ABSTRAK

Percobaan mikrobiologi: Isolasi dan Penanaman Mikroba bertujuan untuk

mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam bidang

mikrobiologi, mengenal dan melakukan teknik menanaman bakteri serta mengisolasi bakteri

untuk mendapatkan biakan murni. Prinsip yang mendasari percobaan ini adalah inokulasi

bakteri dengan konsepsi biakan murni. Metode yang digunakan dalam percobaan ini adalah

metode streak (penggoresan ).Bakteri yang digunakan dalam percobaan ini adalah

Staphylococcus aureus. Hasil yang diperoleh dalam percobaan ini adalah: pada medium

nutrient cair, pada kontrol berwarna putih transparan dam tidak terdapat endapan sedangkan

pada medium positif terdapat endapan putih. Pada medium agar, untuk control tetap bening,

sedangkan pada media padat 1 dan terdapat bintik-bintik putih yang menggerombol

membentuk suatu koloni. Pada medium agar miring, pada kontrol berwarna putih transparan

sedangkan pada medium positif terjadi kekeruhan dimana timbul bintik-bintik putih yang

jaraknya berjauhan.

PERCOBAAN 10

MIKROBIOLOGI : ISOLASI DAN PENANAMAN MIKROBA

I. TUJUAN

1.1. Mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam

bidang mikrobiologi

1.2. Mengenal dan melakukan teknik penanaman bakteri

1.3. Mengisolasi bakteri untuk mendapatkan biakan murni

II. TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Pengertian Mikrobiologi

Mikrobiologi adalah telah mengenai organisme hidup yang berukuran

mikroskopis. Dunia mikroorganisme terdiri dari 5 kelompok organisme

yaitu bakteri, protozoa, virus serta algae dan cendawan mikroskopis. Dalam

bidang mikrobiologi kita mempelajari banyak segi mengenai jasad-jasad

renik ini dimana adanya ciri-ciri kekerabatan antara sesamanya seperti juga

dengan kelompok organisme lainnya. Pengendalian dan peranannya dalam

kesehatan serta kesejahteraan kita. Mikroorganisme sangat erat kaitannya

dengan kehidupan. Beberapa diantaranya bermanfaat dan yang lainnya

merugikan. Banyak diantaranya menjadi penghuni dalam tubuh manusia.

Beberapa organisme menyebabkan penyakit dan yang lain terlibat dalam

kegiatan manusia seperti pembuatan anggur, keju, yogurt, produksi

penicillin serta proses-proses perlakuan yang berkaitan dengan pembuangan

limbah.

(Michael, 1986)

Informasi yang diperoleh dari mikrobiologi memungkinkan kemajuan

besar dalam kemampuan kita untuk mengawasi banyak penyakit menular.

Disamping itu mikroorganisme telah digunakan untuk mempelajari berbagai

proses biokimia yang diketahui terjadi pada bentuk kehidupan yang lebih

tinggi. Jadi banyak fakta tentang metabolisme manusia yang diketahui

sekarang. Mula-mula diketahui terjadi pada mikroorganisme bidang baru

genetika molekuler yang menjelaskan bagaimana gen mengatur aktivitas sel

berasal dari studi tentang mikroorganisme. Oleh karena itu jelaslah bahwa

bidang mikrobiologi bukan hanya studi tentang mikroorganisme penyebab

penyakit tetapi merupakan studi tentang semua aktivitas hayati

mikroorganisme.

(Volk, 1993)

II.2. Identifikasi Sifat-sifat Mikroorganisme

II.2.1. Organisme Eukariot

1. Jamur

Fungsi bersel banyakyang dikenal sebagai jamur jauh lebih

kompleks dari pada khamir. Jamur secara khas berkembang

sebagai pertumbuhan bercabang seperti rambut dan sebagian besar

membentuk spora seksual dan aseksual. Beberapa jamur

memberikan rasa bagi keju yang baik (Roquefort, camembert dan

brie). Dilain pihak sedikit jamur menyebabkan penyakit gawat

pada manusia.

2. Protozoa

Protozoa mempunyai bentuk dan ukuran, ada yang lonjong atau

berbentuk bola. ada yang memanjang dan ada yang berubah

bentuk. Sambil bergerak diatas permukaan. Beberapa jenis ada

yang berdiameter 1 sampai 2 mm, sehingga dapat dilihat dengan

mata telanjang. Kebanyakan protozoa dapat berkembang baik

secara seksual maupun aseksual.

(Volk, 1993)

2.2.2. Organisme Prokariot

1. Bakteri

Bersel tunggal, walaupun kadang ada gumpalan bersel banyak.

Bakteri lebih kecil ukurannya dari pada protozoa. Beberapa sel

bakteri yang umum panjangnya kira-kira 1 µm; 2000 bakteri

semacam ini akan mencapai liputan kepala jarum pentul pada titik

terlebar.

Bakteri adalah organisme sangat kecil yang mampu berada dimana

saja. Bakteri kadang menampakkan kehadirannya tetapi seelalu

tidak di sadari karena aktivitasnya yang tidak tampak karena

terlalu kecil. Bakteri dapat dilihat dengan menggunakan

mikroskop.

2. Algae

Dahulu dikenal dengan ganggang biru-hijau, tersebar diseluruh

dunia baik dalam air tawar/ air laut. Memperoleh energi dengan

semacam fotosintesis yang identik dilakukan oleh tumbuhan

tingkat tinggi. Klorofilnya tidak terdapat dalam kloroplas tetapi

dalam lamella disebut blakoid beberapa ganggang biru-hijau yang

terbentuk benang sewaktu-waktu menghasilkan sel yang menebal

disebut heterosista. Fungsi utama heterosista adalah mengubah

nitrogen dalam atmosfer menjadi ammonia dan menyediakan gas

N2.

