PENGGUNAAN TEMBAKAN PARTIKEL ...oseanografi.lipi.go.id/dokumen/os_xxxix_3_2014-3.pdf23 Keberhasilan...

10
21 I) Bidang Sumberdaya Laut, Pusat Penelitian Oseanografi-LIPI dianjurkan rnengingat bibit yang dipergunakan terus mengalami penurunan kualitas sehingga basil panen yang diperoleh kurang maksimal. Sekarang sedang dikembangkan penyediaan bibit unggul rumput laut dengan metode yang lebih modern dengan harapan diperoleh bibit uoggul rumput laut yang berkualitas. Penggunaan metode yang lebih modern untuk penyediaan bibit unggul antara lain menggunakan metode transformasi genetik. Transformasi genetik merupakan alat yang ampuh tidak hanya untuk menjelaskan fungsi dan mekanisme reguJasi gen yang terlibat dalam berbagai peristiwa fisiologis, tetapi juga untuk membangun organisme yang membawa sifat- sifat tertentu yang kita harapkan. Penggunaan teknologi yang lebih modern dengan mengguna- kan transformasi genetik bertujuan untuk Rurnput laut merupakan salah satu komoditas unggulan perikanan yang memberikan masukan bagi devisa negara. Indonesia memiliki kondisi geografis berupa kepulauan dan memiliki pantai yang panjang sangat mendukung budidaya rumput laut. Kondisi ini meojadikan Indonesia sangat potensial untuk budidaya rumput laut. Namun demikian, bukan berarti budidaya rumput lautdi Indonesia tanpa mengalami kendala. Salah satu kendala yang sampai saat ini masih dihadapi adalah ketersediaan bibit unggul. Peoyediaan bibit unggul dapat di1akukan secara konvensional maupun dengan eara yang lebih modern. Penyediaan bibit unggul secara konvensional sudab kurang PENDAHULUAN PENGGUNAAN TEMBAKAN PARTIKEL PADA TRANSFORMASI GENETIK RUMPUT LAUT Oleb Tri Handayani" ABSTRACT lHEUSEOFPARTICLEBOMBARDMENTINSEAWEEDGENETICTRANSFORMA11ON. Particle bombardmentisaphysical method ofcell transformation.Thismethodcan be used in high density cell number.It is a versatile and effective transformationmethod, not limited by cell type, species or genotype. There are no intrinsic vector requirements so transgenes of any size and arrangement can be introduced, and multiple gene cotransformation is stralghtforward.A major advantage ofparticle bombardmentis that the delivered DNA can bemanlpulated to influence the qualityandstructureoftheresultanttransgeneloci.Particlebombardmentcanbeappliedeffectively for genetictransformationinseaweeds,suchas: Ulvapertusa, Laminariajaoonica, Undariapinnatifida, Kapaphycusalvarezii, Porphyravezoensis, Po lenera, Po okamurae,'p. onoi, Po variegate,.p. pseudolinearis, Graeilariagraeilis, andg. ehangii. Geneexpressioninthetransformationofseaweedusingparticle bombardment can be transient and stable. Based on their gene expression status, suggesting that genetic transformation usingparticle bombardment technique can be applied in seaweed. ISSN 0216-1877 Oseana, Volume XXXIX, Nomor 3, Tahun 2014: 21 - 29

Transcript of PENGGUNAAN TEMBAKAN PARTIKEL ...oseanografi.lipi.go.id/dokumen/os_xxxix_3_2014-3.pdf23 Keberhasilan...

21

I) Bidang Sumberdaya Laut, Pusat Penelitian Oseanografi-LIPI

dianjurkan rnengingat bibit yang dipergunakanterus mengalami penurunan kualitas sehinggabasil panen yang diperoleh kurang maksimal.Sekarang sedang dikembangkan penyediaanbibit unggul rumput laut dengan metode yanglebih modern dengan harapan diperoleh bibituoggul rumput laut yang berkualitas.

