HALAMAN PENGESAHAN

Nama Mahasiswa : Melinda Oktafiani

No. Pokok Mhs : 1114111034

Fakultas : Pertanian

Judul Praktikum : Penghitungan Jumlah Bekteri

Tempat : Laboratorium Budidaya Perairan

Waktu Praktikum : Selasa, 23 Oktober 2012

Kelompok : 3 (Tiga)

Bandar Lampung, 30 Oktober 2012

----------------------------------------------

Catatan Nilai

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI AIR (BDI 206)

PENGHITUNGAN JUMLAH BAKTERI

Disusun Oleh : Melinda Oktafiani (NPM. 1114111034)

Jurusan Budidaya Perairan/Perikanan Fakultas Pertanian

Universitas Lampung 2012

Abstrak

Sebuah praktikum tentang penghitungan jumlah bakteri telah dilakukan di Laboratorium Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung pada tanggal 23 Oktober 2012. Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui berbagai cara menghitung jumlah sel dari biakan suatu bakteri. Cara yang digunakan adalah metode standar plate count dan analisa spektrofotometer (turbidimeter). Metode plate count standar terdiri dari pengenceran sampel dengan PBS (phosphate buffer saline) steril. Pada metode turbidimetri digunakan spektrofotometer dengan mentransmisikan menurun sejumlah cahaya ketika populasi sel meningkat. Cahaya yang ditransmisikan akan diubah menjadi energi listrik dan kemudian diindikasikan pada sebuah galvanometer. Pembacaan menggunakan metode spektrofotometer ini lebih cepat daripada standar plate count tetapi terbatas karena tingkat sensitifitasnya dibatasi untuk suspensi bakteri 107 sel atau lebih. Hasil dari praktikum ini tidak bisa dihitung karena jumlah bakteri yang tumbuh lebih banyak dibanding jumlah yang dapat dihitung. Jumlah koloni yang dapat dihitung berkisar 30-300 koloni, namun hasil menunjukkan bakteri yang tumbuh jauh lebih banyak dan terlalu dekat sehingga sulit untuk dibedakan sebagai coloni-forming unit (CFU). Hal ini dapat terjadi karena miscalculation dalam proses pengenceran.

Kata kunci : spektrofotometer, CFU, PBS, standar plate count, suspense

A. PENDAHULUAN

Pertumbuhan mikroorganisme yang membentuk koloni dapat dianggap bahwa

setiap koloni yang tumbuh berasal dari satu sel, maka dengan menghitung

jumlah koloni dapat diketahui penyebaran bakteri yang ada pada bahan. Jumlah

mikroba pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam cara,

tergantung pada bahan dan jenis mikrobanya. Ada 2 macam cara perhitungan

jumlah mikroba/bakteri, yaitu perhitungan secara langsung dan tidak langsung.

Perhitungan jumlah mikroba secara langsung yaitu jumlah mikroba dihitung

secara keseluruhan, baik yang mati atau yang hidup sedangkan perhitungan

jumlah miroba secara tidak langsung yaitu jumlah mikroba dihitung secara

keseluruhan baik yang mati atau yang hidup atau hanya untuk menentukan

jumlah mikroba yang hidup saja, ini tergantung cara-cara yang digunakan. Untuk

menentukan jumlah miroba yang hidup dapat dilakukan setelah larutan bahan

atau biakan mikroba diencerkan dengan faktor pengenceran tertentu dan

ditumbuhkan dalam media dengan cara-cara tertentu tergantung dari macam dan

sifat-sifat mikroba.

Banyak metode yang digunakan dalam menaksir secara kuantitatif dari suatu

populasi bakteri. Namun, ada dua metode yang paling sering digunakan yaitu

metode hitung koloni di cawan petri (standard/viable plate count method) dan

analisa spektrofotometer (turbidimeter). Meskipun kedua metode tersebut kadang

akan menghasilkan hasil perhitungan yang mirip, tetapi keduanya memiliki

perbedaan prinsip. Untuk metode plate count merupakan metode penaksiran

jumlah kepadatan bakteri secara tidak langsung dan informasi yang didapatkan

hanya bakteri yang hidup (viable) saja, bakteri yang mati tidak ikut terhitung.