3. Virus

Virus adalah perantara yang terkecil dan dapat mengarahkan

pengadaannya sendiri. Bersifat ultra mikroskopis, terlampau kecil,

dapat dilihat dengan mikriskop cahaya konvensional. Klasifikasi

virus dipisahkan dalam suku berdasarkan bentuknya, ada tidaknya

membran, tipe asam nukleat dalam virion (DNA dan RNA) bentuk

asam nukleat (cabang ganda, benang tunggal, lurus, melingkar)

dan adanya asam nukleat multiple atau dalam virion.

(Volk, 1993)

2.3. Konsepsi Biakan Murni

Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan

campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi

terpisah-pisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan

mikroorganisme pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak

berjauhan dari sesamanya juga memungkinkkan setiap selnya berhimpun

membentuk koloni. Sekelompok massa sel yang dapat dilihat dengan mata

secara langsung. Semua sel dalam koloni itu sama, dianggap kesemuanya itu

merupakan keturunan (progeny) satu mikroorganisme dan karena itu

mewakili apa yang disebut mikrobiologi biakan murni. Penggunaan agar

pada media mikrobiologi yang semula diusulkan oleh laboratorium Koch

pada awal 1880-an tetap digunakan secara luas sampai kini.

Percobaan Koch dan penelitian di laboratorium membuktikan bahwa jasad

renik tertentu menyebabkan timbulnya penyakit tertentu. Postulat Koch

ialah:

1. Mikroorganisme tertentu selalu dapat dijumpai berasosiasi dengan

penyakit tertentu.

2. Mikroorganisme itu dapat diisolasi dan ditumbuhkan menjadi biakan

murni di laboratorium.

3. Biakan murni mikroorganisme tersebut akan menimbulkan penyakit itu

bila disuntikan pada hewan yang rentan (suseptibet)

4. Penggunaan prosedur laboratorium memungkinkan diperolehnya

kembali mikroorganisme yang disuntikan itu dari hewan yang dengan

sengaja diinfeksi dalam percobaan.

(Michael, 1986)

2.4. Teknik Biakan Murni

Untuk mendapatkan koloni bakteri sebagai sumber biakan murni ada dua

teknik yang dapat dipakai yakni :

1. Metode piringan goresan (streak-plate method)

Medium agar steril dicairkan, didinginkan 45°C, dituangkan kedalam

cawan petri steril dan dibiarkan menjadi padat, kemudian dengan kawat

penginokulasi yang penuh bakteri. Goresan dilakukan diatas permukaan

agar. Apabila sebaran dilakukan dengan menggerakan kawat gelang.

Kian kemari dari satu bagian ke bagian lain dari cawan petri, bakteri

yang tertinggal pada kawat gelang semakin berkurang. Jika dilakukan

dengan sempurna goresan akhir akan meninggalkan bakteri individual

cukup terpisah satu sama lain, sehingga setelah mengalami pertumbuhan

koloni dari bakteri individual akan benar-benar terpisah satu sama lain,

kemudian koloni tunggal dapat dipindahkan ke medium steril dan

tumbuhlah biakan murni.

2. Metode piringan tuangan (Pour Plate Method)

Metode ini terdiri atas penginokulasi bukan campuran kevdalam tabung

uvi yang mengandung agar mencair yang telah diinginkan selama 450C.

Isinya diaduk untuk memancarkan bakteri ke seluruh medium.

Campuran itu dituangkan kedalam cawan petri kosong dan medium cair

dituangkan diatasnya. Cawan diputar untuk mencampur isinya sebelum

medium menjadi padat.

Pertumbuhan koloni dalam medium. Tujuan kedua prosedur ialah

memisahkan sel-sel bakteri satu sama lain sehingga sel-sel itu tumbuh

menjadi koloni-koloni yang terpisah dari medium yang padat, kemudian

dapat diambil sel-sel dari koloni untuk mendapatkan biakan murni.

Dalam praktek sering piringan kedua digores kembali dengan organism

yang berrasal dari koloni yang diisolasi untuk menjamin bahwa hasil

yang diperoleh adalah biakan murni.

(Volk, 1993)

2.5. Macam-macam Media Biakan

Medium yang padanya bakteri ditumbuhkan akan beranak dalam

susunannya sesuai dengan kebutuhan jenis-jenis yang bersangkutan.

Beberapa bakteri dapat hidup pada medium yang sangat sederhana yang

hanya mengandung garam organik ditambah sumber karbon organik seperti

gula. Bakteri lain memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yang

kepadanya ditambahkan darah atau bahan kompleks lain.

(Volk, 1993)

2.5.1. Media Saringan (Infusion media)

Salah satu media paling lazim yang digunakan untuk memelihara

bakteri sehari-hari disebut air kalolu, dibuat dengan merebus daging

cacah dengan air kemudian menyaring materi padat sehingga

diperoleh cairan jernih yang disebut air saringan pepton, yang

merupakan protein yang mengalami degradasi sebagian ditambahkan

air saringan itu sebagai sumber karbon, nitrogen dan zat anorganik

tertentu guna pertumbuhan bakteri.

(Volk, 1993)

2.5.2. Media Karbohidrat

Berbagai gula (karbohidrat) dapat ditambahkan pada dasar kaldu

yang mengandung makanan. Medium macam ini dipakai untuk

menentukan apakah jenis bakteri yang diidentifikasi itu mampu

menggunakan gula untuk pertumbuhannya. Dalam media jenis ini

yang lazim dipakai adalah gula seperti glukosa, monosa, galaktosa,

sukrosa, maltose dan laktosa. Disamping itu, digunakan pula alkohol-

alkohol gula seperti manitol, gliserol, dan duisitol.

