PENGEMBANGAN KANDIDAT BAHAN AKTIF … · Degenerasi kolagen tipe I disebabkan oleh degenerasi...

PENGEMBANGAN KANDIDAT BAHAN AKTIF ANTIPHOTOAGINGDARI BEBERAPA TUMBUHAN KOSMETIK TRADISIONAL INDONESIA

DODI DARMAKUSUMA

SEKOLAH PASCASARJANAINSTITUT PERTANIAN BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DANSUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Pengembangan KandidatBahan Aktif Antiphotoaging dari Beberapa Tumbuhan Kosmetik TradisionalIndonesia adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing danbelum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumberinformasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidakditerbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalamDaftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada InstitutPertanian Bogor.

Bogor, Januari 2014

Dodi DarmakusumaNIMB161080011

RINGKASAN

DODI DARMAKUSUMA. Pengembangan Kandidat Bahan Aktif Antiphotoagingdari Beberapa Tumbuhan Kosmetik Tradisional Indonesia. Dibimbing olehWASMEN MANALU, FRANS UMBU DATTA, AGIK SUPRAYOGI, danNASTITI KUSUMORINI.

Kulit merupakan organ terbesar yang bersentuhan langsung denganlingkungan. Paparan sinar matahari merupakan salah satu faktor lingkungan yangberpengaruh langsung pada kesehatan kulit dan dapat menyebabkan penuaan dini.Penuaan dini pada kulit yang disebabkan oleh paparan sinar ultraviolet (UV) darimatahari dikenal dengan istilah photoaging. Salah satu ciri photoaging adalahterbentuknya kerutan yang dalam sebagai gejala klinis pada kulit. Pembentukankerutan yang dalam pada kulit disebabkan oleh kerusakan dan degenerasi kolagen,khususnya kolagen tipe I. Kerusakan dan degenerasi kolagen tipe I padaphotoaging disebabkan oleh paparan radiasi UV. Kerusakan kolagen tipe Idisebabkan oleh peningkatan aktivitas matrix metalloproteinase-1 (MMP-1).Degenerasi kolagen tipe I disebabkan oleh degenerasi prokolagen tipe I akibatpaparan UV.

Penggunaan antiphotoaging merupakan salah satu cara untuk mencegahphotoaging. Mencegah terjadinya kerusakan dan degenerasi kolagen tipe Imerupakan tujuan penggunaan antiphotoaging. Salah satu cara populer untukmencegah photoaging adalah penggunaan bahan alami sebagai bahan aktifantiphotoaging. Pengembangan bahan alami sebagai bahan aktif antiphotoagingmerupakan aktivitas penting dalam ruang lingkup penelitian antiphotoaging.

Indonesia memiliki kekayaan sumber bahan kosmetik alami, khususnyatumbuhan kosmetik tradisional yang memiliki peluang untuk dikembangkansebagai bahan aktif antiphotoaging. Tujuan utama penelitian ini adalahmenentukan potensi khasiat dan mekanisme antiphotoaging kandidat ekstrakbahan aktif antiphotoaging dari beberapa bahan tumbuhan kosmetik tradisionalIndonesia. Penelitian ini terdiri atas tiga tahap penelitian, yaitu: (i) Penapisankandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging; (ii) Penentuan potensi khasiat danmekanisme kerja kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging; (iii) Karakterisasikandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging.

Tahap pertama penelitian ini adalah penapisan kandidat ekstrak bahanaktif antiphotoaging dari beberapa ekstrak tumbuhan kosmetik tradisionalIndonesia, yaitu: Temu Giring (Curcuma heyneana), Temu Ireng(Curcumaaeruginosa), Temu Putih (Curcuma zedoaria), dan Ki Urat (Plantagomajor).

Hasil penapisan kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging menunjukkanbahwa ekstrak Ki Urat dan Temu Ireng menghambat MMP-1 dalam sel HaCaTyang terpapar UV. Aktivitas antioksidan ekstrak memainkan peran penting dalamaktivitas penghambatan MMP-1. Fakta menunjukkan bahwa kedua ekstrakmemiliki aktivitas antioksidan yang tinggi pada konsentrasi ini.

