PERCOBAAN III Biokimia Kromatografi
-
Upload
mahabbah-nyonyabriptumohtarhadi-arfamz -
Category
Documents
-
view
805 -
download
4
Transcript of PERCOBAAN III Biokimia Kromatografi
PERCOBAAN III
Judul : Kromatografi Kertas Pada Asam-Asam Amino
Tujuan : Untuk mempelajari pemisahan asam amino dengan cara kromatografi
kertas
Hari/tanggal : Rabu/ 23 Maret 2011
Tempat : Laboratorium Kimia FKIP UNLAM Banjarmasin
I. TEORI DASAR
Pada awalnya kromatografi dianggap semata-mata sebagai bentuk partisi cairan–
cairan. Serat selulosa yang hidrofilik dari kertas tersebut dapat mengikat air, setelah
disingkapkan ke udara yang lembab, kertas saring yang tampak kering itu sebenarnya
dapat mengandung air dengan persentase tinggi, katakan 20 % (bobot/bobot) akan
lebih. Jadi kertas itu sebenarnya dapat mengandung air dengan persentase tinggi dan
kertas itu dipandang sebagai analog dengan sebatang kolom yang berisi stasioner
berair. Zat-zat terlarut itu padahal fase geraknya dapat campur dengan air akan dalam
beberapa kasus, malahan fase geraknya adalah larutan itu sendiri.
Susunan serat kertas membentuk medium berpori yang bertindak sebagai
tempat untuk mengalirkannya fase bergerak. Berbagai macam tempat kertas secara
komersil tersedia adalah Whatman 1, 2, 31 dan 3 MM. Kertas asam asetil, kertas
kieselguhr, kertas silikon dan kertas penukar ion juga digunakan. Kertas asam asetil
dapat digunakan untuk zat–zat hidrofobik.
Selain kertas Whatman dalam teknik kromatografi dapat pula digunakan kertas
selulosa murni. Kertas selulosa yang dimodifikasi dan kertas serat kaca. Untuk
memilih kertas, yang menjadi pertimbangan adalah tingkat dan kesempurnaan
pemisahan, difusivitas pembentukan spot, efek tailing, pembentukan komet serta laju
pergerakan pelarut terutama untuk teknik descending dan juga kertas seharusnya
penolak air. Seringkali nilai Rf berbeda dari satu kertas ke kertas lainnya. Pengotor
yang terdapat pada kertas saring adalah ion-ion Ca2+, Mg2+, Fe3+, Cu2+.
Dalam kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase yaitu
fase gerak dan fase diam. Transfer massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi
bila molekul-molekul campuran serap pada permukaan partikel-partikel atau terserap.
Pada kromatografi kertas naik, kertasnya digantungkan dari ujung atas lemari
sehingga tercelup di dalam solven di dasar dan solven merangkak ke atas kertas oleh
daya kapilaritas. Pada bentuk turun, kertas dipasang dengan erat dalam sebuah baki
solven di bagian atas lemari dan solven bergerak ke bawah oleh daya kapiler dibantu
dengan gaya gravitasi. Setelah bagian muka solven selesai bergerak hampir sepanjang
kertas, maka pita diambil, dikeringkan dan diteliti. Dalam suatu hal yang berhasil,
solut-solut dari campuran semula akan berpindah tempat sepanjang kertas dengan
kecepatan yang berbeda, untuk membentuk sederet noda-noda yang terpisah. Apabila
senyawa berwarna, tentu saja noda-nodanya dapat terlihat.
Harga Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona realtif terhadap garis depan
pengembang. Kromatogram yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona dicirikan oleh
nilai-nilai Rf. Nilai Rf didefinisikan oleh hubungan:
Rf =Jarak (cm) dari garis awal ke pusat zona
Jarak (cm) dari garis awal ke garis depan pelarut
Pengukuran itu dilakukan dengan mengukur jarak dari titik pemberangkatan
(pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan pusat rapatan tiap zona.
Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Nilai Rf akan
menunjukkan identitas suatu zat yang dicari, contohnya asam amino dan intensitas
zona itu dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi dengan membandingkan dengan
noda-noda standar.
Proses pengeluaran asam mineral dari kertas desalting. Larutan ditempatkan
pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2–3 cm dari salah satu ujung
kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, ia diletakan
didalam ruangan yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai.
