7

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1.Tandan Kosong Kelapa Sawit (TKKS)

2.1.1. Ketersediaan TKKS

Indonesia adalah negara produsen CPO (Crude Palm Oil) terbesar dan

memiliki areal kelapa sawit terluas di dunia. Berdasarkan data dari FAO (Food and

Agriculture Organization), produksi CPO Indonesia mencapai 19.76 juta ton,

sedangkan produksi tandan buah segar (TBS) Indonesia mencapai 90 juta ton pada

tahun 2010 (FAOSTAT 2012). Ekspansi lahan kelapa sawit di Indonesia juga

mengalami peningkatan. Perkebunan kelapa sawit baru banyak dibuka di pulau

Kalimantan, Sulawesi dan Papua. Indonesia diperkirakan akan tetap menjadi

produsen CPO terbesar melampaui negara-negara produsen CPO lainnya (Gambar 1).

Gambar 1. Produksi CPO (Crude Palm Oil) Indonesia dan Malaysia dari tahun

1998-2010 (FAOSTAT 2012).

0

1

2

3

4

5

6

0

5

10

15

20

25

1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Lu

as

Lah

an

Saw

it (

x 1

000 0

00 h

a)

Pro

du

ksi

CP

O (

x1 0

00 0

00 t

on

)

Tahun

Luas Lahan Sawit IndonesiaLuas Lahan Sawit MalaysiaProduksi CPO IndonesiaProduksi CPO Malaysia

8

Kandungan minyak sawit kurang lebih 14-20% dari tandan buah segar (TBS).

Ekstraksi minyak menyisakan sejumlah besar biomassa lignoselulosa, yaitu: serat

(fiber), cangkang, dan TKKS. Pengolahan satu ton TBS dapat menghasilkan 140

200 kg CPO, 600 700 kg limbah cair, 190 kg serat dan cangkang sawit, dan 230 kg

(TKKS) (Gambar 2). Jumlah TKKS di Indonesia diperkirakan mencapai 20,7 juta ton

pada tahun 2010 (FAOSTAT 2012). Sedangkan TKKS yang dihasilkan oleh sebuah

PKS berkisar antara 200 600 ton/hari, tergantung pada kapasitas pabrik dan volume

TBS yang diolah. Sebagian besar TKKS belum banyak dimanfaatkan, sebagian kecil

lainnya dimanfaatkan untuk landfill, dibakar, ditebar untuk mulsa, atau diolah

menjadi kompos.

Gambar 2. Neraca massa pengolahan TBS menjadi CPO di pabrik kelapa sawit

(dimodifikasi dari (Lacrosse 2004)).

9

2.1.2. Karakteristik Fisik TKKS

Karakteristik fisik serat TKKS ditunjukkan pada Gambar 3. Serabut TKKS

dihasilkan dengan mencacah TKKS utuh menjadi serabut-serabut. Karakteristik fisik

serabut TKKS diperlihatkan pada Tabel 1. Panjang serabut TKKS pendek berkisar

antara 10-30mm, sedangkan serabut panjang berkisar antara 100-300mm. Diameter

serabut TKKS berkisar atara 0.12 0.78 mm (Hassan et al. 2010). Aspek ratio dari

panjang dan diameter (L/D) serabut TKKS berkisar antara 83 952. Serabut TKKS

tersusun dari serat-serat TKKS yang lebih halus.

Gambar 3. Serabut Tandan Kosong Kelapa Sawit (TKKS).

10

Tabel 1. Karakteristik fisik tandan kosong kelapa sawit (TKKS) (Law et al. 2007)

Karakteristik TKKS Aspen Spruce

Panjang serat1, mm 0.99 0.96 3.00

Diameter serat (D) 1

, m 19.1 20.8

Ketebalan dinding sel (T) 1

, m 3.38 1.93

Kekasaran serat (fiber coarseness) 1

, mg/m 1.37 1.01

Kehalusan serat (Fines

11

kandungan butiran silika ini diketahui dapat meningkatkan penetrasi senyawa kimia

ke dalam TKKS dalam proses pulping (Law et al. 2007).

Gambar 4. Butiran silika (silica bodies) yang terdapat di permukaan serabut TKKS

(kiri), sedangkan lapisan bagian dalam tidak terlihat adanya butiran

silika (kanan) (Law et al. 2007).

2.1.3. Karakteristik Kimia TKKS

Karakteristik kimia TKKS diperlihatkan pada Tabel 2. Terdapat sedikit variasi

kandungan bahan kimia yang dilaporkan oleh beberapa peneliti baik di Indonesia

maupun Malaysia. Perbedaan ini kemungkinan disebabkan karena perbedaan contoh

TKKS yang diambil dari varietas, umur tanaman, teknik budidaya, dan daerah iklim

yang berbeda.

TKKS terutama tersusun atas tiga komponen utama, yaitu: lignin, selulosa,

dan hemiselulosa. Kandungan selulosa dan hemiselulosa dalam TKKS relatif lebih

tinggi daripada kandungan dari biomassa lignoselulosa lain. Selulosa merupakan

polimer glukosa yang tidak bercabang. Hemiselulosa merupakan polimer dari

beberapa monomer gula, seperti: glukosa, arabinosa, xylosa, mannose, dan galaktosa.

12

Proporsi kandungan xylosa dalam hemiselulosa TKKS lebih tinggi daripada

komponen gula lainnya. Kandungan lignin terdiri dari Acid Insoluble Lignin (AIL)

dan Acid Soluble Lignin (ASL). ASL merupakan lignin yang memiliki bobot molekul

rendah. Kandungan ASL di dalam TKKS lebih rendah daripada kandungan ASL.

Tabel 2. Karakteristik kimia tandan kosong kelapa sawit (TKKS)

Kandungan (% dari berat kering) (Law et al. 2007) (Isroi et al. 2013 )

Ekstraktif 3.7+-0.3

Lignin larut asam 7.810.03

Lignin tak larut asam 18.8+-0.3

Lignin tak larut asam bebas abu 17.8+-0.2 26.560.14

Abu 1.3+-0.2

Larut air panas 7.5+-0.8

Larut 1% NaOH 14.5+-2.7

Holoselulosa 82.4+-1.4

Selulosa 62.9+-2.0 39.132.26

Hemiselulosa 28.0 23.042.79

Arabinosa 2.5+-1.1

Xylosa 33.1+-2.6

Mannosa 1.3+-0.01

Galaktosa 1.0+-0.0

Glukosa 66.4+-3.7

Silika (EDAX) 1.8 (atomic)

Silika (Metode TAPPI) 0.9+-0.1

Copper 0.8 +-0.7 g/g

Calcium 2.8+-0.1 g/g

Manganese 7.4+-0.4 g/g

Iron 10.0 g/g

Sodium 11.0+-0.4 g/g

2.2. Biomassa Lignosellulosa

Senyawa struktural utama biomassa tumbuhan berkayu adalah lignoselulosa

yang komponen penyusun utamanya adalah lignin, selulosa, dan hemiselulosa.

13

Biomassa lignoselulosa ini juga merupakan penyusun limbah organik yang berasal

dari limbah agroindustri, baik dari tanaman pangan, perkebunan, maupun tanaman

industri.

2.2.1. Lignin

Kandungan lignin di dalam TKKS lebih mirip dengan kandungan lignin di

dalam kayu keras (hardwood) (Law et al. 2007). Lignin adalah polimer tri-

dimensional phenylphropanoid yang dihubungkan dengan beberapa ikatan antara

karbon-karbon dan beberapa ikatan lain antara unit phenylprophane yang tidak

mudah dihirolisis (Higuchi 2004). Di alam lignin ditemukan sebagai bagian integral

dari dinding sel tanaman, terbenam di dalam matrik polimer dari selulosa dan

hemiselulosa. Lignin tersusun dari unit phenylpropene: unit guaiacyl (G) dari

prekusor trans-coniferyl-alcohol, syringyl (S) unit dari trans-sihapyl-alcohol, dan p-

hydroxyphenyl (H) unit dari prekursor trans-p-coumaryl alcohol. Komposisi lignin di

alam sangat bervariasi tergantung pada spesies tanaman. Lignin dikelompokkan

menjadi dua kelompok utama, yaitu: guaiacyl lignin dan guaiacyl-syringyl lignin

(Wong 2009). Guaiacyl lignin adalah produk polimerisasi yang didominasi oleh

coniferyl alcohol, sedangkan guaiacyl-syringlyl lignin tersusun atas beberapa bagian

dari inti aromatic guaiacyl dan syringyl, bersama dengan sejumlah kecil unit p-

hydroxyphenyl. Kayu lunak terutama tersusun atas unit guaiacyl, sedangkan kayu

keras tersusun atas unit syringyl. Kayu lunak diketahui lebih resisten untuk

didelignifikasi dengan ekstraksi basa daripada kayu keras (Ramos et al. 1992). Hal ini

14

menimbulkan dugaan bahwa guaiacyl lignin membatasi pemekaran (swelling) serat

dan dengan demikian menghalangi serangan enzim pada unit syringyl lignin. Struktur

yang lebih resisten dari guaiacyl lignin juga telah diobservasi di dalam penelitian

degradasi dari lignin sintetis oleh Phanerochaeta chrysosporium (Faix O. et al. 1995).

Hasil beberapa penelitian lignin menunjukkan bahwa ada beberapa macam

struktur lignin (Novikora et al. 2002). Lignin terdiri dari daerah amorphous dan

bentuk-bentuk teratur seperti partikel tabung dan globula. Ada indikasi bahwa

struktur kimia dan struktur tri-dimensional lignin sangat dipengaruhi oleh matrik

polisakarida. Lignin memiliki karakteristik hidrofobik. Simulasi dinamik

menunjukkan bahwa gugus hydroxyl dan methoxyl di dalam prekusor lignin dan

oligomer lignin mungkin berinteraksi dengan mikrofibril selulosa.

