PERCOBAAN III

Judul : Kromatografi Kertas Pada Asam-Asam Amino

Tujuan : Untuk mempelajari pemisahan asam amino dengan cara kromatografi

kertas

Hari/tanggal : Rabu/ 23 Maret 2011

Tempat : Laboratorium Kimia FKIP UNLAM Banjarmasin

I. TEORI DASAR

Pada awalnya kromatografi dianggap semata-mata sebagai bentuk partisi cairan–

cairan. Serat selulosa yang hidrofilik dari kertas tersebut dapat mengikat air, setelah

disingkapkan ke udara yang lembab, kertas saring yang tampak kering itu sebenarnya

dapat mengandung air dengan persentase tinggi, katakan 20 % (bobot/bobot) akan

lebih. Jadi kertas itu sebenarnya dapat mengandung air dengan persentase tinggi dan

kertas itu dipandang sebagai analog dengan sebatang kolom yang berisi stasioner

berair. Zat-zat terlarut itu padahal fase geraknya dapat campur dengan air akan dalam

beberapa kasus, malahan fase geraknya adalah larutan itu sendiri.

Susunan serat kertas membentuk medium berpori yang bertindak sebagai

tempat untuk mengalirkannya fase bergerak. Berbagai macam tempat kertas secara

komersil tersedia adalah Whatman 1, 2, 31 dan 3 MM. Kertas asam asetil, kertas

kieselguhr, kertas silikon dan kertas penukar ion juga digunakan. Kertas asam asetil

dapat digunakan untuk zat–zat hidrofobik.

Selain kertas Whatman dalam teknik kromatografi dapat pula digunakan kertas

selulosa murni. Kertas selulosa yang dimodifikasi dan kertas serat kaca. Untuk

memilih kertas, yang menjadi pertimbangan adalah tingkat dan kesempurnaan

pemisahan, difusivitas pembentukan spot, efek tailing, pembentukan komet serta laju

pergerakan pelarut terutama untuk teknik descending dan juga kertas seharusnya

penolak air. Seringkali nilai Rf berbeda dari satu kertas ke kertas lainnya. Pengotor

yang terdapat pada kertas saring adalah ion-ion Ca2+, Mg2+, Fe3+, Cu2+.

Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase yaitu

fase gerak dan fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi

bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap.

Pada kromatografi kertas naik, kertasnya digantungkan dari ujung atas lemari

sehingga tercelup di dalam solven di dasar dan solven merangkak ke atas kertas oleh

daya kapilaritas. Pada bentuk turun, kertas dipasang dengan erat dalam sebuah baki

solven di bagian atas lemari dan solven bergerak ke bawah oleh daya kapiler dibantu

dengan gaya gravitasi. Setelah bagian muka solven selesai bergerak hampir sepanjang

kertas, maka pita diambil, dikeringkan dan diteliti. Dalam suatu hal yang berhasil,

solut-solut dari campuran semula akan berpindah tempat sepanjang kertas dengan

kecepatan yang berbeda, untuk membentuk sederet noda-noda yang terpisah. Apabila

senyawa berwarna, tentu saja noda-nodanya dapat terlihat.

Harga Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona realtif terhadap garis depan

pengembang. Kromatogram yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona dicirikan oleh

nilai-nilai Rf. Nilai Rf didefinisikan oleh hubungan:

Rf =Jarak (cm) dari garis awal ke pusat zona

Jarak (cm) dari garis awal ke garis depan pelarut

Pengukuran itu dilakukan dengan mengukur jarak dari titik pemberangkatan

(pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan pusat rapatan tiap zona.

Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Nilai Rf akan

menunjukkan identitas suatu zat yang dicari, contohnya asam amino dan intensitas

zona itu dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi dengan membandingkan dengan

noda-noda standar.

Proses pengeluaran asam mineral dari kertas desalting. Larutan ditempatkan

pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2–3 cm dari salah satu ujung

kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, ia diletakan

didalam ruangan yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai.

Terdapat tiga tehnik pelaksanaan analisis. Pada tehnik ascending; pelarut bergerak

keatas dengan gaya kapiler. Sedangkan ketiga dikenal dengan cara radial atau

kromatografi kertas sirkuler.

