Beberapa Hal Praktis dalam Percobaan Biokimia

Pembuatan Larutan

Pada umumnya percobaan biokimia dilakukan pada media cair (berbentuk larutan). Beberapa larutan harus dibuat dengan ketelitian tinggi, tetapi ada sebagian yang tidak. Seringkali kali digunakan larutan dengan konsentrasi rendah, misalnya 10-6 M (M). Larutan ini biasanya dibuat dengan mengencaerkan larutan yang agak pekat, misalnya 10-3 atau lebih rendah diencerkan 100 1000 kali. Pertama-tama yang harus diperhatikan adalah jumlah kebutuhannya sehingga tidak banyak sisa di akhir percobaan, terutama untuk senyawa biokimia. Bahan kimia yang digunakan harganya mahal dan harus digunakan dalam keadaan segar.

Beberapa perlakuan tertentu seringkali diperlukan untuk melarutkan suatu senyawa seperti pengadukan, pemanasan dan atau penambahan asam maupun basa encer. Misalnya, untuk melarutakn casein kadang-kadang diperlukan sedikit pemanasan.

Pengenceran

Pengenceran hendaknya dilakukan menurut metode yang benar, karena hal ini sangat menentukan perhitungan hasil akhirnya. Persamaan yang dapat digunakan adalah:

V1C1 = V2C2

Cn = konsentrasi larutan (n = 1,2)

Vn = volume larutan pada masing-masing konsentrasi, biasanya dalam ml (n = 1,2).

Contoh: Akan dibuat larutan 2 mg/ml protein yang berasal dari 15 mg/ml protein. Pertama-tama yang ditetapkan adalah volume total larutan protein 2 mg/ml yang diinginkan, misalnya 10 ml. Maka larutan protein 15 mg/ml yang harus di ambil x ml serta ditambahkan (10-x) ml buffer atau air yang destilate dengan perhitungan sebagai berikut:

V1 (15) = 10 (2)

V1 = 20/15 = 1,67 ml

Pembuatan buffer

Buffer adalah suatu larutan dengan komposisi sedemikian rupa sehingga tahan terhadap perubahan pH. Cairan di dalam setiap sel makhluk hidup mempunyai kapasitas buffer tertentu. Perubahan pH sedikit saja, dapat mengubah aktivitas enzim-enzim metabolism dan akhirnya bias berakibat fatal bagi sel, sampai mematikan sel hidup yang merupakan mesin enzimatis.

Percobaan biokimia tertutama yang berhubungan dengan kagiatan isolasi maupun ekstraksi organ atau komponen sel, harus dilakukan dalam system buffer. Komponen buffer tertentu dapat dilihat sebagai berikut:

Buffer asetat 0,2 M

Bahan: 0,2 M asam asetat; 0,2 M Natrium asetat.

Cara:Campurkan x ml 0,2 M asam asetat dan (100-x) ml 0,2 ml Natrium asetat, sehingga volume total menjadi 100 ml.

x ml92888376665543322217

pH3,63,84,04,24,44,64,85,05,25,4

Buffer karbonat 0,1 M

Bahan: 0,1 M Na HCO3; 0,1 M Na2CO3.

Cara:Campurkan x ml 0,1 M Na HCO3 dan (100-x) ml 0,2 ml Na2CO3, sehingga volume total menjadi 100 ml.

x ml938882736149382718105,5

pH9,09,29,49,69,81010,210,410,610,811,0

Buffer sitrat 0,05 M

Bahan: 0,05 M asam sitrat dan 0.05 M Na sitrat

Cara: Campurkan x ml 0,05 M asam sitrat dan (100-x) 0,05 M Na sitrat sehingga volume total menjadi 100 ml

x ml9186807570656055504439

pH3,03,23,43,63,84,0 4,24,44,64,85,0

x ml3429241914

pH5,25,45,65,86,0

Buffer fosfat 0,2 M

Bahan: 0,1 M NaOH dam 50 ml 0,2 M NaH2PO4.

Cara:Campurkan x ml 0,20 M NaOH, 50 ml NaH2PO4 dan (50-x) ml air, sehingga volume total menjadi 100 ml.

x ml3.55,89,11318243035404345

pH5,86,06,26,46,66,8 7,07,27,47,67,8

x ml47

pH8,0

ANALISA KUALITATIF DAN KUANTITATIF DENGAN SPEKTROFOTOMETER

Pendahuluan

Pada percobaan ini akan dipelajari mengenai analisis senyawa kimia secara kualitatif dan kuantitatif. Pertama-tama dipelajari tentang absorpsi senyawa organik CuSO4 dan senyawa organik NAD (Nikotinamida Adenin Dinukleotida). NAD merupakan ko-faktor (ko- enzim) utama reaksi-reaksi biokimia. Hampir setiap reaksi oksidasi biokimia diikuti dengan perubahan NAD NADH, disamping itu juga perubahan FAD FADH2. NAD memiliki spektra absorpsi yang khas dan berubah jika menerima atom hidrogen menjadi NADH.

Pada bagian kedua protein dianalisa kuatitatif larutan protein yang tidak berbwarna dapat dibuat berwarna dengan mereaksikannya dengan pereaksi burret (Cu dalam suasana basa). Pengukuran jumlah protein (biasanya dalam satuan mg) selalu diperlukan dalam percobaan enzimatik secara internasional, aktivitas enzim selalu dinyatakan dalam suatu unit tertentu bagi setiap mg protein atau enzim. Pada bagian ini akan dibuat pula kurva baku dengan mempergunakan protein murni, biasanya dipakai larutan bivine serum albumin.

Pada bagian lain akan diukur fosfat dengan metode fi shesubarow yang dimodofikasi. Peristiwa sel metabolisme sel selalu melibatkan konsumsi atau pelepasan fosfat organik, misalnya perubahan glukosa menjadi 1 glukosa-P atau ATP menjadi ADP. Reaksi-reaksi ini dapat diukur dengan memantau jumlah fosfat anorganik yang berkurang karena diikat oleh molekul lain atau jumlah fosfat anorganik yang dilepaskan dari suatu molekul tertentu. Untuk membuat kurva baku digunakan ion fosfat (KH2PO4).

Bahan dan alat

Bahan kimia yang digunakan adalah CuSO4; K atau Na tartarat (garam Rochell); NaOH; KH2PO4; H2SO4; (NH4)6MO7O24.4H2O (garam molibdat); p-metil aminofenol (elon); sedang bahan dasar yang digunakan adalah NAD pada 10-3 M dan biovine serum albumin sebagai protein baku 10 mg/ml.

Peralatan yang dipakai adalah spektrofotometer dan tabung reaksi

2. Prosedur Kerja

Pengukuran spektro absorpsi CuSO4 dan NAD

a. Siapkan spektrofotometer. Hidupkan spektrofotometer dan bersihkan kuvet atau tabung reaksi untuk mengukur absorbansi.

b. Pilihlah salah satu panjang gelombang (), misalnya 500 nm. Atur prosentase transmisi menjadi nol.

c. Siapkan larutan CuSO4 0,1 M dan NAD 10-3 M, buatlah dalam labu ukur 50 ml. Siapkan pula blanko yang berupa air destilat yang berfungsi pula sebagai pelarut.

d. Selanjutnya diukur spektro absorpsi CuSO4 dan NAD. Ukurlah absorbansi CuSO4 mulai dari 400 nm, 425 nm, 450 nm dan seterusnya sampai dengan 600 nm. Setiap kali pengukuran di cek dengan blanko. Lakukan hal yang sama pada NAD, mulai dari panjang gelombang 300 nm, 310 nm, 320 nm dan seterusnya sampai dengan 400 nm.

e. Buatlah tabel hubungan antara panjang gelombang dengan absorbansi beserta kurvanya.

