Pengobatan sukses Ebola Virus-Terinfeksi pada Monyet cynomolgus dengan Antibodi Monoklonal

Xiangguo Qiu,1 Jonathan Audet,2 Gary Wong,2 Stephane Pillet,1 Alexander Bello,2 Teresa Cabral,1 Jim E. Strong,1 Frank Plummer,1 Cindy R. Corbett,1,2,3 Judie B. Alimonti,1,2 Gary P. Kobinger1,2,3*

AbstrakEbola virus (EBOV) dianggap sebagai salah satu penyebab infeksi yang paling agresif dan mampu menyebabkan kematian pada manusia dan primata non-manusia (NHPs) dalam beberapa hari paparan. Strategi baru-baru ini telah berhasil mencegah infeksi di NHPs setelah pengobatan; Namun, strategi ini hanya berhasil bila diberikan sebelum atau beberapa saat setelah infeksi. Karya ini menunjukkan bahwa kombinasi dari tiga antibodi monoklonal penetralisir (mAbs) yang ditujukan terhadap selubung Ebola glikoprotein (GP) menghasilkan kelangsungan hidup lengkap (empat dari empat monyet cynomolgus) tanpa efek samping jelas ketika tiga dosis diberikan 3 hari terpisah mulai pada 24 jam setelah tantangan mematikan dengan EBOV. Perlakuan yang sama dimulai 48 jam setelah tantangan mematikan dengan EBOV mengakibatkan dua dari empat kera cynomolgus sepenuhnya pulih. Para korban menunjukkan sebuah EBOV-GP- humoral spesifik dan respon imun diperantarai sel. Data ini menyoroti pentingnya peran antibodi terhadap replikasi control EBOV in vivo, dan mendukung penggunaan mAbs terhadap infeksi filovirus yang berat.

Virus Ebola (EBOV) dapat menyebabkan infeksi fulminan dan perkembangan yang cepat sampai mati di hingga 90% dari manusia yang terinfeksi. Infeksi EBOV di manusia atau kera hasil dalam pengembangan gejala sisa klinis dengan tingkat tinggi kesamaan, membenarkan penggunaan kera sebagai Model yang relevan sebagian besar infeksi pada manusia (1, 2). Babi adalah satu-satunya lainnya hewan mematikan terinfeksi oleh EBOV non-disesuaikan; Namun, penyakit ini pada babi lebih pernafasan di alam, dan karena itu berbeda dari manusia (3). Monyet hijau Afrika, babun Hamadryad, cynomolgus kera, dan kera rhesus semuanya telah digunakan sebagai bukan manusia primata (NHP) model infeksi filovirus (2). Karena hijau Afrika monyet dan baboon Hamadryad agak tahan terhadap beberapa filoviruses, baik cynomolgus dan rhesus kera telah secara rutin digunakan untuk studi EBOV, dan keduanya menunjukkan penyakit yang sama profil untuk infeksi EBOV.Meskipun konsekuensi yang relatif rendah terhadap kesehatan masyarakat di seluruh dunia, EBOVinfections adalah masalah kesehatan masyarakat karena kematian yang tinggi Tingkat dan kurangnya profilaksis / intervensi terapeutik. baru-baru kemajuan dalam pengembangan vaksin terhadap EBOV mengakibatkan identifikasi beberapa strategi imunisasi yang berhasil untuk me-mount pelindung respon imun terhadap kera (4). The stomatitis vesikular virus (VSV) berbasis Ebola vaksin mengakibatkan perlindungan 50% di rhesus kera bila diberikan 20 sampai 30 menit setelah tantangan mematikan dengan EBOV (5). Temuan ini menunjukkan bahwa cepat bertindak intervensi terapeutik dapat dikembangkan untuk melindungi kera terhadap mematikan Paparan EBOV. Memang, protokol pengobatan lain yang disediakan hidup parsial kera telah diidentifikasi. Infus intravena kontinyu untuk 7 hari mulai 30 sampai 60 menit setelah infeksi EBOV dengan rekombinan manusia protein diaktifkan C (rhAPC), yang menghambat pembekuan darah dan peradangan sementara mempromosikan fibrinolisis, mengakibatkan 18% survival (6-9). Inhibitor lain koagulasi, nematoda rekombinan antikoagulan protein c2 (rNAPc2), menghasilkan 33% untuk bertahan hidup jika diberikan subkutan 10 menit atau 24 jam setelah EBOV tantangan dan diperlakukan setiap hari selama 14 atau 8 hari, masing-masing (10). Tipe lain dari terapi, terapi antisense virus RNA seperti EBOV, diuji menggunakan phosphorodiamidate oligomer morfolino bermuatan positif (PMOplus), yang merupakan antisense oligonukleotida sintetik analog yang mengganggu terjemahan dengan membentuk pasangan basa kopel dengan urutan RNA yang spesifik. PMOplus disampaikan oleh kombinasi dosis intraperitoneal dan subkutan dimulai 30 sampai 60 menit setelah Infeksi selama 10 sampai 14 hari menghasilkan 62,5% bertahan tantangan EBOV (11). Baru-baru ini, pemberian intravena harian kecil mengganggu RNA (Sirnas) menargetkan genom EBOV menunjukkan Tingkat kelangsungan hidup 66% dengan empat dosis intravena dan 100% dengan tujuh dosis (12). Khususnya, semua strategi ini diperlukan inisiasi dalam waktu 20 sampai 60 menit dari virus tantangan. Semua studi di atas untuk mempelajari pengobatan protokol dilaksanakan setelah infeksi dilakukan di rhesus kera lebih kera cynomolgus, terutama