Hasil penelitian pada tahap penelitian kedua menunjukkan bahwaperlakuan ekstrak Ki Urat menghambat ekspresi MMP-1 pada sel HaCaT yangterpapar UV. Persentase rataan ekspresi MMP-1 perlakuan Ki Urat (12.07 x 103

pixel) lebih rendah dibandingkan kontrol negatif (27.75 x 103 pixel). Hal ini

menunjukkan perlakuan ekstrak Ki Urat memiliki potensi untuk menghambatpembentukan MMP-1 yang disebabkan paparan sinar UV.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak Ki Urat berpotensi mencegahdegenerasi prokolagen tipe I yang disebabkan paparan sinar UV. Persentase rataanekspresi prokolagen tipe I perlakuan ekstrak Ki Urat (36.70 x 103 pixel) lebihtinggi dan berbeda nyata dibandingkan kontrol negatif (7.84 x 103 pixel). Rataanekspresi prokolagen tipe I pada perlakuan ekstrak Ki Urat tidak berbeda nyatadibandingkan kontrol (32.811 x 103 pixel). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrakKi Urat memiliki aktivitas menghambat penurunan pembentukan prokolagen tipeI pada kultur sel HDFs akibat paparan UV.

Intensitas fluoresensi DCF pada kontrol negatif dan perlakuan ekstrakmeningkat dibandingkan kontrol (2338.50). Rataan intensitas fluoresensi DCFpada perlakuan ekstrak Temu Ireng (6169.75) dan perlakuan ekstrak Ki Urat(5604.00) secara signifikan berbeda dan lebih rendah dibandingkan kontrolnegatif (8049.75). Kenyataan ini menunjukkan bahwa ekstrak menghambatproduksi ROS intraseluler dalam sel HDFs atau menunjukkan efek antioksidanintraseluler.

Hasil penelitian pada tahap ketiga menunjukkan bahwa ekstrak TemuIreng dan Ki Urat mengandung metabolit sekunder alkaloid, terpenoid, fenol, danflavonoid. Senyawa fenolik dalam ekstrak sebagai antioksidan memainkan peranpenting dalam mencegah photoaging. Senyawa ini dapat menghambatpembentukan MMP-1 dan menghambat penurunan pembentukan prokolagen tipeI akibat paparan UV.

Hasil penelitian menunjukkan kandungan total fenol ekstrak Temu Ireng(11.33 mg/gGAE) lebih rendah dibandingkan ekstrak KiUrat (16.93 mg/gGAE).Hal ini menyebabkan aktivitas antioksidan intraseluler dan kapasitas totalantioksidan ekstrak Temu Ireng lebih rendah dibandingkan ekstrak Ki Uratsehingga kemampuan ekstrak Temu Ireng dalam menghambat pembentukanMMP-1 dan menghambat penurunan pembentukan prokolagen tipe I lebih rendahdibandingkan ekstrak Ki Urat.

Fakta ini menguatkan dugaan bahwa kemampuan fenol dalam ekstrakuntuk mengatasi stres oksidatif dengan mekanisme antioksidan, sehingga dapatmencegah photoaging dengan menghambat pembentukan MMP-1 danmenghambat penurunan pembentukan prokolagen tipe I yang disebabkan paparansinar UV.

Hasil penelitian ini secara keseluruhan memberikan fakta-fakta ilmiahtentang potensi ekstrak Ki Urat sebagai bahan aktif antiphotoaging yang dapatmenghambat pembentukan MMP-1 dan menghambat penurunan pembentukanprokolagen tipe I akibat paparan sinar UV dengan mekanisme antioksidan yangmeredam radikal bebas yang terbentuk karena paparan sinar UV.

Kata Kunci: Antiphotoaging, MMP-1, Prokolagen Tipe I, Antioksidan, TemuGiring (Curcuma heyneana), Temu Ireng (Curcumaaeruginosa),Temu Putih (Curcuma zedoaria), Ki Urat (Plantago major).

SUMMARY

DODI DARMAKUSUMA. Development of Candidate of Antiphotoaging ActiveIngredients from Some Indonesian Traditional Cosmetic Plants. Supervised byWASMEN MANALU, FRANS UMBU DATTA, AGIK SUPRAYOGI, andNASTITI KUSUMORINI.

