rangkap melalui pembentukan peroksida oleh oksidasi

    udara atau hidrolisis oleh mikroorganisme. Jumlah asam lemak bebas

    yang terdapat dalam minyak dapat menunjukkan umur penyimpanan dan

    kualitas minyak tersebut.

    Angka asam adalah jumlah mg KOH yang dibutuhkan untuk

    menetralkan asam lemak bebas yang terdapat dalam 1 g lemak atau

    minyak.

    Prosedur:

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    8

    1. Larutkan 10 g sampel dalam 50 mL alkohol secara kuantitatif,

    kemudian tambahkan

    indikator phenolphthalein.

    2. Titrasi campuran dengan larutan NaOH 0,1 N sampai timbul warna

    merah jambu yang tidak hilang selama 30 detik. Lakukan hal yang

    sama pada blanko.

    3. Hitung angka asarn sampel.

    B. Penentuan Angka Iodium

    Angka iodium adalah jumlah mg iodium yang diserap oleh 1 g minyak

    atau lemak. Angka iodium dapat menunjukkan indikasi seberapa banyak

    asam lemak tidak jenuh yang terdapat dalam minyak atau lemak. Asam

    lemak tidak jenuh dapat mengalami reaksi adisi dengan halogen pada

    ikatan rangkapnya. lodin monoklorida bereaksi dengan ikatan rangkap dan

    jumlah iodium yang bereaksi dapat ditentukan dengan cara mentitrasi

    iodium yang sisa dengan dengan larutan standar tiosulfat, setelah terlebih

    dahulu ditambah KI.

    Prosedur:

    1. Timbang 0,5 g sampel dalam erlenmeyer tertutup dan larutkan dalam

    10 mL kloroform.

    2. Tambahkan 10 mL larutan Hannus/Wijs secara kuantitatif ke dalamnya

    dan diamkan selama 30 menit di tempat gelap.

    3. Tambah 10 mL larutan KI 15% lalu kocok.

    4. Semprot dinding erlenmeyer dan tutupnya dengan air didih.

    5. Titrasi campuran dengan larutan natrium tiosulfat 0,1 N sampai larutan

    berwarna kuning.

    6. Tambahkan 1 mL larutan kanji, selanjutnya titrasi kembali sampai

    warna biru hilang. Lakukan percobaan yang sama untuk blanko.

    7. Hitung angka iodium sampel.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    9

    C. Penentuan Angka Peroksida

    Lipid mudah mengalami oksidasi sehingga menyebabkan tengik. Lipid

    bila teroksidasi akan menghasilkan senyawa hidroperoksida. Untuk

    mengetahui banyaknya lipid yang teroksidasi ditentukan dengan bilangan

    peroksida. Ada beberapa cara untuk penentuan ini.

    Prosedur:

    1. Masukkan 100 mg sampel ke tabung reaksi, tambahkan 0,5 mL larutan

    KI, larutan AlCl3 0,5 mL dan 1 mL n-heksana.

    2. Inkubasi campuran pada 37C selama 5 menit.

    3. Tambahkan 15 mL larutan HCl 0,01 N dan 0,5 mL larutan kanji. Kocok

    campuran dengan kuat dengan menggunakan corong pisah. Pisahkan

    lapisan bawah dan baca absorbansinya pada = 560 nm.

    4. Lakukan kalibrasi menggunakan larutan standar KIO3 dengan cara

    mencampurkan 0,2 mL larutan KIO3, 0,5 mL larutan AICl3 dan 0,5 mL

    larutan KI lalu tambahkan 15 mL larutan HCl 0,01 N dan 0,5 mL larutan

    kanji dan diukur absorbansinya pada = 560 nm.

    stA x m

    KA x x 1,2 proksida Angka

    Dengan:

    A = absorbansi sampel pada = 560 nm

    Ast = absorbansi standar pada = 560 nm

    m = berat minyak (g)

    K = faktor konversi volume (1,01212)

    D. Penentuan bilangan TBA (Asam Tiobarbiturat)

    Hidroperoksida yang merupakan hasil utama pada reaksi oksidasi lipid

    dapat mengalami penguraian menjadi senyawa yang lebih kecil seperti

    aldehida. Aldehida dapat menimbulkan bau dan rasa tidak enak pada lipid.