Kromatografi bergantung pada pembagian ulang molekul-molekul campuran

antara dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi absorpsi, kromatografi partisi

cairan dan pertukaran ion. Sistem utama yang digunakan dalam kromatografi partisi

adalah partisi gas, partisi cairan yang menggunakan alas tak bergerak (misalnya

komatografi kolom), kromatografi kertas dan lapisan tipis.

Distribusi dapat terjadi antara fase cair yang terserap secara stasioner dan zat

alir bergerak yang  kontak secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi

partisi cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang

diserapkan pada suatu pendukung, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis

adsorbennya disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran plastik.

Kromatografi kertas adalah salah satu cara analisa yang ampuh dan sering

digunakan dalam penelitian komponen-komponen suatu campuran. Dengan

membandingkan pemindahan zat diselidiki dengan pemindahan zat-zat standar yang

diketahui, seringkali kita dapat mengetahui zat yang kita selidiki. Dalam eksperimen

ini, kita hendak menganalisa secara kualitatif suatu larutan yang berisi bermacam-

macam asam amino.

Kromatografi kertas dapat dilakukan dengan satu dimensi atau dua dimensi.

Apabila macam komponen tidak terlalu banyak maka biasanya cara satu dimensi

cukup memuaskan. Tetapi, jika hasilnya meragukan dan ini biasanya disebabkan

karena macam komponennya terlalu banyak, maka cara 2 dimensi seringkali

diperlukan. Untuk ini diperlukan 2 macam larutan eluen, yang satu diperlukan untuk

ke satu arah dan yang kedua untuk ke arah lain yang tegak lurus pada satu elusi

pertama, Setelah kertas kromatografinya kering. Umumnya kertas kromatografi yang

berukuran 35 x 35 cm adalah yang memenuhi syarat.

Pada percobaan ini penyemprotan dengan larutan ninhidrin dilakukan untuk

pewarnaan noda-noda asam amino pada kertas kromatografi yang telah kering.

Asam-asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk

yang disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk

mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi.

Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :

Asam amino larut dalam air dan pelarut polar lainnya, tetapi tidak larut dalam

pelarut organik non polar, seperti dietil eter atau benzena.

Alanin. Semua asam amino, kecuali glisin dapat dianggap sebagai derivat

alanin. Alanin diperoleh untuk pertama kalinya oleh Weyl dari hasil hidrolisis fibroin,

yaitu protein yang terdapat pada sutera.

Struktur alanin :

Treonin adalah homolog yang lebih besar dari erin dan termasuk dalam

golongan asam amino esensial. Mula-mula treonin diisolasi dari hasil hidrolisis fibrin

darah.

Struktur treonin :

ninhidrin

+

+ RCHO + CO2 + 3H2O + H+

anion ungu

Glisin adalah asam amino yang paling sederhana dan terdapat pada

skleroprotein. Pada tahun 1820 Braconnot menemukan glisin dari hasil hidrolisis

gelatin.

Struktur glisin :

II. ALAT DAN BAHAN

Alat-alat yang digunakan :

1. Gelas ukur 10 mL 1 buah

2. Gelas ukur 25 mL 1 buah

3. Pipet 1 buah

4. Chamber 1 buah

5. Corong pisah 2 buah

6. Pipa kapiler 3 buah

7. Statif dan klem 2 buah

Bahan-bahan yang digunakan adalah :

1. 1-butanol

2. Asam sulfat glasial

3. Akuades

4. Asam amino (glisin, alanin, treonin)

5. Etanol

6. Ninhidrin 0.25%

7. Fenol

8. Kertas kromatografi

III. PROSEDUR KERJA

1. Menyiapkan kertas kromatografi ukuran 8 x 5 cm.

2. Menotolkan asam amino (alanin, glisin, treonin) pada kertas kromatografi.

3. Mengeringkan kertas kromatografi yang telah ditotolkan asam amino.

4. Membuat eluen 1 (1- butanol : asam cuka glasial : akuades dengan

perbandingan 18:4:18), menempatkan ke dalam corong pisah, dan

mendiamkan.

5. Memasukkan pelarut (eluen 1) ke dalam chamber.

6. Mengulangi prosedur keempat untuk membuat eluen kedua yaitu 30 mL

fenol : 10 mL akuades.

7. Mencelupkan kertas kromatografi yang telah ditotol ke dalam masing-

masing eluen.