karena rata-rata waktu untuk mati di kera rhesus adalah sekitar 2 hari lagi (5, 12, 13), sehingga menawarkan lebih banyak waktu untuk intervensi klinis yang sukses. pasif Transfer antibodi juga telah diteliti untuk pengobatan EBOV, dengan hasil yang tidak konsisten (14). Awalnya, seluruh darah dari masa penyembuhan korban dari 1995 Kikwit wabah diberikan kepada pasien EBOV-positif menampilkan gejala. Sebuah perbaikan yang ditandai terlihat: Tujuh dari delapan pasien selamat. Namun, dalam studi kemudian, kera cynomolgus tidak dilindungi ketika diobati dengan dimurnikan imunoglobulin kuda G (IgG) dari kuda EBOV-hypervaccinated (15, 16). penetralisir yang antibodi monoklonal (mAb) KZ52 memberikan perlindungan lengkap dalam kelinci percobaan bila diberikan 1 jam sebelum atau setelah infeksi tetapi gagal untuk melindungi NHPs (17-19). Meskipun hasil yang tidak konsisten, ada bukti bahwa respon imun humoral awal yang kuat berkorelasi dengan survival (20-22). Oleh karena itu, kami dioptimalkan protokol pengobatan dengan tiga delapan EBOV glikoprotein (GP) mAbs -specific (1H3, 2G4, dan 4G7) yang sebelumnya dihasilkan dari tikus divaksinasi dengan VSVDG / EBOV-GP Vaksin (23, 24). Dalam enzim-linked immunosorbent assay (ELISA), mAb 2G4 terikat GP2, dan 4G7 terikat epitop di C-terminal porsi GP1 dari EBOV-GP, sedangkan 1H3 terikat pada GP larut (SGP) bagian (asam amino 1-295) (23). Tak satu pun dari ini mAbs EBOV-GP spesifik crossreactive dengan virus Marburg atau EBOV lainnya spesies tetapi bereaksi dengan EBOV lainnya strain. Secara individual, antibodi ini dilindungi tikus dan lebih efektif bila diberikan 24 atau 48 jam setelah infeksi dari pada 1 sampai 4 hari sebelum infeksi. meskipun individual antibodi yang kurang protektif pada marmut, kombinasi dari tiga antibodi (1H3 + 2G4 + 4G7: 15 mg / kg gabungan Total) sepenuhnya pelindung bila diberikan pada hari 2 setelah infeksi (24). Atas dasar keberhasilan kombinasi Terapi pada marmut, berikutnya Langkah itu untuk menguji koktail mAb di NHPmodel. Studi saat ini dibangun berdasarkan protokol pengobatan yang optimal dalam hewan pengerat eksperimen (24), menyajikan kombinasi tiga mAbs penetralisir (bernama ZMAb) untuk mengobati NHPs yang telah terinfeksi dengan EBOV, dan memeriksa kelangsungan hidup mereka, manifestasi klinis, dan kekebalan tubuh Menanggapi infeksi EBOV.

BAHAN DAN METODE Virus dan peptida EBOV galur Kikwit 95 diproduksi pada sel Vero E6 secara lengkap minimal esensial menengah (cMEM), 2% janin sapi serum (FBS), dan 1% penisilin / streptomisin. EBOV-EGFP (ditingkatkan neon hijau protein) adalah EBOV galur Mayinga encoding gen GFP reporter antara NP dan VP35 (37). Peptida (mencakup EBOV, regangan Kikwit 1995 GP) terdiri dari 15mers dengan 11 asam amino tumpang tindih. ada empat kolam peptida yang mengandung 42 peptida masing-masing sebagai berikut: pool 1 (asam amino 1 sampai 179), pool 2 (asam amino 180-347), pool 3 (asam amino 348-495), and pool 4 (asam amino 496-676).

hewan percobaan Sembilan laki-laki yang sehat atau cynomolgus perempuan kera (Macaca fascicularis; 2,5 sampai 4,9 kg) dari bersertifikat Kanada NHP koloni (Health Canada Hewan Resources Divisi, Ontario) menerima komersial monyet chow, memperlakukan, sayuran, dan buah buahan. Pengayaan peternakan terdiri mainan komersial dan stimulasi visual. Setelah aklimatisasi 10-hari, kera secara acak dibagi menjadi dua kelompok empat atas dasar rejimen pengobatan, ditambah satu NHP menerima PBS hanya sebagai kontrol positif untuk infeksi. masing Masing subjek menerima 1000 PFU (1 masing-masing ml menjadi dua situs intramuskular) dari EBOV di modifikasi media Eagle Dulbecco itu (DMEM). Pada waktu yang ditunjukkan setelah tantangan, subjek diperlakukan secara intravena dengan campuran mAb (ZMAb) (25 mg / kg) mengandung penetralisir tiga EBOV-GP-spesifik mAbs (1H3, 2G4, dan 4G7) sebagai Bolus lambat 5 ml dalam vena saphena. itu subjek dimonitor setiap hari dan mencetak untuk perkembangan penyakit dengan internal protokol filovirus skor disetujui oleh Kanada Science Centre untuk Manusia dan Kesehatan Hewan (CSCHAH) Komite Perawatan Hewan. Skor dinilai perubahan dari normal postur / aktivitas, sikap, tingkat aktivitas, feses / output urine subjek, makanan / asupan air, berat badan, suhu, respirasi, dan mencetak penyakit Manifestasi seperti ruam terlihat, perdarahan, sianosis, atau memerah kulit. Pengujian pada tanggal pemeriksaan yang dilakukan segera sebelum hewan menerima bolus ZMAb termasuk berat badan, suhu (dubur), darah, dan orofaringeal, hidung, dan usap dubur pada 1, 4, 7, 14, 21, dan 28 dpi untuk kelompok 