Penggunaan metode yang lebih modernuntuk penyediaan bibit unggul antara lainmenggunakan metode transformasi genetik.Transformasi genetik merupakan alat yangampuh tidak hanya untuk menjelaskan fungsidan mekanisme reguJasi gen yang terlibat dalamberbagai peristiwa fisiologis, tetapi juga untukmembangun organisme yang membawa sifat­sifat tertentu yang kita harapkan. Penggunaanteknologi yang lebih modern dengan mengguna­kan transformasi genetik bertujuan untuk

Rurnput laut merupakan salah satukomoditas unggulan perikanan yangmemberikan masukan bagi devisa negara.Indonesia memiliki kondisi geografis berupakepulauan dan memiliki pantai yang panjangsangat mendukung budidaya rumput laut.Kondisi ini meojadikan Indonesia sangatpotensial untuk budidaya rumput laut. Namundemikian, bukan berarti budidaya rumput lautdiIndonesia tanpa mengalami kendala. Salah satukendala yang sampai saat ini masih dihadapiadalah ketersediaan bibit unggul.

Peoyediaan bibit unggul dapatdi1akukan secara konvensional maupun denganeara yang lebih modern. Penyediaan bibitunggul secara konvensional sudab kurang

PENDAHULUAN

PENGGUNAAN TEMBAKAN PARTIKEL PADATRANSFORMASIGENETIK RUMPUT LAUT

Oleb

Tri Handayani"

ABSTRACT

lHEUSEOFPARTICLEBOMBARDMENTINSEAWEEDGENETICTRANSFORMA11ON.Particle bombardment is aphysical method of cell transformation.Thismethod can be used in highdensity cell number.It is a versatile and effective transformationmethod, not limited by cell type,species or genotype. There are no intrinsic vector requirements so transgenes of any size andarrangement can be introduced, and multiple gene cotransformation is stralghtforward.A majoradvantage ofparticle bombardment is that the delivered DNA can bemanlpulated to influence thequalityand structure of the resultant transgeneloci.Particle bombardmentcan be applied effectivelyfor genetic transformationinseaweeds,suchas:Ulvapertusa, Laminariajaoonica, Undariapinnatifida,Kapaphycusalvarezii, Porphyravezoensis, Po lenera, Po okamurae,'p. onoi, Po variegate,.p. pseudolinearis,Graeilariagraeilis, andg. ehangii. Gene expression in the transformation of seaweed usingparticlebombardment can be transient and stable. Based on their gene expression status, suggesting thatgenetic transformation usingparticle bombardment technique can be applied in seaweed.

ISSN 0216-1877Oseana, Volume XXXIX, Nomor 3, Tahun 2014: 21 - 29

22

Gambar 1.Prosedur transformasi genetik menggunakan teknik tembakanpartikeJ (Mikami et al., 2009).

bandal dan efisien. Teknik ini digunakan dilaboratorium di selurub duma untuk tujuanpeneJitian dan pengambangan untuk aplikasitertentu (Mikami, 2013). Selain disebut denganistilab tembakan partikel, teknik transformasi inidapat disebut juga dengan istilah tembakanmikroproyektil (microprojectile bombardment),perccpatan partikel (particle acceleration) danbalistik (ballistic) (Kikkert et al., 2004).

Transformasi dengan menggunakantembakan partikel secara umum memiliki prinsipyang sama seperti menggunakan Agrobacte­rium. Langkah-langkah yang diambil antara lain:(1) mengisolasi gen target dari organismesumber, (2) mengembangkan konstruksitransgenik fungsional yang terdiri dari gentarget, promoter, termonator dan gen penanda(marker) untuk memudahkan pelacakan gentarget di dalam sel inang, (3) memasukannya kedalam plasmid tertentu, (4) mengintroduksikan/mentransformasikan transgen ke dalam selinang, (5) meregenerasi sel inang yang sudabditransformasi dan (6) menguji performa atauekspresi gen pada skala lab, rumab kaca danlapangan (Gan, 1989).Prosedur transformasigenetik menggunakan teknik tembakan partikeldigambarkan pada Gambar 1.