Skin is the largest organ that direct contact to the environment. Sunexposure is one of the environmental factors has adversely affect the health ofskin and causes a premature aging. Skin premature aging is caused by irradiationof sun ultraviolet (UV) and is known as a photoaging. The formation of coarselywrinkle on the skin is one of the photoaging characteristics. The formation ofcoarsely wrinkles on the skin is caused by the destruction and degeneration ofcollagen, particularly type I collagen. Destruction and degeneration of type Icollagen on photoaging are caused by the exposure to UV radiation. Destructionof type I collagen due to the increased activity of matrix metalloproteinase-1(MMP-1). Degeneration of type I collagen is caused by UV-induced degenerationof type I procollagen.

The usage of antiphotoaging is one of the ways to prevent photoaging.Prevention of the destruction and degeneration of type I collagen is one of thegoals of antiphotoaging treatment. The usage of natural products as activeingredients antiphotoaging is one of the most popular treatments to preventphotoaging. The development of natural products as active ingredientsantiphotoaging is an important activity in antiphotoging research area.

Indonesia has many natural cosmetic resources, particulary traditionalcosmetics plants that prospectively to be developed as an antiphotoaging activeingredient. The main purpose of this research is to determine the potential ofvirtues antiphotoaging virtues and mechanism of antiphotoaging active ingredientextract candidates from several Indonesian traditional cosmetics plants. Thisresearch consisted of three research stages, i.e.: (i) Screening of antiphotoagingactive ingredient extract candidates; (ii) Determination of potential ofantiphotoaging virtues and action mechanism of antiphotoaging active ingredientextract candidates; (iii) characterization of antiphotoaging active ingredientextract candidates.

The first research stage screened antiphotoaging active ingredient extractcandidates from several extract of Indonesian traditional cosmetics plants. i.e.:Temu Giring (Curcuma heyneana), Temu Ireng (Curcuma aeruginosa), TemuPutih (Curcuma zedoaria), and Ki Urat (Plantago major).

The result of screening of antiphotoaging showed that the Ki Urat extractand Temu Ireng extract inhibited extracellular MMP-1 expression in HaCaT cellsthat exposed by UV. The antioxidant activity of the extracts is an important role toinhibit MMP-1 formation. The fact showed both extracts had high antioxidantactivities at that concentration.

The result of the second stage of research showed that the Ki Urat extractinhibited UV induced MMP-1 expression in cultured HaCaT cells. The meanpercentage of relative expression of MMP-1 at the treatment of Ki Urat extract(12.07 x 103 pixel) was lower than that of negative control (27.75 x 103 pixel).

This facts showed the potential of Ki Urat extract to inhibit the UV-inducedMMP-1 formation.

The result of this research showed that Ki Urat extract was found to havean activity to prevent UV-induced degeneration of type I procollagen. The meanof expression levels of type I procollagen in Ki Urat (36.70 x 103 pixel) wassignificantly higher than that of the negative control (7.84 x 103 pixel). The meanof expression levels of type I procollagen in Ki Urat extract was not different fromthat of the control (32.81 x 103 pixel). This facts showed that the Ki Urat extractinhibited UV-decreased expression levels of type I procollagen in the HDFs cells.

The fluorescence intensity at vehicle group and extracts group increased ascompered to control (2338.50). The means DCFs fluorescence intensity oftreatment of Temu Ireng extract (6169.75) and treatment of Ki Urat extract(5604.00) were significantly different and lower than that of the vehicle(8049.75). This fact showed that the extracts inhibit UV-induced intracellularROS production in the HDFs cell or it showed that they had intracellularantioxidant activities.

The result of the third research stage showed Temu Ireng extract and KiUrat extract contained secondary metabolite, i.e.: alkaloids, terpenoids, phenols,and flavonoids. The presence of phenolic compounds in the extracts asantioxidants plays an important role in preventing photoaging. This compoundinhibited the formation of MMP-1 and inhibited degeneration of type Iprocollagen due to UV exposure.

The research result showed that the total phenol content of the Temu Irengextracts (11.33 mg / g GAE) was lower than Ki Urat extract (16.93 mg / g GAE).It caused the intracellular antioxidant activity and the total antioxidant capacity ofTemu Ireng extract was lower than those of extract Ki Urat, so the ability of TemuIreng extract to inhibit the MMP-1 formation and inhibit degeneration type Iprocollagen was lower than that of Ki Urat extract.