8. Setelah eluen mencapai batas yang telah ditentukan, mengeluarkan kertas

kromagrafi dari chamber dan mengeringkannya menggunakan hair dryer.

9. Menyemprotkan larutan ninhidrin pada kertas kromatografi yang telah

kering.

10. Mengeringkan kembali dengan menggunakan hair dryer, maka noda-noda

asam amino yang berwarna akan terlihat.

11. Mengukur masing-masing Rf dari asam amino.

IV. HASIL PENGAMATAN

No. Variabel yang diamati Hasil pengamatan

A1. Membuat eluen 2 (30 mL fenol :

10mL akuades) Mengocok Menempatkan eluen dalam corong

pisah Mendiamkan

Larutan berwarna orange

Terbentuk lapisan namun lapisan tetap berwarna orange

2. Menjenuhkan chamber dengan cara Chamber jenuh, eluen lama

memasukkan kertas saring kedalam chamber yang telah berisi eluen

kelamaan terserap oleh kertas saring

3. Mentotolkan sampel asam amino pada kertas kromatogradi ukuran 8x5 cm

Mengeringkan Totolan asam amino kering

4. Memasukkan kertas kromatografi kedalam eluen 2

Eluen diserap kertas kromatografi sampai batas

5. Mengeringkan dengan hair dryer Kertas kromatografi kering6. Menyemprot kertas kromatografi dengan

larutan ninhidrin 0.25%Kertas Kromatografi basah oleh larutan ninhidrin

7. Mengeringkan kembali dengan hair dryer Alanin

Treonin Glisin

Kertas kromatografi kering dan terdapat bercak pada kertas Terbentuk warna ungu-

orange Terbentuk warna ungu Terbentuk warna ungu-pink

8. Mengukur panjang noda alanin treonin glisin

Panjang noda: 3.8 cm 3 cm 2.3 cm

B1. Membuat eluen 1(18 mL butanol : 4

mL asam cuka glasial : 18mL air) Mengocok campuran Menempatkan eluen dalam corong

pisah Mendiamkan

Larutan berwarna keruh

Terbentuk 2 lapisan,lapisan atas keruh dan lapisan bawah bening

2. Menjenuhkan chamber dengan cara memasukkan kertas saring kedalam chamber yang telah berisi eluen

Chamber jenuh, eluen lama kelamaan terserap oleh kertas saring

3. Mentotolkan sampel asam amino pada kertas kromatogradi ukuran 8x5 cm

Mengeringkan Totolan asam amino kering

4. Memasukkan kertas kromatografi kedalam eluen 2

Eluen diserap kertas kromatografi sampai batas

5. Mengeringkan dengan hair dryer Kertas kromatografi kering

6. Menyemprot kertas kromatografi dengan larutan ninhidrin 0.25%

Kertas Kromatografi basah oleh larutan ninhidrin

7. Mengeringkan kembali dengan hair dryer Alanin

Treonin

Glisin

Kertas kromatografi kering dan terdapat bercak pada kertas Terbentuk warna ungu-

orange Terbentuk warna ungu-

orange Terbentuk warna ungu-pink

8. Mengukur panjang noda alanin treonin glisin

Panjang noda: 2.2 cm 1.5 cm 2 cm

V. ANALISIS DATA

Percobaan ini menggunakan metode pemisahan asam amino dengan cara

kromatografi kertas. Kromatografi kertas merupakan pemisahan berdasarkan sistem

partisi, dimana fase diam dan fase geraknya berupa cairan pelarut (eluen), dimana

pelarut yang digunakan merupakan campuran beberapa cairan. Dalam percobaan

digunakan dua macam eluen yakni eluen pertama berupa n-butanol : asam cuka

glasial : aquadest dengan perbandingan 18 mL : 4 mL : 18 mL, sedangkan eluen

kedua adalah campuran dari fenol dan air dengan perbandingan 3 : 1. Kromatografi

kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian atau penyerapan. Pada

kromatografi pembagian, senyawa terbagi dalam pelarut alkohol yang sebagian besar

tidak bercampur dengan air (mialnya n-butanol) dan dalam air. Tujuan digunakannya

pelarut campuran n-butanol : asam asetat : air adalah untuk meningkatkan kadar air

lapisan n-butanol dan dengan demikian memperbaiki manfaat campuran pelarut

tersebut.