Terdapat tiga tehnik pelaksanaan analisis. Pada tehnik ascending; pelarut bergerak
keatas dengan gaya kapiler. Sedangkan ketiga dikenal dengan cara radial atau
kromatografi kertas sirkuler.
Kromatografi bergantung pada pembagian ulang molekul-molekul campuran
antara dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi absorpsi, kromatografi partisi
cairan dan pertukaran ion. Sistem utama yang digunakan dalam kromatografi partisi
adalah partisi gas, partisi cairan yang menggunakan alas tak bergerak (misalnya
komatografi kolom), kromatografi kertas dan lapisan tipis.
Distribusi dapat terjadi antara fase cair yang terserap secara stasioner dan zat
alir bergerak yang kontak secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi
partisi cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang
diserapkan pada suatu pendukung, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis
adsorbennya disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran plastik.
Kromatografi kertas adalah salah satu cara analisa yang ampuh dan sering
digunakan dalam penelitian komponen-komponen suatu campuran. Dengan
membandingkan pemindahan zat diselidiki dengan pemindahan zat-zat standar yang
diketahui, seringkali kita dapat mengetahui zat yang kita selidiki. Dalam eksperimen
ini, kita hendak menganalisa secara kualitatif suatu larutan yang berisi bermacam-
macam asam amino.
Kromatografi kertas dapat dilakukan dengan satu dimensi atau dua dimensi.
Apabila macam komponen tidak terlalu banyak maka biasanya cara satu dimensi
cukup memuaskan. Tetapi, jika hasilnya meragukan dan ini biasanya disebabkan
karena macam komponennya terlalu banyak, maka cara 2 dimensi seringkali
diperlukan. Untuk ini diperlukan 2 macam larutan eluen, yang satu diperlukan untuk
ke satu arah dan yang kedua untuk ke arah lain yang tegak lurus pada satu elusi
pertama, Setelah kertas kromatografinya kering. Umumnya kertas kromatografi yang
berukuran 35 x 35 cm adalah yang memenuhi syarat.
Pada percobaan ini penyemprotan dengan larutan ninhidrin dilakukan untuk
pewarnaan noda-noda asam amino pada kertas kromatografi yang telah kering.
Asam-asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk
yang disebut ungu Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan sebagai uji bercak untuk
mendeteksi adanya asam amino pada kertas kromatografi.
Adapun reaksi umum secara keseluruhannya, adalah sebagai berikut :
Asam amino larut dalam air dan pelarut polar lainnya, tetapi tidak larut dalam
pelarut organik non polar, seperti dietil eter atau benzena.
Alanin. Semua asam amino, kecuali glisin dapat dianggap sebagai derivat
alanin. Alanin diperoleh untuk pertama kalinya oleh Weyl dari hasil hidrolisis fibroin,
yaitu protein yang terdapat pada sutera.
Struktur alanin :
Treonin adalah homolog yang lebih besar dari erin dan termasuk dalam
golongan asam amino esensial. Mula-mula treonin diisolasi dari hasil hidrolisis fibrin
darah.
Struktur treonin :
ninhidrin
+
+ RCHO + CO2 + 3H2O + H+
anion ungu
Glisin adalah asam amino yang paling sederhana dan terdapat pada
skleroprotein. Pada tahun 1820 Braconnot menemukan glisin dari hasil hidrolisis
gelatin.
Struktur glisin :
II. ALAT DAN BAHAN
Alat-alat yang digunakan :
1. Gelas ukur 10 mL 1 buah
2. Gelas ukur 25 mL 1 buah
3. Pipet 1 buah
4. Chamber 1 buah
5. Corong pisah 2 buah
6. Pipa kapiler 3 buah
7. Statif dan klem 2 buah
Bahan-bahan yang digunakan adalah :
1. 1-butanol
2. Asam sulfat glasial
3. Akuades
4. Asam amino (glisin, alanin, treonin)
5. Etanol
6. Ninhidrin 0.25%
7. Fenol
8. Kertas kromatografi
III. PROSEDUR KERJA
1. Menyiapkan kertas kromatografi ukuran 8 x 5 cm.
2. Menotolkan asam amino (alanin, glisin, treonin) pada kertas kromatografi.
3. Mengeringkan kertas kromatografi yang telah ditotolkan asam amino.
4. Membuat eluen 1 (1- butanol : asam cuka glasial : akuades dengan
perbandingan 18:4:18), menempatkan ke dalam corong pisah, dan
mendiamkan.