Contoh tabel

Panjang gelombang Absorbansi

...............

..............

..............

Carilah panjang gelombang maksimum masing-masing CuSO4 dan NAD. Panjang gelombang maksimum adalah pada saat terjadi penyerapan maksimum.

f. Hitung koefisien ekstinsi (E) CuSO4 dan NAD untuk panjang gelombang maksimum, dengan rumus

A = E x C ---> E = A/C

A = Absorbansi

C = konsentrasi dalam M

Pembuatan kurva baku dan penentuan konsentrasi protein.

a. Siapkan enam tabung reaksi. Satu untuk blanko dan yang lain untuk larutan biovine serum albumin dengan berbagai konsentrasi.

b. Buatlah larutan 10 mg/ml atau 100 mg/10 ml Bovine serum Albumin. Kemudian encerkan hingga konsentrasi larutan menjadi 8 mg/ml; 5 mg/ml; 1,25 mg/ml serta 0,625 mg/ml.

c. Siapkan pereaksi burret dengan jalan melarutkan 0,75 g CuSO4.5H2O dan 3 g Na, K tartarat di dalam 250 ml H2O. Tambahkan 150 ml larutan NaOH 10% (30 g/300 ml), buat volume menjadi 1 liter dengan penambahan air dan aduk menggunakan pengaduk magnetik.

d. Ambil 1 ml larutan protein dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah 4 ml perekasi burret. Diamkan selama 30 menit. Catat warna apa yang terlihat. Ulangi perlakuan ini untuk larutan protein dengan berbagai macam konsentrasi beserta blankonya.

e. Ukur absorbansi masing-masing spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm.

f. Buatlah tabel dan kurva hubungan antara konsentrasi dan absorbansi.

Tabel

Konsentrasi proteinAbsorbansiAbsorbansi blanko

10

8

5

2,5

1,25

0,625

g. Buatlah persamaan regresi protein, menggunakan perhitungan statistik. Hitung pula koefisien korelasi yang diperoleh; apakah percobaan anda cukup teliti?

h. Timbang protein sampel menurut prosedur pada point d e. Catat berapa konsentrasi protein sampel.

Pembuatan kurva baku fosfat dan penentuan kandungan fosfat sampel (metode Fishe-Subarow yang dimodifikasi).

a. Buatlah larutan K2PO4 10 mole/ml dengan jalan melarutkan 1,360 g KH2PO4 dalam 1 liter H2O. Aduk dengan magnetik. Encerkan menjadi beberapa konsentrasi 10; 5; 0,8; 0,5; 0,25; 0,125 molekul/ml. Tiap konsentrasi dibuat 10 ml.

b. Siapkan perekasi molibdat dengan jalam menambahkan 34 ml H2SO4 pekat tetes demi tetes ke dalam 90 ml air. (Gunakan sarung tangan atau kerjakan di dalam kamar asam), dinginkan. Kemudian larutkan 6.25 g (NH4)6 Mo7O254H2O ke dalam 125 ml H2O, tambahkan larutan H2SO4. Buat volume menjadi 250 ml.

c. Buat larutan pereduksi NaHSO3 3 g per 100 ml, tambahkan 1 g p-metil aminofenol (Elon). Simpan dalam botol yang berwarna coklat (gelap).

d. Masukkan 3 ml larutan fosfat ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 1 ml pereaksi molibdat, 4 ml pereduksi serta 5 ml H2O. Aduk dengan mengocol atau membalikkan tabung setelah ditutup dengan parafin, kemudian biarkan dengan selama 20 menit. Ulangi perlakuan ini untuk berbagai macam konsentrasi larutan fosfat serta blankonya.

e. Baca absorbansi pada 660 nm. Buat tabel beserta kurva yang menunjukkan hubungan konsentrasi larutan fosfat dengan absorbansi. Tentukan persamaan regresinya.

f. Tetapkan kandungan fosfat pada sampel.

SIFAT-SIFAT MENGION ASAM AMINO

Pendahuluan

Semua asam amino bersifat amfoter sekurang-kurangnya memiliki satu gugus asam (karboksil) dan satu gugus basa ( amino). Beberapa asam amino mengandung gugus ion yang mudah mengion sepeerti gugus amino, karboksil, p-hidroksi fenil, sulfuhidril, quanidiuno dan imidazol. Sifat-sifat ionic polipeptida dan protein terutama disebaban oleh gugus tambahan yang mudah mengion karena gugus amino dan karboksil terikat pada ikatan peptide.

Asam amino tidak larut dalam eter. Dalam air menampakkan struktur kutub ganda sebagai berikut:

Contoh:

Struktur kutub ganda

Pada percobaan akan diselidiki tentang reaksi asam amino dengan ion hidrogen dan hidroksil. Dengan penambahan asam atau basa akan terjadi perubahan pH. Dengan menggunakan kurva perubahan pH dapat diduga/diketahui nilai keasaman (pK) masing-masing gugus.

Tiap kelompok memilih salah satu contoh asam amino; asam, basa, dan netral, serta contoh asam amino karbosilat atau diamino.

Bahan dan Alat

Bahan dasar yang digunakan adalah beberapa asam amino netral, asam dan basa. Sedangkan senyawa kimia yang digunakan adalah NaOH 0,10 N (Lampiran IV) dan HCl 0,10 N (Lampiran IV).

Peralatan yang dipakai dalam percobaan adalah pH-meter, pengaduk magnetik serta buret.

Cara Kerja

a. Siapkan pH-meter periksa dengan buffer standar pH 4 dan pH 7

b. Timbang asam amino 400 mg, larutkan dalam 20 ml H2O dalam gelas piala.

c. Rangkaikan pengaduk magenit dengan pH meter, elektroda jangan sampai mengenai magnet pengaduk.

d. Titrasi dengan HCl 0,10 N (Lampiran IV), catat jumlah HCl yang diperlukan dan pH pada berbagai interval selama titrasi sampai pH mencapai 1,0.

e. Lakukan juga titrasi pada 20 ml H2O sebagai blanko dengan 0,10 N HCl, tetes demi tetes sampai kira2 10 tetes, 4 tetes-4 tetes, dan seterusnya, kemudian 2 tetes sampai 10 tetes, 4 tetes-4 tetes, dan seterusnya, sampai pH mencapai 1. Catat pH dan volume HCl.

f. Larutkan kembali 400 mg asam amino sampel ke dalam 20 ml H2O dan tambahkan NaOH 0,10 N (Lamp. IV) sampai pH mencapai 12. Catat pH dan volume NaOH yang ditambahkan pada beberapa interval (ukuran interval 0,5).

g. Lakukan juga titrasi dengan NaOH 0,10 N terhadap 20 ml air sebagai blanko seperti pada butir e. Prosdur e dan g dilakukan sebagai koreksi terhadap sampel.

h. Buatlah tabel sebagai berikut:

Volume HCl O,01 N (ml)

pHSampel (a)Blanko (b)C1= a - b

Volume NaOH O,01 N (ml)

pHSampel (x)Blanko (y)C2= x - y

i. Buatlah kurva hubungan antara pH dengan mili ekuivalen (ml x N) asam atau basa sebagai berikut:

Jumlah ekuivalen asam atau basa yang digunakan melalui titik infleksi kurva melambangkan asam/basa yang diperlukan untuk mentitrasi satu gugus fungsional pada asam amino.

j. Titik akhir titrasi adalah suatu titik pada saat terjadi perubahan yang nyata (curam) pada kurva.

