MAKALAH PENGUJIAN REAL-TIME PCR UNTUK DETEKSI DAN KUANTITASI DNA BABI DAN SAPI DALAM CAMPURAN GELATIN DAN KAPSUL GELATIN

KELOMPOK 2 A

ANGGOTA :SANI PRADASARI AFIFAH (1112102000004) AAYU NOPITA (1112102000007) ADWI HARYATI (1112102000009) AKHAERUNNISA APRIANI (1112102000023) A

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI UIN SYARIF HIDAYATULLAHJAKARTAMARET 2015

PENDAHULUAN

Kehidupan seorang muslim berkaitan erat dengan konsep halal dan haram. Konsep ini bersifat menyeluruh karena tidak hanya diaplikasikan pada makanan dan minuman, namun juga untuk memperole nafkah, tata cara berpakaian, dan berkomunikasi dengan makhluk hidup lainnya (Riaz dan Chaudry, 2004).Dewasa ini teknologi pengujian dan keaslian suatu produk mengalami kemajuan yang pesat. Banyak metode analisa yang telah dikembangkan dan menawarkan hasil yang cepat dan dan otentik, salah satunya adalah metode berbasis DNA. Metode analisa dengan menggunakan DNA memiliki beberapa keuntungan, yaitu DNA dapat ditemukan di semua tipe sel pada pada suatu individu dengan informasi genetik yang identik. DNA merupakan molekul yang stabil dalam proses ekstraksi dan analisa DNA sangat mungkin dikerjakan dari beberapa tipe sampel yang berbeda (Jain, 2004).Real Time PCR adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real Time PCR (juga dikenal sebagaiquantitative real time polymerase chain reaction(Q-PCR/qPCR) yang digunakan sebagai teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.Real-Time PCR bekerja berdasarkan prinsip PCR (Polymerase Chain Reaction), namun berbeda dengan instrumen PCR konvensional, dengan Real-Time PCR, kita dapat mengamati proses penggandaan DNA target secara real-time dari satu siklus PCR ke siklus selanjutnya tanpa perlu melakukan elektroforesis (agarose) untuk melihat hasilnya. Real-Time PCR memiliki keunggulan daripada konvensional PCR yaitu pada Real-Time sistem pengukuran analisis menggunakan molekul probes yang dapat diukur pada tiap siklus reaksinya, pada konvensional PCR deteksinya memerlukan gel agarosa untuk proses elektroforesis DNA pada deteksi produk hasil amplifikasi DNA tersebut.Kelompok kami, yaitu 2A, mendapatkan jurnal yang memuat tentang pengujian Real-time PCR untuk deteksi dan penghitungan DNA babi dan sapi dalam campuran gelatin dan kapsul gelatin. Deteksi dan kuantitasi bahan dari spesies sapi dan babi dalam gelatin dan kapsul gelatin diperlukan untuk perhatian kesehatan dan untuk beberapa alasan religius. Perhatian pada produk sapi yang digunakan dalam gelatin telah berkembang sejak adanya Bovine Spongiform Encephalophaty (BSE), yang dikenal sebagai penyakit sapi gila.PCR kuantitatif (juga disebut qPCR atau PCR real time) penggunaannya telah meningkat untuk deteksi yang cepat, sensitif dan spesifik pada DNA spesies yang spesifik dalam berbagai produk yang diproses. Alat ini dapat mendeteksi DNA sapi dan babi serendah 1 pg/mL. Oleh karena itu, alat qPCR spesifik pada spesies babi dan sapi dideskripsikan disini sebagai alat uji DNA yang simpel, dapat diandalkan dan sensitif untuk penentuan dan kuantitasi spesies asal dari produk yang sangat diproses.