5. Memasukkan pelarut (eluen 1) ke dalam chamber.
6. Mengulangi prosedur keempat untuk membuat eluen kedua yaitu 30 mL
fenol : 10 mL akuades.
7. Mencelupkan kertas kromatografi yang telah ditotol ke dalam masing-
masing eluen.
8. Setelah eluen mencapai batas yang telah ditentukan, mengeluarkan kertas
kromagrafi dari chamber dan mengeringkannya menggunakan hair dryer.
9. Menyemprotkan larutan ninhidrin pada kertas kromatografi yang telah
kering.
10. Mengeringkan kembali dengan menggunakan hair dryer, maka noda-noda
asam amino yang berwarna akan terlihat.
11. Mengukur masing-masing Rf dari asam amino.
IV. HASIL PENGAMATAN
No. Variabel yang diamati Hasil pengamatan
A1. Membuat eluen 2 (30 mL fenol :
10mL akuades) Mengocok Menempatkan eluen dalam corong
pisah Mendiamkan
Larutan berwarna orange
Terbentuk lapisan namun lapisan tetap berwarna orange
2. Menjenuhkan chamber dengan cara Chamber jenuh, eluen lama
memasukkan kertas saring kedalam chamber yang telah berisi eluen
kelamaan terserap oleh kertas saring
3. Mentotolkan sampel asam amino pada kertas kromatogradi ukuran 8x5 cm
Mengeringkan Totolan asam amino kering
4. Memasukkan kertas kromatografi kedalam eluen 2
Eluen diserap kertas kromatografi sampai batas
5. Mengeringkan dengan hair dryer Kertas kromatografi kering6. Menyemprot kertas kromatografi dengan
larutan ninhidrin 0.25%Kertas Kromatografi basah oleh larutan ninhidrin
7. Mengeringkan kembali dengan hair dryer Alanin
Treonin Glisin
Kertas kromatografi kering dan terdapat bercak pada kertas Terbentuk warna ungu-
orange Terbentuk warna ungu Terbentuk warna ungu-pink
8. Mengukur panjang noda alanin treonin glisin
Panjang noda: 3.8 cm 3 cm 2.3 cm
B1. Membuat eluen 1(18 mL butanol : 4
mL asam cuka glasial : 18mL air) Mengocok campuran Menempatkan eluen dalam corong
pisah Mendiamkan
Larutan berwarna keruh
Terbentuk 2 lapisan,lapisan atas keruh dan lapisan bawah bening
2. Menjenuhkan chamber dengan cara memasukkan kertas saring kedalam chamber yang telah berisi eluen
Chamber jenuh, eluen lama kelamaan terserap oleh kertas saring
3. Mentotolkan sampel asam amino pada kertas kromatogradi ukuran 8x5 cm
Mengeringkan Totolan asam amino kering
4. Memasukkan kertas kromatografi kedalam eluen 2
Eluen diserap kertas kromatografi sampai batas
5. Mengeringkan dengan hair dryer Kertas kromatografi kering
6. Menyemprot kertas kromatografi dengan larutan ninhidrin 0.25%
Kertas Kromatografi basah oleh larutan ninhidrin
7. Mengeringkan kembali dengan hair dryer Alanin
Treonin
Glisin
Kertas kromatografi kering dan terdapat bercak pada kertas Terbentuk warna ungu-
orange Terbentuk warna ungu-
orange Terbentuk warna ungu-pink
8. Mengukur panjang noda alanin treonin glisin
Panjang noda: 2.2 cm 1.5 cm 2 cm
V. ANALISIS DATA
Percobaan ini menggunakan metode pemisahan asam amino dengan cara
kromatografi kertas. Kromatografi kertas merupakan pemisahan berdasarkan sistem
partisi, dimana fase diam dan fase geraknya berupa cairan pelarut (eluen), dimana
pelarut yang digunakan merupakan campuran beberapa cairan. Dalam percobaan
digunakan dua macam eluen yakni eluen pertama berupa n-butanol : asam cuka
glasial : aquadest dengan perbandingan 18 mL : 4 mL : 18 mL, sedangkan eluen
kedua adalah campuran dari fenol dan air dengan perbandingan 3 : 1. Kromatografi
kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian atau penyerapan. Pada
kromatografi pembagian, senyawa terbagi dalam pelarut alkohol yang sebagian besar
tidak bercampur dengan air (mialnya n-butanol) dan dalam air. Tujuan digunakannya
pelarut campuran n-butanol : asam asetat : air adalah untuk meningkatkan kadar air
lapisan n-butanol dan dengan demikian memperbaiki manfaat campuran pelarut
tersebut.