Sedangkan prinsip analisa spektrofotometer didasarkan pada kekeruhan dan

menghitung seluruh sel bakteri baik yang hidup maupun yang mati (Setyawan

dan Harpeni, 2012).

B. TINJAUAN PUSTAKA

Perhitungan bakteri adalah suatu cara yang digunakan untuk menghitung jumlah

koloni bakteri yang tumbuh pada suatu media pembiakan. Secara mendasar ada

dua cara penghitungan bakteri, yaitu secara langsung dan secara tidak langsung.

Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan

membuat preparat dari suatu bahan (preparat sedrhana diwarnai atau tidak

diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan

perhitungan secara tidak langsung hanya mengetahui jumlah mikroorganisme

pada suatu bahan yang masih hidup saja (viable count). Dalam pelaksanaannya

ada beberapa cara yaitu:

1. Perhitungan pada cawan petri (total plate count / TPC

2. Perhitungan melalui pegenceran

3. Perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode)

4. Calorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Anonim, 2012).

Metode standar/viable plate count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel

mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah

ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah

diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau

dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut (Anonim, 2012).

Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahwa setiap sel akan hidup

berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks

bagi jumlah oganisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik pengitungan ini

membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran dan mencawankan hasil

pengenceran. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi dan kemudian

dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan yang dipilih untuk penghitungan

koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang berisi 30-300 koloni.

Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal dihitung dengan cara

mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada

cawan bersangkutan.

Gambar : Pengerjaan Perhitungan Koloni dengan Total Plate Count (TPC)

Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah

bakteri dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap

cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan

jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya

dalam biakan cair, terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan

dapat disebut optical density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang

gelombang 520 nm – 700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat

memperlihatkan jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan

cawan) hingga pengukuran optical density (ditentukan dengan spektrofotometer)

(Anonim, 2012).

Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan cara

menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar. Contohnya

suatu sampel pada suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam

sppesies diencerkan dalam suatu taung tersendiri. Enceran ini kemudian diambil

barang 1 ml untuk diencerkan lagi ke tabung yang berisi pelarut. Enceran yang

kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut (Dwidjoseputro, 1994).

Jumlah terbaik yang digunakan untuk perhitungan mikroba antara 30-300 koloni.

Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal (Purwoko, 2007).

C. MATERI DAN METODE

Praktikum ini dilakukan pada pukul 11.30 WIB di Laboratorium Budidaya Perairan

Fakultas Pertanian Universitas Lampung pada tanggal 23 Oktober 2012. Alat dan

bahan yang digunakan untuk praktikum ini adalah sampel bakteri yang telah

dibiakkan pada media, Plate Count Agar (PCA) dalam tabung reaksi, petri dish,

Phospate Buffer Saline (PBS), larutan standard Mc. Farland, spektrofotometer,

mikro pipet, Bunsen, alcohol, kertas label, tabung reaksi, penangas air, kertas

pembungkus dan kalkulator Casio.

Praktikum ini melalui beberapa tahap yaitu Sandar Plate Count dan Metode

Turbidimetri. Adapun prosedur kerja praktikum ini sebagai berikut:

1. Standar Plate Count

Pada penghitungan menggunakan Standar Plate Count, langkah pertama

ialah mengencerkan tabung PCA dalam air mendidih. Kemudian

mendinginkan agar dalam penangas air (500C) selama 5 - 10 menit. Lalu

menuangkan air ke dalam petridish dan dibiarkan membeku (10 - 15

menit). Kemudian menandai petri dengan nama dan tingkat pengenceran.

Selanjutnya, membuat seri pengenceran 10-1 - 10-3 dari sampel bakteri.

Dengan menggunakan mikro pipet, mengambil 0,1 cairan dari masing-

masing pengenceran ke dalam petridish yang sesuai. Gunakan spreader

untuk meratakan suspense di atas permukaan lempengan agar.

Kemudian membungkus petridish dengan kertas pembungkus dam

memasukkan ke dalam incubator 350C dalam posisi terbalik,

menginkubasi selama 24-48 jam. Langkah selanjutnya adalah

menghitung koloni pada petri yang mempunyai kisaran 30 – 300 koloni.