This fact reinforces the notion that the ability of phenols in the extracts toovercome the oxidative stress by antioxidant mechanisms, so it preventphotoaging by inhibiting the MMP-1 formation and degeneration of type Iprocollagen due to UV exposure.

The results of this study provided scientific facts about potential of the KiUrat extract as an antiphotoaging active ingredient to inhibits the MMP-1formation and the degeneration of type I procollagen due to UV exposure byantioxidant mechanisms that reduce free radicals due to UV exposure.

Kay Words: Antiphotoaging, MMP-1, Tipe I Procollagen, Antioxidant, TemuGiring (Curcuma heyneana), Temu Ireng (Curcumaaeruginosa),Temu Putih (Curcuma zedoaria), Ki Urat (Plantago major).

Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkanatau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atautinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentinganIPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis inidalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENGEMBANGAN KANDIDAT BAHAN AKTIFANTIPHOTOAGING DARI BEBERAPA TUMBUHAN

KOSMETIK TRADISIONAL INDONESIA

DODI DARMAKUSUMA

DisertasiSebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Doktorpada

Program Studi Ilmu-Ilmu Faal dan Khasiat Obat

SEKOLAH PASCASARJANAINSTITUT PERTANIAN BOGOR

2014

Penguji pada Ujian Tertutup: Prof. drh. Tutik Wresdiyati, PhD, PAVet

Dr. dr. Irma Herawati Suprapto, MS

Penguji pada Ujian Terbuka: Prof. Dr. Anas Subarnas, MSc, Apt

Dr. Dra. Hj. Ietje Wientarsih, M.Sc., Apt.

Judul Disertasi :Pengembangan Kandidat Bahan Aktif Antiphotoaging dariBeberapa Tumbuhan Kosmetik Tradisional Indonesia

Nama :Dodi DarmakusumaNIM :B161080011

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Prof. Wasmen Manalu, PhD, AIFKetua

Prof. Ir Frans Umbu Datta, M.App.Sc, PhDAnggota

Prof. Dr. drh. Agik Suprayogi, MSc, AIFAnggota

Dra. Nastiti Kusumorini, PhD, AIFAnggota

Diketahui oleh

Ketua Program StudiIlmu-Ilmu Faal dan Khasiat Obat

Prof. drh. Agik Suprayogi, MSc, PhD, AIF

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 5 Desember 2013 Tanggal Lulus:

Judul Disertasi : Pengembangan Kandidat Bahan Aktif Antiphotoaging dari Beberapa Tumbuhan Kosmetik Tradisional Indonesia

Nama : Dodi Darmakusuma NIM :B161080011

Disetujui oleh

Prof\v;-'-"-a-sm-en--:;"M7'a-n-a:-lu-,:::P~hD=-,AIF-:-::-::' r ProfIr Prans Umbu Datta, M.App.Sc, PhD Ketua Anggota

~-=:::>

Prof Dr drh Agik Suprayogi, MSc, AlP Dra Nastiti Kusumorini, PhD, AlP

Anggota Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi llmu-Ilmu Paal dan Khasiat Obat

Prof Dr drh Agik Suprayogi, MSc, AIF

Tanggal Ujian: 5 Desember 2013 . Tanggal Lulus: 2 8 JAN 201 ;

http:M.App.Sc

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa taala atassegala karunia-Nya sehingga disertasi ini berhasil diselesaikan. Judul yang dipilihdalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2010 ini ialahPengembangan Kandidat Bahan Aktif Antiphotoaging dari Beberapa TumbuhanKosmetik Tradisional Indonesia.