Percobaan ini diawali dengan membuat eluen pertama yang terdiri atas n-butanol,
asam asetat dan air. Ketika larutan dicampurkan, terbentuk dua lapisan. Hal ini terjadi
karena n-butanol bersifat non polar sedangkan asam asetat dan air bersifat polar, jadi
asam asetat dan air akan saling bercampur, sedangkan n-butanol dan dua pelarut lain
akan tidak saling campur. Kemudian campuran tadi dkocok dan dipisahkan dalam
corong pisah. Setelah mendiamkan beberapa saat larutan terpisah menjadi dua dengan
lapisan atas keruh dan lapisan bawah bening. Eluen kemudian dimasukkan ke dalam
chamber dan ditutup sampai jenuh, tujuannya yaitu untuk menjenuhkan chamber
dengan uap pelarut sehingga mempercepat pemisahan. Begitu pula dengan eluen
kedua yang terdiri atas fenol bersifat non polar dan air bersifat polar. Eluen kedua
yang dihasilkan berwarna orange dan mengalami sedikit perubahan pada saat
didiamkan beberapa saat. Eluen atas berwarna orange tua dan lapisan bawah
berwarna orange muda.
Sampel asam amino yang akan digunakan dalam percobaan adalah alanin, treonin
dan glisin. Setelah itu, masing-masing sampel asam amino ditotolkan pada kertas
kromatografi (kertas Whafman) dengan menggunakan pipa kapiler, kemudian
dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhi oleh uap eluen. Kemudian botol
reagent ditutup rapat agar terjadi pemisahan yang sempurna. Pemisahan asam amino
dengan cara kromatografi kertas disebabkan adanya perbedaan koefisien partisi antara
air dan pelarut organik. Fase air akan tertahan dengan kuat di pori-pori kertas karena
adanya interaksi yang kuat antara air dengan gugus hidroksil dari selulosa, dimana
gugus ini bersifat hidrofilik. Perbedaan koefisien partisi menunjukkan perbedaan laju
rambatan pada permukaan kertas dari air dan pelarut organik yang merambat secara
perlahan.
Pada saat kertas kromatografi ditotolkan sampel asam amino, maka akan terjadi
pemisahan, dimana pelarut organik merambat ke atas melalui kapiler kertas
mengangkut campuran asam amino yang ada ditotolkan pada kertas kromatografi.
Asam amino yang paling larut di dalam pelarut organik, akan diangkut paling cepat
dan asam amino yang paling kurang larut akan tertinggal paling bawah. Jadi, karena
pelarut yang digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air dan fenol : air bersifat
nonpolar, maka dari ketiga sampel asam amino yang digunakan (alanin, treonin,
glisin), dapat dilihat sifat kepolarannya. Sampel yang paling atas merupakan sampel
yang paling larut dalam pelarut yang artinya bersifat paling non polar dibandingkan
sampel asam amino lainnya. Setelah sampel mencapai batas yang telah ditentukan,
mengeluarkan sampel dari eluen dan mengeringkan menggunakan hair dryer.
Kemudian menyemprotkan larutan ninhidrin pada kertas kromatografi tadi. Asam
amino merupakan jenis zat tidak berwarna, sehingga untuk mengetahui letak noda
diperlukan pereaksi lokasi. Dalam percobaan ini digunakan larutan ninhidrin yang
disemprotkan pada kertas kromatografi setelah dikeringkan, sehingga noda-noda pada
kertas kromatografi dapat terlihat yakni noda yang berwarna ungu ketika kertas
kromatografi dikeringkan lagi dengan menggunakan hair dryer. Terbentuknya noda
berwarna ungu ini disebabkan karena terjadinya reaksi antara hidrat dari triketon
siklik (ninhidrin) dengan asam amino, adapun persamaan reaksi yang terjadi untuk
tiap sampel adalah :
Alanin
ninhidrin
+
+ CH3CHO + CO2 + 3H2O + H+
anion ungu
Reaksi alanin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :
Treonin
ninhidrin
+
+ CH3CHOHCHO + CO2 + 3H2O + H+
anion ungu
Reaksi treonin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :
Glisin
ninhidrin
+
+ HCHO + CO2 + 3H2O + H+
anion ungu
Reaksi glisin dengan ninhidrin secara terperinci ialah :
Noda-noda ini kemudian diukur dengan membandingkan jarak komponen yang
dipisahkan (analit) dengan jarak pergerakan pelarut, disimbolkan dengan Rf.