Percobaan ini diawali dengan membuat eluen pertama yang terdiri atas n-butanol,

asam asetat dan air. Ketika larutan dicampurkan, terbentuk dua lapisan. Hal ini terjadi

karena n-butanol bersifat non polar sedangkan asam asetat dan air bersifat polar, jadi

asam asetat dan air akan saling bercampur, sedangkan n-butanol dan dua pelarut lain

akan tidak saling campur. Kemudian campuran tadi dkocok dan dipisahkan dalam

corong pisah. Setelah mendiamkan beberapa saat larutan terpisah menjadi dua dengan

lapisan atas keruh dan lapisan bawah bening. Eluen kemudian dimasukkan ke dalam

chamber dan ditutup sampai jenuh, tujuannya yaitu untuk menjenuhkan chamber

dengan uap pelarut sehingga mempercepat pemisahan. Begitu pula dengan eluen

kedua yang terdiri atas fenol bersifat non polar dan air bersifat polar. Eluen kedua

yang dihasilkan berwarna orange dan mengalami sedikit perubahan pada saat

didiamkan beberapa saat. Eluen atas berwarna orange tua dan lapisan bawah

berwarna orange muda.

Sampel asam amino yang akan digunakan dalam percobaan adalah alanin, treonin

dan glisin. Setelah itu, masing-masing sampel asam amino ditotolkan pada kertas

kromatografi (kertas Whafman) dengan menggunakan pipa kapiler, kemudian

dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhi oleh uap eluen. Kemudian botol

reagent ditutup rapat agar terjadi pemisahan yang sempurna. Pemisahan asam amino

dengan cara kromatografi kertas disebabkan adanya perbedaan koefisien partisi antara

air dan pelarut organik. Fase air akan tertahan dengan kuat di pori-pori kertas karena

adanya interaksi yang kuat antara air dengan gugus hidroksil dari selulosa, dimana

gugus ini bersifat hidrofilik. Perbedaan koefisien partisi menunjukkan perbedaan laju

rambatan pada permukaan kertas dari air dan pelarut organik yang merambat secara

perlahan.

Pada saat kertas kromatografi ditotolkan sampel asam amino, maka akan terjadi

pemisahan, dimana pelarut organik merambat ke atas melalui kapiler kertas

mengangkut campuran asam amino yang ada ditotolkan pada kertas kromatografi.

Asam amino yang paling larut di dalam pelarut organik, akan diangkut paling cepat

dan asam amino yang paling kurang larut akan tertinggal paling bawah. Jadi, karena

pelarut yang digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air dan fenol : air bersifat

nonpolar, maka dari ketiga sampel asam amino yang digunakan (alanin, treonin,

glisin), dapat dilihat sifat kepolarannya. Sampel yang paling atas merupakan sampel

yang paling larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling non polar dibandingkan

sampel asam amino lainnya. Setelah sampel mencapai batas yang telah ditentukan,

mengeluarkan sampel dari eluen dan mengeringkan menggunakan hair dryer.

Kemudian menyemprotkan larutan ninhidrin pada kertas kromatografi tadi. Asam

amino merupakan jenis zat tidak berwarna, sehingga untuk mengetahui letak noda

diperlukan pereaksi lokasi. Dalam percobaan ini digunakan larutan ninhidrin yang

disemprotkan pada kertas kromatografi setelah dikeringkan, sehingga noda-noda pada

kertas kromatografi dapat terlihat yakni noda yang berwarna ungu ketika kertas

kromatografi dikeringkan lagi dengan menggunakan hair dryer. Terbentuknya noda

berwarna ungu ini disebabkan karena terjadinya reaksi antara hidrat dari triketon

siklik (ninhidrin) dengan asam amino, adapun persamaan reaksi yang terjadi untuk

tiap sampel adalah :

Alanin

ninhidrin

+

+ CH3CHO + CO2 + 3H2O + H+

anion ungu

Reaksi alanin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :

Treonin

ninhidrin

+

+ CH3CHOHCHO + CO2 + 3H2O + H+

anion ungu

Reaksi treonin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :

Glisin

ninhidrin

+

+ HCHO + CO2 + 3H2O + H+

anion ungu

Reaksi glisin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :

Noda-noda ini kemudian diukur dengan membandingkan jarak komponen yang

dipisahkan (analit) dengan jarak pergerakan pelarut, disimbolkan dengan Rf.