Menghitung jumlah bakteri hidup dengan cara mengalikan faktor

pengenceran yang digunakan denan 10 (karena volume suspense bakteri

yang dimasukkan ke dalam petri hanya 0,1 ml). Hasil akhir pengalian

merupakan jumlah bakteri yang hidup dalam satuan colony-forming

unit/ml (CFU/ml).

2. Metode Turbidimetri

Pada pelaksanaan penghitungan jumlah bakteri menggunakan metode

turbidimetri, langkah pertama adalah membuat larutan standar Mc.

Farland. Kemudian menyalakan alat spektrofotometer (dengan mengikuti

panduan penggunaan alat). Lalu mengukur absorbansi dari masing-

masing larutan Mc. Farland pada panjang gelombang 550 – 600 nm.

Selanjutnya membuat kurve regresi dimana Y = kepadatan bakteri

(sel/ml) dan X = Absorbansi (menggunakan kalkulator Casio). Setelah itu

mengukur suspense bakteri pada panjang gelombang 550 – 600 nm.

Terakhir memasukkan hasil absorbansi suspense bakteri ke dalam rumus

regresi, hasilnya adalah jumlah kepadatan semua sel bakteri dalam

suspense dengan satuan sel/ml.

D. HASIL DAN PEMBAHASAN

Berikut hasil yang didapat dari praktikum penghitungan jumlah bakteri:

No Nama Sampel Pengenceran Jumlah Bakteri (CFU/ml)

1 Air Laut

10-1 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-2 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-3 TBH (Tidak bisa dihitung)

2 Air PDAM

10-1 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-2 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-3 TBH (Tidak bisa dihitung)

3 Air Sumur

10-1 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-2 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-3 TBH (Tidak bisa dihitung)

4 Air Kolam

10-1 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-2 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-3 TBH (Tidak bisa dihitung)

5 Air Tambak Udang

10-1 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-2 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-3 TBH (Tidak bisa dihitung)

6 Air kolam Lele

10-1 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-2 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-3 TBH (Tidak bisa dihitung)

7 Akuarium Air Tawar

10-1 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-2 TBH (Tidak bisa dihitung)

10-3 TBH (Tidak bisa dihitung)

Pada praktikum ini didapatkan hasil biakan yang terlalu banyak sehingga tidak

dapat dihitung. Hal ini terjadi karena miscalculation dalam volume pengenceran

Plate Count Agar (PCA). Dalam pengenceran hanya menggunakan seri

pengenceran 10-1 – 10-3 , seharusnya masih dapat dilakukan pengenceran

sampai 10-6 sehingga diperoleh biakan yang tidak terlau rapat dan banyak.

Seharusnya dalam satu petridish, jumlah koloni yang dapat dihitung berkisar 30-

300 koloni. Jika kurang dari 30 koloni maka tidak dapat diterima untuk alasan

statistik dan jika lebih dari 300 koloni pada cawan petri maka ada kemingkinan

ada koloni yang tetrlau dekat satu dengan lainnya untuk dibedakan sebagai

colony-forming unit (CFU). Karena terlalu banyak koloni yang tumbuh maka hasil

tidak bisa dihitung.

Pengenceran adalah mencampur larutan pekat (konsentrasi tinggi) dengan cara

menambahkan pelarut agar diperoleh volume akhir yang lebih besar.

Pengenceran bertujuan untuk mengurangi konsentrasi atau kekentalan dari

suatu bahan agar setelah masa inkubasi koloni mikroba yang tumbuh jumlahnya

dapat dihitung dengan mudah. Jumlah koloni yang muncul setelah masa inkubasi

paling baik yaitu antara 30-300 koloni (Dwidjoseputro, 1993). Perbandingan

dalam melakukan pengenceran yang dilakukan adalah 10-1, 10-2 dan 10-3. Larutan

yang digunakan untuk melakukan pengenceran adalah Phosphate buffer saline

(PBS). Pengenceran pada sampel dapat dilakukan beberapa kali agar biakan

yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat

akan mengganggu pengamatan). Sekitar 0,5 ml suspensi dituang ke dalam

cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media agar steril hangat

dengan suhu antara 40 – 50°C, kemudian ditutup rapat dan diletakkan dalam

inkubator bersuhu 37°C selama 1 – 2 hari dengan posisi terbalik (Megamii,

2009).