Tembakan partikel merupakan teknikyang dapat digunakan untuk mengiintroduksi­kan DNA asing ke kultur sel. Teknik inimerupakan metode fisik dati transformasi seldengan kepadatan tinggi. Terdapat beberapametode tembakan partikel yang tersedia,kebanyakan melibatkan penggunaan "genegun", sebuah perangkat yang dirancang untukmemindahkan partikel ke dalam kultur sel secara

TEMBAKAN PARTIKEL (PARTICLEBOMBARDMEN1)

mendapatkan bibit rumput laut dengan sifat-sifatseperti yang diharapkan dan daJamjangka waktuyang lebih singkat,

Metode transformasi geneti1c yangsudab berkembang sekarang ini, salah satunyaada lab dengan teknik tembakan partikel.Tembakan partikel merupakan teknik transfermateri genetik ke sel atau jaringan denganmenggunakan prinsip fisika(Kikkert et al., 2004).Teknik ini sudab diujikan pada beberapa jenisrumput laut, baik rumput laut merah, coklat danbijau. Tulisan ini akan memaparkan informasitentang penggunaan teknik tembakan partikelpada transformasi genetik pada rumput laut.

23

Keberhasilan teknik tembakan partikelini dapat diketahui dengan menggunakan markerspesifik atau gen penanda. Selain meoggunakanmarker spesifik, dapat diketahui juga melaluiekspresi gen target. Jika DNA asing mencapaiinti, maka ekspresi transgen kemungkinandihasilkan dan transgen dapat stabil di dalamkromosom inang. DNA yang ditembakkan ke selinang sebagian akan lisis (apabila tidak tersisipdi dalam genom inang) dan sebagain akan stabildi dalam kromosom inang (Kikkert et 01.,2004).

Tembakan partikel juga memainkanperanan peoting dalaro transformasi organelseperti kloroplas, yang memungkinkan rekayasaorganel yang mengkodekan resisteosi atauketahanan terhadap herbisida dan pestisidapada tanaman dan untuk mempelajari prosesfotosintesis (Yao et 01., 2006). Penggunaantembakan partikel juga tidak:terbatas pada tiogkatsel, tetapi juga pada tingkat jaringan, danorganel (Kikkert et al., 2004) dan bahkan padakeseluruhan bagian tubub (thallus) rumput laut(Takahashi et al., 2010; Mikami et 01., 2009;Haddy et al., 2012).

pIaSIic discwith DNA­~coated gold partIdes

.... _ disc stopped by ~.....,..• •# ••• ~ ••

DNA-p coaled - •__I -gold particles -' • - -.. .... . . .,

• ••I

~ target p&anl cells

Gambar2. Diagram ilustrasitransfer gen menggunakan teknik tembakan partikel (gene gun)(Kikkert et al., 2004).

(mikroproyektil) dengan DNA plasmid. Partikelyang telah dilapisi, kemudian dilapisi padamakroproyektil yang dipercepat dengan tekananudara dan ditembakkan ke jaringan inang padapetri, seperti ditunjukkan pada Gambar 2. Sebuahpelat berlubang digunakan untuk mengbentikanmakroproyektil, semen tara itu mikroproyektildibiarkan masuk ke dalam sel-sel di sisi lain.Mikroproyektil masuk ke dalam sel, transgendilepaskan dari permukaan partikel dan dapatmasuk ke daJam DNA kromosom sel. Markerspesifik digunakan untuk mengideotifikasi sel­sel yang membawa transgen. Sel-sel tanamanyang ditransformasi kemudian diregenerasimenjadi taoaman utuh menggunakan kulturjaringan (Gan, 1989).