Tipe ikatan utama lignin di dalam kayu spruce adalah ikatan (linkage) ether,

dan ikatan arylglycerol- -aryl ether adalah tipe ikatan yang utama. Sebagai

tambahan, unit phenylpropene diikat oleh ikatan karbon-karbon (Sjstrm 1981).

Gugus fungsional yang mempengaruhi reaktifitas lignin meliputi gugus phenolic

hydroxyl bebas, methoxyl, benzylic hydroxyl, benzyl alcohol, noncyclic benzyl ether

dan carbonyl. Guaiacyl lignin mengandung gugus phenolic hydroxyl daripada

syringyl. Skema struktur dari lignin kayu lunak, termasuk struktur baru

dibenzodiaxocin diperlihatkan pada Gambar 5.

15

Gambar 5. Struktur lignin kayu lunak (Brunov, 1998).

Struktur kimia lignin dapat mengalami perubahan di bawah kondisi suhu yang

tinggi dan asam, seperti pada pretreatment dengan uap panas. Lignin terpecah

menjadi partikel yang lebih kecil dan terlepas dari selulosa pada reaksi temperatur

tinggi di atas 200oC (Tanahashi et al. 1983). Penelitian pada lignin kayu keras

menunjukkan bahwa ikatan -O-4 aryl ether terpecah pada saat perlakuan steam-

explotion yang menyebabkan penurunan bobot molekul dan meningkatkan

kandungan phenolic (Marchessault et al. 1981).

2.2.2. Selulosa

Selulosa adalah komponen utama yang mencapai 39,13% dari bobot kering

16

TKKS (Isroi et al. 2013 ). Selulosa sangat erat berasosiasi dengan hemiselulosa dan

lignin. Isolasi selulosa membutuhkan perlakuan kimia yang intensif (Aziz et al.

2002). Selulosa terdiri dari unit monomer D-glukosa yang terikat melalui ikatan -1-

4-glikosidik. Residu glukosa tersusun dengan posisi 180o antara satu dengan yang

lain, dan selanjutnya pengulangan unit dari rantai selulosa membantuk unit selobiosa

(Gambar 6). Derajat polimerasi (DP) selulosa bervariasi antara 7000 15000 unit

glukosa, tergantung pada bahan asalnya.

(A)

(B)

Gambar 6. Skema molekul selulosa (A)

(http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohydrates.html) dan

model molekul selulosa (B) (http://www.lsbu.ac.uk/water/hycel.html).

Gugus fungsional dari rantai selulosa adalah gugus hydroxyl ( OH). Gugus

OH ini dapat berinteraksi satu sama lain dengan gugus O, N, dan S, membentuk

17

ikatan hydrogen. Ikatan H juga terjadi antara gugus OH selulosa dengan air.

Gugus-OH selulosa menyebabkan permukaan selulosa menjadi hidrofilik. Rantai

selulosa memiliki gugus-H di kedua ujungnya. Ujung C1 memiliki sifat pereduksi.

Struktur rantai selulosa distabilkan oleh ikatan hydrogen yang kuat disepanjang

rantai. Setiap rantai selulosa saling terikat dengan ikatan hydrogen dan bersama-sama

membentuk mikrofibril yang sangat terkristal (highly crystalline) (Gambar 7).

Selulosa alam mengandung area amorphous yang lebih sedikit dibandingkan area

terkristal, terutama di wilayah yang sangat terkristal. Sebuah kristal selulosa

mengandung sepuluh rantai glukan dengan orientasi pararel. Tujuh kristal

polymorphs selulosa telah diidentifikasi, yang dikodekan dengan I, I , II, IIII,IIIII, IVI

dan IVII (O'Sullivan 1997). Kristal selulosa jenis I dan I ditemukan melimpah di

alam dibandingkan selulosa lain (Attala and Vanderhart 1984).

Gambar 7. Usulan pola ikatan hydrogen dalam selulosa I dan II (Kolpak &

Badwell, 1976).

18

2.2.3. Hemiselulosa

Hemiselulosa umumnya dikelompokkan berdasarkan residu gula utama yang

menyususun rangkanya, seperti: xylan, mannan, galactan, dan glucan, dengan xylan

dan mannan adalah gugus utama dari hemiselulosa (Gambar 8). Hemiselulosa

umumnya dilaporkan berasosiasi secara kimia atau terikat-silang dengan polisakarida,

protein, atau lignin. Xylan kemungkinan sebagai wilayah ikatan utama antara lignin

dan karbohidrat lain. Hemiselulosa lebih mudah larut daripada selulosa, dan dapat

diisolasi dari kayu dengan cara ekstraksi. Rata-rata derajat polimerisasi (DP) dari

hemiselulosa bervariasi antara 70 dan 200 tergantung pada jenis biomassa

lignosellulosa (Palonen 2004).

Gambar 8. Beberapa gula penyusun hemiselulosa (Hu et al. 2008)

Hemiselulosa di dalam kayu keras dan tanaman semusim terutama tersusun

atas xylan (15-30%), sedangkan hemiselulosa kayu lunak tersusun atas

galaktoglukomannan (15 20%) dan xylan (7 10%). Xylan kayu keras terdiri atas

unit -D-xylopyranosyl, yang mengandung asam 4-O-methyl--D-glucuronic dan

19

gugus samping acetil. Asam 4-O-methyl-- D-glucuronic diikat ke rangka xylan

melalui ikatan O-(12) glycosidic dan asam asetik diesterifikasi pada gugus karbon

2 dan/atau 3 hydroxyl. Rasio molar antara xylosa : asam glukoronat : residu acetil

adalah antara 10:1:7. Xylan kayu lunak adalah arabino-4-O-methylglucuronoxylan,

yang tidak terasetilasi, tetapi rangka xylan disubstitusi pada karbon 2 dan 3 secara

berurutan dengan asam 4-O-methyl--D-glucuronic dan residu -L-arabinofuranosyl

(Perezn et al., 2005). Galaktoglukomannan kayu lunak memiliki rangka ikatan--1-4

unit -D-glucopyranosyl dan -D-mannopyranosyl, yang sebagian disubstitusi oleh

-D-galactopyranosyl dan gugus asetil (O'Sullivan 1997). Terdapat dua macam

galaktoglukomanan: fraksi larut air dan larut alkali, dengan rasio

mannose:glukosa:galaktosa:residu asetil 3:1:1:0.24 untuk faksi larut air, dan

3:1:0.1:0.24 untuk fraksi larut alkali (Palonen 2004).

2.3. Pretreatment

Pretreatment adalah perlakuan pendahuluan terhadap biomassa lignoselulosa

sebelum diolah/dikonversi menjadi produk-produk turunannya. Pretreatment

biomassa lignoselulosa adalah tahapan proses yang harus dilakukan pada biokonversi

lignoselulosa untuk mendapatkan hasil yang tinggi dan sangat penting dalam

pengembangan teknologi skala komersial (Mosier et al. 2005). Pretreatment

merupakan tahapan yang banyak memakan biaya dan berpengaruh besar terhadap

biaya keseluruhan proses. Sebagai contoh pretreatment yang baik dapat mengurangi

jumlah enzim yang digunakan dalam proses hidrolisis (Wyman et al. 2005).

20

Pretreatment juga dapat meningkatkan hasil gula yang diperoleh. Gula yang

diperoleh tanpa pretreatment kurang dari 20%, sedangkan dengan pretreatment dapat

meningkat menjadi 90% dari hasil teoritis (Hamelinck et al. 2005). Tujuan dari

pretreatment adalah untuk mengubah struktur lignoselulosa agar selulosa menjadi

lebih mudah diakses oleh enzim yang memecah polymer polisakarida menjadi

monomer gula. Ringkasan berbagai teknik pretreatment ditampilkan pada Tabel 3.

Tabel 3. Beberapa metode pretreatment biomassa lignoselulosa untuk produksi

bioetanol

Prinsip Proses/Metode Perubahan pada

biomassa

Referensi

Pretreatment

mekanik atau

fisik

Milling:

- ball milling - two-rol milling - hammer milling - colloid milling - vibrotory ball

milling

Irradiation:

- gamma-ray - electron beam - microwave Lainnya:

- hydrothermal - uap bertekanan

tinggi

- expansi - extrusi - pirolisis - air panas

- mengurangi ukuran partikel

- meningkatkan luas permukaan

yang kontak

dengan enzim

- mengurangi kristalisasi

selulosa

(Taherzadeh &

Karimi, 2008)

(Sun & Cheng,

2002)

(Zhu, et al.,, 2005)

(Thomsen et al.,

2008)

(Ahring et al.,,

1996)

(Hendriks &

Zeeman, 2009)

(Eggeman &

Elander, 2005)

(Ohgren et al.,,

2006)

(Kabel et al.,,

2007)

Pretreatment Explosion: - meningkatkan (Sun & Cheng,

21

Prinsip Proses/Metode Perubahan pada

biomassa

Referensi

kimia dan

fisiko-kimia

- eksplosi uap panas

- ammonia fiber explotion

(AFEX)

- eksplosi CO2 - eksplosi SO2 Alkali:

- sodium hidroksida

- ammonia - ammonium sulfat - ammonia recycle

percolation

(ARP)

- kapur (lime) Asam:

- asam sulfat - asam fosfat - asam hidroklorat - asam parasetat Gas:

- Clorin dioksida - Nitrogen

dioksida

- Sulfur dioksida Agen Oksidasi:

- Hidrogen peroksida

- oksidasi basah - Ozone Pelarut untuk

ekstraksi lignin:

- ekstrasi etanol-air

- ekstrasi benzene-

area pemukaan

yang mudah

diakses

- delignifikasi sebagian atau

hampir

keseluruhan

- menurunkan kristalisasi

selulosa

- menurunkan derajat

polimerisasi

- hidrolisis hemiselulosa

sebagian atau

keseluruhan

2002)

(Taherzadeh &

Karimi, 2008)

(Eggeman &

Elander, 2005)

(Eklund et al.,

1995)

(Negro et al.,

2003)

(Bower et al.,

2008)

(Cara et al., 2008)

(Kim & Hong,

2001)

(Mosier, et al.,

2005)

(Saha & Cotta,

2008)

(Shimizu et al.,

1998)

(Sun & Chen,

2008)

(Sun & Chen,

2008b)

(Sun & Cheng,

2005)

(Zhang et al.,

2008)

22

Prinsip Proses/Metode Perubahan pada

biomassa

Referensi

air

- ekstraksi etilen glikol

- ekstraksi butanol-air

- agen pemekar (swelling)

(Kim & Lee, 2002)

(Zhao et al., 2008)

(Lloyd &

Wayman, 2005)

(Ahring et al.,

1996)

(Silverstein et al.,

2007)

Biologi - Jamur Pelapuk Putih

- Aktinomicetes

(Taniguchi et al.,

2005)

(Shi et al., 2008)

(Keller et al.,

2003)

(Kirk & Chang,

1981)

Selama beberapa tahun terakhir berbagai teknik pretreatment telah dipelajari

dan dikembangkan melalui pendekatan biologi, fisika, kimia. Pretreatment sebaiknya

dapat memenuhi kebutuhan berikut ini: 1) meningkatkan pembentukan gula atau

kemampuan menghasilkan gula pada proses berikutnya melalui hidrolisis enzimatik;

2) menghindari degradasi atau kehilangan karbohidrat; 3) menghindari pembentukan

produk samping yang dapat menghambat proses hidrolisis dan fermentasi, 4) biaya

yang dibutuhkan ekonomis (Sun and Cheng 2002). Teknik pretreatment yang telah

23

dikembangkan lebih banyak dilakukan secara mekanik atau fisiko-kimia.

Perbandingan berbagai metode pretreatment telah diulas secara detail dalam beberapa

referensi (Alvira et al. 2010, Hendriks and Zeeman 2009, Mosier et al. 2005,

Taherzadeh Muhammand J. and Karimi 2008).

Salah satu metode pretreatment kimia yang dilaporkan efisien dalam

meningkatkan hidrolisis enzimatik biomassa lignoselulosa adalah pretreatment

menggunakan asam fosfat (Nieves et al. 2011). Asam fosfat dengan konsentrasi tinggi

(>81%) adalah pelarut selulosa yang ideal (Zhang Y-HP et al. 2006). Selulosa dapat

terlarut dalam asam fosfat pada suhu rendah dan re-gerenasi selulosa tetap berada

dalam bentuk amorphous. Asam fosfat juga telah lama dimanfaatkan untuk

menghidrolisis selulosa kayu (Moore 1919). Penggunaan asam fosfat untuk

pretreatment biomassa lignoselulosa memiliki beberapa keunggulan dibandingkan

metode pretreatment menggunakan bahan kimia lain yaitu bahwa residu asam fosfat

tidak memiliki efek inhibitor pada tahapan hidrolisis dan fermentasi. Pretreatment

asam fosfat dilaporkan dapat meningkatkan 40% produksi biogas dari TKKS(Nieves

et al. 2011).

2.4. Pretreatment Biologi dengan Jamur Pelapuk Putih (JPP)

Pemanfaatan jamur pelapuk putih (JPP) untuk pretreatment biomassa

lignocellulosa sudah dimulai sejak akhir tahun 1970-an. Jamur Pelapuk Putih (JPP)

merupakan kelompok mikroba yang paling banyak dimanfaatkan untuk pretreatment

biomassa lignoselulosa (Sun and Cheng 2002). Beberapa spesies JPP yang telah

24

dimanfaatkan untuk pretreatment biologi disajikan dalam Tabel 4. JPP adalah satu-

satunya mikroba yang dapat mendegradasi lignin secara sempurnya menjadi CO2. JPP

menghasilkan enzim lignin peroksidase (LiP), mangan peroksidase (MnP), versatile

peroksidase (VP) dan lakase (Lac) yang berperan di dalam degradasi lignin (Hammel

and Cullen 2008). Pretreatment biologi telah dimanfaatkan untuk hidrolisis enzimatik

lignosellulosa sejak awal tahun 1980-an, namun tidak banyak laporan setelah itu.

Selanjutnya pretreatment biologi diteliti secara intensif dan banyak dimanfaatkan

untuk pakan ternak dan pembuatan pulp (biopulping). Beberapa tahun terakhir

pemanfaatan JPP untuk pretreatment biologi kembali diteliti dan dilaporkan, seiring

dengan maraknya penelitian biomassa lignosellulosa sebagai bahan baku produksi

bioetanol.

Tabel 4. Beberapa spesies jamur pelapuk putih (JPP) untuk perlakuan pendahuluan

biologi biomassa lignoselulosa

Jamur Pelapuk

Putih

Biomassa

Lignoselulosa

Kegunaan

perlakuan

pendahuluan

Referensi

Bjerkandera adusta Jerami gandum Pakan Ternak (Rodrigues et al.

2008)

Ceriporia lacerata kayu Bioetanol (Lee et al. 2007)

Ceriporiopsis

subvermisproa,

Jerami padi

Kayu

Limbah pertanian

bioetanol

Biomekanikal

pulping

Biopulping

(Taniguchi et al.

2005)

(Akhtar et al. 1998)

(Yaghoubi et al.

2008)

(Mosai et al. 1999)

25

Jamur Pelapuk

Putih

Biomassa

Lignoselulosa

Kegunaan

perlakuan

pendahuluan

Referensi

Cyanthus

stercoreus

Corn stover bioetanol (Keller et al. 2003)

Cyanthus

stercoreus

Jerami

Daun-daunan

Pakan ternak (Karunanandaa and

Varga 1996)

Fomes fomentarius Jerami gandum Pakan Ternak (Rodrigues et al.

2008)

Panus conchatus Jerami padi biopulping (Yu et al. 1994)

Phanerochaete

chrysosporium

Batang kapas,

Corn stover,

Jerami padi,

Pulp

Daun-daunan

bioetanol

Biopulp

Biobleaching

Pakan ternak

(Shi et al. 2008)

(Keller et al. 2003)

(Taniguchi et al.

2005)

(Chen Hongzhang et

al. 2002)

(Yang Qifeng et al.

2007)

(de Jong et al. 1997)

(Karunanandaa and

Varga 1996)

Phellinus pini Kayu Pulp (Blanchette R.A.

and Burnes 1988)

Phlebia tremellosus Bagase

Kayu

bioetanol

Biopulping

(Mes-Hartree et al.,

1987)

(Blanchette R.A.

and Burnes 1988)

Phlebiopsis Kayu Pulp (Behrendt and

26

Jamur Pelapuk

Putih

Biomassa

Lignoselulosa

Kegunaan

perlakuan

pendahuluan

Referensi

gigantea Blanchette 1997)

Plebia tremellosus Kayu Pulp (Blanchette R.A.

and Burnes 1988)

Pleorotus ostreatus Jerami padi

Jerami gandum

bioetanol

Biogas

(Taniguchi et al.

2005)

(Muller and Trosch

1986)

Pleurotus sajorcaju Jerami

Daun-daunan

Pakan ternak (Karunanandaa and

Varga 1996)

Polyporus brumalis kayu bioetanol (Lee et al. 2007)

Poria medullpanis Kayu Pulp (Blanchette R.A.

and Burnes 1988)

Scytinostroma

galactinum

Kayu Pulp (Blanchette R.A.

and Burnes 1988)

Stereum hirsutum kayu bioetanol (Lee et al. 2007)

Trametes hirsute pulp Biopulp (Yang Qifeng et al.

2007)

Tremetes versicolor Jerami padi

Jerami gandum

bioetanol

Pakan Ternak

(Taniguchi et al.

2005)

(Rodrigues et al.

2008)

Pretreatment biologi biomassa lignoselulosa memiliki beberapa keunggulan

dibandingkan dengan pretreatment fisik/mekanik, kimia, atau fisiko-kimia, yaitu: a)

lebih spesifik terhadap substrat maupun reaksinya, 2) membutuhkan energi yang lebih

27

rendah, 3) hasil yang lebih tinggi terhadap produk yang diinginkan, 4) peluang

transformasi yang tidak bisa dilakukan oleh reagen kimia (Kirk T.Kent and Chang

1981). Salah satu kelemahan pretreatment biologi adalah waktu yang dibutuhkan

lebih lama, hingga beberapa minggu (Taniguchi et al. 2005), sedangkan pretreatment

fisik/kimia hanya beberapa menit atau jam saja (Taherzadeh Muhammand J. and

Karimi 2008). Pengaruh pretreatment biologi pada perubahan biomassa lignoselulosa

antara lain adalah: penurunan kandungan lignin, penurunan derajat polimerisasi

selulosa, dan penurunan derajat kristalisasi selulosa. Pretreatment biomassa

lignoselulosa secara biologi kurang mendapatkan perhatian, khususnya untuk

produksi bioetanol dibandingkan dengan pretreatment secara fisika/mekanik, kimia

atau fisiko-kimia (Hendriks and Zeeman 2009).