    Selain itu aldehida dapat bersifat karsinogenik. Untuk mengetahui

    banyaknya aldehida dapat digunakan metode TBA, Sebagai contoh reaksi

    antara malonaldehida dengan TBA.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    10

    Prosedur:

    1. Timbang 0,2 g minyak dan 1 mL heksana. Kocok campuran.

    2. Pipet 0,5 mL campuran, tambahkan 4 mL larutan TCA 20% dan 2 mL

    larutan asam tiobarbiturat 0,67%.

    3. Tambahkan 1 mL kloroform ke dalam campuran, kocok dan pisahkan

    dengan corong pisah. Ukur absorbansi larutan yang berwarna merah

    jernih pada = 531.5 nm.

    IV. PUSTAKA

    Frais, F. 1972. Practical Biochemistry in Introductory Course, 1st ed., Butterworth & Co., Ltd., London, 104.

    Harrow, B., et al. 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., W. B. Sanders Comp., New York, 13-17.

    Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005. Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005. Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    11

    DARAH

    I. TUJUAN

    1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi kolesterol dalam darah.

    2. Mahasiswa dapat menentukan kadar glukosa dalam darah.

    II. TEORI SINGKAT

    Kolesterol termasuk senyawa lipid kelompok steroid, bisa terdapat

    bersama lemak hewan, tidak terdapat bersama lemak tumbuhan.

    Kolesterol terdapat pada seluruh tubuh, terutama pada jaringan syaraf,

    baik pada sistem syaraf pusat maupun sistem syaraf tepi (perifer), juga

    terdapat pada anak ginjal, plasma darah dan lemak kulit. Hablur kolesterol

    berbentuk persegi panjang dan sukar larut dalam air, keberadaannya

    dalam serum berkonjugasi sebagai lipoprotein 25% kolesterol dan 75%

    ester asam lemak tak jenuh. Pemeriksaan kolesterol secara klinis dapat

    dipergunakan untuk menganalisis metabolisme tubuh. Kadar kolestrol

    dalam serum bergantung pada usia, jenis kelamin, pola hidup, pola

    makanan, keseimbangan hormonal dan kehamilan. Kadar kolesterol

    normal dalam darah adalah 140 250 mg/100 mL.

    Dalam lingkungan asam, kolesterol bereaksi dengan asam menjadi

    senyawa yang tidak stabil dan memberikan warna yang intensif, sehingga

    berguna untuk identifikasi.

    III. PROSEDUR KERJA

    A. Penentuan Kolesterol dalam Darah

    a. Pembuatan Filtrat Darah Bebas Protein

    1. Diambil 0,1 mL darah yang oxalated, dimasukkan dalam tabung

    sentrifuse yang telah berisi 1,9 mL aquades, dicampur hingga

    homogen.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    12

    2. Ditambahkan 1,5 mL Ba(OH)2 0,3 M, diaduk hingga homogen.

    3. Ditambahkan lagi kedalamnya 1,5 mL ZnSO4 5 %.

    4. Semua campuran dihomogenkan dan dimasukkan ke dalam tabung

    sentrifuse selama 20 menit.

    5. Filtrat bening hasil sentrifuse akan digunakan untuk menentukan

    kadar kolesterol dalam darah.

    b. Penentuan Kolestrol dalam Darah (500 nm)

    1. Serum darah sebanyak 1 mL dimasukkan kedalam tabung

    sentrifuse kemudian ditambahkan 1 mL kloroform, kocok dan

    sentrifuse selama 5 menit.

    2. Ambil supermatannya dan pindahkan ke tabung reaksi, kemudian

    tambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrida dan 3 tetes asam sulfat

    pekat.

    3. Kocok hati-hati dan periksa warna yang terbentuk.

    4. Warna yang terbentuk tidak stabil dari warna merah berubah ke

    biru dan hijau.