EKSTRAKSI PROTEINPendahuluan

Pada percobaan ini akan dilakukan ekstraksi kasein dari susu serta albumin dari putin telur dan ekstraksi campuran protein dari tepung kacang hijau.

Kasein adalah protein utama yang terkandung dalam susu sapi, menyusun kira-kira 80% (berat) total protein, kasein ini terdapat sebagai campuran protein terutama , , dan kasein. Berat molekul kasein kira-kira 122.000, sedang kasein 24.100. Keduanya merupakan fosfoprotein.

Albumin (ovalbumin) terdapat pada putih telur dalam jumlah tinggi. Albumin merupajan glikoprotein yang mengandung kira-kira 2% (berat) gula dan 1.2% asetil heksoamino. Berat molekulnya 45.000 serta mempunyai titik isoelektrik 4,6. Di samping albumin terdapat pada putih telur, pada kuning telur juga terdapat protein utama disebut vitelin dan terdapat dalam lipoprotein (lipovitelin). Ada dua bentuk lipovitelin yaitu vitelin dan , berat molekul keduanya kira-kira 400.000.

Pengaruh beberapa parameter terhadap kelarutan protein

1. Kekuatan ion

Kelarutan protein dipengaruhi oleh kekuatan ion. Pada umunya dengan meningkatkanya kekuatan ion, kelarutan protein semakin besar. Peristiwa ini disebut salting in. Tetapi setelah mencapai titik tertentu, kelarutannya justru menurun, keadaan atau peristiwa ini disebut salting out. Pada kekuatan ion rendah, gugus protein yang terionisasi dikelilingi oleh ion lawan, sehingga interaksi antaraa protein dan kelarutannya meningkat. Apabila kekuatan ion meningkat, akan lenih banyak air yang diikat oleh ion, sehingga tidak cukup untuk hidrasi protein. Akibatnya interaksi antara protein lebih kuat dan kelarutannya menurun. Adapu kekuatan ion dapat digambarkan oleh persamaan

u = [ ci . zi2]

u = kekuatan ion

ci = konsentrasi ion

zi = muatan ion

Garam yang biasa digunakan untuk pengendapan protein adalah amonium sulfat.

2. pH, suhu dan konsentrasi dielektrik

Disamping kekuatan ion, kelarutan protein juga dipengaruhi oleh pH, suhu dan konsentrasi dielektrik. Perubahan pH akan mengubah ionisasi pada gugus fungsional protein yang berarti pula mengubah muatan protein. Protein mengendap pada titik isoelektriknya (P1), yaitu yang menunjukkan muatan total protein sama dengan 0, sehingga interaksi antar protein menjadi maksimum.

Peningkatan suhu menyebabkan denaturasi protein. Akibatnya struktur protein terbuka dan dudug nonpolar yang berada dalam molekul menjadi terbuka di luar. Oleh karena itulah kelarutan protein dalam air yang polar menjadi turun.

Pengaruh konstanta dielektrik diterapkan dengan penambahahan etanol, metanol serta aseton dan dapat dijabarkan dengan rumus sebagai berikut

F = Q1Q2/DT2

F = Gaya tarik menarik (tolak-menolak) antar dua muatan Q1 dan Q2

T = Jarak antar dua muatan

D = konstanta dielektrik maksimum

Penurunan konstanta dielektrik medium menyebabkan peningkatan gaya tarik menarik antar gugus bermuatan pada protein. Oleh karena itu interkasi antar protein meningkat, sehingga kelarutan protein menurun.

Bahan dan Alat Percobaan

Bahan terdiri dari bahan dasar dan bahan kimia. Adapun bahan dasar terdiri dari susu skim, telur dan tepung hunkue, sedang bahan kimia terdiri dari HCl 10%, AgNO3 1%, Etanol 95%, CH3COOH 1 M, (NH4)2SO4 6% (jenuh) dan NaOH 4% (10 M).

Peralatan percobaan terdiri dari kertas pH, kertas saring, pipet pasteur, sentrifuge, pengaduk magnetik, pompa vakum, spektrofotometer, timbangan (neraca analitik), tabung cuvet, labu pemisah dan kain kasa.

Prosedur Kerja

Ekstraksi Kasein

a. Larutan susun (50 g) menjadi 100 ml, di dalam gelas piala 600 ml. Tambahkan 300 ml air destilate, tempatkan di atas pengaduk magnetik, tambahkan sekurang-kurangnya 2 ml HCl 10% (Lampiran 1) selama 5-6 menit, secara perlahan-lahan, hingga pH menjadi 4,6 4,7. Gunakan kertas pH untuk memeriksanya.

b. Aduk selama 10 menit. Biarkan mengendap selama 30 menit kemudian buang supernatan.

c. Tambahkan 200 ml aur destilata pada endapan sehingga endapan larut. Endapkan lagi dengan menambahkan sekurang-kurangnya 2 ml HCl 10% secara per lahan-lahan di atas pengaduk magnetik selama 5 10 menit, sehingga pH menjadi 4,6 4,7. Biarkan 30 menit, kemudian buang supernatan.

d. Kumpulkan endapan di dalam corong Buchner yang telah diberi alas dengan tiga lapis kertas saring. Saring dengan pompa vakum, kemudian letakka endapan dalam gelas piala 200 ml.

e. Tambahkan 20 ml air destilata pada endapan, kemudian endapan di saring lagi menggunakan corong buchner. Prosedur ini diulang sampai filtrat bebas dari ion khlorida. Gunakan AgNO3 1% (Lampiran II) untuk menguji Cl.

f. Campurkan kasein dengan 20 ml etanol 95% (lampiran II) saring dengan pompa vakum, kemudian endapan di cuci dengan aseton.

g. Tempatkan kasein pada gelas arloji. Keringkan di udara terbuka atau oven 60 C kemudian beratnya ditimbang. Terakhir, hitung rendemen kasein.