Tembakan partikcl atau biolistikmerupakan metode yang umum digunakanuntuk transformasi genetik tanaman danorganisme lain.Tembakan partikel menggunakanmikroproyektil berkecepatan tinggi untukmemindahkan substansi ke dalam sel ataujaringan. Untuk transformasi genetik, DNAdilapiskan di permukaan tungsten (wolfram)berukurao mikron atau partikel emas melaluipresipitasi dengan kalsium klorida danspermidin. Jutaan partikellogam yang dilapisiDNA ditembakkan ke sel atau jaringan targetmenggunakan perangkat biolistilc atau "genegun" (Gambar l)(Kikkert et 01.,2004).

Metode tembakan partikel dimulaidengan melapisi tungsten atau partikel emas

Spesies Status Promoter Marker Referensiekspresi

2enUlva pertusa Transien UprbcS EGFP Kakinuma et 01.

(2009).Lam inarlaJ!rjJpnica Transien CaMV35S GUS Qin et 01. (1998)-Laminaria japonica Stabil SV40 GUS Jiang et 01. (200_§)_Laminaria japonica Transien CaMV 35S, GUS Li el 01.(2009)

UBI,AMTLaminaria ~onica Stabil FCP GUS Li et 01. (2009)Laminariaj_{1p_onica Stabil SV40 HBsAg Jiang et 01. (200~Lam inaria j(J]J_onica Stabil SV40 Rt-PA Zhang et 01. (20081Lam inarlajcp_onica Stabil SV40 Bar Zhang et 01. (20081

Tabell. Transformasi genetik pada rumput laut dengan mengguoakan teknik tembakan partikel.

24

0/.,2008; Takahashi et 0/.,2010; Son et 01.;2012;Hirata et al., 2011a; &Hirataet al.;2011b), dan a­galactosidase (Wang etaI.,2010; Gan et 01.;2003;Gan et 01.,2004; Haddy et 01.,2012). Selainmenggunakan marker yang bervariasi, jugamengguoakao promoter yang bervariasi (Tabel1).Promoter yang seriog diguoakao antara lain:cauliflower mozaic virus 35S(Qin et aI., 1998;Liet 01.,2009; Kurtzman & Cbeney, 1991; Kuanget 0/.,1998; Fukuda et 01.,2(08), dan Simian virus40 (Jiang et 01.,2006;Jiang et 01.,2002; Zhang et01.,2008; Yu et 01.,2002; Wang et 01.,2010; Ganet 01.,2003; Gao et 01.,2004;Haddy et 01.,2012).Transformasi genetik pada rumput laut dengaomeoggunakan teknik tembakan partikel sudahberhasil dilakukan. Keberhasilan transformasiditandai dengan tersisipnya gen target ataumarker ke dalam genom rumput laut. Ekspresigen target yang disisipkan ke dalam genomrumput laut sebagian sudab bersifat stabil,walaupun masih ada yang bersifat transien(Tabell). Berdasarkan status ekspresi geonya,menunjukkan bahwa metode transformasigenetik deogan menggunakan teknik tembakanpartikel dapat diaplikasikan pada rumput lautdanmetode inicukup efektifuotuk diaplikasikan.

Teknik tembakan partikel pada rumputlaut secara umum masih mengguoakan markeratau gen penanda, belurn banyakmengarah pada

Metode tembakao partikel sudahbanyak diaplikasikan uotuk transfonnasi genetikpada rumput laut. Beberapa jeois rumput lauttelah berhasil ditransformasi dengan teknik iniantara lain: VIvapertusa(Kakiouma et 0/.,2009).Laminaria japonica (Qin et 0/., 1998; Jiang et01.,2006; Liet al., 2009; Jiang et 0/.,2002; Zhanget 0/.,2(08), Undariapinnati.fo:ld..Qinet 0/., 1998;Yu et 0/.,2002). Kapaphycus a/varezii(Kurtzman&Cheney, 1991; Wanget 0/., 2010), Porphyrayezoensis (Kuang et 01., 1998; Fukuda et 0/.,2008; Takahasbi et 0/.,2010; Mikami et 01.,2009;Uji et 0/.,2010; Son et 01.,2012; Hirata et 0/.,2011a; Hirata et 01.,2011 b),P. tenera(Son et 0/.,2012; Hirata et 0/., 2011a; Hirata et 0/. 2011b),Pokamurae, P. Onoi, P. variegate. P.pseudolinearis (Hirata et 01.,2011 a; Hirata et01., 20 IIb). Gracilaria gracilis (Haddy et 01.,2012), dan G changii (Gao et 01.,2003; Gan et01.,2004).