Rumusnya : Rf = jarak nodajarak eluen
Dari perhitungan diketahui bahwa masing-masing asam amino memiliki harga Rf
yang berbeda. Untuk eluen pertama yaitu alanin Rf = 0,44; threonin Rf = 0,4; dan
glisin Rf = 0,3. Sedangkan untuk eluen kedua, ialah harga Rf alanin = 0,76; Rf
treonin = 0,6; dan Rf glisin = 0,46. Perbedaan ini dipengaruhi oleh keterikatan analit
terhadap eluen. Karena eluen yang digunakan bersifat non polar maka senyawa yang
lebih non polar akan terikat lebih kuat pada eluen sehingga harga Rf akan semakin
besar. Berdasarkan literatur, harga Rf untuk alanin, treonin, dan glisin adalah 0,38;
0,35; 0,26. Harga Rf ini berbeda dengan hasil percobaan, karena kemungkinan
terdapat perbedaan komposisi eluen dan besarnya ukuran kertas kromatogarfi yang
digunakan.
Untuk eluen pertama, harga Rf masing-masing sampel asam amino
menunjukkan kecenderungan semakin besar dari glisin, treonin, dan alanin. Artinya
alanin lebih larut dalam eluen pertama, yaitu n-butanol yang bersifat non polar
sehingga dapat dikatakan bahwa alanin bersifat lebih non polar dibandingkan dengan
kedua sampel lainnya, tetapi karena harga Rf treonin lebih besar dibandingkan
dengan glisin, maka dapat dinyatakan bahwa sifat kepolaran treonin lebih rendah dari
pada glisin (glisin paling polar, sedangkan treonin kurang polar). Dalam hal ini asam
asetat dan air bersifat polar sehingga dapat larut bersama-sama dan berkumpul dalam
pori-pori kertas kromatografi sebagai fase diam, sedangkan 1-butanol bersifat non
polar yang akan melarutkan asam amino dan dapat diketahui pergerakannya dengan
harga Rf diatas, dengan begitu dapat diketahui sifat kepolaran dari masing-masing
asam amino tersebut.
Sedangkan untuk eluen kedua, harga Rf sampel asam amino dari yang paling
besar adalah alanin, treonin, dan glisin. Artinya glisin lebih polar dibandingkan
dengan treonin dan alanin, dimana alanin bersifat non polar. Hal ini sesuai dengan
literatur yaitu pada eluen kedua ini digunakan pelarut fenol yang bersifat non polar,
sehingga senyawa yang lebih larut urutannya adalah alanin terlebih dahulu lalu
treonin dan glisin karena dilihat dari strukturnya alanin bersifat lebih non polar
dibandingkan kedua asam amino lainnya, dan treonin bersifat lebih non polar
dibandingkan dengan asam amino glisin atau dapat dikatakan bahwa glisin
merupakan asam amino yang paling polar dibandingkan kedua sampel asam amino
yang digunakan. Terjadinya perbedaan sifat kepolaran ini dapat ditunjukkan oleh
harga Rf dan dari literatur. Pada eluen pertama ini akuades lebih tertarik pada kertas
kromatografi kertas yang bersifat hidrofilik, sehingga asam amino yang bersifat non
polar lebih larut bersama dengan pelarut 1-Butanol yang bersifat non polar juga, hal
ini dapat dilihat dari harga Rf alanin yang lenih besar dibandingkan dengan glisin dan
treonin.
Sifat kepolaran asam amino tersebut dapat dibuktikan dari struktur masing-
masing asam amino, berikut :
Alanin Treonin Glisin
Dari rumus struktur diatas, alanin mempunyai gugus R non polar, glisin dan
threonin mempunyai gugus R polar, tetapi gugus R pada glisin, yaitu suatu atom
hidrogen terlalu kecil untuk mempengaruhi derajat polaritas gugus α-amino dan α-
karboksil yang tinggi sehingga treonin lebih non polar dibandingkan dengan glisin.