Ekstraksi Albumin

a. Siapkan 2 buti telur. Pisahkan dua bagian telur, putih dan kuning telur. Putih telur dikumpulkan jadi satu dan tentukan volumenya.

b. Aduk putih telut dengan batang gelas dan tambahkan 0,1 bagian volume larutan CH3COOH 1 M (lampiran II) atau 6%.

c. Buatlah kantung dari dua lapis kain kasa, letakkan albumin telur yang sudah ditambah asam, aduk dengan batang gelas dan peras hingga filtrat keluar dari kantung.

d. Buat larutan amonium sulfat jenuh. Tambahkan larutan ini kepada filtrat yang diperoleh dengan volume sama. Jika belum terbentuk (terlihat) endapan, tambahkan (NH4)2SO4 kristal, kemudian di aduk dengan pengaduk magnetik hingga terlihat endapan.

e. Pisahkan supernatan dan endapan dengan sentrifus.

f. Tambahkan lagi larutan (NH4)2SO4 jenuh, ke dalam supernatan dengan sentrifus, selanjutnya satukan semua endapan.

g. Semua endapan yang diperoleh dicampur dengan (sedikit) aseton, saring menggunakan corong buchner dengan 3 lapis kertas saring dan pompa vakum.

Ekstraksi Protein tepung Hunkuea

a. Timbang 100 g tepung Hunkue, larutkan dalam 150 200 ml air destilt.

b. Tambahkan NaOH 4% (lampiran II) (10 m) secara perlahan-lahan. Aduk dengan pengaduk magnetik sampai sebagian besar protein (partikel) melarut. Catat pada pH berapa protein larut.

c. Tambahkan HCl 4 5 % (Encerkan Hcl 10% dengan perbandingan 1:2) secara perlahan-lahan, aduk dengan pengaduk magnetik hingga timbul endapan pada titik isoelektrik kalau didiamkan (hingga tercapai titik iso yang ditandai dengan timbulnya endapan). Catat berapa titik isoelektriknya atau pH pada saat terjadi pengendapan protein.

d. Endapan protein yang diperoleh adalah protein kacang hijau yang merupakan hasil ekstraksi tepung hunkue, Perlu diketahui bahwa tepung hunkue terbuat dari kacang hijau dan ekstraksi demikian merupakan cara umum dilaksankan.

e. Buang supernatant (jika perlu gunakan sentrifuge). Cuci endapan denagn sedikit aseton, sering dengan pompa vakum. Kering anginkan atau keringkan dengan oven. Terkahir, timbang beratnya.

ENZIM

Pendahuluan

Enzim merupakan protein yang disintesa oleh enzim hewan untuk mengkatalisa reaksi yang berlangsung didalamnya. Oleh karena reaksi itu bnayak sekali, maka biokatalisator yang dibentuk jumlah maupun jenisnya tak terhitung banyaknya. Enzim merupakan biokatalisator dengan spesifitas tinggi.

Sebagai protein, enzim memiliki sifat-sifat umum protein, misalnya enzim akan terdenaturasi pada suhu tinggi dan kondisi ekstrim lainnya seperti terlalu tinggi rendahnya pH ataupun tekanan. Beberapa oksidator, keadaan popularitas larutan, tekanan osmotic yang abnormal juga dapat menghambat kerja enzim.

Reaksi enzim dengan satu substrat dapat dilambangkan sebagai berikut:

k1 k2 E + S ES E + P

k-1 S = Substrat

P = Produk

E = Enzim

Kecepatan reaksi (v) dipengaruhi oleh kadar substrat (s) dan hubungan keduanya ditunjukkan dengan kurva hiperbola sebagai berikut:

Gambar pengaruh kadar substrat terhadap kecepatan

Vo = Kecepatan awal reaksi = ds/dt = dp/dt

km = S = kadar substrat

Pada umumnya hanya sejumlah kecil enzim yang diperlukan untuk melangsungkan reaksi katalitik karena enzim dapat digunakan berulang-ulang.

Pada percobaan ini akan dipelajari aktivitas enzim amiloglukosidase pada substrat pati. Amiloglukosidase akan memecah ikatan 1,4 dan 1,6 pati menjadi glukosa. Glukosa yang dihasilkan diuji dengan metode somogy (1945). Prinsionya adalah glukosa dapat dioksidasi oleh pereaksi yang mengandung Cu dalamn basa.

Gula pereduksi Gula teroksidasi

Cu+2 Cu+1 I- I2Sisa I2 dititrasi dengan Na2S2O3Aktivitas enzim dinyatakan dalam satuan unit per mililiter filtrat enzim. Satu unit aktivitas setara dengan satu mikromol glukosa (sebagai gula pereduksi) yang dihasilkan dari perlakukan enzim terhadap larutan pati.

Unit aktivitas enzim amiloglukosidase dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

UAA = [0,1099 x (a-b) + 0.048] x c x 1000/ (5 x 180)

UAA = Unit aktivitas enzim amiloglukosidase

a = Jumlah titrant yang diperlukan untuk blanko

b = Jumlah titrant yang diperlukan untuk sampel

c = Faktor pengenceran (jika ada)

Bahan dan Alat

Bahan yang diperlukan adalah enzim kasar, buffer asetat pH 4,5 1 N. Larutan pati 0,56%, pereaksi somogy, larutan Iod-oksalat, H2SO4 2 N, Na2S2O3 0,005 N.

Alat yang dibutuhkan adalah penangas air, alat gelas (buret, pipet, dan sebagainya).

Prosedur Kerja

Persiapan larutan

a. Larutan Somogy

25 g Na2CO3, 25 g Na-K tartarat, 75 ml larutan CuSO4 (100 g CuSO4) dalam 1 liter larutan), 20 g NaHCO3, 5 g KI, 250 ml larutan KIO3 0,1 N, dilarutkan dalam air sampai volumenya menjadi 1 liter dan diamkan semalam sebelum dipakai.

b. Larutan Iod-oksalat

2,5 g KI dan 2.5 K2C2O4 dilarutkan menjadi 100 ml. Tiap minggu larutan ini harus diganti dengan yang baru.

c. Larutan H2SO4 2 N dibuat dengan mengencerkan asam sulfat pekat.

d. Larutan standar Na-tiosulfat 0,005 N dibuat dari larutan stok Na-tiosulfat 0,1 N.

e. Substrat (pati 0,56%)

Sebanyak 0,56 g pati terlarut ditimbang dan dilarutkan dalam sedikit air suling. Larutan yang terbentuk kemudian ditambahkan ke dalam 50 ml air mendidih, lalu didihkan selama 5 menit. Setelah itu larutan pati diangkat dan didinginkan dengan air mengalir. Larutan pati yang telah dingin dituangkan ke dalam labu takar 100 ml, ditambah 5 ml buffer asetat 1 N pH 4,5 dan volumenya ditetapkan menjadi 100 ml dengan air suling.

Aktivitas enzim

a. Sepuluh milliliter larutan pati 0,56% dalam buffer ditambah dengan 0,2 ml filtrat enzim, kemudian diinkubasikan pada suhu 37 40 C selama 30 menit.

b. Diambil sebanyak 5 ml dan ditambahkan 5 ml pelarut Somogy, ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit.

c. Setelah itu didinginan dengan air mengalir, kemudian ditambahkan 2 ml larutan Iod-oksalat dan 3 ml larutan H2SO4 2 N. Digoyang perlahan-lahan sampai seluruh endapan larut.

d. Dibiarkan dalam air dingin selama 5 menit, sambil dikocok-kocok.

e. Kemudian dititrasi dengan larutan Na2S2O 0.005 N

SIFAT SPEKTRAL MOLEKUL

Pendahuluan

Molekul-molekul yang mempunyai peran biologi penting akan memmpunyai sifat-sifat spectral tertentu. Sifat spectral (penyerapan sinar) tersebut penting diperhatikan, karena:

1. Sifat spectral merupakan salah satu parameter senyawa tertentu.

2. Sifat spectral dapat mencerminkan keadaan (utuh/rusaknya) molekul. Adanya interaksi beberapa bahan kimia dengan bagian tertentu suatu molekul dapat mengubah karakteristik spectral yang dihasilkan, misalnya penambahan asam, basa, atau logam berat.