24 jam dan pada 2, 5, 8, 14, 21, dan 28 dpi untuk Kelompok 48 jam. Pemeriksaan meliputi analisis hematologi (Animal Kontra darah, scil Vet abc) dan biokimia darah untuk albumin, ALP, ALT, amilase, nitrogen urea darah, antigen karbohidrat, kreatinin, globulin, glukosa, K +, Na +, fosfat, bilirubin total, dan protein (VS2 VetScan, Abaxis). Bertahan hewan disimpan sampai 28 hari. Penelitian pada hewan yang dilakukan pada kondisi CL4 dan disetujui oleh Komite Perawatan Hewan CSCHAH mengikuti pedoman Dewan Kanada pada Perawatan Hewan.Penetralisir EBOV-GP-spesifik mAb produksi dan pemurnian Penciptaan mAbs penetralisir EBOV-GP spesifik (1H3, 2G4, dan 4G7) telah dijelaskan sebelumnya (23). Untuk pemurnian mAb, awal kultur sel hibridoma yang tumbuh di RPMI 1640 (Invitrogen), 1mML-glutamin, 10% FBS, dan 1 penisilin / streptomisin (Invitrogen) dan kemudian diperluas di Hybridoma-SFM (Invitrogen), 1 mM L-glutamine, dan 1 antibiotik-antimycotic (Invitrogen) dalam botol rol pada 37 C dan 5% CO2 selama 7 sampai 14 hari. Supernatan diklarifikasi dengan sentrifugasi dan terkonsentrasi 10 kali lipat dengan Amicon Aduk sistem Sel [30-kD molekul cutoff berat (MWCO) filter, Millipore]. antibodi dimurnikan pada HiTrap Protein G HP kolom (GE Healthcare) dengan Protein A Binding Buffer dan IgG Elusi Buffer (Thermo Scientific) sesuai dengan instruksi produsen '. pecahan positif dikumpulkan dan buffer ditukar ke PBS dengan unit Centriprep (30-kD MWCO filter, Millipore). Kemurnian antibodi dinilai pada > 98% dengan elektroforesis gel SDS-poliakrilamida. Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA untuk monyet IgG, IgM, dan mouse IgG dilakukan pada NHP sera seperti yang dijelaskan sebelumnya (13). Tes dilakukan sekali dengan masing-masing sampel diuji dalam rangkap tiga. Untuk monyet IgG dan IgM, a sampel dianggap positif ketika absorbansi lebih tinggi dari mean ditambah 2 SD dari sebelum perlakuan kontrol negatif dari masing-masing monyet. Untuk kuantifikasi tingkat tikus IgG, kolam dari tiga antibodi pengobatan (2 mg / ml masing-masing, 6 mg / ml Total) adalah serial diencerkan dan digunakan sebagai standar. Nilai rata-rata dari hari 0 yang dikurangi dari rata-rata nilai ujian tanggal. EBOV titrasi The EBOV kultur jaringan median dosis infeksi (TCID50) titer virus ditentukan dengan menambahkan 10 kali lipat pengenceran serial seluruh darah sampel dari NHPs ke sel Vero E6. Uji ini dilakukan sekali dengan empat ulangan per pengenceran. Piring mencetak gol untuk efek sitopatik pada 10 dpi, dan titer dihitung dengan Reed dan Muench Metode. Untuk titer GEQ, RNA total diekstraksi dari darah dengan QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen). EBOV terdeteksi oleh kuantitatif RT-PCR dengan LightCycler 480 RNA Guru Hidrolisis Probe (Roche) assay menargetkan RNApolymerase (nukleotida 16.472-16.538, AF086833). Reaksi conditionswere sebagai berikut: 63 C selama 3 menit, 95 C untuk 30 s, dan bersepeda dari 95 C selama 15 s, 60 C selama 30 s untuk 45 siklus dengan StepOne Plus (Applied Biosystems). Batas deteksi yang lebih rendah untuk pengujian ini adalah 1 PFU / ml. Urutan primer adalah sebagai berikut: EBOVLF2 (CAGCCAGCAATTTCTTCCAT), EBOVLR2 (TTTCGGTTGCTGTTTCTGTG), dan EBOV LP2 FAM (FAM-ATCATTGGCGTACTGGAGGAGCAG). EBOV-penetralisir titrasi antibodi NHP sera yang tidak aktif pada 56 C selama 45 menit dan kemudian diencerkan secara serial dua kali lipat dengan DMEM dalam rangkap tiga sebelum inkubasi pada 37 C untuk 60 menit dengan volume yang sama EBOV-EGFP (100 PFU per juga). Campuran virus serum ditambahkan ke sel Vero E6 dan diinkubasi pada 37 C selama 48 jam. Lempeng tetap di 10% fosfat-buffer formalin, dan GFP tingkat yang diukur oleh fluoresensi plate reader (Imaging Advanced Devices). Serum pengenceran skor yang lebih besar tertinggi dari pengurangan 50% dalam ekspresi EGFP dianggap positif untuk antibodi, dan titer netralisasi dilaporkan sebagai kebalikan dari pengenceran ini. tes sitokin PBMC diisolasi dengan cara pengenceran darah utuh 1: 1 dengan PBS sebelum overlay ke Ficoll. Setelah sentrifugasi pada 750 g selama 45 menit, yang buffy coat dicuci dua kali dan kemudian disuspensi dalam (cRPMI) RPMI 1640, 0,1 mM MEM asam amino nonesensial, 1 mMsodium piruvat, 10 mM Hepes, 2 mM L-glutamine, 55 mM b-mercaptoethanol, 10% FBS, dan 1% penisilin / streptomisin. Tes IFN-g ELISpot (BD Bioscience) dilakukan sesuai protokol produsen (4), dengan 5 105 PBMC di cRPMI ditambah EBOV peptida pool (2,5 mg / ml), dan diinkubasi selama 18 jam. Spots divisualisasikan dengan AEC substrat (BD Biosciences) dan dihitung dengan Lempeng Pembaca