J/6 ISSN 0216 - 3128 Widyastut, dkk.

PERBANDINGAN METODA PENANDAAN 99mTc- PEPTIDA

MENGGUNAKAN DUA JENIS SENYAWA HYNIC SEBAGAILIGAND PENGHUBUNG

Widyastuti, Sri Aguswarini, Cecep Taufik, Anna Roseliana, Agus Ariyanto, Abdul MutalibPusat Radioisotop dan Radiofarmaka - BATAN

ABSTRAK

PERBANDINGAN METODA PENANDAAN 99mTc_PEPTIDA MENGGUNAKAN DUA JENIS

SENYAWA HYNIC SEBAGAI LIGAND PENGHUBUNG. Telah dilakukan penelitian terhadap 2 jenissenyawa HYNIC sebagai ligand penghubung pada penandaan 2 macam senyawa peptida yaitu BPTl danTOC dengan 99mTc.Penandaan peptida tersebut dengan 99mTcdilakukan dengan menggunakan 2 macammetoda konjugasi , dimana untuk BPTI digunakan NHS-HYNIC sedangkan untuk TOC digunakan BOC­

HYNIC, kemudian akan dibandingkan ejisiensi penandaan kedua hasil konjugasi ini serta stabilitas peptidabertandanya. Hasil konjugasi diidentifikasi dengan HPLC fasa balik dan kemurnian radiokimia dianalisa

dengan HPLC dan kromatograji lapis tipis/ kromatograji kertas. Vji biodistribusi dilakukan pada tikusnormal untuk melihat sifat farmakokinetika peptida bertanda tersebut. Dilakukan juga uji stabilitas in vitromenggunakan cystein challenge sebagai simulasi stabilitas di dalam tubuh. Hasil pengujian dengan HPLCmenunjukkan polaritas yang mirip antara kedua peptida yang belum dan yang sudah ditandai dengan99mTc. Kemurnian radiokimia 99mTc_HYNIC_BPTI dan 99mTc-HYNIC-TOC yang dianalisis dengankromatograji kertas/lapis tipis berturut-turut adalah 87.33 % dan 85.88 %. Hasil uji biodistribusimenunjukkan akumulasi tertinggi pada ginjal dan kandung kemih, dan cacahan pada organ dan jaringanlainnya relatifrendah. Ilasil uji stabilitas dalam cystein (cystein challenge) setelah satl/jam inkl/hasi I/ntukkedua sediaan tersebut tidak menunjl/kkan penl/runan kemurnian radiokimia yang herarti. Ilasil penelitianmenunjukkan bahwa penggunaan NHS-HYNIC maupun BOC-HYNIC demikian juga perbedaan metodakonjugasi tidak memberikan perbedaan yang berarti pada ejisiensi penandaan 99mTc_peptida, tetapimetoda konjugasi menggunakan BOC-HYN IC memerlukan waktu pengerjaan yang lama serta jenis reagen

yang lebih banyak. Kedua sediaan peptida tersebut mempunyai sifat farmakokinetika yang memenuhi syaratuntuk digunakan sebagai perunut.

Kata kunci : Peptida, 99mTc, ligan, penandaan

ABSTRACT

COMPARISON OF 99mTc_PEPTIDE LABELING METHOD USING TWO KINDS OF HYNIC LIGAND

AS LINKER. Experiment using 2 kinds of HYN IC in 99mTclabeling on 2 kinds of peptides .i.e BPTI andTOC has been carried out. Labeling of these peptides with 99mTc were carried out using differentconjugation methods and different kinds of HYNIC, for this purpose NHS-HYNIC was used for BPTl whileBOC-HYNIC was used for TOC, and then their labelling efficiency and stability were compared. Labelingefficiency was analysed using RP-HPLC and paper chromatography and thin layer chromatography (TLC),and biodistribution study to examine their pharmacokinetic behavior was done I hour after injection onnormal mice. HPLC results showed that all radiolabeled peptides have similar polarity as their unlabeledconjugates, and chromatography result (from both paper and TLC) showed that the labeling efficiency of99mTc - HYNIC-BPTI and 99mTc-HYNIC_TOC were 87.33% and 85.88% respectively. The cystein challengetest for 99mTc_HYNIC_BPTI and 99mTc_HYNIC_TOC after I hour did not give significant difference.Biodistribution study showed that all labeled peptides were accumulated mainly in kidney and bladder.Both NHS-HYNIC and BOC-HYNIC, as well as the different conjugation methods do not give significantdifference in labeling efficiency of99mTc-peptides, but conjugation method using BOC-HYNIC is more time

consuming and need more various reagents. It can be concluded that these peptide basedradio pharmaceuticals have a good prospects to be used as imaging agents.Keywords: Peptide, 99mTc, ligand, labeling