Sehingga urutan kepolarannya dari yang paling polar adalah :
Glisin > Threonin > Alanin
VI. KESIMPULAN
1. Kromatografi kertas untuk pemisahan asam amino ini menggunakan kertas
whatmann yang berukuran 8 x 5 cm yang terbuat dari serat selulosa, dengan
eluen sebagai fase geraknya.
2. Dalam percobaan digunakan dua buah eluen yang merupakan campuran dari
beberapa pelarut yaitu untuk eluen pertama 1-butanol : asam cuka glasial :
aquadest dengan perbandingan 18 mL : 4 mL : 18 mL dan eluen ke dua fenol
: air dengan perbandingan 3 : 1.
3. Sampel asam amino yang akan dipisahkan adalah alanin, treonin dan glisin,
dan setelah dipisahkan dengan kromatografi kertas, lalu direaksikan dengan
larutan ninhidrin untuk mengetahui posisi asam amino pada kertas
kromatrografi setelah diangkut oleh eluen dengan ditandai terbentuknya
noda berwarna ungu.
4. Pengukuran harga Rf untuk tiap noda pada kromatografi kertas melalui
rumus: Rf = jarak nodajarak eluen
dan didapat harga Rf untuk masing-masing sampel
adalah untuk eluen pertama, Rf alanin = 0,44; Rf threonin = 0,4 dan Rf glisin
= 0,3; sedangkan untuk eluen kedua, harga Rf alanin = 0,76; Rf treonin = 0,6
dan Rf glisin = 0,46.
5. Dengan eluen organik yang bersifat non polar maka semakin besar harga Rf,
semakin bersifat non polar sampel asam amino tersebut. Jadi, urutan
kepolaran sampel asam amino dari yang paling polar adalah :
Glisin > Threonin > Alanin
VII. DAFTAR PUSTAKA
Anwar, Chairil, Bambang Purnowo, Harno Dwi Pranowo dan Tutik Dwi
Wahyuningsih. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Depdikbud:
Jakarta
Basset, J, et al. 1994. Buku Ajar Vogel; Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik.
Penerbit buku kedokteran EGC: Jakarta
Day & Underwood. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif. Edisi Keempat. Erlangga:
Jakarta
Fessenden dan Fessenden. 1994. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga. Erlangga:
Jakarta
Harborne, J. B. 1996. Metode Fitokimia. ITB: Bandung
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Penerbit Universitas Indonesia:
Jakarta
Poedjiadi, Anna dan F. M. Titin Supriyanti. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. UI-Press:
Jakarta
Matsjeh, Sabirin, Hardjono Sastrihamidjojo dan Respati Sastrosajdono. 1996. Kimia
Organik II. Depdikbud: Jakarta
Syahmani dan Sudarsih .2010. Penuntun Praktikum Biokimia. FKIP UNLAM,
Banjarmasin
Svehla, G. 1979. Vogel Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semi
Mikro Jilid 1 Edisi Kelima. PT. Kalman Media Pustaka: Jakarta
LAMPIRAN I
Perhitungan :
Eluen 1 :
Rf Alanin= nodapanjangeluen
=2,25
=0,44
Rf Glisin= nodapanjang eluen
=1,55
=0,3
Rf Treonin= nodapanjang eluen
=25=0,4
Eluen 2 :
Rf Alanin= nodapanjangeluen
=4,55
=0,9
Rf Glisin= nodapanjang eluen
=4,75
=0,94
Rf Treonin= nodapanjang eluen
=55=1
Tugas :
1. Hitung harga Rf tiap-tiap noda dan catat warnanya. Kemudian tetapkan
komponen asam-asam amino dalam larutan yang diselidiki dengan
membandingkan Rf-nya dengan Rf asam-asam amino standar.
2. Jika suatu asam amino memiliki harga Rf 0,45, seberapa jauh asam amino itu
akan bergerak pada plat kromatografi kertas dimana pelarut bergerak 15,2 cm?
3. Apa yang terjadi jika Anda tidak menggunakan sarung tangan dan jari anda
terkena semprotan ninhidrin ?
4. Apa keuntungan dan kerugian metode pemisahan dengan kromatografi kertas?
5. Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisa kuantitatif?
6. Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf ?