Tujuan percobaan ini adalah untuk mempelajari pengaruh penambahan zat-zat kimia antara lain CuSO4, FeSO4 serta pengaruh pH terhadap struktur kasein dan albumin.

Bahan dan Alat

Bahan dasar yang digunakan adalah albumin, kasein, serta piridoksin. Sedang senyawa kimia yang digunakan adalah buffer fosfat, HCl 0,1 N, NaOH 0,1 N, CuSO4 5 M (Lamp. V) serta FeSO4 5 M (Lamp. V).

Peralatan yang digunakan: Spektrofotmeter, pH meter, serta peralatan gelas seperti gelas ukur, labu ukur, pipet dan tabung reaksi.

Cara Kerja

Persiapan, pereaksi dan pelarut

a. Persiapan HCl 0,1 N

Ambil 1,5 ml HCl pekat, kemudian encerkan menjadi 500 ml

b. Persiapan NaOH 0,1 N

Timbang 4 g NaOH Kristal, kemudian encerkan dalam 1 liter air atau 2 g dalam 500 ml air.

c. Persiapan CuSO4 dan FeSO4 jenuh

Jenuhkan air dengan bahan-bahan tersebut

d. Persiapan larutan bahan

Timbang 100 mg salah satu bahan, kemudian larutkan dalam 50 ml air destilat atau alcohol 50% sampai jenuh. Saring menggunakan kertas Whatman kemudian ambil filtratnya.

e. Persiapan bahan yang akan diukur

Siapkan tujuh buah tabung reaksi, kemudian tambahkan masing-masing seperti petunjuk berikut:

TabungSampel

(ml)NaOH

(ml)HCl

(ml)CuSO4

(ml)FeSO4(ml)pH

(ml)

15

252.5

350.5

452.5

550.5

652.5

752.5

Inkubasi pada suhu 5 C selama 30 menit

f. Lakukan hal yang sama seperti butir e untuk blanko. Semuanya tanpa sampel.

Pengukuran

Ukur penyerapan sinar oleh sampel maupun blanko pada panjang gelombang berikut:

Albumin dan kasein; 195, 197, 200, 205, 210, 240,250, dan 300 nm

Piridoksin; 250, 275, 290, 300, 320, 340, 360, dan 400 nm

Pertanyaan

a. Buatlah dan isi daftar sebagai berikut untuk tiap senyawa (kasein, albumin, piridoksin).

Panjang gelombangAbsorbansi sampel (a)Absorbansi blanko (b)a -b

b. Berapa panjang gelombang tiap senyawa/molekul.

c. Bagaimana pengaruh asam, basa, dan logam berat terhadap absorbansi dan panjang gelombang maksimum.

LIPIDA KOLESTEROL

PENDAHULUAN

Kolesterol dapat diekstrak dari sumber pangan kerena kelarutannya yang tinggi di dalam aseton, sedang kebanyakan lipid kompleks lain tidak larut. Beberapa sumber kolesterol yang tinggi antara lain otak dan kuning telur.

Kolesterol termasuk dalam golongan steroid yang fungsi selulernya beragam. Pada umumnya, kolesterol terdapat di dalam membran sel dan dapat menjadi precursor senyawa steroid lain seperti asam empedu yang berperan di dalam perencanaan dan penyerapan lemak, hormone aldosteron yang berperan mengatur kesetimbangan air dan elektrolit serta hormone seksual testosterone dan progesterone.

Analisa kalorimetrik kolesterol (uji Liebermann Bucahrd) dilaukan berdasarkan asetilasi 3 hidroksi oleh anhidrida dalam H2SO4. Esteri asetil 3 hidroksi srterol yang mngandung ikatan ganda ( 5 seperti kolesterol di dalam asam mengalami epimerisasi menjadi bentuk 3 dan reaksi eliminasi yang menimbulkan produk berwarna.

BAHAN DAN ALATBahan yang dibutuhkan adalah otak dan kuning telur, sedang senyawa kimia yang digunakan yaitu aseton dan etanol, asset anhidrida, H2SO4, dan kloroform.

Peralatan yang dipakai dalam percobaan ini meliputi blender, corong Buchner, corong gelas, kertas saring, penangas air, unit alat destilasi dan oven vakum.

PROSEDUR KERJA

Metode ekstraksi kolesterola. Tambahkan 100 ml aseton pada 25 g otak atau kuning telur dalam gelas piala, aduk 1 menit.b. Siapak blender dan bersihkan dengan sedikit aseton. Masukkan homogenat ke dalam blender kemudian diputar selama 10 menit.

c. Saring suspensi dengan corong Buchner yang dilapisi kertas saring. Residu dicuci kembali dengan 50 ml aseton, disaring dan filtratnya dikumpulkan.

d. Aseton yang terkandung dalam filtrat diuapkan dengan vakum.

e. Residu kolesterol yang terdapat dalam corong Buchner dikumpulkan, dikeringanginkan dan ditimbang beratnya.

f. Larutkan kembali kolesterol di dalam kloroform ( 10 mg/ml), kemudian analisa dengan TLC

Uji kolesterol

a. Buat pereaksi Liebermann-Buchard.

Dinginkan 30 ml asam asetat anhidrida pada suhu 0 C. Tambahkan 1 ml H2SO4 tetes demi tetes, biarkan pereaksi ini pada suhu dingin (0 C) selama 10 menit.

b. Larutkan kolesterol kerong pada konsentrasi 10 mg/ml dan 1 mg/ml.

c. Siapkan 4 tabung reaksi, masukkan 1 ml larutan kolesterol, konsenterasi 10 mg/ml dan 1 mg/ml, masing-masing dua tabung, angin-anginkan sebentar agar kloroform menguap. Tambahkan 1 ml asam asetat glasial ke dalam tabung secara hati-hati.

d. Tambahkan 2 ml pereaksi Liebermann Buchard. Biarkan 30 menit di tempat gelap.

e. Amati warna apa yang terlihat.

f. Baca absorbansinya pada ( 525 nm. Gunakan table pengamatan sebagai berikut:

Konsentrasi kolesterol UlanganWarna yang terlihatPenyerapan pada ( 525 nm

10 mg/ml1

2

1 mg/ml1

2

Uji Kemurnian Kolesterol

a. Siapkan lempeng TLC pada ketebalan 250 (m, keringan oven pada T 105 C selama 5 menit sebelum dipakai.

b. Buat pelarut campuran kloroform, metanol, asam aetat dan air, dengan perbandingan 50 : 25 : 7 : 3.

c. Lakukan peneteesan larutan pekat tetes demi tetes (5 6 tetes), biarkan menguap. Buat spot sekecil mungkin kemudian simpan lempeng dalam wadah tertutup.

d. Pewarnaan dilakukan dengan uap I2.

e. Amati berapa spot yang diperoleh pada percobaan ini? Simpan lempeng TLC untuk percobaan selanjutnya.