Hatakka (1983) mempelajari pretreatment jerami gandum (wheat straw) oleh

19 JPP dan menemukan bahwa 35% jerami diubah menjadi gula pereduksi oleh

Pleurotus ostreatus dalam lima minggu. Hasil yang sama diperoleh pada pretreatment

dengan Phanerochaete sordida 37 dan Pycnoporus cinnaboarinus 115 dalam waktu

empat minggu. Taniguchi et al. (2005) mengevaluasi pretreatment biologi jerami padi

dengan empat spesies JPP (Phanerochaeta chrysosporium, Tremetes versicolor,

Ceriporiopsis subvermispro, dan Pleorotus ostreatus) untuk hidrolisis enzimatik.

Pretreatment dengan Pleorotus ostreatus lebih banyak mendegradasi lignin daripada

komponen holoselulosa, dan meningkatkan hasil hidrolisis enzimatik.

Di Korea Lee et al. (2007) melakukan pretreatment biologi terhadap kayu

dengan tiga jenis JPP, yaitu: Ceriporia lacerata, Stereum hirsutum, dan Polyporus

28

brumalis, selama delapan minggu. Perlakuan kayu dengan S. hirsutum dapat

meningkatkan hasil gula hingga 21,01% daripada kayu yang tidak mendapat

pretreatment. Shi et al. (2008) memperlakukan sisa batang kapas (cotton stalk)

dengan P. chysosporium. Fermentasi kultur padat batang kapas dengan kandungan air

75% tanpa penambahan garam mineral selama 14 hari dapat menurunkan kandungan

lignin hingga 27,6%, sisa padatan yang diperoleh sebanyak 71,1%, 41,6%

karbohidrat tersedia.

Ceriporiopsis subvermispora banyak dimanfaatkan untuk pembuatan pulp.

Akhtar et al. (1992) memanfaatkan C subvermispora untuk membuat biomekanikal

pulping. Perlakuan chip kayu dengan C. subvermispora selama 4 minggu dapat

menurunkan sebesar 47% energi yang diperlukan untuk pembuatan pulp dan

menurunkan 30% ekstrak resin dibandingkan dengan kontrol. Enam isolat JPP

(Coriolus versicolor, Dichomitus squalens, Phellinus pini, Phlebia tremellosus, Poria

medulla-panis, dan Scytinostroma galactinum) diuji untuk pembuatan biopulp.

Penelitian tersebut menemukan bahwa jenis JPP dan tipe kayu sangat berpengaruh

terhadap degradasi lignin dan selektivitas penghilangan lignin (Blanchette & Burnes,

1988). Ditemukan pula variasi aktivitas enzim lignolitik dari strain JPP dari spesies

yang sama. Mosai et al. (1999) memanfaatkan C. subvermispora untuk pembuatan

biosulfite pulp. Inkubasi chip kayu selama 5 hari mengahasilkan: 5% penurunan

kappa number, 11% peningkatan kecerahan (brightness) tanpa penurunan rendemen

pulp. Chen et al. (2002) memanfaatkan P. chrysosporium untuk pembuatan biopulp

dari jerami yang telah diperlakukan dengan uap panas (steam-exploded). Kandungan

29

lignin berkurang hingga 60% pada hari ke-5 inkubasi dengan P. chrysosporium dan

jerami langsung dapat dimanfaatkan untuk pembuatan pulp. Yaghoubi et al. (2008)

menemukan bahwa pretreatment jerami dengan C. subvermispora dalam pembuatan

biochemical pulp memberikan kualitas pulp yang sangat baik, terutama pada daya

tarik (tensile strength) dan burst factor.

Pretreatment biologi biomassa dengan JPP juga dimanfaatkan untuk produksi

biogas maupun pembuatan pakan ternak. Muller & Trosch (1986) menyeleksi 32

spesies JPP untuk pretreatment jerami gandum dalam produksi biogas. Perlakuan

jerami dengan Pleurotus ostreatus memberikan penurunan lignin tercepat. Produksi

biogas dari jerami yang telah diperlakukan dengan JPP lebih besar dua kali

dibandingkan dengan jerami yang tidak diperlakukan. Karunanandaa & Varga (1996)

memperlakukan jerami dengan 4 JPP (Cyuthus stercoreus (Cd), Phanerochaete

chrysosporium (PC) and Pleurotus sajorcaju) yang dimanfaatkan untuk pakan ternak.

Perlakuan jerami denga JPP secara signifikan meningkatkan uji pencernaan in vitro

melalui peningkatan ketersediaan selulosa untuk pencernaan mikroba rumen.

Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan, Bogor, mengembangkan teknologi

pengomposan TKKS dengan mamanfaatkan JPP. Beberapa isolat JPP telah berhasil

diisolasi dan isolat yang diketahui memiliki kemampuan tinggi dalam mendegradasi

TKKS adalah Polyota sp dan Agraily sp. Kedua JPP tersebut yang dikombinasikan

dengan beberapa Trichoderma sp telah dimanfaatkan sebagai bahan aktif aktivator

pengomposan TKKS. Pengomposan TKKS telah berhasil dilakukan dengan kapasitas

200 ton TKKS per hari (Siswanto et al. 2008).

30

2.5. Jamur Pelapuk Putih (JPP)

Jamur yang terlibat dalam biodegradasi biomassa lignoselulosa dapat dibagi

menjadi tiga kelompok utama, yaitu: jamur pelapuk putih (white-rot fungi), jamur

pelapuk coklat (brown-rot fungi), dan jamur pelapuk lunak (soft-rot fungi), tergantung

dengan tipe pelapukan yang disebabkan oleh jamur tersebut. Jamur pelapuk putih

(JPP) dan jamur pelapuk coklat (JPC) termasuk di dalam kelompok basidiomycetes,

sedangkan jamur pelapuk lunak (JPL) termasuk di dalam kelompok ascomycetes, dan

aktivitasnya seringkali terkait dengan tinggi rendahnya kelembaban kayu (Blanchette

R.A 1995). JPC lebih mendegradasi poliskarida di dalam biomassa lignoselulosa dan

hanya sedikit melarutkan lignin. JPP adalah mikroba yang paling efisien dalam

mendegradasi lignin menjadi CO2 (Hammel and Cullen 2008). Ligninolitik

berhubungan dengan produksi enzim ekstraseluler pendegradasi lignin yang

dihasilkan oleh JPP.

2.5.1. Degradasi Biomassa Lignoselulosa oleh Jamur Pelapuk Putih (JPP)

2.5.1.1. Enzim Ligninolitik dan Degradasi Lignin

JPP menghadapi tiga tantangan utama untuk mendegradasi lignin. Pertama,

polimer lignin berukuran besar oleh karena itu sistem ligninolitik harus ekstraseluler.

Kedua, struktur lignin tidak memiliki ikatan yang dapat dihidrolisis, oleh karena itu

mekanisme degradasi harus oksidatif bukan hidrolisis. Ketiga, karena struktur

polimer yang stereoirreguler, enzim ligninolitik harus kurang sepesifik daripada

enzim-enzim lainnya (Kirk T. Kent and Cullen 1998). Perombakan lignin oleh JPP

31

melibatkan aktivitas ligninolitik enzim yang diringkaskan pada Tabel 5.

Tabel 5. Enzim dan reaksinya yang terlibat di dalam degradasi lignin (Hatakka

Annele 2001)

Aktivitas enzim,

singkatan

Kofaktor atau

substrat, Mediator Pengaruh utama atau reaksi

Lignin peroksidase, LiP H2O2, veratryl

alkohol

Oksidasi cincin aromatic

menjadi radikal kation

Mangan peroksidase,

MnP

H2O2, Mn, asam

organik sebagai agen

pengkelat, thiol,

lemak tak larut

Okisasi Mn(II) menjadi

Mn(III), mengkelat senyawa

phenolik Mn(III) teroksidasi

menjadi radikal phenolik;

reaksi lain di dalam kehadiran

senyawa lain

Lakase, Lacc O2, mediator,

misalnya:

hydroxybenzotiazole

atau ABTS

Phenol dioksidasi menjadi

radikal phenolik; reaksi lain di

dalam kehadiran mediator

Glyoxal oxidase, GLOX Glyoxal, methyl

glyoxal

Glyoxal dioksidasi menjadi

asam glyoxylic; produksi H2O2

Aryl alcohol oksidase,

AAO

Aromatic alcohol

(anisyl, veratyl

alcohol)

Alcohol aromatic diokisasi

menjadi aldehida; produksi

H2O2

Enzym lain yang

memproduksi H2O2

Beberapa senyawa

organik

O2 direduksi menjadi H2O2

Enzim ekstraseluler utama yang terlibat dalam perombakan lignin adalah

lignin peroksidase yang mengandung heme (Ligninase, LiP, E.C 1.11.1.14), mangan

peroksidase (MnP, EC 1.11.1.13) dan lakase yang mengandung tembaga (Cu;

benzenediol:oxygen oxidoreductase, EC 1.10.3.2)(Hatakka Annele 2001). Kelopok

baru dari lignin peroksidase, mengkombinasikan sifat struktural dan fungsional dari

32

LiP dan MnP, adalah versatile peroxidase (VP) (Hammel and Cullen 2008). VP dapat

mengoksidasi Mn2+

dan senyawa phenolik, seperti halnya dapat mengoksidasi

senyawa aromatik non-phenolik seperti veratryl alcohol. Beberapa enzim aksesori

tambahan juga terlibat dalam produksi hydrogen peroksidase. Glyoxal oxidase

(GLOX) dan aryl alcohol oxidase (AAO; EC 1.1.3.7) termasuk dalam kelompok ini.