Disertasi ini merupakan wujud dari keinginan penulis untuk membagipengetahuan tentang permasalahan photoaging dan memberikan solusi ataspermasalahan tersebut dengan menggunakan kekayaan sumber daya alamIndonesia, khususnya kekayaan tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Ir. Wasmen Manalu, PhD, AIF,Prof. Ir. Frans Umbu Datta, M.App.Sc, PhD, Prof. Dr. drh. Agik Suprayogi, M.Sc,AIF, dan Dra. Nastiti Kusumorini, PhD, AIF sebagai pembimbing. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Prof. Jin Ho Chung atas dukungan fasilitasdan bimbingan riset selama penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasihkepada Yao Cheng MD, Dr. Park, Dr. Lee, Dr. MH Shin , Ge Eung, Mira Shi dansemua rekan-rekan dari Laboratory For Cutaneous Aging Research, ClinicalResearch Institute, Seoul National University Hospital, Seoul, Republic of Korea,atas persaudaraan, kerja sama dan saran teknis selama penelitian ini. Penulismengucapkan terima kasih kepada Bapak Tommy Julianto bin Bustami Effendidan Ibu Noor Meliza Jamil dari Biopharmaceutics and Pharmacokinetics,Universiti Teknologi MARA, Puncak Alam, Malaysia, atas bantuan yang luarbiasa selama riset ini berlangsung. Penulis mengucapkan terima kasih kepadaRektor Universitas Nusa Cendana dan Direkur Jenderal Pendidikan Tinggi sertaseluruh rakyat Indonesia atas dukungan pembiayaan Program Doktor ini.

Secara khusus penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak danMamah, keluarga, guru-guru, dan dosen-dosen yang pernah memberikan Ilmukepada penulis, Pimpinan dan Staf FKH IPB, Pimpinan dan Staf DepartementAnatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, rekan-rekan dari Universitas Nusa Cendanayang sedang berjuang di IPB, Ibu Dr. Martha Tilaar beserta jajaran PT. MartinaBerto Tbk., Yang Mulia Datuk Abdul Rahman, Mr. Mukmin (Mr. Kim), rekan-rekan pejuang devisa di Korea (Dain cs), Madam Park, Mr. Song, rekan-rekanProgram Studi Magister Ilmu Kimia UNPAD angkatan 1997, rekan-rekan stafLaboratorium Intrumentasi Kimia UPI, dan berbagai pihak yang membantupenyelesaian studi penulis.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2014

Dodi Darmakusuma

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL xiiDAFTAR GAMBAR xivDAFTAR LAMPIRAN xvi1 PENDAHULUAN 1

1.1 Latar Belakang 11.2 Tujuan Penelitian 31.3 Manfaat Penelitian 31.4 Tingkat Kebaharuan (Novelty) 31.5 Kerangka Pemikiran 3

2 PENAPISAN KANDIDAT EKSTRAK BAHAN AKTIFANTIPHOTOAGING DARI TUMBUHAN KOSMETIKTRADISIONAL INDONESIA

6

2.1 Pendahuluan 62.2 Bahan dan Metode 92.3 Hasil 132.4 Pembahasan 152.5 Simpulan 16

3 POTENSI KHASIAT DAN MEKANISME ANTIPHOTOAGINGDARI KANDIDAT EKSTRAK BAHAN AKTIFANTIPHOTOAGING TERPILIH

18


4 KARAKTERISASI METABOLIT SEKUNDER: UJI FITOKIMIA,PENENTUAN FENOL, DAN PENENTUAN FLAVONOID PADAEKSTRAK TEMU IRENG DAN EKSTRAK KI URAT

33


5 PEMBAHASAN UMUM 446 SIMPULAN DAN SARAN 49

6.1 Simpulan 496.2 Saran 49

DAFTAR PUSTAKA 50LAMPIRAN 59RIWAYAT HIDUP 94

DAFTAR TABEL

1 Rataan ekspresi MMP-1 pada aplikasi ekstrak terhadap sel HaCaT,kapasitas total antioksidan, dan nilai SPF ekstrak

14

2 Rataan ekspresi MMP-1 dan ekspresi prokolagen tipe I pada penentuanpotensi kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging dalammenghambat pembentukan MMP-1 dan menghambat penurunanpembentukan prokolagen tipe I

27

3 Rataan intensitas fluorocence DCF pada penentuan aktivitas antioksidanintraseluler

29

4 Hasil uji fitokimia ekstrak Temu Ireng dan Ki Urat 385 Rataan kandungan fenol dan flavonoid pada ekstrak Temu Ireng dan Ki

Urat38

6 Rataan persentase viabilitas sel HaCaT pada penentuan konsentrasiekstrak tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia tahap kedua