(Volk, 1993)

2.6. Fase-fase pertumbuhan Bakteri

Jika keadaan baik, hampir semua bakteri mampu berkembang biak dengan

amat cepat. Waktu yang diperlukan bagi satu organisme untuk membelah

menjadi dua disebut waktu generasi. Dalam mempelajari laju pertumbuhan

biakan bakteri, hasilnya dapat di proyeksikan sebagai logaritma jumlah sel

terhadap waktu pertumbuhan. Terdapat 4 fasa pertumbuhan, yaitu :

2.6.1. Fasa tenggang (Lag)

Fasa tenggang adalah periode penyesuaian pada lingkungan dan

lamanya dapat 1 jam hingga beberapa hari. Lama waktu ini

tergantung pada macam bakteri, umur biakan dan nutrient yang

terdapat dalam medium yang disediakan. Fasa tenggang ini hanya

tenggang dalam pembiakan saja karena sebenarnya sel itu sangat aktif

dalam metabolisme inklusi dihabiskan. Dan ada sintesis enzim dan

konsituen penting secara aktif. Pada bagian belakang fasa tenggang

terjadi perbesaran ukuran keseluruhan.

(Volk, 1993)

2.6.2. Fasa Logaritma (log)

Fasa ini adalah periode pembiakan yang cepat dan merupakan periode

yang di dalamnya biasanya teramati cirri-ciri khas sel-sel yang aktif

selama fasa inilah waktu generasi tetap tak berubah jenis, jika dibuat

proyeksi logaritma jumlah organisme terhadap waktu, fasa log ini

muncul sebagai garis lurus, jadi waktu generasi dapat ditentukan

dalam fasa ini.

(Volk, 1993)

2.6.3. Fasa Stasioner

Sementara biakan menjadi tua dan mendekati populasi bakteri

maksimum yang ditunjang medium, laju pembiakan berkurang dan

beberapa sel mati. Apabila laju pembiakan sama dengan laju

kematian, jumlah keseluruhan bakteri akan tetap. Hal ini dinamakan

fasa stasioner.

(Volk, 1993)

2.6.4. Fasa Kematian

Apabila laju kematian melampaui laju pembiakan, banyaknya bakteri

yang sebenarnya menurun. Fasa kematian ini biasanya pembiakan

berhenti.

(Volk, 1993)

2.7. Mikroorganisme

Sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan

tanaman dan hewan. Mikroorganisme lebih menguntungkan karena

pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh substrat yang murah lebih mudah

ditingkatkan hasilnya melalui pengaturan pertumbuhan dan rekayasa

genetika. Faktor yang menpengaruhi pertumbuhan bakteri adalah PH

optimum dan suhu yang sesuai untuk menumbuhkan bakteri digunakan suhu

inkubasi 37°C.

(Akhdiya, 2003)

2.8. Penanaman mikroba

Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru

harus dilaksanakan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar

semua alat-alat yang sangkut pautnya dengan medium dan pekerjaan

inokulasi (penanaman) itu benar-benar steril, hal ini untuk menghindarkan

kontaminasi. Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi mikroba adalah

sebagai berikut :

1. Menyiapkan ruangan, ruangan tempat inokulasi harus bebas angin dan

bersih.

2. Pemindahan dengan kawat inokulasi, ujung kawat inokulasi sebaiknya

dari platina atau dari nikram, lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan

sebelum mengambil inokulum.

3. Pemindahan dengan pipet.

(Waluyo,2005)

Untuk menanam suatu mikroba perlu diperhatikan faktor-faktor nutrisi serta

kebutuhan akan oksigen (gas O2 atau udara ). Cara menumbuhkan mikroba

anaerob sangat berbeda dengan aerob. Untuk semuanya itu ada cara-cara

tertentu yang harus diperhatikan. Menanam mikroba yang aerob relatif lebih

mudah daripada yang anaerob.

1. Penanaman mikroba aerob

Ada beberapa cara penanaman mikroba aerob, tergantung pada tujuan

penanaman. Berdasarkan atas bentuk medium dan cara penanaman

dapat dibedakan menjadi :

a. Biakan agak tegak

b. Biakan agak miring

c. Biakan air

2. Penanaman mikroba anaerob

Untuk mikroba anaerob, oksigen dari udara bersifat toksik, karena itu

oksigen harus dikeluarkan dari dalam medium. Ada beberapa cara

untuk menumbuhkan meikroba anaerob, yaitu:

a. Menggunakan metode yang paling sederhana dan paling banyak

digunakan. Medium yang digunakan Chioglycollate-cair,

Chioglycollate-agar, glukosa otak dan lain-lain. Medium-

medium tersebut mengandung bahan-bahan yang dapat

menyerap oksigen sehingga dalam suasana dalam medium

menjadi anaerob,misalnya medium Chioglycollate-agar dalam

cawan petri yang ditutup dengan penutup brewer.

b. Menutup oksigen bebas dengan pembakaran.

Alat yang digunakan misalanya eksikator, kedalam eksikator ini

ditambahkan phosphor murni (P4). Selama ada oksigen, fosfor

akan teroksidasi dan membentuk fosforpentaoksida. Untuk

mempercepat peracunana fosfor, maka pada dasar eksikator

ditambahkan air yang akan menyerap atau melarutkan fosfor

pentaoksida tersebut.

c Absorpsi Oksigen secara Kimia

Yang diperlukan adalah eksikator, asam pirogalel dan kolt.

Untuk setiap liter eksikator diberi 12,5 mL larutan KOH 20%

dan 10ml larutan asam pirogalol 40%.

d Menggunakan anaerob jari, anaerob pack atau inkubator anaerob.

2.9.Isolasi Bakteri

Mengisolasi suatu mikroba adalah memisahkan mikroba tersebut dari

lingkungan di alam dan menumbuhkanya sebagai biakan murni dalam

medium buatan. Untuk isolasi harus diketahui cara-cara menanam dan

menumbuhkan mikroba pada medium biakan serta syarat-syarat lain untuk

pertumbuhan.

(Kingsburg, 1985)

Untuk mengisolasi bakteri dari alam menjadi biakan murni pada umumnya

ada dua cara yaitu:

1. Metode cawan Gores (Streak Plate Method)

Dilakukan dengan cara menggoreskan jarum ose penginokulasian yang

berisi biakan campuran pada permukaan cawan petri steril berisi

medium yang telah padat. Ada beberapa cara yang digunakan namun

kesemuanya meletakkan sebagian besar organisme pada beberapa

goresan pertama dan menyisakan bakteri individual yang cukup

terpisah satu sama lain pada goresan terakhir. Bakteri individual ini

yang terpisah tumbuh menjadi koloni bakteri yang saling terpisahkan

antara satu spesies dengan spesies lainnya.