ELISpot (AID Cell Technology). Frekuensi + CD4 atau CD8 + sel yang memproduksi IFN-g dan IL-2 dinilai dengan aliran cytometry dengan reagen BD Biosciences. PBMC, pada 106 sel per sumur di cRPMI dengan EBOV peptida pool (5 mg / ml) ditambah GolgiPlug (1 ml / ml). PBMC dirangsang semalam adalah diwarnai dengan anti-manusia klorofil CD4-peridinin protein-Cy5.5 antibodi tikus andCD8-allophycocyanin (klon L200 dan RPA-T8, masing-masing), diikuti dengan inkubasi 20-menit di Cytofix / Cytoperm. Sitokin intraseluler terdeteksi dengan pewarnaan dengan anti-manusia IFN-g-fluorescein isothiocyanate dan IL-2-phycoerythrin antibodi tikus (klon B27 dan MQ1-17H12, masing-masing) diencerkan dalam Perm / Wash penyangga. Kemudian, 300.000 peristiwa diperoleh (Accuri), dan data dianalisis dengan FCS Express bintang 4 (DeNovo Software). Urutan EBOV-GP Total RNA diekstraksi dari sampel darah 8-dpi dari NHP B2, B3, dan tantangan virus dengan Kit QIAamp Viral RNAMini (Qiagen). EBOV-GP diamplifikasi dengan OneStep RT-PCR Kit (Qiagen) menurut instruksi produsen. Kondisi reaksi adalah sebagai berikut: 50 C selama 30 menit, 95 C selama 15 menit, dan kemudian 39 siklus 95 C untuk 15 s, 50 C selama 30 s, dan 72 C selama 30 s. Pemurnian produk PCR dilakukan dengan QIAquick PCR Pemurnian kit (Qiagen) sesuai pabrikan instruksi dan sequencing pada Sequencer ABI 3720XL DNA dengan Terapan Biosystems BigDye Terminator Versi 3.1 Kimia. Urutan berkumpul dengan DNASTAR Lasergene 9 SeqMan perangkat lunak. Urutan primer adalah sebagai berikut: GP1,2 Xho I Fwd (1 sampai 18): GACCTCGAGATGGGCGTTACAGGAATATTG; GP1,2 Nhe I Rev (2030-2014): GACGCTAGCCTAAAAGACAAATTTGC; GP1,2 Fwd01 (264-285): CAGGTCCGGTGTCCCACCAAAGG; GP1,2 Fwd02 (528-546): CGCTGAAGGTGTCGTTGC; GP1,2 Rev02 (546 untuk 528): GCAACGACACCTTCAGCG; GP1,2 Fwd03 (757-776): CTGCTCCAGCTGAATGAGAC; GP1,2 Rev03 (746-721): GTGAATCTTGATTACCGTTGGACG; GP1,2 Fwd04 (1051-1070): GTTCAAGTGCACAGTCAAGG; GP1,2 Rev04 (1070-1051): CCTTGACTGTGCACTTGAAC; GP1,2 Fwd05 (1311-1330): GAGCAAGGGTACCGACTTCC; GP1,2 Rev05 (1330-1311): GGAGGTCGGTACCCTTGCTC; GP1,2 Fwd06 (1563-1582): GGATGAAGGTGCTGCAATCG; GP1,2 Rev06 (1582-1563): CGATTGCAGCACCTTCATCC; GP1,2 Rev07 (1835-1817): GGTTCGATACAGCAGTCCG statistika Untuk bertahan hidup, tes log-rank digunakan untuk menentukan signifikansi antara kelompok eksperimen dan kontrol, termasuk sejarah kontrol. Hasil ELISA dianggap positif ketika tes hasilnya lebih tinggi dari rata-rata ditambah 2 SD dari sebelum pengobatan kontrol negatif dari setiap monyet; Oleh karena itu, hasil yang positif berarti P 0,05.

HASIL pengamatan klinis Kera cynomolgus digunakan sebagai Model NHP untuk menguji apakah dan seberapa efektif pengobatan ZMAb bisa meningkatkan kelangsungan hidup bila diberikan setelah dosis tinggi infeksi EBOV. delapan cynomolgus kera secara acak ke dalam dua kelompok empat hewan (dua dari masing-masing sex) dan terinfeksi intramuskuler dengan 1000 plak unit pembentuk (PFU) dari EBOV (Gambar. 1A). Setiap kelompok kemudian diperlakukan intravena dengan tiga dosis dari mAb campuran (ZMAb) (25 mg / kg), yang terdiri dari penetralisir tiga EBOV-GP-spesifik mAbs (1H3, 2G4, dan 4G7). Meskipun dosis pada 15 mg / kg adalah 100% efektif dalam studi guinea pig (24), yang dosis pada 25 mg / kg dipilih karena dosis manusia diterima adalah antara 25 dan 50 mg / kg. Setiap dosis diberikan 3 hari terpisah, dengan satu kelompok mulai ZMAb perawatan di 24 jam dan kelompok lain pada 48 jam setelah tantangan. Sebuah 3-hari dosis protokol dipilih karena subjek dibius setiap kali, dan sedasi setiap hari kedua tidak akan membiarkan banyak waktu untuk pemulihan dan akan menjadi terlalu berat. Sebagai kontrol positif untuk infeksi EBOV, satu NHP ditantang 1000 PFU dari EBOV dan kemudian diobati dengan phosphate-buffered saline (PBS) pada hari 1, 4, dan 7. Untuk mengkonfirmasi pengiriman ZMAb, kami menentukan kadar serum IgG dengan ELISA pada 4, 7, dan 14 hari pasca-infeksi (dpi) dan 5, 8, dan 14 dpi untuk kelompok 24- dan 48-jam, masing-masing (Gambar. 1B). Sampel serum diambil segera sebelum hewan yang diterima bolus ZMAb. Ada tingkat variabel mAbs di Darah mulai dari 80 sampai lebih dari 1000 mg / ml sebelum kedua dan pengobatan ketiga pada 4 sampai 5 dan 7 sampai 8 dpi sebelum penurunan semua tapi satu binatang (B3) pada titik-titik waktu kemudian. Secara keseluruhan, dalam semua kasus, ada tingkat terdeteksi mAbs. Kelangsungan hidup subyek dipantau setiap hari, dan signifikan Perbedaan ditemukan pada kelangsungan hidup pengobatan 24- dan 48-jam kelompok (P = 0,0062) dibandingkan dengan kelompok kontrol dengan sejarah kontrol disertakan. Binatang kontrol PBS-diolah eutanasia pada hari ke-5 ketika skor klinis mencapai kriteria euthanization (Gambar. 