Lignin Peroksidase (LiP). Lignin Peroksidase (LiP) pertama kali ditemukan

di media Phanerochaete chrysosporium dalam kondisi pertumbuhan pada medium

dengan sedikit kandungan nitrogen. LiP adalah homoprotein monomerik dengan

bobot molekul antara 40 kDa. Seperti enzim peroksidase lainnya, LiP memiliki siklus

katalitik yang dinamakan reaksi ping-pong. Reaksi yang terjadi adalah H2O2

mengoksidasi enzim pada keadaan awal (resting enzyme) dengan dua elektron

membentuk senyawa intermediat I, senyawa tersebut kemudian mengoksidasi

substrat aromatik dengan menggunakan satu elektron membentuk senyawa

intermediat II dan produk radikal bebas. Senyawa intermediat II yang dihasilkan

dapat kembali mengoksidasi substrat lainnya sehingga terbentuk enzim awal dan

produk radikal bebas. Terbentuknya radikal bebas secara spontan atau bertahap inilah

yang mengakibatkan lepasnya ikatan antar molekul dan beberapa inti pada cincin

aromatik (Hammel and Cullen 2008).

33

Gambar 9. Reaksi yang terjadi pada perombakan lignin oleh LiP (atas). Struktur -

O-4 dari lignin dan reaksi pemecahan C C oleh LiP. (bawah).Oksidasi yang dikatalis oleh LiP dari veratryl alcohol (Hammel

and Cullen 2008).

Mangan Peroksidase (MnP). Beberapa JPP yang tidak menghasilkan LiP

diketahui dapat mendegradasi lignin, penelitian berikutnya mengungkapkan bahwa

eznim yang berperan adalah mangan peroksidase (MnP) (Hammel and Cullen 2008).

Beberapa kelompok JPP menghasilkan mangan peroksidase (MnP) dan kemudian

diketahui bahwa MnP terdistribusi secara luas (Higuchi 2004). MnP juga merupakan

oksidator kuat dan dapat mengoksidasi struktur phenolik tetapi tidak dapat

mengoksidasi struktur non-phenolik lignin secara langsung, karena ketiadaan residu

invariant tryptophan yang diperlukan untuk transfer elektron ke subtrat aromatik.

Prinsip fungsi MnP adalah bahwa enzim tersebut mengoksidasi Mn2+

membentuk Mn3+

dengan adanya H2O2 sebagai oksidan. Aktivitasnya distimulasi oleh

34

adanya asam organik yang berfungsi sebagai pengkelat atau penstabilkan Mn3+

.

Mekanisme reaksi yakni MnP pada keadaan awal dioksidasi oleh H2O2 membentuk

senyawa MnP-senyawa I yang dapat direduksi oleh Mn2+

dan senyawa fenol

membentuk senyawa MnP-senyawa II. Senyawa tersebut kemudian direduksi

kembali oleh Mn2+

tetapi tidak oleh fenol, membentuk enzim keadaan awal dan

produk. Adanya Mn2+

bebas sangat penting untuk menghasilkan siklus katalitik yang

sempurna.

MnP + H2O2 MnP-senyawa I + H2O MnP-senyawa I + Mn

2+ MnP-senyawa II + Mn3+

MnP-senyawa I + AH MnP-senyawa II + A + H+

MnP-senyawa II + Mn2+

MnP + Mn3+

Lakase (Lac). Lakase (E.C.1.103.2; benzendiol: oksigen oksidoreduktase)

sebagian besar merupakan glikoprotein ekstraseluler yang mengandung atom

tembaga dengan bobot molekul antara 60-80 kDa dan juga merupakan salah satu grup

terkecil enzim yang dinamakan oksidase tembaga biru (Thurston 1994). Sebagian

besar molekul monomerik lakase mengandung empat molekul tembaga (Cu) di dalam

strukturnya yang dapat dikelompokkan menjadi tiga kelompok menggunakan

UV/visible dan spektrometer electron paramagnetic resonance (EPR). Tembaga tipe

I (T1) bertanggung jawab untuk intensitas warna biru dari enzime pada 600 nm dan

dapat dideteksi dengan EPR, tembaga tipe II (T2) tidak berwarna, tetapi tetap dapat

dideteksi dengan EPR, dan tembaga tipe III (T3) mengandung pasangan atom

tembaga yang memberikan sedikit absorbansi dekat spectrum UV tetapi tidak

terdeteksi dengan EPR. Sisi tembaga T2 dan T3 saling berdekatan dan membentuk

35

pusat tiga inti (trinuclear) yang terlibat dalam mekanisme katalitik dari enzim.

Lakase hanya menyerang sub unit phenolik lignin, diawali dengan oksidasi

C, pemecahan C-C dan pemecahan gugul alkil (Gambar 10). Lakase juga dapat

mengurangi satu molekul dioxygen menjadi dua molekul air bersamaan dengan

pembentukan satu-elektron oksidasi dari sebagian besar senyawa aromatic yang

melibatkan polyphenol (Bourbonnais and Paice 1996), methoxyl-subsituted

monophenol dan amina aromatic (Archibald F. and Roy 1992). Oksidasi ini terjadi di

dalam radikal bebas terpusat-oksigen (oxygen-centred free radical), yang kemudian

dapat dirubah oleh reaksi yang dikatalis oleh enzim kedua menjadi quinone. Quinone

dan radikal bebas kemudian dapat melanjutkan polymerasi (Thurston 1994).

Gambar 10. Oksidasi unit phenolik oleh lakase (Archibald F. and Roy 1992).

36

Lakase mirip dengan enzim pengoksidasi-phenol yang lain, dimana lebih

mempolimerasi lignin dengan meng-couple radikal phenoxy yang diproduksi dari

oksidasi gugus phenolik lignin (Bourbonnais et al. 1995). Oleh karena spesifitas

lakase untuk subunit phenolik dari lignin dan keterbatasan akses pada lignin di dalam

dinding serat, lakase hanya memberikan sedikit efek pada pemutihan pulp

(Bourbonnais and Paice 1996). Jangkauan subtrat lakase dapat diperluas ke subunit

non-phenolik dengan penambahan mediator seperti 2.2-azinobis-(3-

ethylbenzthiazoline-6-sulfonate; ABTS) (Gambar 11).

Gambar 11. Oksidasi subunit non-phenolik oleh lakase dan ABTS (Archibald F.S. et

al. 1997).

Versatil Peroksidase (VP). Versatil Peroksidase (VP). merupakan salah satu

tipe enzim baru dari kelompok ligninolitik peroksidase (Hammel and Cullen 2008,

Higuchi 2004, Wong 2009). VP ditemukan pada berbagai spesies Pleurotus dan

37

Bjerkandera, namun P. chrysosporium sepertinya tidak menghasilkan VP. VP dapat

mengoksidasi Mn2+

sama baiknya pada senyawa aromatik phenolik maupun non-

phenolik. VP mengoksidasi Mn2+

menjadi Mn3+

, memecahkan model lignin non-

phenolik vertatryl-glycerol- -guaiacyl ether menghasilkan veratryl aldehida, serta

mengoksidasi I dan p-dimethoxybenxene menjadi versatryl aldehida dan p-

benzoquinone seperti halnya reaksi yang dikatalis oleh LiP.

2.5.1.2. Degradasi Selulosa dan Hemiselulosa

Degradasi Selulosa. Degradasi selulosa kristal oleh JPP P. chrysospoerium

mirip pada selulase dari jamur lainnya, yaitu dilakukan oleh komplek enzim

multikomponen yang tiap-tiap komponennya saling berinteraksi secara sinergi untuk

mendegradasi selulosa menjadi glukosa. Endoglukanase (EGs) berkerja secara acak

pada permukaan luar mikrofibril selulosa, yaitu membuka ujung non-reduksi yang

kemudian oleh cellobiohidrolase (CBHs) dihirolisis dan menghasilkan selobiose.

Tahap berikutnya selobiose dipotong oleh -glukosidase menghasilkan glukosa

(Eriksson 1981).

Degradasi hemiselulosa. Hemiselulosa secara struktur lebih komplek

dibandingkan selulosa yang hanya mengandung ikatan 1,4- -glikosidik.

Hemiselulosa adalah sebuah grup homopolimer dan heteropolimer yang mengandung

sebagian besar ikatan-ikatan utama anhidro- (14)D-xylopyranosa, mannopiranosa,

glukopiranosa dan galaktopiranosa. Enzim-enzim yang mendegradasi hemiselulosa

adalah enzyme komplek yang umum disebut hemiselulase. Hemiselulase

38

menunjukkan sebagai agen bleaching yang menjanjikan dalam produksi pulp dan

kertas. Degradasi hemiselulosa oleh JPP kemudian dianalogikan secara kasar dengan

selulosa, tetapi mekanisme serangannya telah dipelajari secara lebih detail oleh Kirk

dan Cowling (1984). Ikatan hemiselulosa diserang pertamakali oleh endoenzim-

endoenzim (mannanase dan xilanase) yang menghasilkan secara intensif ikatan-ikatan

pendek yang dihirdolisis menjadi gula sederhana oleh glukosidase (mannosidase,

xilosidase, dan glukosidase). Seperti halnya dengan selulase, gula-gula sederhana

membatasi produksi sebagian besar enzim-enzim pendegradasi selulosa oleh JPP.

Selulosa diduga menjadi sumber karbon penting untuk mendorong terbentuknya

enzim-enzim pendegradasi hemiselulosa oleh jamur.