Rumusnya : Rf = jarak nodajarak eluen

Dari perhitungan diketahui bahwa masing-masing asam amino memiliki harga Rf

yang berbeda. Untuk eluen pertama yaitu alanin Rf = 0,44; threonin Rf = 0,4; dan

glisin Rf = 0,3. Sedangkan untuk eluen kedua, ialah harga Rf alanin = 0,76; Rf

treonin = 0,6; dan Rf glisin = 0,46. Perbedaan ini dipengaruhi oleh keterikatan analit

terhadap eluen. Karena eluen yang digunakan bersifat non polar maka senyawa yang

lebih non polar akan terikat lebih kuat pada eluen sehingga harga Rf akan semakin

besar. Berdasarkan literatur, harga Rf untuk alanin, treonin, dan glisin adalah 0,38;

0,35; 0,26. Harga Rf ini berbeda dengan hasil percobaan, karena kemungkinan

terdapat perbedaan komposisi eluen dan besarnya ukuran kertas kromatogarfi yang

digunakan.

Untuk eluen pertama, harga Rf masing-masing sampel asam amino

menunjukkan kecenderungan semakin besar dari glisin, treonin, dan alanin. Artinya

alanin lebih larut dalam eluen pertama, yaitu n-butanol yang bersifat non polar

sehingga dapat dikatakan bahwa alanin bersifat lebih non polar dibandingkan dengan

kedua sampel lainnya, tetapi karena harga Rf treonin lebih besar dibandingkan

dengan glisin, maka dapat dinyatakan bahwa sifat kepolaran treonin lebih rendah dari

pada glisin (glisin paling polar, sedangkan treonin kurang polar). Dalam hal ini asam

asetat dan air bersifat polar sehingga dapat larut bersama-sama dan berkumpul dalam

pori-pori kertas kromatografi sebagai fase diam, sedangkan 1-butanol bersifat non

polar yang akan melarutkan asam amino dan dapat diketahui pergerakannya dengan

harga Rf diatas, dengan begitu dapat diketahui sifat kepolaran dari masing-masing

asam amino tersebut.

Sedangkan untuk eluen kedua, harga Rf sampel asam amino dari yang paling

besar adalah alanin, treonin, dan glisin. Artinya glisin lebih polar dibandingkan

dengan treonin dan alanin, dimana alanin bersifat non polar. Hal ini sesuai dengan

literatur yaitu pada eluen kedua ini digunakan pelarut fenol yang bersifat non polar,

sehingga senyawa yang lebih larut urutannya adalah alanin terlebih dahulu lalu

treonin dan glisin karena dilihat dari strukturnya alanin bersifat lebih non polar

dibandingkan kedua asam amino lainnya, dan treonin bersifat lebih non polar

dibandingkan dengan asam amino glisin atau dapat dikatakan bahwa glisin

merupakan asam amino yang paling polar dibandingkan kedua sampel asam amino

yang digunakan. Terjadinya perbedaan sifat kepolaran ini dapat ditunjukkan oleh

harga Rf dan dari literatur. Pada eluen pertama ini akuades lebih tertarik pada kertas

kromatografi kertas yang bersifat hidrofilik, sehingga asam amino yang bersifat non

polar lebih larut bersama dengan pelarut 1-Butanol yang bersifat non polar juga, hal

ini dapat dilihat dari harga Rf alanin yang lenih besar dibandingkan dengan glisin dan

treonin.

Sifat kepolaran asam amino tersebut dapat dibuktikan dari struktur masing-

masing asam amino, berikut :

Alanin Treonin Glisin

Dari rumus struktur diatas, alanin mempunyai gugus R non polar, glisin dan

threonin mempunyai gugus R polar, tetapi gugus R pada glisin, yaitu suatu atom

hidrogen terlalu kecil untuk mempengaruhi derajat polaritas gugus α-amino dan α-

karboksil yang tinggi sehingga treonin lebih non polar dibandingkan dengan glisin.