KARBOHIDRAT GLIKOGEN

PENDAHULUAN

Glikogen merupakan karbohidrat cadangan yang terdapat dalam hewan dan mempunyai BM kira-kira 162. Pada hewan glikogen banyal dijumpai dalam hati, otot kerangka, ginjal dan masih banyak jaringan lain kecuali otot. Glikogen hati berfungsi untuk mempertahankan tingkat glukos darah. Oleh karena itu merupakan cadangan makanan pusat pada semua jaringan tubuh.

Molekul glikogen tersusun atas unit-unit -D-glukosa yang saling berkaitan. Jenis ikatan antara dua sakarida adalah 1, 4 -glukosida sedang bila membentuk percabangan, maka ikatan cabang adalah 1,6 -glukosida.

Pada isolasi glikogen, pemisahan protein dan assam nukleat dilakukan dengan cara pengendapan asam trikhloroasetat (TCA), kemudian glikogen diendapkan dengan meenggunakan alcohol.

Glikogen terhidrolisa menjadi unit penyusunnya (glukosa) oleh enzim pemecah polimer glukosa atau oleh asam. Untuk mendeteksi total gula dapat dilakukan melalui reaksi kimia dengan menggunakan pereaksi antron (10-ucto-9, 10-dihidroantiasen). Reaksi antara senyawa antron dan gula akan menimbulkan warna biru hijau. Dengan demikian untuk memperoleh kuantifikasi warna yang tepat harus diukur pada ( yang sesuai menggunakan spektrofotometer dalam hal ini pada ( 620 nm.

Ekstraksi glikogen harus dikerjakan sebelelum melakukan percobaan lebih lanjut misalnya menguji aktivitas enzim glikogen fosforilase atau enzim lain. Kadang-kadang perlu diketahui apakah ada pengaruh suatu perlakuan tertentu, misalnya puasa atau suatu penyakit/keadaan abnormal terhadap kandungan glikogen dalam hati.

Bahan dan Alat

Bahan dasar yang digunakan dalam percobaan ini adalah hati sapi. Sedang senyawa kimianya meliputi asam trikloroasetat (50 g/l) sebanyak 1 liter (dingin), etanol 95%, eter, larutan iodium (5 mmol/l dalam 30 g/l KI), NaCl jenuh, pereaksi antron (1 g/500 ml H2SO4 pekat) yang disiapkan dalam keadaan segar; Na,K tartarat (300 g/500 ml air), HCl 2 N, NaOH 2 N, standar glukosa serta disiapkan pula pasir halus.

Peralatan yang dipakai melipitu desikator, gelas arloji, gelas piala serta kertas whatman no 54.

PROSEDUR KERJA

Isolasi glikogen

a. Timbang berat hati mula-mula, potong/guntinglah menjadi potongan kecil kemudian taruh di dalam mortar.

b. Tuang kira-kira 5 ml/g hati TCA dingin 50 g/l, selanjutnya homogenisasi dengan menggunakan blender.

c. Ambil homogenate, saring dengan kertas saring biasa. Filtrat dikumpulkan dalam gelas piala yang telah didinginkan.

d. Tambahkan volume TCA pada endapan kemudian homogenisasi dan lakukan penyaringan kembali.

e. Ambil 1 tetes masing-masing filtrate, tambahkan I2, kemudian letakkan di atas piring putih. Amati apa yang terjadi.

f. Campurkah filtrate, tambahkan etanol 95% dua kali volume. Aduk dan biarkan gumpalan glikogen mengapung.

g. Jika endapan glikogen belum terlihat, tambahkan sedikit NaCl dan panaskan sebentar (sampai hangat).

h. Sentrifus ( 3000 g) selama 10 menit. Buang supernatan.

i. Larutkan endapan dengan sedikit air, endapkan kembali glikogen dengan menambah etanol 95% dua kali volume.

j. Sentrifus kembali, endapan dicuci dua kali dengan 95%, kemudian dengan eter.

k. Sentirfus kembali, endapannya dikumpulkan di atas gelas arloji, kemudian dikeringanginkan atau ditaruh di dalam desikator.

l. Timbang endapan, kemudian simpan untu pengujian selanjutnya.

Hidrolisa asam glikogena. Larutkan 50 mg glikogen yang telah diisolasi ke dalam 1 ml HCl 2 N. Ambil 1 ml larutan dengan pipet, masukkan ke dalam tabung reaksi. Lakukan hal yang sama sebanyak 5 tabung dan ditutup dengan kelereng.

b. Inkubasi selama 0, 5, 15, 30, dan 45 menit

c. Netralkan dengan NaOH 4 N

d. Tentukan jumlah gula pereduksi dengan pereaksi antron.

e. Pertama-tama buatlah kurva standar. Larutkan glukosa sebanyak 0,1 g per 100 ml. Encerkan menjadi 0,05 g/100 ml (1:25), 0,025 g/100 ml (1:4), 0,0125 g/100 ml (1:8) dan 0,01 g/100 ml (1:10).

f. Ambil 1 ml larutan glukosa dengan berbagai konsentrasi, masukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah dengan 4 ml pereaksi Antron (Lamp. IX). Tabung ditutup dan selanjutnya diinkubasi pada air mendidih selama 10 menit.

g. Dinginkan, kemudian baca absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm. Buat pula blankonya, yaitu dengan mereaksikan 4 ml pereaksi antron dengan 1 ml HCl 2 N dan 1 ml NaOH 4 N.

h. Ulangi perlakuan seperti butir f untuk 1 ml glikogen hasil hidrolisa.

Pertanyaan

a. Buatlah table kurva yang menunjukkan hubungan antara penyerapan dan waktu inkubasi glukosa standar dan glikogen contoh:

Waktu inkubasi (menit)Penyerapan (blanko)620

0

5

15

30

45

DIFRENSIASI PADA PERKECAMBAHAN

Pendahuluan

Perkembangan organisme tingkat tinggi, mulai dari janin/bayi/benih sampai menjadi makhluk dewasa, melibatkan serangkaian perubahan yang nyata dan sangat kompleks. Berdasarkan reaksi-reaksi biokimiawi induksi enzim pada bakteri, akibt adanya substrat baru dilingkungan, merupakan suatu contoh pengontrolan biokimiawi sederhana. Pada hewan tingkat tinggi mekanisme pengontrolan dan perubahan biokimiawi yang terjadi lebih kompleks. Pada percobaan ini, akan dipelajari beberapa ekspresi biokimiawi selama perkembangan sel.

Suatu tanaman yang tumbuh dan benih yang berkecambah di lingkungan gelap akan menjadi hijau pada keadaan terang. Peristiwa ini ada ekspresi dari sintesa khlorofil dan khloroflas yang dirangsang oleh sinar matahari, yang lebih dikenal dengan peristiwa fotosintetis.

Manifestasi perkembangan embrio pada biji kecambah yang lain adalah pemecahan cadangan makanan yang berfungsi sebagai makann bagi respirasi substrat dan pertumbuhan sel baru.