2.6. Pretreatment Biologi oleh Jamur Pelapuk Putih (JPP) dengan Fermentasi

Kulur Padat (FKP)

Pretreatment biologi biomassa lignoselulosa dengan JPP umumnya dilakukan

dengan fermentasi kultur padat (Taniguchi et al., 2005; Zhang et al., 2007; Shi et al.,

2008; Wan & Li, 2010). Fermentasi kultur padat merupakan salah satu metode

fermentasi paling kuno dan didefinisikan sebagai kultivasi mikroba pada media padat

yang basah, tidak larut, dan dapat pula sebagai sumber karbon atau energi (Hlke et

al., 2004; Rahardjo et al., 2006). Fujian et al., (2001) menyatakan bahwa produksi

enzim ligninolitik oleh P. chrysosporium lebih tinggi dilakukan dengan FKP

(fermentasi kultur padat) daripada dengan fermentasi kultur terendam (submerged

fermentation). Penelitian yang dilakukan oleh Elisashvili et al., (2008) menyatakan

39

bahwa produksi enzim MnP oleh isolat Lentinus endones dan Pleurotus sp lebih baik

menggunakan FKP daripada fermentasi terendam.

FKP memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan metode fermentasi

yang lain, antara lain: sedikit membutuhkan air, konsentrasi tinggi dari hasil yang

diinginkan, represi katabolit tidak terjadi, sedikit atau tidak memerlukan sterilisasi,

solid-support untuk pertumbuhan mikroba, dapat dilakukan dalam skala yang besar,

energi yang dibutuhkan relatif sedikit, tidak memerlukan bahan kimia anti-foaming.

Beberapa tantangan yang dihadapi dalam up-scale fermentasi kultur padat antara lain

adalah pengendalian temperatur, pH, kelembaban, oksigen; penanganan substrat, dan

pemenuhan kebutuhan inokulum (Hlker & Lenz, 2005). Beberapa kekurangan

pretreatment dengan FKP terutama kesulitan untuk mengatur gradien parameter

(seperti: suhu, pH, kelembaban, konsentrasi substrat atau okigen) yang sulit dikontrol

pada kondisi sedikit air (Hlke et al., 2004).

2.6.1. Faktor-faktor yang Berpengaruh pada Pretreatment Biologi Menggunakan Jamur Pelapuk Putih

Produksi dan aktivitas enzim ligninolitik JPP dipengaruhi oleh beberapa

faktor, seperti: strain jamur, konsentrasi dan sumber nitrogen (N), penambahan Mn2+

dan Cu2+

, temperatur, pH awal, dan aerasi. Faktor nutrisi kemungkinan berperan pada

tipe serangan, dan dengan demikian jamur dapat secara selektif mendegradasi

lignoselluosa (Eaton 1985) (Rayner & Boddy 1988; Eaton & Hele 1993). Beberapa

parameter kultur yang mempengaruhi degradasi lignin oleh P. chrysospoerium telah

dipelajari sejak lama (Kirk T. Kent et al. 1976, Kirk T. K. et al. 1978). Mereka

40

menemukan bahwa degradasi lignin dipengaruhi oleh konsentrasi nitrogen,

konsentrasi O2, pH, dan vitamin. Sangat penting untuk mengoptimalisasi kondisi FKP

oleh JPP untuk mendapatkan produksi dan akitivitas enzime ligninolitik yang tinggi,

dan degradasi lignin yang tinggi.

2.6.1.1. Strain Jamur Pelapuk Putih (JPP)

Terdapat variasi yang luas dari strain JPP terkait dengan kemampuannya

dalam mendegradasi lignin maupun menghasilkan enzim ligninolitik. Beberapa JPP

menghasilkan ketiga enzim ligninilitik, sebagian hanya dua, atau satu dari enzim

ligninolitik (Elisashvili et al. 2008, Kirk T. Kent and Cullen 1998). Perbedaan ini

menyebabkan JPP memiliki kemampuan yang berbeda-beda dalam mendegradasi

biomassa lignoselulosa. Sebagai contoh, Pleurotus sajor-caju, strain P1-27, dan

Lentinus endodes, strain LS54, menghasilkan MnP dan Lac, tetapi tidak LiP ketika

ditumbuhkan pada media tertentu yang hanya mengadung glukosa sebagai sumber

karbon (Buswell et al. 1995, Fu et al. 1997), P chrysospoerium menghasilkan LiP,

MnP, dan Lac (Rivela et al. 2000) (Rodrguez et al., 1997; Rivela et al., 2000).

Pemilihan JPP yang tepat untuk pretreatment biologi merupakan tahapan awal

yang penting (Blanchette Robert A. et al. 1988, Hatakka A.I. 1983, Muller and Trosch

1986). Beberapa parameter yang digunakan untuk memilih JPP antara lain adalah:

kemampuan tumbuh dengan substrat biomassa lignoselulusa, kemampuan tinggi

dalam menurunkan kandungan lignin tetapi sedikit mendegradasi holoselulosa,

rendemen (yield) gula yang dihasilkan pada hidrolisis enzimatik, dan kemudahan

41

untuk dikultur dalam skala besar.

2.6.1.2.Penambahan Mn2+

dan Cu2+

Beberapa sumber kation, seperti Mn2+

, Ca2+

, dan Cu2+

, dilaporkan

memberikan pengaruh terhadap degradasi lignin oleh JPP (Jeffries et al. 1981,

Tychanowicz et al. 2006). Media yang rendah-nitrogen dan konsentrasi Mn2+

di

dalam kultur media memainkan peran dan dalam mengatur aktivitas MnP dan LiP

pada beberapa JPP (Bonnarme and Jeffries 1990). Dalam kondisi ketiadaan Mn2+

,

produksi enzim LiP mendominasi; sedangkan dalam kondisi terdapat Mn2+

, produksi

enzim MnP mendominasi. Efek pengaturan Mn2+

ini juga ditemukan pada lima strain

P chrysosporium, dua spesies lain Phanerochaete sp, tiga spesies Phlebia, Lentinus

endodes, dan Phellinus pini. Aktivitas LiP ditemukan dalam kondisi konsentrasi Mn2+

yang rendah. Beberapa penelitian menemukan bahwa mineralisasi lignin sintetik oleh

Pleurotus ostreatus meningkat dengan penambahan Mn2+

(Kerem and Hadar 1995).

Hasil penelitian lain memperkuat pernyataan tersebut, bahwa penambahan Mn2+

di

dalam media kultur meningkatkan hingga 125% mineralisasi lignin oleh Pleurotus

pulmonarius (Camarero et al. 1996).

Selain Mn2+

, penambahan Cu2+

juga dilaporkan dapat meningkatkan aktivitas

enzim ligninolitik. Penambahan Cu2+

di dalam medium berpengaruh kuat pada

produksi enzim ligninolitik dan mempercepat dekolorisasi pewarna Poly R-478 oleh

Tremetes trogii (Levin et al. 2002). Hasil ini juga diperkuat oleh hasil penelitian lain

yang menyatakan bahwa penambahan Cu2+

juga meningkatkan aktivitas Lac oleh

42

Pleurotus pulmonarius dan Rhizoctonia praticola (Janusz et al. 2006, Tychanowicz et

al. 2006).

2.6.1.3. Aerasi

Aerasi merupakan salah satu parameter penting yang sulit dikontrol pada FKP.

Aerasi memiliki beberapa fungsi, antara lain: oksigenasi, menghilangkan CO2,

pengaturan panas, distribusi uap air, distribusi senyawa volatil yang dihasilkan selama

fermentasi. Aerasi dipengaruhi oleh porositas subatrat; pO2 dan pCO2 sebaiknya

dioptimasi untuk setiap tipe medium, mikroorganisme, dan proses yang diterapkan

(Graminha et al. 2008). Produksi, aktivitas enzim, dan degradasi lignin dipengaruhi

oleh aerasi. Sebuah penelitian klasik menemukan bahwa aerasi diperlukan untuk

pertumbuhan dan delignifikasi biomassa lignoselulosa oleh JPP (Duncan 1961).

Aerasi ditambahkan pada pembuatan biomechanical pulp skala laboratorium maupun

skala 50 ton (Akhtar et al. 1998). Penambahan aerasi sangat berpengaruh terhadap

pertumbuhan mikroba dan kualitas biomechanical pulp yang dihasilkan. Beberapa

Hasil penelitian mendukung pernyataan bahwa aerasi merupakan faktor yang paling

berpengaruh nyata pada pretreatment dengan P. chrysospoerium (Chen Hongzhang et

al. 2002). Pretreatment yang dilakukan tanpa aerasi umumnya dilakukan dalam skala

kecil, seperti dengan menggunakan cawan petri atau Erlenmeyer. Dalam skala kecil

penambahan aerasi relatif kurang diperlukan dan JPP dapat tumbuh dengan baik.

2.6.1.4. Sumber dan Konsentrasi Nitrogen

Konsentrasi nitrogen di dalam media kultur memainkan peranan penting di

43

dalam produksi dan aktivitas enzim ligninolitik, baik pada FKP maupun fermentasi

cair, tetapi pengaruh nitrogen bervariasi di antara spesies dan strain JPP. Penelitian

pengaruh nitrogen juga dilakukan pada degradasi senyawa xenobiotik dan

dekolorisasi pewarna oleh JPP (Hatvani and Mcs 2002, Kotterman et al. 1996,

Leung and Pointing 2002). Konsentrasi nitrogen sangat penting untuk degradasi

lignin oleh P. chrysospoerium Burds, tetapi sumber nitrogen hanya berpengaruh kecil

(Kirk T. K. et al. 1978). Aktivitas enzim ligninilitik oleh Pleurotus ostreatus menurun

dengan penambahan nitrogen anorganik pada medium. Konsentrasi nitrogen yang

rendah dari nitrogen organik (peptone dan casein) memberikan efek positif pada

aktivitas enzim (Mikiashivili et al. 2006).