Cara perhitungan kuantitas/densitas sel bakteri pada kultur cair yang paling

umum adalah dengan menggunakan nilai kekeruhan suspensi sel yang

didapatkan dengan pengukuran menggunakan spektrofotometer.

Sel bakteri dihitung dengan panjang gelombang 600 nm dan nilai absorbansi

yang muncul kemudian dikonversi untuk mendapatkan nilai densitas sel bakteri

dalam kultur.

Gambar : Skema kerja Spektrofotometer

Cara perhitungan menggunakan spektrofotometer dimulai dengan membuat

larutan Mc. Farland kemudian memasukkan larutan ke dalam spektrofotometer.

Dengan menggunakan spektrofotometer, sejumlah cahaya yang ditransmisikan

menurun ketika populasi sel meningkat. Cahaya yang ditransmisikan akan

diubah menjadi energy listrik, dan kemudian diindikasikan pada sebuah

galvanometer. Pembacaan secara tidak langsung mencerminkan jumlah bakteri.

Kemudian dihitung dengan persamaan MC. Farland:

Y = 2,62 x 109 µ - 6,39 x 107

Dengan y = kepadatan (CFU/ml) dan µ = adsorbs (Å)

CFU/ml = jumlah koloni x 1

pengenceran x

1volume yangdigunakan

Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan

CFU’s/volume atau berat. CFU’s adalah singkatan dari Coloni Forming Unit’s

yang artinya unit-unit atau satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan

pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan

dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal yang mempunyai cirri khas

masing-masing. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi ada

jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga

tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan

masih menempel pada induknya, seperti halnya yang terjadi pada streptococcus,

diplococcus, sarcin sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis

yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka

pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan

dari beberapa sel.

Pada praktikum penghitungan jumlah bakteri ini semua hasil pengenceran bakteri

tidak bisa dihitung karena dalam proses pengenceran ternyata larutan masih

terlalu pekat sehingga bakteri yang dihasilkan melebihi batas yang bisa dihitung.

Dalam pengenceran menggunakan pengenceran sampel 10-1, 10-2, 10-3,

seharusnya pengenceran yang dilakukan dapat mencapai 10-6, dengan begitu

bakteri yang dihasilkan tidak terlalu banyak. Larutan berisi bakteri yang dibiakkan

dengan kepadatan yang cukup tinggi akan menghasilkan biakan bakteri yang

lebh banyak. Oleh karena itu, untuk mendapatkan hasil yang lebih optimal maka

sebaiknya seri pengenceran lebih kecil.

E. KESIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat ditarik keksimpulan sebagai

berikut:

Metode yang dapat digunakan untuk menghitung bakteri antara lain

metode standard plate count dan metode spektrofotometer (turbidimetri).

Metode standard plate count terdiri dari pengenceran sampel dengan

PBS (phosphate buffer saline) steril hingga bakteri cukup untuk dihitun

secara akurat.

Metode turbidimeter menggunakan alat yaitu spektrofotometer yang

didasarkan pada kekeruhan larutan.

Terjadi kesalahan dalam proses pengenceran sehingga jumlah biakan

yang dihasilkan terlalu banyak dan tidak dapat dihitung.

Diperlukan ketelitian dan perhitungan yang akurat sebelum melakukan

penegenceran dan saat akan melakukan perhitungan bakteri.

Adapun saran yang dapat disampaikan untuk praktikum kali ini adalah agar

praktikan lebih teliti dalam melakukan pengenceran dan sebaiknya sebelum

praktikum telah diadakan percobaan terlebih dahulu agar mendapatkan hasil

yang lebih optimal.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2012. Tes Jurnal Praktikum Mikrobiologi.

http://artikelteknikkimia.blogspot.com. Diakses tanggal 27 Oktober 2012.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Megamii. 2009. Pemeriksaan Bakteri Secara Makroskopis.

http://megamii.wordpress.com. Diakses tanggal 27 Oktober 2012.

Purwoko, T. 2007. Fisiologi Mikroba. Jakarta: Bumi Aksara.