PENDAHULUAN

Peptida berukuran keeil yang dilabel dengan Te­99m atau radioisotop pemanear y lainnya telahdiketahui mempunyai potensi sebagai perunut

tumor dan beberapa penyakit lainnya dalamkedokteran nuklir. Peptida merupakan salah satusenyawa yang diandalkan dalam penelitianradiofarmaka dewasa ini, disebabkan oleh beberapa

Prosiding PPI - PDIPTN 2006Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN

Yogyakarta, 10 Juli 2006

Widyastut, dkk. ISSN 0216-3128 Il7

faktor antara lain mudah diperoleh dari hasilsintesa, afinitas yang tinggi terhadap reseptor padajaringan sasaran dan ukuran molekulnya kecilsehingga mudah diekskresi dari sistim peredarandarah (2,3).

Ketersediaan Tc-99m di rumah-sakit rumah­

sakit dalam bentuk generator Tc-99m membuatpara ilmuwan tertarik untuk dapat menandai peptidadengan Tc-99m, tetapi hasil yang diperoleh masihbelum memuaskan. Hal ini disebabkan oleh

tingginya aktivitas farmakologi dari beberapa jenispeptida yang digunakan. Oleh karena itu jumlahpeptida yang digunakan harus sekecil mungkin,sehingga diperlukan efisiensi yang tinggi padaproses penandaan dan stabilitas kompleks yangtinggi pula. Untuk itu diperlukan suatu senyawapengkhelat yang dapat mengikat Tc-99m sekaligusmengikat peptida yang disebut "bifunctionalchelator" (BFC), dan salah satu senyawa BFC yangmemenuhi syarat untuk itu ialah HydrazinoNicotinamid (HYNIC) (I).

Penandaan peptida dengan Tc-99mmenggunakan HYNIC sebagai BFC berbedadengan pengkhelat lainnya, karena disini Tc-99mberikatan dengan gugus hydrazino membentukikatan Tc-N yang kurang stabil, sehinggadiperlukan suatu co-ligand untuk menstabilkanmolekul tersebut, dimana salah satunya adalahtrisin.

Dalam penelitian ini akan dikaji hasilpenandaan 2 macam peptida dengan Tc-99mmenggunakan HYNIC sebagai BFC dan trisinsebagai co-ligand melalui serangkaian pengujianantara lain kemurnian radiokimia, stabilitas in vitrodan biodistribusi (untuk melihat sifatfarmakokinetikanya).

Peptida yang akan digunakan dalampenelitian ini ialah Tyr3 -octreotide (TOC) danBPTI. TOC merupakan analog somatostatin yangtelah diketahui mempunyai afinitas yang tinggipada tumor, sedangkan BPTI merupakan peptidayang mirip (ukuran maupun sifat farmakokinetika)dengan HNE-2, dimana HNE-2 telah dibuktikanpada beberapa publikasi internasional mempunyaisifat dapat terlokalisasi secara spesifik padajaringan yang mengalami intlamasi/infeksi. Padapenelitian ini BPTI digunakan sebagai modelpengganti HNE-2, karena BPTI tersedia di pasaran.

BAHAN DAN TAT A KERJA

Bahan dan Peralatan

Bahan yang digunakan ialah NHS-HYNIC(Polatom, Poland), BPTI (Aprotinin, Sigma

A 1153), Tricine (Sigma), buffer NH4-asetat 0.25 MpH 5.2, buffer fosfat-salin (PBS) 0.5 M pH 7.2,N,N-Dimetil formamida anhidrat (DMF, Aldrich),SnC12.2H20 (Merck), Generator Tc-99m(BATEK), BOC-HYNIC (P2RR), BOC-TOC, 0­(7-azabenzotriazolil)-I, I ,3,3-tetrametiluroniumheksatlorofosfat (HA TU, Aldrich), N,N­Diisopropiletilamin (Aldrich), Tioanisol (Aldrich),asetonitril (Merck), Asam tritluoroasetat (Merck),air demin, air bidestilata steril (IPHA), larutan HCI0.0 I N, larutan NaOH I N, gas nitrogen, dan lainlain.