ALAT DAN BAHAN

Alat dan bahan yang digunakan untuk pengujian ini, yaitu :1. Gelatine Porcine2. Gelatine Bovine3. Gelatin Capsule Porcine4. Gelatin Capsule Bovine5. Nuclease free water6. MasterPure DNA Purification Kit7. Isopropanol8. Larutan Glycogen9. Porcine dan Bovine Genom DNA10. Probe porcine 5-(FAM)CCC AAC CCC CAA ACT GTC TCC T (ZEN)- 311. Probe Bovine 5-(FAM) TCC ACT GTT TCC CCA TCT ATT TGC CA (ZEN)312. Primer porcine 5-ATT TCC ATC CCA CAG CCC-3 (Forward) dan 5-AAC AGA TGC TGA CTC ACA GAC-3 (Reverse)13. Primer Bovine 5-CTA AGA TCA TGG CAT CAG GTC C- 3 (Forward) dan 5-CCC CAA AAT AAA GTC AGC CAC- 3 (Reverse)14. Genomic DNA Bovine15. Genomic DNA Porcine16. Larutan glycogen17. Larutan isopropanol18. Carrier tRNA19. PCR Real Time

METODELOGI PENELITIAN

Gelatin babi dan gelatin sapi dicampurkan satu dengan yang lainnya dengan persentase 0%,1%, 5%, 10%, 20% dan 40 % (w/w), dengan total berat campuran 2000 mg, lakukan secara bergantian.Kapsul Gelatin babi dan gelatin sapi dicampurkan satu dengan yang lainnya dengan persentase 50 % (w/w), dengan total berat campuran 1000 mgLarutkan gelatin dengan menambahkan 40 mL nuclease-free water dan diinkubasi pada suhu 65C selama 30 menit sampai benar-benar terlarut.Ambil 300 L larutan gelatin kemudian diisolasi menggunakan MasterPure DNA Purification.Tambahkan campuran tersebut dengan larutan isopropanol, gliserol, dan carrier tRNA agar terjadi presipitasi.Tambahkan larutan pelisis sel yang berisi proteinase K.Buatlah kurva standar dengan menguji genom DNA porcein dan bovine pada konsentrasi 1 mg/mL pada qPCR dengan melakukan 10 kali pengenceran.Pengujian DNA yang telah diisolasi dengan pcr real time sebanyak 40 siklus.

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Uji perkembangan alat qPCR yang spesifik untuk babi dan sapi Untuk mengetahui ketelitian dan keakuratan alat qPCR terhadap genom DNA babi dan genom DNA sapi dapat dilakukan dengan cara menguji campuran antara genom DNA sapi dan DNA babi yang telah diketahui kadarnya. Sebelumnya, untuk mencari kadar DNA babi dan DNA sapi dalam suatu campuran harus dilakukan pembuatan kurva standar baik kurva standar DNA babi maupun kurva standar DNA sapi. Hal ini dapat dilakukan dengan cara melakukan pengenceran 10 kali dari genom DNA babi maupun DNA sapi dimulai dari 1 pg/ml sampai 107 pg/ml. Kemudian masing masing konsentrasi di masukkan ke dalam alat qPCR dan dilihat hasilnya lalu dibuat kurva kalibrasi, kurva kalibrasi yang baik memilki linieritas yang linier ditandai dengan niali R (regresi linier) yang mendekati 0,9999. Berikut ini hasil dari kurva kalibrasi DNA babi (gambar A) dan DNA sapi (gambar B).

Dari hasil diatas diketahui bahwa pada nilai regresi linier DNA babi dan DNA sapi samasama bernilai R2 = 0,9981, sedangkan slope DNA babi -3,3987 dan DNA sapi -3,5248. Berdasarkan literatur nilai amplifikasi yang efisien bernilai antara 90 110% (Adam, 2006). Nilai amplifikasi ini dapar dicari dengan cara memasukkan nilai slope kedalam formula (efisiensi = 10-1/slope) 1), efisiensi qPCR DNA babi dan sapi yaitu 97 % dan 92%, hal ini berarti bahwa DNA babi dan DNA sapi sangat efisien untuk dilakukan pengujian menggunakan qPCR.