Sehingga urutan kepolarannya dari yang paling polar adalah :

Glisin > Threonin > Alanin

VI. KESIMPULAN

1. Kromatografi kertas untuk pemisahan asam amino ini menggunakan kertas

whatmann yang berukuran 8 x 5 cm yang terbuat dari serat selulosa, dengan

eluen sebagai fase geraknya.

2. Dalam percobaan digunakan dua buah eluen yang merupakan campuran dari

beberapa pelarut yaitu untuk eluen pertama 1-butanol : asam cuka glasial :

aquadest dengan perbandingan 18 mL : 4 mL : 18 mL dan eluen ke dua fenol

: air dengan perbandingan 3 : 1.

3. Sampel asam amino yang akan dipisahkan adalah alanin, treonin dan glisin,

dan setelah dipisahkan dengan kromatografi kertas, lalu direaksikan dengan

larutan ninhidrin untuk mengetahui posisi asam amino pada kertas

kromatrografi setelah diangkut oleh eluen dengan ditandai terbentuknya

noda berwarna ungu.

4. Pengukuran harga Rf untuk tiap noda pada kromatografi kertas melalui

rumus: Rf = jarak nodajarak eluen

dan didapat harga Rf untuk masing-masing sampel

adalah untuk eluen pertama, Rf alanin = 0,44; Rf threonin = 0,4 dan Rf glisin

= 0,3; sedangkan untuk eluen kedua, harga Rf alanin = 0,76; Rf treonin = 0,6

dan Rf glisin = 0,46.

5. Dengan eluen organik yang bersifat non polar maka semakin besar harga Rf,

semakin bersifat non polar sampel asam amino tersebut. Jadi, urutan

kepolaran sampel asam amino dari yang paling polar adalah :

Glisin > Threonin > Alanin

VII. DAFTAR PUSTAKA

Anwar, Chairil, Bambang Purnowo, Harno Dwi Pranowo dan Tutik Dwi

Wahyuningsih. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Depdikbud:

Jakarta

Basset, J,  et al. 1994. Buku Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik.

Penerbit buku kedokteran EGC: Jakarta

Day & Underwood. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif. Edisi Keempat. Erlangga:

Jakarta

Fessenden dan Fessenden. 1994. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga. Erlangga:

Jakarta

Harborne, J. B. 1996. Metode Fitokimia. ITB: Bandung

Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia:

Jakarta

Poedjiadi, Anna dan F. M. Titin Supriyanti. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. UI-Press:

Jakarta

Matsjeh, Sabirin, Hardjono Sastrihamidjojo dan Respati Sastrosajdono. 1996. Kimia

Organik II. Depdikbud: Jakarta

Syahmani dan Sudarsih .2010. Penuntun Praktikum Biokimia. FKIP UNLAM,

Banjarmasin

Svehla, G.  1979.  Vogel Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semi

Mikro Jilid 1 Edisi Kelima. PT.  Kalman Media Pustaka: Jakarta

LAMPIRAN I

Perhitungan :

Eluen 1 :

Rf Alanin= nodapanjangeluen

=2,25

=0,44

Rf Glisin= nodapanjang eluen

=1,55

=0,3

Rf Treonin= nodapanjang eluen

=25=0,4

Eluen 2 :

Rf Alanin= nodapanjangeluen

=4,55

=0,9

Rf Glisin= nodapanjang eluen

=4,75

=0,94

Rf Treonin= nodapanjang eluen

=55=1

Tugas :

1. Hitung harga Rf tiap-tiap noda dan catat warnanya. Kemudian tetapkan

komponen asam-asam amino dalam larutan yang diselidiki dengan

membandingkan Rf-nya dengan Rf asam-asam amino standar.

2. Jika suatu asam amino memiliki harga Rf 0,45, seberapa jauh asam amino itu

akan bergerak pada plat kromatografi kertas dimana pelarut bergerak 15,2 cm?

3. Apa yang terjadi jika Anda tidak menggunakan sarung tangan dan jari anda

terkena semprotan ninhidrin ?

4. Apa keuntungan dan kerugian metode pemisahan dengan kromatografi kertas?

5. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif?

6. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf ?