Alat alat yang digunakan ialah peralatangelas, misalnya vial 2 cc, 5 cc dan 10 cc, tabungmikro, tabung reaksi, dan lain lain, pipet eppendorfberbagai ukuran, syringe berbagai ukuran, kolomSephadex G-25 (PD-IO, Pharmacia), kolom SeppakC-18 (Waters), timbangan, pH-meter, kertasindikator pH, spektrofotometer UV dengan mikrokuvet, HPLC (Shimadzu) dengan kolom C 18,peralatan kromatografi kertas/lapis tipis, alatpencacah gamma (GiC & mini assay), dan lain lain.

Tata Kerja

a. Konjugasi

HYNIC-BPTI

0.2-1 mg larutan BPTI dicampurkan denganlarutan NHS-HYNIC (dalam DMF bebas air),jumlah molar NHS-HYNIC 3 atau 5 kali molarBPTl, dan volume DMF tidak lebih dari 10 %volume total campuran reaksi. Campuran reaksidiinkubasi pad a suhu ruangan selama 30-60men it, kemudian dimurnikan melalui kolomSephadex G-25 (PD- I0) dengan eluen bufferNH4-asetat 0.25 M pH 5.2. Kadar konjugatditentukan dengan spektrofotometer UV pada280 nm, dan konjugat dapat disimpan pada ­20DC bila tidak akan langsung digunakan.

HYNIC-TOC

1.3 mg BOC-HYNIC, 2 mg HATU dan 5 mgdiisopropiletiamin (DEA) dalam 300 J.llDMFkering direaksikan selama 30 menit pada suhuruangan. 60 J.l1dari larutan ini direaksikandengan I mg BOC- TOC (yang telah

dilarutkan dalam 20 J.l1DMF + 5 J.l1air) dandiinkubasi selama I jam. Perbandingan molarBOC-HYNIC dan HATU terhadap BOC-TOCkurang lebih 1.5 : I. Larutan reaksi ditambah5 ml air untuk menghentikan reaksi, kemudiandilewatkan ke dalam kolom SEPP AK C 18

yang telah dikondisikan, dibilas dengan 5 ml

Prosiding PPI • PDlPTN 2006Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN

Yogyakarta, 10 Juli 2006

/18 ISSN 0216 - 3128 Widyastut, dkk.

air dan dielusi dengan I ml asetonitril.

Larutan reaksi diuapkan dalam vakum hinggavolume 100 Ill, kemudian ditambahkan 10 IIItioanisol dan 300 III TFA dan diinkubasiselama 5 menit untuk menghilangkan gugusBOC (deproteksi) kemudian diuapkan hinggakering, dan dilarutkan dalam 100 Ill.etanol 50%. Konjugat HYNIC-TOC dianalisa denganHPLC fasa balik dengan eluen 0.1 % TF A/airdan asetonitril secara gradien. Konjugatdisimpan pada -20°C bila tidak akan langsungditandai.

b. Penandaan Tc99m-HYNIC-peptida

10 - 50 Ilg konjugat direaksikan denganlarutan trisin (100 mglml dalam air), 1-5 mCiTc99m dan 5-25 'Ill larutan SnC12.2H20 (Imgllml dalam HCI O.OIN bebas oksigen), dandiinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar.

c. Analisa

Konjugat bertanda diidentifikasi denganHPLC (dengan metoda yang sarna denganidentifikasi konjugat tidak bertanda) dan tiapmenit eluat ditampung dalam tabung reaksidan diukur radioaktifitasnya. Kemurnianradiokimia diuji dengan kromatografi kertasdengan eluen aseton untuk menentukan %Tc99m bebas dan kromatografi lapis tip isdengan eluen campuran ammonium asetat­metanol (I: I) untuk menentukan % Tc99mkoloid.

d. Uji stabilitas dalam cystein

100 III larutan peptida bertanda direaksikandengan larutan 0.1 M cystein (dalam PBS pH7.2), perbandingan molar peptida terhadapcystein dibuat I : 1000, diinkubasi pada suhu37°C selama 0 jam, I jam dan 24 jam,kemudian dianalisa dengan kromatografi lapistipis (KL T) dengan eluen metil etil keton(MEK) untuk menentukan % Tc bebas(Rf=I), dan eluen PBS pH 7.2 untukmenentukan % Tc-peptida (Rf=O). Sebagai

kontrol dilakukan pengerjaan yang sarna tetapitanpa menambahkan cystein.