1C). Kontrol hewan dikonfirmasi infeksi produktif setelah EBOV tantangan dengan waktu mati yang mirip dengan 12 hewan kontrol historis sebelumnya (rata-rata waktu sampai mati = 6,5 hari) dari studi Tantangan lain yang dilakukan dalam 16 bulan sebelumnya menggunakan stok virus yang sama dan kondisi (dosis, rute, dll) (Gambar. 1D). Dua hewan dari kelompok 48 jam (B3 dan B2) yang eutanasia di 8 dan 11 dpi, masing-masing, ketika mereka mencapai titik akhir manusiawi skor. Sisa enam hewan selamat dan sepenuhnya pulih meskipun bukti replikasi virus, meskipun dengan titer virus lebih rendah dari yang terlihat dalam yang nonsurvivors. Tingkat Terkemuka virus yang terdeteksi oleh real-time membalikkan transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR) dari darah semua diperlakukan hewan dengan pengecualian dari satu subjek (A2) pada kelompok 24 jam (Gambar. 1E). Kontrol dan dua hewan eutanasia memiliki genom setara angka (GEQ) copy di atas 104 partikel / ml darah, sedangkan hewan diperlakukan hidup tantangan dikembangkan viremia dari 102-104 GEQ / ml darah yang memuncak sekitar 7 dpi sebelum datang ke tingkat tidak terdeteksi hari 14 untuk semua kecuali satu hewan dari 48 jam group (B1) (Gambar. 1E). Virus menular itu ditemukan dengan membatasi analisis pengenceran dari sampel darah hanya dalam dua (A1 dan B1) dari enam korban pada 7 dan 8 dpi, masing-masing (Gambar. 1F). Ini adalah 1,25 log lebih rendah dari yang terdeteksi di nonsurvivors. partikel EBOV terdeteksi oleh RT-PCR di mulut, hidung, dan mukosa dubur dari yang nonsurvivors antara 4 dan 12 dpi tapi tidak di mukosa selamat pada setiap titik waktu (Tabel 1). Daerah ini dipilih sebagai tiga perwakilan situs shedding untuk sekresi mukosa di mana bisa mengandung virus yang dapat ditularkan kepada orang lain. Bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa korban memiliki titer virus lebih rendah dari nonsurvivors. Tanda-tanda klinis yang paling menonjol diamati pada nonsurvivors yang mengingatkan infeksi NHP EBOV khas dengan beberapa atau semua fitur berikut: demam, penurunan aktivitas, makanan rendah dan asupan air menyebabkan penurunan berat badan, dan tanda-tanda awal sesekali perdarahan kulit (seperti petechiae,. Gambar 2, A dan B, dan Tabel 2). Dua selamat (A4 dan B4) menunjukkan tanda-tanda penyakit termasuk dikurangi Kegiatan, makanan rendah / konsumsi air dengan penurunan berat badan, dan penurunan ekskresi feses. Skor klinis tetap relatif rendah untuk semua hewan lain (Gbr. 2C). Perubahan yang paling nyata dalam hematologi dan kimia darah yang diamati antara 5 dan 15 dpi di nonsurvivors menunjukkan leukocytopenia, jumlah trombosit rendah, dan tinggi enzim hati [SGPT (ALT) / alkaline phosphatase (ALP)] menunjukkan hematologi dan hati disfungsi umum terkait dengan infeksi EBOV (25). Sebaliknya, hematologi dan profil kimia darah sebagian besar tetap tidak berubah dalam korban dengan pengecualian dari trombositosis sementara antara 7 dan 21 dpi untuk semua kecuali satu hewan (A1;. Gambar 2, D ke F). Respon imun EBOV-GP spesifik Respon imun dipantau untuk melihat apakah ZMAb bisa memberikan sementara kontrol pada EBOV replikasi cukup lama untuk mata pelajaran untuk me-mount kekebalan protektif Tanggapan menyebabkan kelangsungan hidup. untuk mencirikan respon humoral, kami kadar antibodi penetralisir diukur dan jumlah tingkat IgM dan IgG antibodi mengikat EBOV-GP dari sampel serum oleh uji antibodi penetralisir atau ELISA, masing-masing. meskipun penetralisir Kegiatan antibodi dapat dikaitkan dengan baik ZMAb dan antibodi endogen, pemantauan IgM dan IgG adalah khusus ditujukan untuk endogen NHP respon antibodi menggunakan sekunder IgM atau IgG spesifik untuk antibodi NHP di ELISA tes. Tingkat signifikan (P 0,05) dari jumlah NHP IgM khusus untuk EBOV-GP terdeteksi awal dari 5 sampai 7 dpi dan tetap relatif konstan dalam semua selamat sampai 28 dpi (Gambar. 3A). Satu nonsurvivor (B3) memiliki tingkat IgM bawah deteksi uji limit, sedangkan nonsurvivor lain (B2) memiliki tingkat yang sebanding dengan orang-orang dari hewan lain selamat tantangan mematikan pada 5 dan 8 dpi, pada saat hewan ini mencapai titik akhir manusiawi dan eutanasia. Signifikan (P 0,05), tetapi variabel tingkat NHP IgG anti-EBOV-GP terdeteksi 8-21 dpi yang umumnya meningkat dari waktu ke waktu menjadi 28 dpi di semua hewan diperlakukan dengan pengecualian dari B2 nonsurvivor pada kelompok 48 jam (Gambar. 