Berbagai gen atau marker telah berhasilditransformasikao ke dalam rumput laut (TabelI).Marker yang paling dominan digunakanadalah a-glucuronidase (Qin et 01.,1998; Jianget al.;l.OO6;Lietal..2009,Yu et01.;2002;Kw1zman& Cbeney, 1991; Kuaog et 01., 1998; Fukuda et

APLIKASITEMBAKAN PARTIKELPADARUMPUTLAUT

25

penggunaan gen penanda pada transformasi inibertujuan untuk mengetahui apakah tekniktembakan partikel dapat diaplikasikan padarumput laut. Selain itu,juga untuk mengetahuiefektivitas promoter yang digunakan dalamtransformasi.

transformasi gen potensial untuk tujuan spesifik(TabeJ 1).Penggunaan gen penanda (marker) inibertujuan untukmembedakan sel ataujaringanyang telah berhasil ditransformasi dan sel ataujaringan yang belurn berhasil ditransfonnasi. Halini menunjukkan bahwa secara umum,

Keterangan: UprbcS: Ulva pertusa- rubisco small subunit, EGFP: green flourescent protein,CaMV35S: cauliflower mozaic virus 35S, GUS: a-glucuronidase, SV40: Simian virus 40,UBI: Ubiquitin, AMT: adenin-metil transfer enzyme, FCP: fucoxanthin chlorophyll ale­binding protein, PyGAPDH: Porphyra yezoensis-glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,PyAct I:Porphyra yezoensis-actin I,PtHSP70; Porphyra tenera-heatshock protein 70, HBsAg; human hepatitis B surface antigen, Rt-PA: recombinanthuman tissue-type plasminogen, LacZ: a-galactosidase, PyGUS: Porphyrayezoensis­a-glucuronidase, AmCFP: cyan flourescent protein, ZsGFP: green flourescent protein,ZsYFP: yellow flourescent protein, sGFP: green flourescent protein.

Undaria pinnatifida Transien CaMV 35S GUS Qin et 01. (1998).Undariapinnatijida Transien SV40 GUS Yu et 01. (2002)Kappahycus alvarezii Transien CaMV35S GUS Kurtzman& Cheney

(1991)Ka .1. cus alvarezii Stabil SV40 lacZ Wang et 01. (2010)Porphyra yezoensis Transien CaMV35 S GUS Kuang et 01. (1998)Porphyra yezoensis Transien CaMV 35S, PyGUS Fukuda et 01. (2008)

PyGAPDHPorphyra yezoensis Transien PyActl PyGUS Takahashi et 01.

(2010)Porphyra yezoensis Transien PyActl AmCFP Mikami et al. (2009)Porphyra yezoensis Transien PyActl AmCFP, Uji et al. (2010)

ZsGFP, ZsYFP,sGFP

Porphyra Transien PtHSP70, PyGUS Son et 01. (2012)yezoensis&P. tenera PyGAPDHPorphyra yezoensis, Transien PyActl PyGUS, sGFP Hirata et 01. (2011a)P. tenera,P. okamurae, P. Onoi,P. variegate, &P. pseudolinearisPorphyra yezoensis, Transien PtHSP70 PyGUS Hirata et 01. (2011b)P. tenera;P. okamurae, P. Onoi,P. variegate. &P. pseudolinearisGracilaria changii Transien SV40 lacZ Gan et al. (2003)Gracilaria changii Stabil SV40 lacZ Gan et aI. (2004)Gracilaria gracilis Stabil SV40 lacZ Haddy et aJ. (2012)