(Volk,1991)

2. Teknik Piringan tuangan (Pour Plate Method)

Dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:

a. Menginokulasikan biakan, campuran ke dalam tabung uji yang

mengandung agar mencair yang telah didinginkan sampai suhu

45°C. tabung ini diketuk agar bakteri mencapai keseluruhan

medium. Isi tabung uji lalu dituangkan ke dalam cawan petri dan

dibiarkan menjadi padat.

b. Dengan cara Shake Culture (cara penanaman mikroba melalui cara

piaraan adukan)

Yaitu dengan menuangkan inokulum kedalam cawan petri

kosong lalu ditambahakan medium agar cair ke atasnya dan campuran

ini diputar (wadah cawannya) untuk mencampur isinya sebelum

medium menjadi padat.

(Volk, 1973)

2.10.Disinfektan

Disinfektan atau yang sering disebut juga larutan sterilisasi dingin yang

dapat merusak mikroorganisme (virus, bakteri, kapang) tetapi tidak dapat

mematikan spora bakteri. Disinfektan ini tidak dapat menggantikkan

sterilisasi autoklaf.

Disinfektan dapat digunakan pada permukaan yang keras (baki, kursi, meja

dsb), alat-alat yang peka terhadap pemanasan seperti plastik, pipa kapiler

sebelum dan sesudah penggunaannya. Disinfektan dalam penggunaannya

harus memperhatikan prosedur yang dianjurkan. Beberapa disinfektan

bersifat toksik dan membutuhkan penanganan yang khusus dalam

pembuangannya.

(Pelczar,1988 )

2.11.Sterilisasi (numberingnya tlg di cek ia kawan)

Agar biakan bakteri dapat dibuat, maka medium dan alat-alat yang

diperlukan harus disterilsasi sebelum inokulasi. Sterilisasi yaitu proses

untuk mematikan semua organisme yang dapat menjadikan kontaminan.

Metode yang lazim digunakan untuk memsterilisasikan media dan alat-alat

ialah dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-bersama dengan

uap air disebut sterilisasi basah (menggunakan autoklaf), sedangkan jika

tanpa uap air disebut Sterilisasai kering (menggunakan oven).

(Pelczar,1988)

2.12. Inokulasi Bakteri

Menurut Pelezar dan Chan (1996), ada berbagai cara yang dapat digunakan

untuk penanaman bakteri, antara lain:

1. Pembiakan dengan Lempengan (Plate Culture atau Streak Culture)

Dibuat dengan menggeserkan sengkelit (ose) yang telah terinokulasi oleh bakteri ke

atas cawan Petri berisi media padat sampai meliputi seluruh permukaan dengan

gerakan ke kanan dan ke kiri, sehingga diperoleh koloni yang menggerombol dan

memenal.

(Salle, 1973)

2. Piaraan Agar Miring

Penanaman bakteri dapat dilakukan dengan cara menggerakkan ujung kawat yang

berisi bakteri satu kali dari ujung bawah ke ujung atas, sehingga garis merupakan

diameter memanjang pada permukaan miring medium.

(Salle, 1973)

3. Piaraan Tusukan (Stab Culture)

Stab culture dibuat dengan cara menumbuhkan ose yang berisi bakteri dari

permukaan atas agar tegak, tegak lurus medium, tengah-tengah medium. Bakteri

yang tumbuh di dalam medium dapat berupa bakteri yang memakan gelatin medium

maupun tidak memakan gelatin medium.

4. Piaraan Adukan (Shake Culture)

Bakteri dari medium cair atau dari medium padat yang telah diencerkan sehingga

menjadi suspensi, dituangkan ke tengah-tengah cawan petri kemudian ditambahkan

gelatin atau agar-agar yang belum beku, lalu cawan ditutup dan diputar sehingga

suspensi bercampur dengan medium. Jika bakteri telah tumbuh maka akan berupa

koloni-koloni yang berada pada permukaan medium yang pertama adalah bakteri

anaerob dan yang kedua adalah bakteri aerob.

(Salle, 1973)

2.13.Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba

Kehidupan mikroba umumnya sangat dipengaruhi dan tergantung oleh keadaan

lingkungannya. Secara garis besar ada tiga faktor lingkungan yang mempengaruhi, yaitu:

1. Faktor Fisik, misalnya: suhu, pH, tekanan osmotik, kandungan oksigen, dll

2. Faktor Kimia, misalnya: senyawa racun

3. Faktor biolagik, misalnya: interaksi dengan mikroba lainnya

2.13.1. Faktor fisik

a. Pengaruh suhu terhadap pertumbuhan bakteri

Berdasarkan kisaran suhu pertumbuhannya, mikroba dibagi tiga:

- Psikofilik : tumbuh pada kisaran suhu -5˚C – 20˚C

- Mesofilik : tumbuh pada kisaran suhu 20˚C – 45˚C

- Termofilik : tumbuh di atas suhu 45˚C

b. Pengaruh pH

Setiap jenis mikroba memiliki kemampuan untuk hidup pada rentang pH yang

spesifik. Namun secara umum mikroba dapat tumbuh pada kisaran pH antara 4–9

dengan pertumbuhan optimum pada pH 6.5– 7.5 selama pertumbuhan mikroba, pH

medium akan berubah akibat produk- produk metabolisme mikroba, yakni asam

hasil degradasi karbohidrat dan basa hasl penguraian protein.

c. Pengaruh Oksigen bebas(O2)

Pada berbagai mikroba sangat bervariasi, hal ini mencerminkan adanya perbedaan

sistem enzim beroksidatif yang terdapat dalam mikroba tersebut.