3B). Menetralisir kadar antibodi umumnya rendah, dengan titer timbal balik dari 1:10 sampai 1: 100 (. Gambar 3C), dibandingkan dengan sebelumnya Studi EBOV mana penetralisir yang lebih tinggi titerwas antibodi 1: 128-1: 512 (26-28) .the tingkat penetralisir memuncak sekitar 7 sampai 8 dpi sebelum berkurang ke tingkat yang tidak terdeteksi oleh 14 sampai 21 dpi.This assay tidak dapat membedakan antara antibodi penetralisir NHP dan ZMAb. Namun, EBOV khusus antibodi yang dihasilkan oleh NHPs harus meningkat pada saat ini, namun penetralisir kadar antibodi penurunan sebesar 14 sampai 21 dpi, karena itu menunjukkan bahwa penetralisir aktivitas wasmainly disediakan oleh ZMAb. Saat ini, kami tidak memiliki izin yang waktu untuk theZMAbs di cynomolgusmacaques. Ingeneral, penetralisir yang respon antibodi yang rendah tetapi humoral EBOV-GP spesifik Respon imun IgM dan IgG hadir dan kuat. Respon seluler-EBOV spesifik dievaluasi dengan dua metode dalam sel mononuklear darah perifer (PBMC) dari korban pada 21 dpi. Hari 21 dipilih karena volume yang lebih besar darah diperlukan untuk tes ini dan mata pelajaran yang lebih kecil (3 kg) dan sudah berdarah tiga kali dalam 8 hari pertama. Menambahkan darah besar menggambar pada hari ke-10 atau 14 mungkin bisa mengganggu pemulihan subjek dan oleh karena itu ditunda sampai hari 21. Sebuah immunospot enzyme-linked (ELISpot) assay digunakan untuk menentukan jumlah EBOV-GP- spesifik interferon-g (IFN-g) sel -producing di PBMC dirangsang dengan empat kolam dari EBOV-GP peptida yang mencakup seluruh GP. untuk menentukan apakah IFN-g produksi adalah khusus karena + CD4 dan Sel CD8 + T, kami melakukan aliran cytometric sitokin intraseluler pewarnaan (ICS) assay. The ELISpot uji menunjukkan terjadinya IFNg- sel mensekresi di PBMC dirangsang in vitro dalam semua kecuali satu hewan (A4;. Gambar 4A). Meskipun PBMC menanggapi semua empat peptida kolam dalam tiga dari empat kelompok 24 jam, respon dominan secara keseluruhan adalah untuk pool 3 (asam amino 347-495) diikuti oleh pool 2 (asam amino 180-347). Kelompok 48 jam menanggapi didominasi untuk kolam 2 dan 4, meskipun respon ke kolam renang 3 sedikit lemah. Arus cytometry analisis menunjukkan perbedaan antara hewan mengenai sub-populasi sel kekebalan yang bertanggung jawab untuk sintesis IFN-g (Gambar. 4B). Dua hewan (A1 dan A2) telah didominasi CD8 + IFN-g + sel, sedangkan korban A3 dan B1 memiliki lebih besar persentase CD4 + IFN-g + sel. B4 subjek memiliki CD4 + dan CD8 + IFN-g + sel, sedangkan A4 memiliki dasarnya tidak ada IFN-g respon. Meneliti CD8 + IFN-g respon keseluruhan menunjukkan bahwa PBMC menanggapi semua empat kolam peptida dalam semua NHPs kecuali A4, dengan kolam renang 3 (asam amino 347-495) dan 4 (asam amino 496-679) memunculkan persentase terbesar dari CD8 + IFN-g + sel (Gambar. 4C). itu CD4 + IFN-g respon juga luas, karena sebagian besar mata pelajaran merespon untuk semua empat kolam (Gambar. 4D). Namun, kolam tunggal tidak keseluruhan dominan. Interleukin-2 (IL-2), yang merupakan sitokin penting dalam cellmediated respon imun selama fase amplifikasi, ditemukan akan diinduksi kuat dalam menanggapi VSVDG / tikus EBOVGP-diimunisasi dalam penelitian sebelumnya (29). Oleh karena itu, persentase CD4 + dan CD8 + Sel mengekspresikan IL-2, IFN-g, atau keduanya diselidiki oleh ICS (Gbr. 5). Sebagian besar IL-2 + sel yang sangat CD4 +, meskipun kecil porsi CD8 + sel yang IL-2 + (Gambar. 5B). Sebaliknya, IFN-g ekspresi ditemukan lebih merata di kedua + CD4 dan sel CD8 +, dengan CD4 + sel kadang-kadang lebih dominan daripada sel CD8 +, dan sebaliknya (Gambar. 5C). Persentase CD8 + IFN-g + dan CD4 + IFN-g + sel juga memproduksi IL-2 pada umumnya 30% untuk CD8 dan 73% untuk CD4. Secara keseluruhan, ada tampaknya respon diperantarai sel EBOV-GP-spesifik yang kuat kekebalan pada 21 dpi dalam korban. Melarikan diri mutasi pada nonsurvivors ZMAb diobati Untuk mengetahui apakah dua nonsurvivors 48 jam yang diobati tidak dilindungi oleh perlakuan ZMAb karena mutasi melarikan diri, kita diekstrak EBOV virus RNA dari darah pada hari ke-8 untuk B2 dan Hari 11 untuk B3 dan dikenakan untuk analisis urutan. urutan yang dibandingkan dengan urutan tantangan virus. dua mutasi ditemukan di EBOV diisolasi dari B2 dan terletak di amino asam 275 dan 508 dari EBOV-GP (Gbr. 6). Mutasi ini tidak ditemukan dalam EBOV alam lainnya isolat ketika mencari GenBank. Di sisi lain, B3 tidak memiliki mutan melarikan diri. B3 itu eutanasia pada hari 11 karena alasan kemanusiaan karena kelumpuhan hindlimb. Namun, skor klinis untuk B3 membaik saat ini karena subjek mulai makan lebih banyak dan demam menurun (Gbr. 2, B dan C).