Semua perkemb tersebut antara lain didasari dengan meningkatkanya sintesa enzim-enzim pemecah mankanan.Bahan dan Alat

Bahan dasar terdiri dari 500 g kacang kedele dan 500 g kacang tanah. Bahan kimia terdiri dari buffer asetat 0.1 M pH 5 (lihat petunjuk pembuatan buffer); 1 ml larutan pati; larutan I2/KI 0,1 n ( 6 G KI dilarutkan ke dalam 10 ml H2O, tambahkan 3,25 g I2, kemudian encerkan menjadi 250 ml.

Peralatan percobaan terdiri dari wadah untuk perkecambahan, gelas piala, pencuci, gelas pengaduk, tabung reaksi, mortar, spektrofotometer.Cara Kerja

Pengukuran konsentrasi klorofil

a. Siapakan wadah untuk perkecambahan. Timbang 100 g biji kedele sebanyak 5 kali. Rendam air selama semalam.

b. Pada hari ke lima sebelum percobaan, angkat semua kedele dari rendaman dan kemudian ditiriskan. Ambil 100 g kacang kedele, tempatkan ke dalam suatu wadah, selanjutnya jemur di bawah sinar matahari, setiap hari sampai pada saat percobaan (beri kode A) sisanya ditempatkan dalam suatu wadah yang terbuat dari bambu yang diberi alas daun pisang atau kain kasa. Selanjutnya disimpan/diletakkan ditempat yamg gelap, bersih serta lembab. Untuk menjaga kelembaban, jika perlu disiram dengan air, tetapi tidak boleh terlalu basah agar tidak berjamur.

c. Pada hari keempat sebelum percobaan, ambil lagi 100 g biji kedele yang telah disimpan di tempat gelap, kemudian jemur di bawah matahari setiap hari sampai saat percobann (beri kode B). Kedele sisa tetap disimpan di tempat gelap, lembab dan bersih.

d. Pada hari ketiga sebelum percobaan, ambil lagi 100 g biji kedele yang telah disimpan di tempat gelap, kemudian jemur di bawah matahari setiap hari sampai saat percobann (beri kode C). Kedele sisa tetap disimpan di tempat gelap, lembab dan bersih.

e. Pada hari kedua sebelum percobaan, ambil lagi 100 g biji kedele yang telah disimpan di tempat gelap, kemudian jemur di bawah matahari setiap hari sampai saat percobann (beri kode D). Kedele sisa tetap disimpan di tempat gelap, lembab dan bersih.

f. Pada saat percobaan, pertama-tama amati kelima sampel yang diperoleh yaitu:

Biji yang dijemur selama 5 hari

Biji yang dijemur selama 4 hari

Biji yang dijemur selama 3 hari

Biji yang dijemur selama 2 hari Biji yang tidak dijemurg. Masing-masing sampel (A, B, C, D, E) digerus menggunakan mortar. (Kulit biji dihilangkan dahulu).Tambahkan sedikit pasir dan 20 ml aseton 80%. Kemudian saring beberapa kali hingga diperoleh filtrat yang jernih dan tampung ke dalam tabung reaksi. Apabila ternyata masih terdapat partikel-partikel pati, lakukan sentrifuge 2000 rpm selama 5 menit, endapan dibuang.

h. Lihat kandungan khlorofil masing-masing filtrat menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 652 nm dengan aseton 80% sebagai blanko. Jika diketahui larutan klorofil 1 mg/ml yang terdapat dalam tabung reaksi dengan lebar 1 cm di tambah 80% aseton dapat mengabsorpsi sinar sebanyak 0,689 pada panjang gelombang 652 nm, maka hitunglah konsentrasi klorofil pad masing-masing sampel. Apabila hasil penyerapan sinar lebih dari satu, lakukan pengenceran 1:2 sampai 1:10. Pada perhitungan konsentrasi, harus dikalikan dengan faktor pengenceran.

Pengamatan Perkembangan aktivitas enzim

a. Siapkan biji kacang tanah, selanjutnya rendam selama 36, 24, 12 dan 1 jam sebelum percobaan. Masing-masing tempatkan pada wadah terpisah dan beri label. Setelah perendaman usahakan untuk membuang kulitnya.

b. Ambil 50 g biji, hancurkan menggunakan mortar dengan penambahan pasir. Tambahkan 100 ml buffer asetat 0,1 M pH 5. Saring dan tamping filtrate menggunakan tabung reaksi. Lakukan penyaringan beberapa kali dengan menggunakan tiga lapis kain kasa.

c. Buat larutan pati 1%. Ambil 5 ml larutan pati, tambahkan 1 ml filtrate b ke dalamnya. Ulangi perlakuan tersebut 3 kali, masing-masing ditempatkan dalam tabung reaksi yang terpisah. Biarkan 0 menit, 3 menit, 15 menit dan 30.

d. Tambahkan ke dalam masing-masing tabung reaksi 1 tetes pereaksi I2/KI 0,1 N.

e. Amati secara visual, apakah yang terjadi. Buatlah table sebagai berikut:

Pengamatan visual

Perlakuan perendaman (jam)Waktu (menit)

0351530

36

24

12

1

f. Pengamatan kuantitatif dilakukan dengan mengukur absorpsi pada panjang gelombang 600 nm. Buatlah tabel butir e.

Pertanyaan

a. Apakah fungsi aseton dan buffer pada percobaan tersebut? Bagaimana, apabila buffer diganti dengaan air destilat.

b. Diskusikan hasil pengamatan (perbedaannya jika ada) pada percobaan tersebut. Mengapa terjadi demikian? Buat kesimpiulannya.

c. Enzim apa yang diamati pada percobaan tersebut? Tuliskan cara pengujian aktivitas enzim tersebut secara lebih kuantitatif.

MENENTUKAN POLA RESPIRASI

Pendahuluan

Respirasi pada buah-buahan diukur berdasarkan jumlah CO2 yang diproduksi. Pola respirasi buah-buahan ada yang menunjukkan kenaikan secara tiba-tiba selama percobaan (klimaterik), dan juga yang menunjukkan penurunan secara lambat selama percobaan (non klimakterik).

Prinsip kerja pada percobaan ini adalah penggunaan larutan alkali untuk mengikat gas CO2 yang diproduksi oleh buah-buahan. Selanjutnya CO2 tersebut ditentukan jumlahnya dengan cara titrasi menggunakan asam.

Bahan dan Alat

Bahan kimia yang digunakan adalah Ca(OH)2 jenuh, NaOH 0,01 N dan 0,05 N. Sedangkan bahan untuk sample percobaan adalah pepaya, semangka, pisang, nenas, apel dan anggur.

Prosedur

Laju respirasi buah pada suhu diukur berdasarkan jumlah gas CO2 yang diproduksi setiap hari selama 6 hari, dengan cara titrimetri seperti telah disebutkan di atas.

Cara pengukurannya adalah sebagai berikut: udara sebelum melewati contoh buah, terlebih dahulu dilewatkan dalam Ca(OH)2 pada Erlenmeyer A untuk mengikat CO2 sisa yang mungkin masih ada, udara yang keluar dari Erlenmeyer A tersebut dilewatkan lagi ke dalam larutan NaOH 0,001 N dalam Erlenmeyer B. Untuk mengalirkan udara ke dalam system digunakan pompa akuarium yang besar.