Berdasarkan kebutuhan O2, mikroba dapat dikelompokkan menjadi:

- Aerob : mikroba yang membutuhkan O2 untuk pertumbuhannya

- Anaerob : mikroba yang tidak membutuhkan O2 untuk pertumbuhanya

- Fakultatif : mikroba yang dapat tumbuh dengan maupun tanpa adanya O2

- Mikroaerofilik : mikroba yang membutuhkan O2 sangat sedikit.

d. Pengaruh Tekanan Osmotik

Medium yang dipergunakan untuk menumbuhkan suatu mikroba mempunyai

persyaratan tertentu, salah satunya adalah medium harus bersifat isotonis terhadap

mikroba. Kondisi medium yang hipertonis atau hipotonik akan mempengaruhi sel

mikroba sehingga mengganggu pertumbuhan.

2. 13. 2 Faktor Kimia

Pada prinsipnya mikroba ada yang bersifat menguntungkan maupun merugikan bagi

kehidupan manusia. Beberapa metode dikembangkan untuk mengendalikan mikroba

yang bersifat merugikan dengan menggunakan agen fisika dan kimia. Metode kimia

untuk mengendalikan pertumbuhan mikroba menggunakan:

1. Antiseptik : senyawa kimia yang digunakan untuk jaringan hidup untuk

menghambat pertumbuhan mikroba.

2. Disinfektan : senyawa kimia yang menghambat pertumbuhan pada bahan

yang tak hidup.

Untuk mengatur pengaruh senyawa kimia terhadap suatu bakteri dapat dilakukan

dengan menggunakan silinder kaca yang diletakkan diatas medium yang telah

diinokulasi dengan bakteri uji. Penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri

ditunjukkan dengan timbulnya daerah bening disekitar cakram uji. Daerah bening

merupakan daerah yang tidak ditumbuhi mikroba. Hal ini terjadi akibat adanya difusi

senyawa kimia ke dalam media akan menyebabkan penghambatan ukuran daerah

bening sangat dipengaruhi oleh variabel- variable teknis yaitu jumlah inokkulum,

waktu inokulasi, komposisi medium, pH, gas- gas udara, stabilitas antimikroba, dsb.

2. 13.3 Faktor Biologis

Beberapa jenis mikroba mampu menghasilkan suatu metabolit yang dapat

bersifat racun bagi mikroba lain, misalnya antibiotik. Pengaruh terhadap metabolik

mikroba terhadap mikroba lain dapat dilakukan dengan teknik bioassay yang

“melawankan” mikroba penghasil metabolit dengan mikroba lain yang sensitif.

(Guchanan, 1992)

2.11. Kurva Pertumbuhan Jasad renik

Pada gambar diatas ,jika suatu bakteri memperbanyak diri menjadi dua dalam

waktu 20 menit. Bila sel tersebut diingkubasikan pada medium dengan kondisi optimum

untuk pertumbuhanya maka dalam waktu 40 jam sel tersebut akan mengalami

pembelahan sebanyak 48(60)/20 kali atau 144 generasi. Jumlah sel setelah 40 jam

secara teoritis mencapai 2^144 sel. Jika setiap sel mempunyai berat 10^-12 gram, maka

secara teoritis berat sel setelah 48 jam akan mencapai 2^144 X 10^-12 gram atau 2.2 X

10^31 gram , atau sama dengan 4000 kali berat bumi. Pada kenyataanya tidaklah

demikian keadaanya, karena tidak semua sel yang terbentuk terus hidup.

(Waluyo,2005)

2.14. Penanaman Mikroba

Pekerjaan memindahkan mikroba dari medium lama ke medium yang baru harus

diusahakan agar semua alat- alat yang sangkut paut dengan medium dan pekerjaan

inokulasi (penanaman) itu benar- benar steril, hal ini untuk menghindarkan kontaminasi.

Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi mikroba adalah sebagai berikut:

1. Menyiapkan ruangan, ruangan tempat inokulasi harus bersih dan bebas angin.

2. Pemindahan dengan kawat inokulasi, ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina

atau dari nikrom, lebih dahulu ujungkawat ini dipijarkan sebelum mengambil

inokulum.

3. Pemindahan dengan pipet.

2.18Analisa bahan

2.18.1. Agar

Ekstrak dari sejenis rumput laut merat yang digunakan sebagai

bahan pembuat gel (gelling agent) dalam media biakan

mikroorganisme, makanan, obat-obatan dank krim kosmetik serta

jelli. Agar nutrient terdiri dari kalau yang terbuat dari ekstrak daging,

darah sapi, yang menjadi gel bersama agar kemudian digunakan

untuk membiakan bakteri, jamur, dan beberapa alya.

(Daintith, 1994)

2.18.2. NaOH

Padatan putih, hidroskopis, bersifat korosif pada kulit.

Biasanya digunakan untuk membuat sabun, tekstil; digunakan untuk

penyaringan petroleum dan minyak nabati, kertas dan obat; mudah

bereaksi dengan air dan dapat menyebabkan ledakan.

(Himanshu, 2004)

2.18.3. Bakteri

Bersel tunggal; berfilamen dan bermiselium dari dunia monera;

organism yang paling sederhana dari semua organism yang dikenal;

variasi bentuk bakteri, batang (basil), bulat (kokus), spiral (spirilium),

benang (filament), perbanyakan dengan membelah diri (reproduksi

aseksual) yaitu produksi spora yang disebarkan melalui udara atau

kawasan berflagela; tidak menjjalani meiosis/singami, tetapi

rekombinasi gen terjadi pada banyak bakteri sarutra, sejumlah kecil

autotrof.

(Abercrombie, 1997)

2.18.4. Pepton

Fragmen belgar yang dihasilkan pada awal proses hirolisis

protein.