    5. Ukur absorbansinya pada panjang gelombang 430 nm dan 560 nm.

    6. Kadar kolesterol darah diukur dari kurva absorbansi vs konsentrasi

    kolesterol standar.

    c. Pertanyaan

    1. Mengapa terjadi perubahan warna tidak stabil pada supernatan

    yang dihasilkan?

    2. Berapakah kadar kolesterol dalam darah secara semikuantitaf?

    3. Apakah kesimpulan percobaan anda?

    B. Penentuan Glukosa dalam Darah

    Salah satu cara penentuan kadar glukosa darah dapat dilakukan

    dengan metode kondensasi gugus amin. Prinsipnya adalah aldosa

    dikondensasi dengan o-toluidin dalam suasana asam dan menghasilkan

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    13

    larutan berwarna hijau setelah dipanaskan. Kadar glukosa ditentukan

    dengan membandingkan warna yang terjadi hasil spektrofotometer

    dengan larutan standar glukosa yang telah ditentukan konsentrasinya.

    Prosedur:

    1. Diambil 0,1 mL darah yang oxalated, dimasukkan dalam tabung

    sentrifuse yang telah berisi 1 mL TCA kemudian disentrifuse selama 5

    menit.

    2. Sebanyak 0,5 mL serum darah diambil dan ditambahkan 2 mL o-

    toluidin lalu dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 8 menit.

    Kemudian didinginkan dengan air mengalir.

    3. Setelah 20 menit, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 630

    nm.

    4. Kadar glukosa darah diukur dari kurva absorbansi vs konsentrasi

    glukosa standar.

    5. Konsentrasi glukosa standar yang dibuat adalah 5, 10, 15, 20 dan 25

    mg/100mL.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    14

    URINE

    I. TUJUAN

    Mahasiswa mengetahui berbagai uji kualitatif urine.

    II. TEORI SINGKAT

    Urine merupakan cairan yang diekskresikan oleh ginjal. Komponen dan

    kadar dari zat-zat yang terdapat dalam urine berbeda-beda tergantung

    dari apa yang dimakan dan apa yang tidak dibutuhkan oleh tubuh. Bagian

    yang tidak dibutuhkan tersebut akan dikeluarkan oleh tubuh.

    Selain air, urine mengandung garam-garam, asam, basa, sisa-sisa

    metabolisme yang tidak dibutuhkan lagi oleh tubuh, zat hasil detoksifikasi

    dan kelebihan zat yang dikeluarkan oleh darah. Untuk mengetahui apakah

    fungsi organ tubuh normal atau tidak dapat dilakukan percobaan terhadap

    urine.

    III. PROSEDUR KERJA

    A. Penentuan Sifat Fisik dari Urine

    Prosedur:

    1. Kumpulkan urine selama 24 jam dan beri pengawet. Sebagai

    pengawet dapat dipakai 2 mL toluene atau 2 mL formaldehida

    40%.

    2. Lakukan penentuan-penentuan sebagai berikut:

    a. Penentuan volume urine

    Setelah ditampung selama 24 jam, tentukan volume urine kemudian

    kocok urine tersebut sarnpai homogen. Pisahkan sebanyak 250 mL

    untuk pemeriksaan di laboratorium.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    15

    b. Penentuan kejernihan dan warna

    Amati warna urine dan kejernihannya.

    c. Penentuan pH urine

    Tentukan pH urine menggunakan kertas pH universal.

    B. Penentuan Beberapa Komponen yang Terdapat dalam Urine

    a. Penentuan garam-garam ammonium

    1. Tempatkan 2 mL urine ke dalam tabung reaksi.

    2. Tambahkan larutan NaOH encer sampai larutan bersifat basa

    (gunakan kertas lakmus merah).

    3. Panaskan campuran di penangas air.

    4. Cium bau uap yang keluar dan uji uap tersebut dengan kertas

    lakmus merah basah.

    b. Pemeriksaan sulfat anorganik dan sulfat eterial

    1. Tempatkan 5 mL urine dalam tabung reaksi.

    2. Asamkan dengan 1 mL larutan HCl 0,5 M.

    3. Tambahkan 1 mL larutan BaCl2 1 M, kocok dan saring endapan

    yang terbentuk.