2.6.1.5. Kadar Air

Kadar air awal lignoselulosa mempengaruhi pertumbuhan JPP. Umumnya

JPP menghendaki kadar air awal yang cukup tinggi sekitar 60-85%. Kandungan air

juga berpengaruh terhadap distribusi okigen (aerasi). Dalam kondisi kandungan air

tinggi pori-pori lignoselulosa akan terisi oleh air dan menghalangi areasi. Kandungan

air secara signifikan mempengaruhi degradasi lignin oleh P. chrysosporium dan

kandungan air terbaik adalah 75% (Shi et al. 2008). Namun, hasil yang berbeda

dilaporkan lain bahwa rasio solid/liquid yang rendah lebih menguntungkan untuk

produksi MnP dan LiP (Fujian et al. 2001). FKP jerami dengan JPP optimum pada

kandungan air 75ml/25g substrat (Zadrail and Brunnert 1981). Dalam kondisi basah

(kadar air tinggi) pertumbuhan miselia terlihat lebih dominan.

44

2.6.1.6. Keasaman (pH) dan Temperatur

Produksi enzim ligninolitik dipengaruhi oleh kondisi keasaman (pH) pada

FKP. Dilaporkan bahwa pH awal media yang baik untuk produksi enzim LiP dan

MnP oleh P. chrysospoerium adalah antara 4.0 5.5 (Fujian et al. 2001), sedangkan

pH substrat menurun selama FKP (Agosin et al. 1985).

Berbagai temperatur yang optimal pada FKP untuk produksi enzim

ligninolitik telah dilaporkan. Produksi enzim oleh P. chrysospoerium dilaporkan

optimal pada temperatur 39oC (Fujian et al. 2001). Laporan lain menyebutkan bahwa

suhu 37oC adalah optimal untuk pertumbuhan miselia, sedangkan suhu 30

oC untuk

produksi enzim (Asther et al. 1988). Degradasi lignin oleh Ganoderma applanatum,

Pleurotus ostreatus, dan Pleurotus serotinus lebih rendah pada 30oC daripada pada

22oC (Zadrail and Brunnert 1981). Hanya Tremetes hirsuta yang meningkat dengan

peningkatan suhu hingga 30oC. Perbedaan temperatur yang goptimal pada JPP

kemungkinan disebabkan karena perbedaan fisologis, strain, dan tipe subatrat.

2.6.2. Pengaruh Pretreatment Biologi terhadap Karakteristik Biomassa Lignoselulosa

Pretreatment biologi biomassa lignoselulosa menggunakan JPP mengubah

karakteristik biokimia dan fisika dari biomassa (Gambar 12). Degradasi lignin oleh

JPP menjadi perhatian utama dalam beberapa penelitian pretreatment biologi. Sebagai

contoh, degradasi lignin dari jerami jagung naik menjadi 54,6% setelah 30 hari

diperlakukan dengan T. versicolor (Yu et al. 2010b), batang bambu menjadi < 20%

45

setelah diperlakukan selama 4 minggu dengan Echinodontium taxodii 2538

dan T. versicolor G20 (Zhang Xiaoyu et al. 2007a), dan jerami gandum menurun

menjadi 39,7% setelah diperlakukan dengan P. ostreatus (Puniya et al.

1994). Degradasi lignin oleh JPP adalah proses non-spesifik oksidatif yang akhirnya

menghasilkan degradasi lengkap lignin.

Gambar 12. Skema diagram pretreatment biologi lignoselulosa. Jamur Pelapuk Putih

menurunkan kadar lignin dan mengubah struktur kimia dan fisika

lignoselulosa yang membuat biokonversi lignoselulosa menjadi lebih

efisien (Isroi et al. 2011).

JPP memiliki kemampuan unik untuk memutuskan polimer (depolymerise),

memecah ikatan karbon-karbon, dan ikatan mineral dengan lignin oleh enzim

ligninolitik. Studi dengan lignin berlabel 14

C menunjukkan bahwa lignin terdegradasi

menjadi 14

CO 2 (Agosin et al. 1985, Hofrichter et al. 1999, Lundquist et al. 1977,

Prez and Jeffries 1990). Pleurotus ostreatus dan B. adusta adalah memecah lignin

yang sangat spesifik berdasarkan penelitian menggunakan lignin berlabel 14

C

(Agosin et al. 1985). Perubahan rasio antara p-hidroksifenil (H), guaiacyl (G), dan (S)

syringyl lignin unit dianalisis menggunakan kromatografi gas pirolisis--spektrometri

46

massa. Penelitian ini menunjukkan bahwa 10 U peroksidase per mg jerami dapat

menurunkan proporsi unit H fenolik dari 31% pada kontrol menjadi 3% pada jerami

yang diperlakukan, unit G 40-4%, dan sejumlah kecil fenolik unit S yang ada di

dalam jerami gandum terdegradasi penuh (Camarero et al. 2001). Beberapa

penelitian mengusulkan bahwa urutan kerentanan unit lignin adalah sebagai berikut:

S> G> H. Secara umum, biomassa dengan lignin yang kaya S lebih rentan terhadap

degradasi JPP dibandingkan unit lignin lainnya (Valmaseda et al. 1991).

Hemiselulosa lebih mudah untuk terdegradasi oleh JPP dibandingkan

komponen lain dalam biomassa lignoselulosa. JPP seperti P. chrysosporium (Kirk T.

Kent and Cullen 1998), Phlebia floridensis (Sharma and Arora

2010), C. subvermispora (Mendona et al. 2008), Pleurotus ostreatus (Baldrian et al.

2005), dan Pleurotus dryinus (Kachlishvili et al. 2005) menghasilkan endoxylanases

yang dapat menghidrolisis hemiselulase. Analisis terhadap komposisi kandungan

tongkol jagung menunjukkan bahwa selama perlakuan selama hari 30 dengan JPP

hemiselulosa terdegradasi sebesar 24,4-34,9% (Yang Xuewei et al. 2010). Tongkol

jagung yang diperlakukan menggunakan C. subvermispora selama 18 hari mengalami

penurunan kandungan hemiselulosa hingga 22,5%, dan Kayu Willow Cina yang

diperlakukan menggunakan Echinodontium taxodii 2.538 selama 120 hari kandungan

hemiselulosa berkurang sebesar 54,8% (Yu et al. 2009). Degradasi hemiselulosa dan

degradasi lignin dapat menurunkan recalcitration dari lignoselulosa terhadap

hidrolisis enzimatik, tapi degradasi xilan meningkatkan risiko menurunkan

kandungan gula yang dapat dikonversi dari biomassa lignoselulosa (Yu et al. 2010a).

47

JPP menghasilkan enzim selulase dengan kekhususan dan karakteristik yang

berbeda. Selulase menghidrolisis -1,4-glikosidik selulosa. JPP dikelompokkan

menjadi dua kelompok berdasarkan selektifitasnya mendegradasi komponen

lignoselulosa, yaitu: non-selektif dan selektif. JPP non-selektif dapat mendegradasi

semua komponen lignoselulosa dalam jumlah yang sama, termasuk

selulosa. Sedangkan JPP selektif mendegradasi selulosa dalam jumlah lebih sedikit

(Blanchette R.A 1995), dan sesuai untuk pretreatment biologi. Pretreatment biologi

menyebabkan perubahan mikrostruktur selulosa. Analisis XRD menunjukkan

penurunan kristalinitas selulosa setelah pretreatment biologi. Indeks kristalinitas

jerami padi menurun dari 44% pada jerami yang tidak diperlakukan, menjadi 15%

pada jerami yang diperlakukan menggunakan P. chrysosprorium (Zeng et al.

2011). Sebaliknya, indeks kristalinitas jerami padi sedikit berkurang setelah

diperlakukan menggunakan D. squelens (Bak et al. 2010). Pretreatment Biologi pinus

merah Jepang (Pinus densiflora) telah terbukti mengurangi kristalinitas selulosa dan

meningkatkan jumlah pori-pori yang memiliki ukuran lebih dari 120 nm (Lee et al.

2007).

Morfologi permukaan biomassa lignoselulosa telah diperiksa oleh analisis

mikroskop elektron (SEM). Hasil analisa SEM menunjukkan beberapa perubahan

fisik di permukaan biomassa setelah pretreatments biologi. Pretreatment biologi

biomassa mengakibatkan lubang tidak teratur pada permukaan jerami jagung (Yu et

al. 2010b). Hasil ini menunjukkan bahwa pretreatment biologi meningkatkan luas dan

48

porositas permukaan substrat. Pretreatment Biologi pada tongkol jagung

dengan Irpex lacteus signifikan meningkatkan volume pori dan ukuran pori (Xu et al.

2010). Jerami gandum yang diperlakukan menggunakan P. chrysosporium memiliki

luas permukaan yang lebih luas, hal ini menunjukkan degradasi agresif atau

modifikasi lignin dan membuat permukaan hemiselulosa dan selulosa menjadi lebih

terbuka (Zeng et al. 2011). Permukaan jerami padi menunjukkan permukaan yang

kasar dan secara parsial rusak setelah pretreatment biologi

menggunakan D. squalens (Bak et al. 2010).