e. Uji biodistribusi

Uji biodistribusi dilakukan denganmenyuntikkan 0.2 ml (50 -150 IlCi) peptidabertanda pada mencil. Setelah I jam hewandikorbankan dan organ organ tennasuksampel darah dan tulang dicacahradioaktifitasnya.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil pengujian dengan HPLC untuk keduapeptida memberikan waktu retensi yang sarna yaitu15-16 men it, sedangkan masing masingkonjugatnya memberikan waktu retensi pad a 17men it, baik untuk konjugat bertanda maupun tidakbertanda.

Hasil pengujian dengan KLT/ kromatografikertas untuk Tc99m-HYNIC-TOC dan Tc99m­HYNIC-BPTI berturut-turut ialah 85.88 % dan87.33 %.

Hasil pengujian dengan cystein (cysteinchallenge) setelah I jam untuk kedua jenis peptidabertanda tidak menunjukkan penurunan % yangberarti, hal ini menunjukkan kedua senyawa iniakan stabil di dalam tubuh setelah I jam.Pengamatan lebih dari I jam belum sempatdilakukan.

Hasil uji biodistribusi untuk kedua pcptidabertanda menunjukkan radioaktifitas yang tinggipada ginjal dan kandung kemih, dan relatif rendahpada organ organ lain, sedangkan adanyaradioaktifitas pad a lambung menunjukkan %Tc99m bebas yang masih cukup tinggi. Tingginyaperbandingan % radioaktifitas pad a sistim ekskresi(ginjal dan kandung kemih) terhadap organ organlain menunjukkan sifat fannakokinetika yangdiharapkan dari sediaan penatah tumor atau infeksi,sehingga apabila terdapat tumor atau infeksi didalam tubuh diharapkan akan diperoleh gambarangamma kamera yang cukup jelas.

DATA HASIL PENGAMATAN

Tabel1.Data kemurnian radiokimia

% Tc bebas

% Tc koloid

% Tc-Hynic-peptidaPeptida bertandaNH4Ac/MeOH

MEK, Rf=1 Rf=Operhitungan

Tc99m-HYNIC- TOC

9.764.3685.88Tc99m-HYNIC-BPTI

5.647.087.33

Prosiding PPI - PDIPTN 2006Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN

Yogyakarta, 10 Juli 2006

Widyastut, dkk. ISSN 0216 - 3128

Tabel 2. Uji Stabilitas dalam cystein

JJ9

Waktu pengamatan% Tc-HYNIC-TOC

% Tc-HYNIC-BPTI(jam)

0

85.8887.33I

84.2385.91

70c"~ 60E 50~::' 40"Q,

c 30".c~ 20"••

10

orgen

Gambar /. Uji biodistribusi 99mTc_HYNIC_BPTI dan 99mTc_HYNIC_TOC

90000

80000

70000(IJ

~ 60000=-

~ 5000011:1

.S! 40000'C

~ 30000#-

20000

10000

oo..- M <D..- ..-

0)..-

CDNmenit

Gambar 2. Kromatogram HPLC 99mTc-H YNIC-BPTI

70000

E 60000Q,••i 50000~i 40000"'6

~ 3QOO):J<

.! 20000"••:: 10000

o

3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

no. frek".

Gambar 3. Kromatogram HPLC Tc99m-HYNIC-TOC

Prosiding PPI - PDlPTN 2006Pustek Akselerator dan Proses Bahan· BATAN

Yogyakarta. 10 Juli 2006

/20!!!!!!!!!!

ISSN 0216 - 3128 Widyastut, dkk.

KESIMPULAN DAN SARAN

Hasil pengujian yang telah dilakukanterhadap kedua jenis HYNIC-peptida baik yangmenggunakan NHS-HYNIC maupun BOC-HYNICmemberikan hasil yang tidak jauh berbeda tetapimetoda yang menggunakan BOC-HYNICmemerlukan waktu pengerjaan yang lebih lama danrumit serta memerlukan lebih banyak jenis reagen.Sejauh ini stabilitas in vitro untuk kedua sediaanpeptida bertanda tidak menunjukkan perbedaanyang berarti, tetapi masih perlu dilakukanpengamatan pada interval waktu yang lebih panjanguntuk memperkuat kesimpulan ini. Dan untukmembuktikan lebih jauh keunggulan metoda yangsatu terhadap metoda yang lainnya perlu dilakukanjuga uji stabilitas masing masing konjugat terhadapwaktu penyimpanan.