    4. Pisahkan fiitrat dan endapannya.

    5. Larutkan endapan dalam 1 mL HCl 0,5 N dan amati perubahan

    yang terjadi.

    6. Didihkan filtrat di penangas air, bila tidak ada endapan, tambahkan

    lagi 1 mL larutan BaCl2 1 M. Bila timbul kekeruhan rnenunjukkan

    adanya sulfat eterial.

    c. Penentuan asam urat

    Tes ini dinamakan juga tes mureksid. Asam urat bila dioksidasikan

    oleh asam nitrat akan menghasilkan asam dialurat dan alloksan, yang

    akan mengalami kondensasi dengan adanya NH3. Hasil kondensasi ini

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    16

    dinamakan mureksid atau ammonium purpurat yang berwarna ungu

    kemerahan.

    Prosedur:

    1. Tempatkan 2 mL urine dalam cawan penguap.

    2. Tambahkan 4 tetes HNO3 pekat dan panaskan di atas hot plate

    dalam lemari asam sampai airnya menguap.

    3. Amati warna yang terbentuk pada endapan dan tambahkan 2 mL

    larutan NH3 1:100.

    4. Amati perubahan warna yang terjadi.

    d. Penentuan kreatinin

    Percobaan ini berdasarkan pembentukan warna merah rubi bila

    kreatinin direaksikan dengan nitroprusida dalam suasana basa. Warna

    tersebut lama kelamaan berubah menjadi kuning. Bila campuran

    tersebut diasamkan dengan asam asetat, warnanya akan berubah

    menjadi hijau dan kemudian menjadi biru karena terbentuknya biru

    prusian.

    Prosedur:

    1. Tempatkan 5 mL urine dalam tabung reaksi dan tambahkan 5 tetes

    larutan natrium nitroprusida 0,1 M.

    2. Teteskan larutan NaOH 1 M tetes demi tetes sampai warna merah

    timbul.

    3. Didihkan campuran tersebut dan amati perubahan warna yang

    terjadi.

    4. Asamkan dengan asam asetat glasial dengan hati-hati, panaskan

    dan amati perubahan warna yang terjadi.

    C. Penentuan Beberapa Senyawa pada Urine tidak Normal

    Yang dimaksud dengan urine tidak normal adalah urine dengan kadar

    senyawa-senyawa tertentu di atas batas ambang normal. Senyawa

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    17

    tersebut bila dalam keadaan normal tidak terdeteksi, tetapi pada

    keadaan tidak normal (penderita), senyawa tersebut akan terdeteksi.

    a. Penentuan adanya glukosa yang berlebih

    Glukosa pada penderita diabetes kadarnya dalam darah berlebih

    dan dikeluarkan melalui urine. Adanya glukosa sebagai gula

    pereduksi dapat dideteksi dengan pereaksi Benedict.

    1. Teteskan 5 tetes urine tidak normal ke dalam tabung reaksi.

    2. Tambahkan 1 mL larutan Benedict dan didihkan selama 5 menit

    di penangas air

    3. Amati perubahan yang terjadi.

    b. Penentuan benda-benda keton

    Benda-benda keton merupakan senyawa-senyawa yang terbentuk

    akibat metabolisme yang tidak sempurna. Benda-benda keton

    terdiri dari aseton, 6-hidroksibutirat dan asetoasetat. Terbentuknya

    benda keton dapat menyebabkan terjadinya asidosis. Benda-benda

    keton ini dapat dikeluarkan melalui urine.

    Prosedur:

    1. Tempatkan 1 mL urine tidak normal dalam tabung reaksi.

    2. Jenuhkan dengan larutan (NH4)2SO4 jenuh sambil dikocok.

    3. Tambahkan 2 tetes larutan natrium nitroprusida 5% (fresh/baru

    dibuat) dan 1 mL NH3 pekat.