(Abercrombie, 1997)

2.18.5 Ragi (Ekstrak yeast)

Jamur bersel 1 yang tersebar luas; sebagian besar masuk

ascomycorina; berkembang biak dengan proses pertunasan;

digunakan untuk industry pembuatan minuman beralkohol dan roti;

juga digunakan secara komersial sebagai sumber protein dan vitamin;

sebagai inang pada beberapa tekhnik bioteknologi untuk pengklonan

DNA.

(Abercrombie, 1997)

2.18.6. Aquadest

Air murni dari penyulingan; titik didih 1000C; titik bekunya

00C; rumus molekul H2O; tidak berwarna (bening); tidak berasa; tidak

berbau; biasanya sebagai pelarut.

(Amiruddin, 1993)

2.18.7. NaCl

Padatan Kristal tanpa warna; larut dalam air dan sedikit larut

dalam etanol; titik didih 14130C; sebagai bahan pengawet dan bumbu

masakan.

(Daintith, 1994)

III. METODE PERCOBAANIII.1. Alat dan Bahan

III.1.1. Alat1. Cawan petri steril 9. Kompor listrik2. Tabung reaksi 10 ml 10. Tutup kapas3. Erlenmeyer 100 ml 11. Kertas coklat4. Autoklaf 12. Benang kasur5. Inkubator 6. Jarum Ose 7. Shaker8. Penangas air

III.1.2. Bahan1. Ragi 2. Pepton 3. NaCl 4. NaOH 5. Bubuk agar6. Akuadest7. Suspense

III.2. Skema Kerja

III.2.1. Pembuatan Medium Nutrien Cair

Penambahan 50 ml aquadest

Pemanasan larutan hingga mendidih selama 5

menit

Pendinginan

Penambahan aquadest 50 ml lagi

Penyaringan dengan kapas

Pembagian larutan menjadi 2 masing-masing

25 ml

Pensterilan dengan autoklaf selama 20 menit

0,15 g ragi + 0,25 g pepton + 0,25 g NaClErlenmeyer

Hasil

III.2.2. Pembuatan Medium Nutrien agar

Penambahan 50 ml aquadest Pemanasan larutan Pendinginan Penetralan medium dengan NaOH 1 N Penambahan aquadest 50 ml lagi Penyaringan dengan kapas

Penambahan 0,75 g bubuk agar untuk 50 ml aquadestPemanasan medium sambil diaduk

Penambahan aquadest hingga volume Penetralan pH menggunakan NaOHPenyaringan dengan kapas

Penutupan dengan kapas Penutupan dengan kapas Penutupan dengan kapasdan kertas coklat dan kertas coklat dan kertas coklat Pengikatan dengan benang Pengikatan dengan benang Pengikatan dengan benangPensterilan dengan autoklaf Pensterilan dengan autoklaf Pensterilan dengan autoklaf selama 20 menit selama 20 menit selama 20 menitPeletakan tabung reaksi Peletakan tabung reaksi Peletakan erlenmeyer

Pendiaman hingga padat Pendiaman hingga padat

0,15 g ragi + 0,25 g pepton + 0,25 g Erlenmeyer

FiltratErlenmeyer

Hasil HasilHasil

Tabung reaksi

5 mL larutan

Tabung reaksi

5 mL larutan

erlenmeyer

Sisa larutan

III.2.3. Pembuatan Medium Nutrien Cair

Pengambilan dengan jarum osePenggoresan pada permukaan agar pada petri dishPembalikan petri dish yang telah di inokulasiPemberian etiket serta bungkus kembaliPenginkubasian pada suhu yang sesuai 370C selama 24-28 jamPengamatan pertumbuhan bakteri Pembandingan dengan media agar miring dan media cair

III.2.4. Menanam bakteri pada medium Nutrien cair

Pengambilan dengan jarum ose Pemindahan dengan cara mencelupkan jarum ose kedalam medium Nutrien cairPenginkubasian pada suhu yang sesuai 370C selama 24-28 jam sambil diaduk dalam shakerPengamatan pertumbuhan bakteri Pembandingan

Stok bakteriGelas bekker

Hasil

Stok bakteriGelas bekker

Hasil

III.2.5. Menanam bakteri pada agar miring

Pengambilan dengan jarum ase Pemindahan dengan cara penggoresan jarum ose kedalam medium Nutrien agar miringPenginkubasian pada suhu yang sesuai 370C selama 24-28 jam sambil diaduk dalam shakerPengamatan pertumbuhan bakteri Pembandingan dengan media cair