Uji biodistribusi pada hewan normal yangtelah dilakukan hanya untuk mengetahuifarmakokinetika dari kedua sediaan peptidabertanda, dan dapat disimpulkan bahwa kedua jenissediaan ini dapat digunakan untuk penatah kelainanorgan (kecuali kelainan ginjal dan kandung kemih).Untuk membuktikan bahwa sediaan ini dapatdigunakan untuk menatah tumor perlu dibuktikanlebih lanjut melalui uji biodistribusi pad a hewanyang menderita tumor.

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwaHYNIC dapat digunakan sebagai ligandpenghubung ('linker') antara Tc99m dan peptida,dan dapat dipilih peptida lain yang sesuai dengantujuan pemakaian, misalnya HNE2 untuk penatahinflamasi atau ubiquicidin (UBI I) untuk penatahinfeksi.

DAFTAR PUSTAKA

I. I. VIRGOLlNI, T. TRAUB, C. NOVOTNY, etai, "New trends in peptide' receptorradioligands", QJ.Nucl.Med 2001; 45: 153-9

2. T.M. BEHR, M. GOTTHARDT, A. BARTH,et aI, "Imaging tumors with peptide-basedradioligands", QJ Nucl Med 200 I ;45: 189-200

3. CLEMENS DECRISTOFORO and STEPHEN

J. MATHER, "Preparation, 99mTc-Labeling,and in vitro Characterization of HYNIC and

N3S Modified RC-160 and [Tyr3]Octreotide",Bioconjugate Chern., Vol. 10, No.3, 1999.

4. ERNEST KJ. PAUWELS, V. RALPHMCCREADY, JAN H.M.B. STOaT, et ai,"The mechanism of accumulation of tumour­

localising radiopharmaceuticals", Eur J NuclMed (1998) 25:277-305

5. CLEMENS DECRISTOFORO, STEPHEN J.

MATHER, "Technetium-99m somatostatin

analogues: effect of _abelling methods andpeptide sequence", Eur J Nucl Med (1999)26:869-876

6. MARY RUSCKOWSKI, TONG QU, JAMESPULLMAN, et aI, "Inflammation and InfectionImaging with a 99mTc-Neutrophil ElastaseInhibitor in Monkeys", J Nucl Med, Vol. 41,No.2, Feb. 2000, 363-374

7. CHARLES B. SAMPSON, Textbook ofRadiopharmacv: Theorv and Practice, ThirdEdition, Gordon and Breach SciencePublishers.

TANYAJAWAB

TumpaI Pandiangan

o Bagaimana cara membandingkannya danmana yang terbaik untuk diimplementasikan ?

Widyastuti

o Kedua metode dibandingkan efisiensipelabelannya, stabilitas in-vitro (dalam serumdan fosfat buffer salin) dan efektivitasnyasebagai pencitra tumor, serta kepraktisandalam proses pengerjaan. Yang terbaik adalahmetoda menggunakan NHS-Hynic karena lebihpraktis dan efisien, sedangkan parameterlainnya yang dibandingkan tidak memberikanperbedaan yang berarti.

Gina Mondrida

o Kenapa uji biodistribusi dilakukan pad a tikusyang sehat, bukan pada tikus yang menderitatumor?

o Uji stabilitas in-vivo kenapa tidak dilakukan ?

Widyastuti

Vii biodistribusi pada tikus sehat dimak.sudkanuntuk melihat sifat farmakokinetik sediaan Tc99m­peptida. yang mana apabila sebagian besarterakumulasi pada saluran kemih dan ginial danhanya sebagian kecil yang terakumulasi padaorgan lain. hal ini menunjuk.kan sifatfarmakokinetik yang baik/sesuai dengan kegunaansebagai penatah tumor. Vii biodistribusi padatikus yang sakit (menderita tumor) seharusnyadilakukan tetapi fasilitas laboratorium untukmenginduksi tumor be/um tersedia.Karena liiistabililas in-vitro yang dilakukan dalam serummanusia segar dan dapar fosfat-salin sudahmewakili kondisi in-vivo.

Prosiding PPI - PDIPTN 2006Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN

Yogyakarta, 10 Jull 2006