Jawaban :

1. Pengukuran harga Rf untuk tiap noda pada kromatografi kertas melalui rumus:

Sehingga,

a. Untuk eluen pertama (campuran 1-butanol : asam cuka glasial : aquadest

dengan perbandingan 18 mL : 4 mL : 18 mL) diperoleh data sebagai berikut :

Jarak alanin 2,2 cm

Jarak glisin 1,5 cm

Jarak treonin 2 cm

Jarak pelarut 5 cm

Maka dapat ditentukan harga Rf masing-masing noda adalah sebagai berikut :

Rf Alanin = Jarak NodaJarak Eluen

= 2,25

= 0,44

Rf Glisin = Jarak NodaJarak Eluen

= 1,55

= 0,3

Rf Alanin = Jarak NodaJarak Eluen

= 25 = 0,4

b. Untuk eluen kedua (campuran fenol : aquadest dengan perbandingan 30

mL : 10 mL) diperoleh data sebagai berikut :

Jarak alanin 4,5 cm

Jarak glisin 4,7 cm

Jarak treonin 5 cm

Jarak pelarut 5 cm

Maka dapat ditentukan harga Rf masing-masing noda adalah sebagai berikut :

Rf Alanin = Jarak NodaJarak Eluen

= 4,55

= 0,9

Rf Glisin = Jarak NodaJarak Eluen

= 4,75

= 0,94

Rf Treonin = Jarak NodaJarak Eluen

= 55 = 1

Berdasarkan hasil perhitungan harga Rf di atas dapat dibandingkan dengan harga

Rf asam-asam amino standar ternyata menunjukkan bahwa komponen-komponen

asam amino dalam larutan meliputi alanin, glisin, dan treonin. Hal ini juga

dibuktikan dengan hasil percobaan yang menghasilkan noda berwarna ungu

ketika disemprot dengan senyawa ninhidrin, dan tentunya kita ketahui bahwa

senyawa asam mino akan memberikan uji positif dengan senyawa ninhidrin yang

akan ditandai dengan terbentuknya warna ungu.

2. Jarak atau jauh asam amino itu bergerak pada plat kromatografi kertas dapat

ditentukan dengan perhitungan dibawah ini :

Jarak noda = Harga Ef x Jarak pelarut

= 0,45 x 15,2 cm

= 6,84 cm

Jadi, jauh asam amino tersebut akan bergerak pada plat kromatografi kertas adalah

dengan jarak 6,84 cm.

3. Apabila jari tangan kita terkena semprotan ninhidrin akan menyebbakan kulit kita

terasa kering.

4. Satu keuntungan utama kromatografi kertas ialah kemudahan dan

kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran

kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan dan penyangga. Untuk

kromatografi kertas preparatif diperlukan kertas yang lebih besar dari pada untuk

analisis. Keuntungan yaitu beban langan bilangan Rf yang besar sehingga

pengukuran Rf merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa

tumbuhan baru, kromatografi kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian

asam penyerapan. Sedangkan kerugian atau kelemahan dari metode pemisahan

dengan kromatografi kertas adalah tidak bisa melakukan analisis kuantitatif pada

komponen-komponen sampel hanya terbatas pada analisis kualitatif saja.

5. Dengan metode kromatografi kertas ini tidak dapat melakukan analisis yang

bersifat kuantittaif, tetapi hanya dapat digunakan untuk analisis kualitatif terhadap

suatu larutan yang berisi bermacam-macam komponen, misalnya seperti pada

percobaan ini yaitu analisi kualittaif terhadap suatu larutan yang berisi bermacam-

macam asam amino, dan hal ini semua ditandai dengan adanya warna ungu serta

dari harga Rf sampel yang diselidiki lalu dibandingkan dengan harga Rf

standarnya.

6. Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu :

a. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan

yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-

perubahan harga Rf.

b. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan

aliran.

c. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari

atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen

pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan

lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka

koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi

mempengaruhi harga Rf.

d. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan

serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi

kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.

e. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-

volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu

mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga

terhadap harga Rf mereka.

LAMPIRAN II

Gambar Hasil Praktikum

A. Eluen 1

Gambar 1. Penjenuhan Gambar 2. Pengeringan

Gambar 3. Penyemprotan dengan ninhidrin

Gambar 4. Kromatografi kertas eluen 1

B. Eluen 2

Gambar 5. Eluen 2 Gambar 6. Penyemprotan

dengan ninhidrin

Gambar 7. Kertas kromatografi eluen 2