IV. DATA PENGAMATAN

No Perlakuan Hasil

1 Pembuatan medium nutrient cair

- 0,5 g ragi+0,25 g pepton+0,25 g

NaCl+50 ml air

- Pemanasan larutan hingga mendidih dan

Pendnginan

- Penetralan medium dengan NaOH 1 N

sedikit demi sedikit sampai PP berubah

warna pink

- Penambahan aquadest 50 ml

- Penyaringan dengan kapas

- Larutan dibagi 2 : 25 ml

- Pensterilan dengan autoklaf selama 20

menit

-warna larutan keruh

-mandidih

-pH 7

-volume lerutan 50 ml yang

digunakan filtrat

Stok bakteriGelas bekker

Hasil

2 Pembuatan medium nutrient agar

- Pembuatan nutrient cair seperti langkah

1-5 dan masukan dalam Erlenmeyer

- Penambahan 0,75 g bubuk agar untuk 50

ml aquadest

- Pemanasan medium sambil diaduk

hingga larut

- Penambahan aquadest hingga volume

semula dan penyetelan PH dengan NaOH

- Penyaringan dengan kapas

- Pemasukan 5 ml medium dalam 2 tabung

reaksi lalu tutup dengan kapas dan kertas

cokelat

- Pengsterilan semua larutan pada autoklat

selama 20 menit, tabung diletakan miring

300

Diperoleh medium nutrient

agar

3 Isolasi bakteri

- Pengambilan bakteri secara aseptic

dengan jarum ase

- Penggoresan pada permukaan agar pada

petridish

- Pembalikan petridish yang telah

diinokulasi dan pemberian etiket serta

bungkus lagi

- Inkubasi pada suhu 370 selama 24-48 jam

- Pengamatan pertumbuhan

- Pembandingan

Control

Media padat

4 Menanam bakteri pada medium nutrient

cair

- Ppengambilan secara aseptic dengan

jarum ase kedalam medium nutrient cair

- Penginkubasian Pada suhu 370 selama 24-

48 jam sambil diaduk dalam shaker

- Pengamatan pertumbuhan bakteri dan

pembandinganControl

Media cair

5 Menanam bakteri pada agar miring

- Pengambilan secara aseptic 1 koloni

bakteri dengan jarum ase

- Pemindahan dengan cara penggoresan

jarum ase kedalam medium nutrient agar

miring

- Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48

jam

- Pengamatan pertumbuhan bakteri

- pembandingan

Control

Agar miring

V. HIPOTESA

Dari percobaan isolasi dan penanaman mikroba, yang dalam tekhnik menanam

bakteri menggunakan media biakan yaitu medium nutrient cair dan medium

nutrient agar, kemungkinan yang terjadi bakteri akan lebih mudah diamati pada

medium nutrient agar karena agar merupakan media padat.

VI. PEMBAHASAN

Percobaan mikrobiologi Isolasi dan Penanaman Mikroba bertujuan untuk

mengenal dan membuat berbagai macam medium yang digunakan dalam bidang

mikrobiologi, mengenal dan melakukan teknik menanaman bakteri serta mengisolasi

bakteri untuk mendapatkan biakan murni. Prinsip yang mendasari percobaan ini

adalah inokulasi bakteri dengan konsepsi biakan murni yaitu dengan memisahkan

campuran mokroorganisme sehingga membentuk koloni yang terpisah antara satu

strain atau jenis mikroba dengan mikroba lainnya dengan menumbuhkan

mikroorganisme pada media agar sehingga masing-masing mikroba bisa tumbuh

secara berjauhan dan setiap selnya berhimpun membentuk koloni.(Burocus ,1961 )

Metode yang digunakan dalam percobaan ini yaitu dengan metode streak

( penggoresan ). Metode streak dilakukan untuk memperoleh biakan murni karena

pada goresan terakhir akan didapatkan koloni bakteri yang semakin berjauhan

sehingga diharapkan goresan yang terakhir adalah biakan murni. Penginokulasian

bakteri dengan metode ini dengan menggunakan jarum ase..

Pada percobaan ini digunakan bakteri yang bersifat aerob yaitu

Staphylococcus aureus. Bakteri tersebut diinokulasi pada medium cair, medium agar,

dan medium agar miring. Pada pembuatan medium nutrient cair digunakan nutrien-

nutrien berupa ekstrak ragi, pepton, dan NaCl. Sedangkan pada medium padat

nutrien-nutrien sama dengan nutrien cair hanya ditambahkan bubuk agar yang berasal

dari alga yang berfungsi sebagai bahan pemadat.

Ekstrak ragi digunakan karena ekstrak ragi mengandung natrium karbinat dan

natrium bikarbonat yang berfungsi sebagai sumber karbon ( Tarigan, 1988 ). Ragi

disini juga berfungsi sebagai sumber makanan bagi bakteri. Hal ini karena sejumlah

mikroorganisme membutuhkan sejumlah karbon dalam bentuk karbondioksida tetapi

kebanyakan diantaranya juga membutuhkan beberapa senyawa karbon organik,

seperti gula, dan karbohidrat (Waluyo, 2005 ). Pepton juga berfungsi sebagai protein

karena pepton merupakan senyawa organic dalam bentuk asam-asam amino yang

merupakan sumber nitrogen (N), yang penting bagi pertumbuhan bagi bakteri

(Waluyo, 2005 ).

NaCl berfungsi sebagai sumber ion logam Natrium karena semua organisme

hidup membutuhkan beberapa unsure logam seperti natrium, kalium, magnesium,

mangan, besi, tembaga, dan kobalt. Berbagai sumber tersebut digunakan untuk

pertumbuhan yang normal, tidak terkecuali kuman (Waluyo, 2005). Ketiganya

merupakan nutrien-nutien atau unsur hara yang diperlukan bakteri agar dapat tumbuh

dengan baik.

Medium nutrien cair dan padat telah dibuat kemudian disterilkan dengan

dimasukkan kedalam autoklaf. Sebelum medium-medium tersebut dimasukkan

kedalam autoklaf, medium padat yang terdapat dalam cawan petri harus dibungkus

terlebih dahulu dengan kertas kemudian dibungkus juga dengan plastik. Hal ini

dimaksudkan agar cawan patri tidak basah karena terkena uap air dari autoklaf karena

cawan patri harus berada dalam kondisi tetap kering dan steril. Sedangkan untuk

medium nutrient cair terdapat pada tabung yang masih harus tertutupi dengan

aluminium foil untuk mencegah kontaminasi dari udara luar.

Autoklaf merupakan alat serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap

air. Autoklaf memiliki suatu ruangan yang dapat Manahan tekanan diatas 1 atm.

Dalam autoklaf, yang mensterilkan adalah panas basah, bukan pada tekanannya. Oleh

karena itu, setelah air di dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air maka uap

air ini akan mengalir keruangan pensterilan guna mendesak keluar semua udara di

dalamnya. Bila masih ada udara yang tersisa, maka udara ini akan menambah tekanan

didalam ruangan pensteril yang akan mengganggu naiknya suhu dalam ruangan

tersebut (Waluyo, 2005 ).

Medium tempat penginokulasian bakteri memiliki fungsi masing-masing.

Medium cair ini digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Medium agar digunakan

untuk memperoleh biakan murni dan medium agar miring digunakan untuk

menyimpan (stock) bakteri untuk digunakan lagi di lain waktu.

Hal ini penting yang harus diperhatikan dalam melakukan penanaman bakteri,

yaitu lingkungan harus berada pada kondisi steril atau aseptik. Hal ini dilakukan agar

medium tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme lain dan dapat tumbuh dengan

baik, sehingga diperoleh biakan murni. Oleh karena itu, sebelim peralatan untuk

inokulasi dipergunakan, terlebih dahulu harus dipanaskan dengan pembakar spirtus.