PEMBAHASAN Infeksi EBOV mengakibatkan tingkat kematian setinggi 90% .Dengan ada vaksin disetujui untuk digunakan manusia, ada kebutuhan mendesak untuk terapi protokol yang akan meningkatkan kelangsungan hidup pada manusia setelah terpapar. idealnya, pengobatan yang efektif dapat disampaikan setelah gejala muncul, tapi EBOV membunuh dengan cepat, memberikan waktu yang terbatas untuk campur tangan. arus terapi hanya telah 100% efektif jika diberikan dalam waktu 1 jam; Namun, kebanyakan orang yang hadir di klinik ketika gejala muncul beberapa hari setelah terinfeksi. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menemukan yang aman dan pengobatan yang layak yang secara signifikan akan meningkatkan kelangsungan hidup di kemudian hari titik waktu setelah infeksi. Penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian kombinasi tiga mAbs penetralisir ditujukan terhadap EBOV-GP bisa menyediakan 100% atau 50% perlindungan ketika diberikan 24 atau 48 jam setelah paparan, masing-masing. Pengobatan mengakibatkan beban virus yang lebih rendah, ringan gejala, dan tidak ada shedding. Fakta bahwa para korban menunjukkan terutama biokimia darah normal dan hematologi menunjukkan efektivitas pengobatan ZMAb dalam mencegah morbiditas, yaitu juga fitur yang diinginkan dari intervensi terapeutik. Selain itu, subjek mampu untuk me-mount terlihat humoral EBOV-GP-spesifik dan sel-dimediasi respon imun. CD8 + respon umumnya luas, tapi terutama terhadap peptida pool 3, yang mencakup asam amino 348-495 dari EBOV-GP. CD4 + respon juga luas namun agak setara untuk semua kolam renang peptida. Ini bukan mengejutkan karena NHPs yang outbred. Memang, ada kemungkinan bahwa pengobatan ZMAb mengurangi replikasi EBOV cukup lama untuk respon imun untuk mengembangkan. Secara keseluruhan, tingkat kelangsungan hidup 100% saat memulai pengobatan hingga akhir 24 jam adalah 24 kali lipat lebih baik daripada terapi saat ini yang memulai pengobatan dalam waktu 1 jam. Kemampuan untuk mencapai perlindungan 50% ketika pengobatan dimulai pada 48 jam setelah infeksi menunjukkan bahwa ZMAb disampaikan dalam periode ini juga dapat menjadi pilihan pengobatan yang layak. Selain dari Infeksi laboratorium disengaja, administrasi hidup hemat pengobatan mungkin terjadi beberapa jam jika tidak hari daripada menit setelah infeksi. Kera rhesus, yang memiliki waktu tertunda sampai mati lebih sesuai dengan infeksi manusia, lebih lanjut dapat meningkatkan persen hidup pada kelompok perlakuan 48 jam. Oleh karena itu, kapasitas untuk meningkatkan kelangsungan hidup dengan memulai pengobatan hingga akhir 48 jam adalah muka substansial atas protokol saat ini diterbitkan. Usaha-usaha sebelumnya untuk mengembangkan protokol pengobatan dengan mAb KZ52 (19) atau antibodi poliklonal (14-16) terhadap EBOV-GP memiliki gagal menyelamatkan macaques.When mematikan terinfeksi membandingkan sebelumnya protokol pengobatan mAb untuk pengobatan ZMAb, yang KZ52 manusia bisa gagal melindungi karena beberapa faktor (19). Pertama, Penelitian KZ52 digunakan kera rhesus, sedangkan penelitian ZMAb ini digunakan cynomolgus kera, membuka kemungkinan beberapa antarspesies perbedaan. Namun, ketika membandingkan ZMAb dan KZ52 di sama guinea pig Model, yang ZMAb lebih efektif, secara umum, daripada KZ52: The ZMAb memberikan perlindungan 100% jika diberikan 48 jam setelah tantangan dibandingkan dengan 1 jam untuk KZ52. Selain itu, EBOV terinfeksi kera cynomolgus mati 2 hari lebih awal dari kera rhesus, sehingga membuat intervensi yang sukses lebih sulit di cynomolgus yang Model. Bersama-sama, penelitian ini menunjukkan bahwa ZMAbs mungkin lebih berkhasiat dibanding KZ52. Kedua, ZMAbs dan KZ52 adalah isotipe yang berbeda: ZMAbs adalah tikus IgG2a, k dan IgG2b, k isotipe, sedangkan KZ52 adalah IgG1 manusia. Meskipun isotipe tikus diketahui berikatan dengan reseptor Fc manusia, mungkin ada perbedaan dalam paruh antara manusia dan mAb tikus di NHP. Waktu paruh dari KZ52 adalah 7 hari (18), tetapi ZMAb paruh saat ini tidak diketahui; Oleh karena itu, lanjut penelitian diperlukan untuk menggoda terpisah perbedaan fungsional. Akhirnya, ada perbedaan intrinsik dalam protokol pengobatan antara studi tersebut. The ZMAb pengobatan menggunakan tiga antibodi mengakui tiga wilayah yang berbeda GP, yang dapat membuat ZMAb lebih efektif dari KZ52, yang hanya mengakui satu epitop. Khususnya, studi KZ52 menggunakan dosis 50 mg / kg dibandingkan dengan dosis kami dari ZMAb dari 25 mg / kg dengan 8,3 mg / kg setiap mAb. Rejimen ini digunakan 25 mg / kg Total dari ZMAb, yang secara klinis Dosis yang relevan bagi pemerintah untuk manusia (30). Dalam