3.2 Deteksi dan penghitungan secara kuantitatif bahan babi dan sapi di dalam gelatin menggunakan qPCR. Untuk mengetahui keefektifan dan keakuratan alat qPCR dalam mendeteksi dan memberikan informasi mengenai kadar kandungan sapi dan babi dalam gelatin dalam jumlah yang besar dilakukan percobaan dengan cara mencampurkan gelatin babi dan gelatin sapi yang sebelumnya telah diketahui kadarnya yang tidak dapat dibedakan secara visual. Campuran gelatin sapi dan babi dicampurkan kemudian dibuat seri konsentrasi 0%, 1%, 5%, 10%, 20%, dan 40% (w/w). Berikut hasil dari percobaan antara campuran babi dan sapi dengan konsentrasi yang berbeda:

Tabel 1 : Tabel campuran gelatin babi dan sapi, dengan konsentrasi gelatin babi (porsine) yang lebih banyak

Tabel 2. Gambar campuran gelatin babi dan sapi, dengan konsentrasi gelatin sapi (bovine) yang lebih banyakPada gambar diatas terlihat bahwa pada konsentrasi gelatin sapi 100% dan babi 0%, DNA sapi dalam gelatin sapi yang terdeteksi pada qPCR 100% sedangkan DNA babi 0,00%. hal ini menunjukan bahwa q PCR sangat efektif dan akurat dalam mendeteksi dan menunjukan kadar suatu bahan meskipun dalam suatu campuran.

Gambar 1. Contoh perhitungan bovine 0% dan porcine 100%Pada gambar diatas terlihat bahwa pada konsentrasi gelatin sapi 0% dan babi 100%, DNA sapi yang terdeteksi pada qPCR 0,00% sedangkan DNA babi 100%. hal ini menunjukan bahwa qPCR mampu membedakan DNA sapi dan DNA babi pada suatu campuran sapi dan babi dengan sangat baik.

3.3. Pengujian qPCR untuk mendeteksi dan menghitung kandungan babi dan sapi dalam gelatin kapsul.QPCR juga dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengetahui kadar suatu bahan gelatin kapsul. DNA yang terdeteksi dalam gelatin kapsul (DNA babi dalam gelatin kapsul babi : 1.10 pg/mg, DNA sapi dalam gelatin kapsul sapi : 0.30 pg/mg). Hasil menunjukan bahwa DNA babi maupun DNA sapi yang terdeteksi pada gelatin kapsul sangat kecil, hal ini mungkin terjadi karena degradasi DNA pada saat pembuatan gelatin kapsul. Pada pencampuran sapi dan babi dalam kapsul gelatin dengan persentase 50 : 50, hasil menunjukan bahwa kadar sapi dalam kapsul gelatin sebesar 45% dan kadar babi dalam kapsul gelatin sebesar 55%. Hal ini menunjukan bahwa alat qPCR memiliki kesensitifan yang masih dapat diterima dalam gelatin kapsul.

KESIMPULAN

Alat QPCR dapat digunakan sebagai alat untuk mengonfirmasi ada atau tidaknya suatu spesies tertentu dalam gelatin dan kapsul gelatin dengan jumlah yang besar. Uji qPCR spesifik pada spesies babi dan sapi dijelaskan disini sebagai alat yang simpel, dapat diandalkan, dan uji DNA yang sensitif untuk menentukan spesies asli pada suatu produk yang diproses tinggi. Kuantitas DNA yang ditentukan mungkin tidak selalu mewakili jumlah bahan babi dan sapi yang spesifik karena data kuantitatif yang diperoleh hanya akan menjadi perkiraan. Hal tersebut disebabkan oleh tingkat degradasi DNA yang terjadi dan jumlah kopian DNA hewan yang satu dengan hewan yang lain dalam spesies yang sama dapat bervariasi.

DAFTAR PUSTAKA

Cai, Hui, et al. (2011). Real-time PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules. Elsevier Inc.Volume 25. Evira Vivikananda. (2014). Deteksi DNA babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal Polymerase Chain Reaction (ii-PCR). Skripsi Sarjana pada FKIK UIN Jakarta: tidak diterbitkan.