26

Tcknik tembakan partikel cukup efektifdiapikasikan untuk transformasi geoetik padarum put laut. Tekn ik ini sudah banyakdipergunakan pada rum put laut denganmelibatkan promoter dan marker yang bervariasi.Beberapa rum put laut telah berhasilditransformasi dengan menggunakan teknik ini,antara lain: Viva pertusa, Laminariajaponica,Undaria pinnatifida, Kapaphycus alvarezii,Porphyra yezoensis, P. tenera, P. okamurae, p.onoi, P. variegate, P. pseudolinearis, Graci/ariagracilis, G changii. Hasil transformasi denganteknik tembakan partikel dapat diperoleh sampaigen target stabil di dalam genom inang,walaupun beberapa masih berupa transien. Halini menjadi tantangan bagi kita untukmengoptimalkan persentase transformasi sertameningkatkan kestabilan gen target di dalamgenom inang.

transformasi dengan bantuan Agrobacteriumberbeda, pada teknik ini terdapat faktor/genverulensi yang mengatur proses masuknya danterintegrasinya gen target ke dalam genom inangsehingga kcmungkinan gen target terpotongoleh enzim endonuklease inang sangat kecil (dela Riva et al., 1998; Tzfira et al., 2002; Tzfira &Citovsky, 2006). Penggunaan teknik tembakanpartikel relatiflebih mabal, hal ini disebabkanoleh prosesnya yang membutuhkan tungstenatau partikel emas untuk menembakan genetarget ke sel inang (Kikkert et al., 2004).

Keterbatasan teknik tembakan partikeldibandingkan dengan transformasi mengguna­kan bantuan Agrobacteriumadalab integrasinyasering terjadi beberapa salinan transgen dalamsatu situs penyisipan, penataan ulang gen yangdisisipkan dan pcnggabungan transgen dibeberapa situs penyisipan. Adanya beberapasalinan dapat menyebabkao terjadinyapembungkaman transgen pada keturunanberikutnya. Terjadinya pembungkaman transgenmenyebabkan gen target yang ditransformasi­kan tidak dapat terekspresi (Yao et al., 2006).

Penggunaan teknologi transformasigenetik memberikan banyak manfaat bagikehidupan manusia. Hal ini menjadikan beberapateknologi mulai banyak dikembangkan, semuadilakukan untukmempennudah kerja atau prosesdaJam mendapatkan organisme dengan sifat-sifattertentu yang diharapkan dengan tujuan utamauntuk kesejahteraan manusia. Begitu jugadengan teknik tembakan partikel, sudah banyakmengaJami pe:rkembangan untuk menyempurna­kan dan mengoptimaikan basil yang diperoleh.

Penggunaan metode transformasigenetik dengan tembakan partikel memilikibanyak kelebiban sekaligus kekurangan.Kelebihan metode ini adalah (I) metode inimerupakan metode transformasi genetik secaralangsung sehingga penggunaannya tidaktergantung pada organisme lain seperti bakteri,sebagai contoh adalah Agrobacteriumtumefaciens, (2) masuknya DNA ke dalam selinang tidak dibatasi secara biologis, tidakdibatasi oleh jenis sel, spesies dan genotipsehingga dianggap sebagai metode yangserbaguna dan efektif, (3) tidak ada persyaratanvektor intrinsik sehingga ukuran vcktor tidakmenjadi kendala (Altpeter et al., 2005). Selainitu metode ini memiliki efisiensi transformasiyang tinggi (Kikkert et al., 2004).