Pembakaran merupakan cara sterilisasi yang 100% efektif, tetapi cara ini

terbatas penggunaannya. Cara ini biasa dipergunakan untuk mensterilkan alat

penanam kuman (jarum ose atau sengkelit) yakni dengan membakarnya sampai pijar.

Dengan cara ini semua bentuk makhluk hidup akan dimatikan. Pembakaran juga

dilakukan untuk bangkai binatang percobaan yang mati (Waluyo, 2005.) Setelah

keluar dari autoklaf, bakteri kemudian diinokulasi pada medium. Penginokulasian

dilakukan dalam sebuah kolom (incase) yang bertujuan agar medium tidak

terkontaminasi oleh mikroorganisme lainnya (Waluyo, 2005).

Medium untuk penanaman bakteri terdiri dari medium positif, yaitu medium

yang akan ditanami dengan bakteri Staphylococcus aureus dan medium negatif atau

yang disebut kontrol yang berfungsi sebagai pembanding untuk pengamatan dan

tidak dilakukan inokulasi bakteri terhadapnya. Setelah tahap inokulasi terlalui,

kemudian dilakukan inkubasi selama 24 jam dengan mengatur suhu optimum

pertumbuhan bakteri staphylococcus aureus pada suhu 37oC. Temperatur optimum

untuk pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus berkisar antara 25-75o C

sedangkan temperatur minimum antara (-5) –(-45)oC. ( Guchanan, 1992). Inkubasi

merupakan Alat yang digunakan sebagai tempat pertumbuhan bakteri yang akan

dibiakkan, yang dapat diatur termperaturnya sehingga sesuai dengan temparatur yang

diperlukan bakteri agar dapat tumbuh dan berkembangbiak dengan secara optimal.

Pengaturan temperatur pada temperatur optimum tersebut dimaksudkan agar bakteri

mudah berkembang biak dan tumbuh secara optimal.

Penginkubasian dilakukan untuk menumbuhkan bakteri yang akan

dibiakkan sesuai dengan suhu yang diperlukan bakteri untuk tumbuh. Setelah

inkubasi selama 24 jam maka bakteri akan tumbuh pada medium positif dan

kemudian dilakukan pengamatan/pembandingan dengan medium negatif. Pada

medium nutrien cair dapat dibedakan antara kontrol (medium negatif) dan medium

positif. Pada medium positif tampak terdapat endapan putih pada tabung, sedangkan

pada kontrol berwarna putih dan tidak terdapat endapan. Pada medium padat 1 (agar)

terdapat bintik-bintik putih agak terputus-putus dan jaraknya tidak terlalu rapat (agak

berjauhan) dan pada medium padat 2 (agar) terdapat bintik-bintik putih yang

bergerombolan seolah membentuk satu blok, bintik-bintik putih tersebut merupakan

biakan murni bakteri Staphylococcus aureus, sedangkan pada control medium padat

tetap bening dan tidak terdapat bintik-bintik putih. Pada medium agar miring,

medium positif terjadi kekeruhan dimana timbul bintik-bintik putih yang jaraknya

agak berjauhan sehinggan medium menjadi tampak keruh, sangat berbeda dengan

kontrol yang berwarna putih bening.

KESIMPULAN

8.1. medium yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri pada percobaan ini adalah

medium nutrient cair, medium agar dan medium agar miring dan bakteri yang

digunakan adalah Staphylococcus aureus.

8.2. Teknik penanaman bakteri diantaranya dengan metode streak (penggoresan).

8.3. Hasil yang penginokulasian bakteri pada medium nutrien cair, pada control

berwarna putih dan tidak terdapat endapan sedangkan pada meium cair terdapar

endapan putih.

8.4. Hasil penginokulasian bakteri pada medium agar pada control pada bening

sedangkan pada media padat 1 dan media padat 2 terdapat bintik-bintik putih

yang menggerombolan membentuk koloni

8.5. Hasil dari penginokulasian bakteri pada medium agar miring, pada control

berwarna putih sedang pada medium agar medium miring terjadi kekeruhan

dimana timbul bintik-bintik putih yang jaraknya agak berjauhan.

DAFTAR PUSTAKA

Anantharayan dan R.P. Jayaran.1979. ”Textbook of Microbiology”.Bombay Calcuta :

New Delhi

Arsyad, M.2001.”Kamus Kimia”.Gramedia : Jakarta

Basri, Sarjoni.1996.”Kamus Kimia”. Rineka Cipta : Jakarta

Burrows, W. 1961.”Textbook of Microbiology”. WB Soundeng Company:

Phyladelphhia

Daintith, John.1994.”Kamus Lengkap Kimia”. Erlangga : Jakarta

Guchanon, E.R dan E.N Gibsons.1992.”Bergeys Manual of Deteminate

Bacteriology,8 th Edition” . The Willians and Wilkins Company : New York

Handoko, Sriani.2000. “ Mikrobiology Dasar “. Universitas Diponegoro : Semarang

Kingsburd, Dtetal.1985.” Microbiology “. John Willey & Sons : New York

Mulyono.2005.” Kamus Kimia”. Ganessa Siratama: Bandung

Pelezar, J.M and E.C.S. Chan.1996.” Dasar-dasar Mikrobiology”. UI Press : Jakarta

Pudjaatmaka, Hadyana.2002.”Kamus Kimia”. Balai Pustaka : Jakarta

Salle,A.J.1973. “Fundamental Principle of Bacteriology”. Mc Graw Hills : USA

Sutedjo, M. 1996. “Mikrobiology Tanah”. Rineka Cipta: Jakarta

Volk, W.A.1991. “Microboilogy Dasar alih bahasa”. Erlangga : Jakarta

Waluyo, L. 2004. “Microbology Umum”. UMM Press : Malang