2.6.3. Kombinasi Pretreatment Biologi dengan Metode Pretreatment Lain

Kelemahan utama dari pretreatment biologi adalah potensi hilangnya

polisakarida (hemiselulosa dan selulosa) dan waktu pretreatment yang lebih lama dari

pretreatment kimia/fisika. Pretreatment biologi dapat dikombinasikan dengan

pretreatment kimia/fisika untuk mengurangi waktu pretreatment, kehilangan

polisakarida, dan untuk meningkatkan hasil gula yang dapat difermentasi.

Pretreatment kimia/fisik sebelum pretreatment biologi memungkinkan substrat akan

mudah untuk diakses jamur dalam menurunkan kandungan lignin (Reid 1989).

Optimalisasi kombinasi pretreatment diarahkan ke hasil gula yang maksimum dan

untuk mengurangi biaya keseluruhan pretreatment, yaitu: waktu inkubasi, konsentrasi

asam, dan/atau energi yang digunakan.

Penelitian kombinasi pretreatment fisika/kimia dengan pretreatment biologi

telah dilaporkan dalam beberapa referensi. Jerami padi yang diperlakukan dengan

49

ledakan uap (steam explotion) sebelum pretreatment biologi menggunakan Pleurotus

ostreatus dapat mengurangi waktu dari 60 hari menjadi 36 hari dan mendapatkan

glukosa 33% (Taniguchi et al. 2010). Jerami padi yang mendapat pretreatment

dengan H2O2 (2%, 48 jam), waktu pretreatment biologi berkurang dari 60 hari

menjadi 18 hari dengan hasil gula yang sebanding (Yu et al. 2010b). Pengurangan

waktu pretreatment dimungkin karena degradasi parsial lignin dan polisakarida, serta

kerusakan parsial dari struktur lignoselulosa selama pretreatment biologi.

Kombinasi pretreatment eceng gondok (Eichhornia crassipes) dengan JPP E.

taxodii (10 hari) dan 0,25% H2SO4 terbukti lebih efektif daripada metode

pretreatment asam saja. Hasil gula pereduksi dari hidrolisis enzimatik meningkat

dengan faktor 1,13-2,11 dibandingkan dengan pretreatment asam di bawah kondisi

yang sama (Ma et al. 2010). Pretreatment biologi serpihan kayu beech sebelum

pretreatment organosolv bisa meningkatkan hasil etanol sebesar 1,6 kali lebih banyak

daripada tanpa pretreatment biologi (Itoh et al. 2003). JPC dikombinasikan dengan

pretreatment organosolv juga telah digunakan (Monrroy et al. 2010). Pretreatment

biologi serpihan kayu Pinus radiata sebelum pretreatment organosolv meningkatkan

asesibilitas enzyme. Pretreatment biologi jerami jagung selama 15 hari menggunakan

E. taxodii diikuti oleh pretreatment alkali/oksidatif dapat menyebabkan peningkatan

50,7% dalam mengurangi gula dibandingkan dengan pretreatment alkali/oksidatif

saja (Yu et al. 2010b). Pretreatment Biologi batang jagung diikuti oleh pretreatment

alkali ringan dengan I. lacteus dapat meningkatkan kecernaan selulosa. Degradasi

lignin pada pretreatment biologi meningkat dan hidrolisis glukosa meningkat

50

signifikan ketika dikombinasikan dengan pretreatment alkali (Yu et al. 2010a).

Peningkatan gula hasil hidrolisis maupun etanol hasil fermentasi dari biomassa

lignoselulosa yang diperlakukan dengan kombinasi pretreatment fisika/kimia-biologi

kemungkinan disebabkan karena pengaruh sinergistik dari kedua pretreatment

tersebut. Struktur lignin dan/atau hemiselulosa mengalami perubahan yang lebih

besar disebabkan oleh kombinasi pretreatment daripada pretreatment tunggal.

Perubahan struktur lignin dan/atau hemiselulosa ini memudahkan selulosa untuk

dihidrolisis menjadi gula.

HALAMAN JUDULHALAMAN PENGESAHANPERNYATAANKATA PENGANTARDAFTAR ISIDAFTAR TABELDAFTAR GAMBARDAFTAR LAMPIRANARTI LAMBANG DAN SINGKATANINTISARIABSTRACTI. PENDAHULUAN1.1. Latar Belakang1.2.Tujuan penelitian2. TINJAUAN PUSTAKA2.1.Tandan Kosong Kelapa Sawit (TKKS)2.1.1. Ketersediaan TKKS2.1.2. Karakteristik Fisik TKKS2.1.3. Karakteristik Kimia TKKS

2.2. Biomassa Lignosellulosa2.2.1. Lignin2.2.2. Selulosa2.2.3. Hemiselulosa

2.3. Pretreatment2.4. Pretreatment Biologi dengan Jamur Pelapuk Putih (JPP)2.5. Jamur Pelapuk Putih (JPP)2.5.1. Degradasi Biomassa Lignoselulosa oleh Jamur Pelapuk Putih (JPP)

2.6. Pretreatment Biologi oleh Jamur Pelapuk Putih (JPP) dengan FermentasiKulur Padat (FKP)2.6.1. Faktor-faktor yang Berpengaruh pada Pretreatment BiologiMenggunakan Jamur Pelapuk Putih2.6.2. Pengaruh Pretreatment Biologi terhadap Karakteristik BiomassaLignoselulosa2.6.3. Kombinasi Pretreatment Biologi dengan Metode Pretreatment Lain

3. LANDASAN TEORI4. HIPOTESIS5. METODE PENELITIAN5.1. Mikroorganisme dan Bahan5.1.1. Mikroorganisme5.1.2. Media5.1.3. Tandan Kosong Kelapa Sawit

5.2. Tahapan Penelitian5.2.1. Tahap 1. Seleksi Jamur Pelapuk Putih untuk Pretreatment BiologiTandan Kosong Kelapa Sawit5.2.2. Tahap 2. Pengaruh Penambahan Mangan (Mn2+) dan Tembaga (Cu2+)terhadap Pretreatment Biologi Tandan Kosong Kelapa sawitMenggunakan Isolat JPP Terpilih Hasil dari Tahap 15.2.3. Tahap 3. Kombinasi Pretretment Biologi Menggunakan Isolat JPPTerpilih Hasil dari Tahap 1 dengan Pretreatment Asam Fosfat

5.3. Metode Pretreatment Biologi5.3.1. Pretretment biologi untuk penelitian Tahap 1 dan 2

5.3.2. Pretreatment biologi untuk penelitian Tahap 35.4. Metode Pretreatment Asam Fosfat5.5. Metode Hidrolisis Enzimatik5.5.1. Hidrolisis Enzimatik untuk Sampel TKKS Hasil Penelitian Tahap 25.5.2. Hidrolisis Enzimatik untuk Sampel TKKS Hasil Penelitian Tahap 3

5.6. Metode Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan5.7.Metode Analisis5.7.1. Analisis Kandungan Lignoselulosa dengan Metode Chesson-Datta5.7.2. Analisis Kandungan Lignoselulosa dengan Metode NERL5.7.3. Analisis Biomassa Jamur Pelapuk Putih5.7.4. Analisis Gugus Fungsional dengan FTIR5.7.5. Analisis Perubahan Struktur Fisik TKKS dengan Scanning ElectronMicroscopy (SEM)5.7.6. Analisis Monosakarida (Selobiosa, Glukosa, Xylosa, Mannosa, Galaktosadan Arabinosa)5.7.7. Analisis Etanol5.7.8. Analisis Statistik

6. HASIL DAN PEMBAHASAN6.1. Seleksi Jamur Pelapuk Putih untuk Pretreatment Biologi Tandan KosongKelapa Sawit6.1.1. Perubahan Kandungan Lignin6.1.2. Perubahan Kandungan Hemiselulosa6.1.3. Perubahan Kandungan Selulosa6.1.4. Pertumbuhan Jamur

6.2. Pengaruh Penambahan Mangan (Mn) dan Tembaga (Cu) terhadapPretreatment Biologi Tandan Kosong Kelapa Sawit Menggunakan Pleurotusfloridanusi LIPIMC9666.2.1. Pengaruh Pretreatment Biologi pada Berat Kering TKKS6.2.2. Pengaruh Pretreatment Biologi pada Perubahan Komponen lignoselulosaTKKS6.2.3. Pengaruh Pretreatment Biologi Pada Karakteristik Fisik Dan StrukturalTKKS6.2.4. Pengaruh Pretreatment Biologi pada Digestibilitas TKKS

6.3. Perubahan Strultural Tandan Kosong Kelapa Sawit Setelah Pretreatmentdengan Pleurotus floridanus dan Asam Fosfat6.3.1. Pengaruh Pretreatment pada Komponen Biomassa6.3.2. Efek Pretreatment terhadap Struktur TKKS6.3.3. Pengaruh pretreatment pada Morfologi TKKS6.3.4. Digestibilitas TKKS6.3.5. Produksi Bioetanol dari TKKS yang telah Mendapat Pretreatment

7. KESIMPULAN DAN REKOMENDASI7.1. Kesimpulan7.2. Rekomendasi

Daftar PustakaLAMPIRANLampiran 1.Lampiran 2.Lampiran 3.Lampiran 4.Lampiran 5.Lampiran 6.Lampiran 7.Lampiran 8.Lampiran 9.Lampiran 10.Lampiran 11.Lampiran 12.Lampiran 13.Lampiran 14.Lampiran 16.Lampiran 18.Lampiran 19.Lampiran 20.Lampiran 21Lampiran 22.Lampiran 23.Lampiran 24.Lampiran 25.Lampiran 26.Lampiran 27.Lampiran 28.Lampiran 29.Lampiran 29.Lampiran 30.