Udara yang keluar dari Erlenmeyer B dianggap sudah bebas dari CO2 dan kemudian dilewatkan ke dalam desikator (C) yang berisi contoh buah seberat 1 kg. Pasangan contoh buah untuk percobaan ini adalah (1) pepaya dan semangka (2) pisang dan nenas, serta (3) apel dan anggur. Pengukuran respirasinya dilakuan masing-masing pada buah. Selanjutnya udara yang keluar dari wadah C ditampung dalam wadah erlenmyer D yang berisi 50 ml NaOH 0,05 N yang berfungsi mengikat gas CO2 yang diproduksi oleh buah sebagai hasil respirasi. Untuk mengikat CO2 yang mungkin belum terikat setelah melewati erlenmyer D maka digunakan lagi satu buah erlenmyer E yang berisi 50 ml larutan NaOH 0,05 N. Skema

Pengukuran jumlah gas CO2 yang terikat oleh larutan NaOH 0,05 N dalam tabung D dan E dilakukan setelah respirasi berlangsung selama 1 jam. Larutan NaOH yang telah mengikat CO2 tersebut dititrasi dengan HCl 0,05 N dengan menggunakan indicator fenolftalin 1%. Untuk koreksi dilakukan dengan cara yang sama seperti di atas, tetapi wadah C tidak diisi oleh buah (blanko).

Laju respirasi dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

Laju respirasi (mg CO2/kg/jam) =

[(ml blanko ml contoh) x N HCl x BM CO2]/2

Dari hasil percobaan yang diperoleh (selama 6 hari, pengukuran tiap hari), gambarkan pola respirasi masing-masing pasangan buah. Tentukan mana yang klimakterik dan mana non klimakterik.

A B C D E

Ca(OH)2 NaOH 0,01 N Contoh NaOH 0,05 N NaOH 0,05 N

PENGARUH ETILEN TERHADAP AKTIVITAS ENZIM PEROKSIDASEPendahuluan

Etilen dapat meningkatkan aktivitas enzim katalase, peroksidase dan amilase bila diberikan pada buah-buahan yang berada pada fase klimaktrerik.

Bahan dan Alat

Bahan kimia yang dibutuhkan adalah karbit. Serta bahan kimia yang diperlukan untuk analisis enzim peroksidase.

Sebagai sampel digunakan jagung manis (sweet corn) yang masih segar (bila mungkin yang baru dipetik) dan masih berklobot, dengan tingkat kematangan yang cukup (tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua).

Prosedura. Siapkan 4 buah kotak (A, B, C, dan D) dan masing-masing diisi dengan 10 klobot jagung.

b. Kotak B, C, dan D ditaruh karbit yang dibungkus dengan kain lembab seperti pada percobaan sebelumnya, masing-masing sebanyak 10, 25 dan 50 gram. Setelah di tutup rapat, semua kotak disimpan pada suhu dingin.

c. Tentukan aktivitas enzom peroksidase pada produk yang belum disimpan (0 jam), ditetapkan pada hari pertama percobaan menggunakan jagung yang masih segar. Penetapan enzim peroksidase dilakukan dengan menggunakan prosedur dibawah ini:

1. Sekitar 4 gram kernel jagung segar dihancurkan dalam larutan buffer fosfat sitrat dingin (selama penghancuran diusahakan menggunakan es batu disekeliling mortal), kemudian volumenya ditetapkan menjadi 250 ml dengan menambahkan buffer fosfat sitrat.

2. Sebanyak 10 ml ekstrak yang diperoleh di atas diencerkan menjadi 250 ml dengan menambahkan buffer fosfat sitrat.

3. Setelah diaduk pelan-pelan sampai homogeny, sebanyak 25 ml aliquot dimasukkan dalam tabung sentrifus untuk digunakan sebagai blanko dalam pembacaan pada spektrofotometer.

4. Kemudian sampel dan blanko ditaruh dipenangas air 25 C selama 30 menit.

5. Selanjutnya ke dalam sampel ditambahkan 1 ml larutan (-fenilandiamin 1% dan 1 ml larutan hydrogenperoksidase 0,3%. Reaksi pembentukan warna dibiarkan berlangsung selama 5 menit dalam penangas air tersebut.

6. Tambahkan 2 ml larutan natrium bisulfit jenuh.

7. Untuk blanko: tambahkan 1 ml larutan (-fenilandiamin 1%, kemudian 2 ml larutan natrium metabisulfit jenuh dan akhirnya 1 ml hydrogen peroksidase. Enzim akan terhambat oleh sulfit sehingga berada dalam keadaan inaktif ketika hydrogen peroksidase ditambahkan.

8. Sample dan blanko selanjutnya disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 5 menit.

9. Supernatan yang diperoleh didekantasi dan dan absorbansinya diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 430 nm. Bila menggunakan spektrofotometer single beam alat diset pada 100% transmittance dengan menggunakan blanko yang bersangkutan (Setiap sampel menggunakan blanko masing-masing). Bila menggunakan spektrofotometer double beam pembacaan aborbansi dapat langsung dilakukan dengan menempatkan sampel dan blanko sekaligus ke dalam alat.

10. Aktiivtas enzim peroksidase dapat dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: Absorbansi

Aktvitas enzim = -----------------------------

(4/250) x (10/250) x 25

Kerusakan Dingin (Chilling Injury) pada Sayuran dan BuahPendahuluan

Suhu rendah pada umunya dapat meningkatkan umur simpan sayur dan buah. Akan tetapi beberapa komoditi tertentu ternyata memperlihatkan respon yang kurang baik terhadap perlakuan ini dan menimbulkan apa yang disebut erusakan dingin atau chilling injury. Dalam percobaan ini akan diamati jenis komditi yang kurang tahan terhadap kerusakan tersebut dan tanda-tanda kerusakan yang timbl dan sejak kapan timbulnya tanda-tanda kerusakan tersebut.

Alat dan BahanPerlatan yang digunakan pada percobaan ini adalah:

1. Ruang pendingin (dapat beruapa lemari es) dengan suhu 0 5 C.

2. Thermometer baik gelas maupun metal, untuk mengukur suhu ruang pendingin.

3. Hygrometer untuk mengukur kelembaban nisbi ruang pendingin.

Sampel yang digunakan adalah komiditi sayauran dan buah-buahan seperti alpukat, pisang, anggur, jambu biji, jeruk, pepaya, nenas, buncis, bit, kubis, wortel, mangga, bunga kol, seldri, jagung manis (berklabot dan sudah dikupas), mentimun, terong. Lobak, cabe merah dan cabe hijau.

Prosedura. Sayuran dan buah-buahan disortasi, komoditi yang masih baik diambil dan dicuci sampai bersih dan tiriskan sampai kering.

b. Simpan sayuran dan buah-buahan tersebut dalam ruang pengdingin (masing-masing komoditi diberi kotak karton terpisah).

c. Setiap hari catat suhu ruang pendingin, kelembaban nisbi, serta keadaan atau penampakan komoditi secara visual. Setiap ada penyimpangan dari keadaan normal dicatat dan juga hari keberapa penyimpangan tersebut.

H2SO4

37