studi yang dipublikasikan NHPs lainnya, antibodi poliklonal digunakan, dengan pasif transfer baik EBOV-kekebalan NHP whole blood (14) atau IgG kuda (15, 16) menjadi naif NHPs. Studi menggunakan poliklonal antibodi telah gagal untuk menyediakan lengkap perlindungan terhadap EBOV di NHPs. sampai Sampai baru-baru ini (31), penelitian ini menunjukkan terapi antibodi yang berhasil melawan Infeksi EBOV di NHPs dan karena itu sangat menunjukkan bahwa rejimen pelindung menggunakan monoklonal EBOV lain atau poliklonal antibodi dapat dikembangkan. Ada beberapa keterbatasan dipertimbangkan dalam penelitian ini. Menggunakan tiga penetralisir mAbs bukan dari satu untuk meningkatkan kelangsungan hidup adalah strategi yang efektif. Akan Tetapi, dari dua hewan yang mati dalam 48 jam kelompok, NHP B3 tidak memiliki melarikan diri setiap mutan, B2 dilakukan mutan melarikan diri dengan dua mutasi di EBOV-GP (asam amino 275 dan 508). Asam amino 275 bersesuaian ke situs mengikat 1H3 di SGP, sedangkan Asam amino 508 sesuai dengan 2G4 Situs mengikat dalam GP2, dan mungkin 4G7 situs mengikat dalam GP1 (23). Data ini menunjukkan bahwa terapi kombinasi mAb bisa mengakibatkan pemilihan melarikan diri mutan. Keterbatasan lain adalah bahwa Kontrol C1 diobati dengan PBS dan tidak IgG tikus yang tidak relevan. Oleh karena itu, kita tidak bisa secara resmi mengesampingkan kemungkinan nonspesifik efek terapi dari IgG tikus. Namun, dua hewan diperlakukan yang tidak bertahan hidup, B2 dan B3, memberikan tambahan pengendalian internal infeksi mematikan serta untuk efek nonspesifik antibodi tikus. potensi lainnya batasan adalah kami menggunakan kera cynomolgus, yang dapat menjelaskan beberapa perbedaan waktu kelangsungan hidup dari sebelumnya diterbitkan studi. meskipun sebagian besar studi untuk pengobatan EBOV setelah Infeksi telah menggunakan kera rhesus, baik cynomolgus dan kera rhesus adalah "standar emas" untuk infeksi EBOV. Namun, kapasitas untuk mencapai 100% bertahan hidup di cynomolgus lebih ketat Model kera menunjukkan bahwa pengobatan mungkin lebih kuat daripada saat ini digambarkan, dan bahwa perlindungan 100% mungkin dicapai dalam kera rhesus saat dikirim hingga akhir 48 jam setelah infeksi. Studi ini menyoroti kemampuan antibodi untuk mengendalikan replikasi EBOV di kera. Meskipun upaya berkelanjutan didedikasikan untuk identifikasi kekebalan parameter berhubungan dengan kelangsungan hidup Hewan atau manusia EBOV terinfeksi, tidak ada biomarker konsensus yang jelas telah diidentifikasi. Sebuah laporan baru-baru ini menunjukkan bahwa CD8 + Deplesi sel T mengurangi kelangsungan hidup monyet divaksinasi dengan adenovirusbased Ebola vaksin (32). Namun, hewan yang tidak bertahan di CD8 + - Kelompok habis juga memiliki miskin CD4 + T tingkat aktivasi sel sebelum penipisan. Studi saat ini juga gagal untuk mengkorelasikan Sel CD8 + T diaktifkan dengan hasil klinis. Sebaliknya, satu-satunya fitur umum diamati dalam nonsurvivors adalah ketidakhadiran produksi setidaknya satu antibodi isotipe (IgM atau IgG). menurut Plotkin (33) dan Jones et al. (34), keberhasilan transfer pasif ini antibodi harus berarti bahwa antibodi dapat digunakan sebagai penanda perlindungan. Selain itu, dalam studi saat ini, A4 subjek tidak memiliki respon seluler belum selamat infeksi. A4 itu, bagaimanapun, memiliki kuat respon antibodi, sehingga memberikan lebih banyak dukungan untuk hipotesis bahwa antibodi dapat digunakan sebagai penanda perlindungan. Temuan ini memiliki implikasi untuk mengembangkan mAbs masa depan terhadap tinggi virus patogen, bahkan mereka yang replikasi diduga dikendalikan oleh respon imun seluler. Secara konsisten, strategi sukses menggunakan mAb setelah Infeksi baru-baru ini dilaporkan terhadap Nipah dan virus Hendra (35). Gelombang baru ini pilihan pengobatan terhadap beberapa virus virus demam berdarah paling ditakuti mungkin memberikan solusi konkret untuk kedua kesehatan masyarakat dan keamanan hayati yang / sektor biosekuriti. Meskipun pertanyaan tetap mengenai berkelanjutan perlindungan terhadap paparan kedua EBOV setelah ZMAb pengobatan, menggabungkan ZMAb dengan strategi pengobatan eksperimental lainnya seperti siRNA, oligomer, vaksin berbasis adenovirus, dan efektifitas komparatif dari ZMAbs berbasis murine diperiksa di sini dengan manusiawi atau chimeric ZMAbs (36), penelitian ini mendukung pengujian dari ZMAb dalam uji praklinis. Selain itu, studi dosis dan penggabungan dari mAbs tambahan mungkin lebih meningkatkan efektivitas pengobatan. Bersama-sama, studi ini memperkuat potensi penggunaan mAbs sebagai pilihan pengobatan yang menjanjikan untuk infeksi filoviral parah.