Selain memiliki kelebihan, tekniktembakan partikel ini memiliki beberapakekurangan an tara lain:kecenderunganmenghasilkan banyak transgen yangroengandung salinan gen target yang terpotong(tidak utuh), hal ini merupakan perbedaanmcndasar antara teknik tembakan partikel danteknik transformasi dengan bantuanAgrobacterium (Altpeter et al., 2005). Padateknik tembakan partikel tidak ada gen yangmengatur mekanisme masuknya dan teritegrasi­nya gen target ke dalam genom inang sehinggapenyisipan gen secara aeak dan kemungkinangen target terpotong oleh enzim endonukleaseinang cukup besar. Sedangkan pada teknik

KEf EBIHANDAN KEKURANGANPENGGUNAANTEMBAKAN PARTIKEL

KurtzmanA.M,&D.P. Cheney. 1991.Directgenetransfer and transient expression in arnarinered alga using the biolisticmethod. Journal of Phycology,27(Supplement) 42.

KikkertlR R.V.Jose& l.R Bruce. 2004. StableTransformation of plant cells by particlebombardmentlbiolostics. In: Pena, L(Eels).Method inMoleculer Biology, vol.286: 61-78. Humana Press Inc, Totowa,NJ.

Kakinuma M, M. Ikeda, D.A. Coury, H.Tominaga, I.Kobayashi, & H.Amano.2009.lsolationand characterization of therbcS genes from a sterile mutant of Ulvapertusa (Ulvales,Chlorophytea) andtransient gene expression using the rbcSgene promoter. Fisheries Science, 75(4):1015-1028.

Hirata R, W.J. Jeong, N. Saga, & K. Mikami.2011b.Heterologous activation ofthe Porphyra tenera HSP70 promoterin Bangiophycean algal cells.BloengineeredBugs,2(5): 272-274.

Hirata R, M. Takahashi, N. Saga, & K. Mikami.20 lla. Transient gene expression systemestablisbedin Porphyra yezoensis iswidely applicable in Bangiophyceanalgae. Marine Biotechnology, 13(5):1038-1047.

Annual Seminar of National ScienceFellowship2004,Bl008, 45-48.

Baddy S.M, A.E. Meyers, & V.E. Coyne. 2012.Transformation of lacZ using differentpromotersin the commercially importantred alga, Gracilaria gracilis. AfricanJournal of Biotechnology, 11(8): 1879-1885.

Gan S.Y, S. Qin, RY. Othman, D. Yu, & S.M.Pbang. 2004. Development of atransformation system for Gracilariachangii (Gracilariales, Rhodophyta),a Malaysian red alga viamicroparticlebombardment. The 4 th

Gan S.Y, S. Qin, RY. Othman, D. Yu, & S.M.Phang. 2003. Transient expression oflacZ in particlebombarded Gracilariachangii (Gracilariales, Rhodophyta).Journal of Applied Phycology, 15(4):351-353.

de laRiva G A, 1.Gonzalez-Cabrera, R ~uez­Padron, & C. Ayro-pardo. 1998.Agrobacterium tumefaciens: a naturaltool for plant transformation. ElectronJBiotechnol. 1 (3): 1- I6.

Fukuda S, K. Mikami, T. Uji, EJ. Park, T. Ohba,K. Asada, Y.Kitade, H. Endo.I. Kato, &N. Saga. 2008. Factors influencingefficiency of transient gene expressionin the red macrophytePorphyrayezoensis. PlantScience, 174(3):329-339.

Gan C. 1989.GeneGun Accelerates DNA-CoatedParticles ToTransform Intact Cells. TheScientist 3: 18-25.

Altpeter, F., N. Baisakh, R Beachy, R Bock, T.Capell, P. Christou, R Daniell, K.Datta,S. Datta, P.l nix, C. Fauquet, N. Haung,A Kohli, RMooibroek, L.Nicholson, T.T. Nguyen, G Nugent, K. Raemakers, A.Romano, DA. Somers, E. Stoger, N.Taylor & R. Visser. 2005. Particlebombardment and the geneticenhancement of crops: myths andrealities. Molecular Breeding, 15: 305-327.

DAFfAR PUSfAKA

28

Tzfira T. & V. Citovsky. 2006. Agrobacterium­mediated genetic transformation ofplants: biology and biotechnology. CurrOpin Plant Biotechnol. 17: 147-154.