    4. Kocok dan biarkan selama 30 menit. Warna ungu yang timbul

    menandakan adanya keton.

    c. Penentuan darah

    Darah kadang-kadang ada dalam urine, terutama bila ada infeksi

    atau luka pada saluran urine dan luka pada ginjal.

    Prosedur:

    1. Tempatkan 2 rnL urine tidak normal dalam tabung reaksi.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    18

    2. Tambahkan 1 mL larutan Benzidin jenuh dan 3,5 mL larutan

    H2O2 3%.

    3. Kocok campuran dan amati perubahan yang terjadi.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    19

    ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMID-SDS

    I. TUJUAN

    1. Mahasiswa mengetahui dan mempergunakan alat elektroforesis

    2. Mahasiswa dapat menentukan berat molekul protein.

    II. TEORI SINGKAT

    Protein adalah suatu polimer yang monomernya terdiri asam amino yang

    terikat oleh ikatan peptide. Suatu protein aktif merupakan suatu polipeptida yang

    telah melipat membentuk struktur tersier dan kuarterner. Protein tertentu

    mempunyai susunan dan jumlah asam amino tertentu. Dengan kata lain protein

    mempunyai berat molekul tertentu dan biasanya dinyatakan dengan susunan Da.

    Satu molekul asam amino mempunyai berat molekul 110 Da. Berat molekul satu

    protein dapat ditentukan dengan berbagai macam cara, salah satunya adalah

    dengan elektroforesis sodiumdodecyl sulfate-polycrylamide gel electrophoresis

    (SDS-PAGE). Metode SDS-PAGE juga dapat digunakan untuk menetukan

    apakah suatu protein terdiri dari satu submit atau lebih.

    Metode SDS-PAGE adalah pemisahan protein didasarkan pada perbedaan

    berat molekul protein dalam suatu medan listrki. SDS adalah suatu detergen

    yang bermuatan negatif yang akan membentuk kompleks dengan molekul

    protein. Dengan demikian protein akan bermuatan negatif dengan muatan yang

    sebanding dengan panjang rantai subunit. SDS mengikat bagian hidrofobik dari

    protein dan merusak struktur sekunder, tersier dan kuarterner protein. Gel

    polikarilamid adalah media pendukung yang dipakai untuk memisahkan protein.

    Gel ini merupakan hasil polimerisasi dari akrilamid dengan menggunakan N,

    Nmetilen-bis-akrilamid sebagai pembentuk ikatan silang. Molekul protein akan

    bermigrasi melewati pori gel akrilamid dengan mobilitas yang tergantung pada

    panjangnya. Jika suatu protein mengandung lebih dari satu submit maka pada

    elektroforesis akan terdapat lebih dari dua molekul yang bermigrasi. Berat

    molekul protein dapat ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi antara

    logaritma berat molekul protein standar dan jarak migrasi.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    20

    Teknik elektroforesis SDS-PAGE ini juga dapat digunakan untuk berbagai

    keperluan, misaknya: penentuan kemurnian protein, penentuan konsentrasi

    protein, penentuan adanya proteolisis dan deteksi adanya modifikasi pada

    protein.

    III. PROSEDUR KERJA

    Alat:

    1) Bio-Rad Mini-Protean II.

    2) Power supply.

    3) Tabung Eppendorf.

    4) Gel loading tips.

    Bahan:

    1) Akrilamid : bis-akrilamid (39:1)

    2) Tris-HCl pH 6.8 1M

    3) Tris-HCl pH 8,7 1M.

    4) SDS 20%.

    5) N,N,N,N-tetrametiletilendiamin (TEMED).

    6) Ammonium persulfat 10%.

    7) Running Buffer (1g SDS, 3,03 g Tris, 14,4 g glisin, ditambahkan air

    sampai dengan

    100 mL).

    8) Larutan staining (40 mL metanol, 15 mL asam asetat, 0,1 g Coomassie

    brilliant blue G250, ditambahkan air sampai dengan 100 mL).

    9) Larutan destaining (10 mL metanol, 7,5 mL asam asetat, ditambahkan

    air sampai dengan 100 mL).