Jawaban :
1. Pengukuran harga Rf untuk tiap noda pada kromatografi kertas melalui rumus:
Sehingga,
a. Untuk eluen pertama (campuran 1-butanol : asam cuka glasial : aquadest
dengan perbandingan 18 mL : 4 mL : 18 mL) diperoleh data sebagai berikut :
Jarak alanin 2,2 cm
Jarak glisin 1,5 cm
Jarak treonin 2 cm
Jarak pelarut 5 cm
Maka dapat ditentukan harga Rf masing-masing noda adalah sebagai berikut :
Rf Alanin = Jarak NodaJarak Eluen
= 2,25
= 0,44
Rf Glisin = Jarak NodaJarak Eluen
= 1,55
= 0,3
Rf Alanin = Jarak NodaJarak Eluen
= 25 = 0,4
b. Untuk eluen kedua (campuran fenol : aquadest dengan perbandingan 30
mL : 10 mL) diperoleh data sebagai berikut :
Jarak alanin 4,5 cm
Jarak glisin 4,7 cm
Jarak treonin 5 cm
Jarak pelarut 5 cm
Maka dapat ditentukan harga Rf masing-masing noda adalah sebagai berikut :
Rf Alanin = Jarak NodaJarak Eluen
= 4,55
= 0,9
Rf Glisin = Jarak NodaJarak Eluen
= 4,75
= 0,94
Rf Treonin = Jarak NodaJarak Eluen
= 55 = 1
Berdasarkan hasil perhitungan harga Rf di atas dapat dibandingkan dengan harga
Rf asam-asam amino standar ternyata menunjukkan bahwa komponen-komponen
asam amino dalam larutan meliputi alanin, glisin, dan treonin. Hal ini juga
dibuktikan dengan hasil percobaan yang menghasilkan noda berwarna ungu
ketika disemprot dengan senyawa ninhidrin, dan tentunya kita ketahui bahwa
senyawa asam mino akan memberikan uji positif dengan senyawa ninhidrin yang
akan ditandai dengan terbentuknya warna ungu.
2. Jarak atau jauh asam amino itu bergerak pada plat kromatografi kertas dapat
ditentukan dengan perhitungan dibawah ini :
Jarak noda = Harga Ef x Jarak pelarut
= 0,45 x 15,2 cm
= 6,84 cm
Jadi, jauh asam amino tersebut akan bergerak pada plat kromatografi kertas adalah
dengan jarak 6,84 cm.
3. Apabila jari tangan kita terkena semprotan ninhidrin akan menyebbakan kulit kita
terasa kering.
4. Satu keuntungan utama kromatografi kertas ialah kemudahan dan
kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran
kertas saring yang berlaku sebagai medium pemisahan dan penyangga. Untuk
kromatografi kertas preparatif diperlukan kertas yang lebih besar dari pada untuk
analisis. Keuntungan yaitu beban langan bilangan Rf yang besar sehingga
pengukuran Rf merupakan parameter yang berharga dalam memaparkan senyawa
tumbuhan baru, kromatografi kertas biasanya melibatkan kromatografi pembagian
asam penyerapan. Sedangkan kerugian atau kelemahan dari metode pemisahan
dengan kromatografi kertas adalah tidak bisa melakukan analisis kuantitatif pada
komponen-komponen sampel hanya terbatas pada analisis kualitatif saja.
5. Dengan metode kromatografi kertas ini tidak dapat melakukan analisis yang
bersifat kuantittaif, tetapi hanya dapat digunakan untuk analisis kualitatif terhadap
suatu larutan yang berisi bermacam-macam komponen, misalnya seperti pada
percobaan ini yaitu analisi kualittaif terhadap suatu larutan yang berisi bermacam-
macam asam amino, dan hal ini semua ditandai dengan adanya warna ungu serta
dari harga Rf sampel yang diselidiki lalu dibandingkan dengan harga Rf
standarnya.
6. Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu :
a. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan
yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-
perubahan harga Rf.
b. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan
aliran.
c. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari
atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen
pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan
lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka
koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi
mempengaruhi harga Rf.
d. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan
serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi
kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.
e. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-
volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu
mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga
terhadap harga Rf mereka.
LAMPIRAN II
Gambar Hasil Praktikum
A. Eluen 1
Gambar 1. Penjenuhan Gambar 2. Pengeringan
Gambar 3. Penyemprotan dengan ninhidrin
Gambar 4. Kromatografi kertas eluen 1
B. Eluen 2
Gambar 5. Eluen 2 Gambar 6. Penyemprotan
dengan ninhidrin
Gambar 7. Kertas kromatografi eluen 2