UjiT,MTakahashi,N. Saga,& K Mikami. 2010.Visualization of nuclear localization oftranscriptionfactors with cyan and greenfluorescent proteins in the red algaPorphyra yezoens is .MarineBiotechnology, 12(2): 150-159.

WangJ, P. Jiang, Y.Cui, X. Deng, F. Li,J. Liu, &S. Qin. 2010. Genetic transformation inKappaphycus alvarezii using micro­particle bombardment: a potentialstrategy for germplasmimprovement.Aquaculture International, 18(6): 1027-1034.

Son SH, 1.W.Abo, T. Uji, D.W. Cboi, E.1. Park,M.S. Hwang, J.R. Liu, D. Choi, K.Mikami,& w.J. Jeong. 2012. Developmentof a transient gene expression system inthe red macroalga,Porphyra tenera.Journal ofApplied Phycology, 24(1): 79-87.

TakahasbiM, T.Uji,N. Saga,& K.Mikami.2010.Isolation and regeneration oftransientlytransfonned protoplasts fromgametopbytic blades of the marine redalga Porphyra yezoensis. ElectronicJournal ofBiotechnology. 13(2):622-628.

Tzfira T.,M. Vaidya & V. Citovsky, 2002.Increasing plant susceptibility toAgrobacterium infection byoverexpression of the Arabidopsisnuclear protein VIPI. Ce// BioI. 99 (16):10435-10440.

Mikami K, T. Uji, L.Li,M.Takahashi, H. Yasui,& N. Saga. 2009. Visualization ofphospboinositidesvia the developmentof the transient expression system of acyan fluorescentprotein in the red algaPorphyra yezoensis . MarineBiotechnology, 11(5): 563-569.

Mikami, K.20] 3. Current advances in seaweedtransformation.lntech, 13:323-347.

QinS,P. Jiang,X. Li,X. Wang, &C. Zeng. 1998.A transformation model for Laminariajaponica(Phaeopbyta, Laminariales).Chinese Journal 0/ Oceanology andLimnology, 16(1): 50-55.

Jiang p, S. Qin, & C.K. Tseng. 2002. Expressionof hepatitis B surface antigen gene(HBsAg) in Laminaria japonica(Laminariales, Phaeophyta). Chinese&ienceBu/letin,47(17): 1438-1440.

Jiang P, S. Qin, & C.K. Tseng. 2003. Expressionof the lacZreporter gene in sporophytesof theseaweed Laminaria japonica(Pbaeopbyceae) by gametophyte­targeted transformation.Plant CellReports, 21(12): 1211-1216.

Kuang M,SJ. Wang, Y.u,D.L. Shen, & C.K.Zeng. ]998. Transient expression ofexogenous GUSgene in Porphyrayezoensis (Rhodophyta). ChineseJournal 0/ Oceanology andLimnology, ]6(1): 56-61.

Li F, S.Qin, P. Jiang, Y.Wu, & w. Zhang. 2009.The integrative expression of GUS genedrivenby FCP promoter in the seaweedLaminaria japon/ca (Phaeophyta).Journal 0/ Applied Phycology, 21(3):287-293.

ZhangY.C, P. Jiang,J.T. Gao,J.M. Liao, SJ.Sun,Z.L.Shen,& S.Qin. 2008. Recombinantexpressionof rt-PA gene (encodingRetepJase) in gametophytes of theseaweed Laminaria japonica(LaminariaJes, Phaeophyta). Science inChina-Series C, Life sciences, 5](12):111~1120.

YaoQ,L. Cong,JL.Chang, K.X. Li, GX. Yang&GY.He. 2006. Low copynumber genetransfer and stable expression in acommercial wheat cultivar via particlebombardment. Joumal of ExperimentalBotany 57(14):3737-3746.

YuD, S. Qin, G Sun, & Z. Chengkui. 2002.Transient expression of 1acZ in theeconomic seaweedUndaria pinnatlfida.High Technology Letters, 12(8):93-95.

30