    10) 5x Sampel Buffer (12,5 mL 1M Tris pH 6,8; 20 mL gliserol, 10 mL

    mercaptoethanol, 40 mL 10% SDS, 15 mg Bromophenol Blue).

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    21

    Tabel Komposisi Gel Poliakrilamid 10%

    PERHATIAN!!!

    Akrilamid adalah senyawa neurotoxin, Jadi gunakan sarung tangan kalau membuat gel akrilamid.

    Polimer akrilamid tidak bersifat neurotoxin.

    Jangan menyentuh alat elektroforesis yang sedang ada voltase.

    Cara Kerja:

    A. Persiapan Gel

    1. Campurkan semua larutan untuk separating gel dengan urutan

    penambahan sesuai dengan tabel diatas.

    2. Tuangkan (dengan menggunakan pipet) larutan ke dalam gel

    sandwich sampai kira-kira 1,5 cm dari bagian atas plate.

    3. Tambahkan air sampai ketinggian kira-kira 1-5 mm.

    4. Diamkan sampai terjadi polimerisasi (30 menit).

    5. Campurkan semua larutan untuk stacking gel dengan urutan

    penambahan sesuai dengan tabel di atas.

    6. Buang air yang terdapat pada bagian atas separating gel.

    7. Tuangkan campuran stacking gel di atas separating gel dan

    siapkan comb.

    8. Diamkan sampai terjadi polimerisasi (30 menit).

    B. Persiapan Sampel

    1. Siapkan larutan protein standard an sampel protein.

    2. Tambahkan larutan 5x sampel buffer.

    Larutan Induk Stacking Gel (mL) Running Gel (mL)

    Acr/Bis 2, 5 10 H2O 14,84 13

    1 M Tris pH 6,8 2,5 - 1 M Tris pH 8,7 - 15

    20% SDS 0,1 0,2 10% APS 0,1 0,2

    TEMED (l) 16 30

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    22

    3. Didihkan selama 5 menit.

    C. Elektrolisis Gel

    1. Pasangkan gel sandwich yang telah disiapkan ke alat

    elektroforesis.

    2. Tuangkan running buffer kedalam tank elektroforesis.

    3. Masukan sampel protein (10-20 g) ke dalam tiap-tiap lubang gel

    dengan pipet mikro (Eppendorf).

    4. Pasang penutup alat elektroforesis.

    5. Sambungkan ke power supply dan lakukan elektroforesis pada

    voltase tetap 200 V.

    6. Matikan alat setelah blue dye tepat keluar dari gel (kira-kira 60

    menit).

    D. Staining dan Destaining

    1. Keluarkan gel dari plate (gunakanlah sarung tangan).

    2. Masukan kedalam larutan destaining (50 mL).

    3. Biarkan selama 15 menit.

    4. Pindahkan kedalam larutan destaining (50 mL).

    5. Biarkan sampai gel menjadi bersih (30 menit-semalam).

    Tugas:

    1. Buat kurva kalibrasi protein standar.

    2. Tentukan berat molekul protein sampel yang dianalisis.

    IV. TUGAS PENDAHULUAN

    1. Jelaskan reaksi pembentukan polimer poliakrilamid dan sebutkan

    fungsi bis-akrilamid, TEMED, ammonium persulfat dan

    merkaptoetanol.

    2. Jelaskan prinsip elektroforesis.

    3. Jelaskan bagaimana cara memvisualisasikan protein hasil

    pemisahan dengan SDS-PAGE.

  • Petunjuk Praktikum Biokimia II

    Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ

    23

    V. PUSTAKA

    Bollag, D. M., Rozycki, M. D. and Edelstein, S. J. 1996, Protein Methods, 2nd ed., A John Willey & Sons, Inc. Pub, New York.

    Boyer, R. F. 1993, Modern Experimental Biochemistry, 2nd ed., The

    Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California. Matthew, C. K. and van Holde, K. E. 1991, Biochemistry, The

    Benjamin/Cummnings Publishing Company, Inc. California.

    COVER.pdfkata pengantarisi2