61

7 Rataan persentase viabilitas sel HaCaT pada paparan beberapa dosis UV 618 Ekspresi MMP-1 sel HaCaT pada penapisan potensi aktivitas penghambat

pembentukan MMP-163

9 Anova ekspresi MMP-1 sel HaCaT pada penapisan potensi aktivitaspenghambat pembentukan MMP-1

63

10 Hasil uji Duncan rataan ekspresi MMP-1 sel HaCaT pada penapisanpotensi aktivitas penghambat pembentukan MMP-1

63

11 Data kapasitas antioksidan ekstrak etanol beberapa tumbuhan kosmetiktradisional Indonesia dengan konsentrasi 100 ppm

64

12 Anova kapasitas antioksidan ekstrak etanol beberapa tumbuhan kosmetiktradisional Indonesia dengan konsentrasi 100 ppm

64

13 Hasil uji Duncan kapasitas antioksidan ekstrak etanol beberapa tumbuhankosmetik tradisional Indonesia dengan konsentrasi 100 ppm

64

14 Data hasil pengukuran SPF 6715 Anova hasil pengukuran SPFs 6716 Hasil uji Duncan rataan SPFs 6717 Rataan persentase Viabilitas sel HDFs pada perlakuan berbagai

konsentrasi larutan ekstrak Temu Ireng dan Ki Urat68

18 Rataan persentase viabilitas sel HDFs pada paparan beberapa dosis UV 6819 Ekspresi MMP-1 pada penentuan potensi kandidat ekstrak bahan aktif

antiphotoaging terpilih untuk menghambat pembentukan MMP-173

20 Anova ekspresi MMP-1 pada penentuan potensi kandidat ekstrak bahanaktif antiphotoaging terpilih untuk menghambat pembentukan MMP-1

73

21 Hasil uji Duncan ekspresi MMP-1 pada penentuan potensi kandidatekstrak bahan aktif antiphotoaging terpilih untuk menghambatpembentukan MMP-1

73

22.

Ekspresi prokolagen pipe I pada penentuan potensi penghambatanpenurunan pembentukan prokolagen tipe I kandidat ekstrak bahan aktifantiphotoaging

77

23 Anova rataan ekspresi prokolagen tipe I pada penentuan potensipenghambatan penurunan pembentukan prokolagen tipe I kandidat ekstrakbahan aktif antiphotoaging

77

24 Hasil uji Duncan rataan ekspresi prokolagen tipe I pada penentuan potensipenghambatan penurunan pembentukan prokolagen tipe I kandidat ekstrakbahan aktif Antiphotoaging

77

25 Absorbansi DPPH pada penentuan inhibition ioncentration 50 (IC50)ekstrak Temu Ireng

78

26 Data % Inhibisi radikal DPPH pada penentuan inhibition concentration 50(IC50) ekstrak Temu Ireng

78

27 Absorbansi DPPH pada penentuan inhibition concentration 50 (IC50)ekstrak Ki Urat

78

28 Data % inhibisi radikal DPPH pada penentuan inhibition concentration 50(IC50) ekstrak Ki Urat

79

29 Intensitas fluorocence DCF pada perlakuan dan kontrol 8030 Anova rataan intensitas fluorocence DCF 8031 Hasil uji Duncan rataan intensitas fluorocence DCF 8032 Hasil pengukuran absorbansi larutan baku gallic acid pada 730 nm 8333 Hasil pengukuran absorbansi ekstrak Temu Ireng dan ekstrak Ki Urat

pada 730 nm83

34 Nilai GAE ekstrak Temu Ireng dan ekstrak Ki Urat 8435 Hasil uji t rataan kandungan fenol total ekstrak Temu Ireng dan ekstrak Ki

Urat84

36 Hasil pengukuran absorbansi larutan baku quercetin pada 415 nm 8537 Hasil pengukuran absorbansi ekstrak Temu Ireng dan ekstrak Ki Urat

pada 415 nm85

38 Nilai QE ekstrak Temu Ireng dan ekstrak Ki Urat 8639 Hasil uji t rataan kandungan flavonoid total ekstrak Temu Ireng dan

ekstrak Ki Urat86

40 Komponen hasil kromatografi ekstrak Temu Ireng 8741 Komponen hasil kromatografi ekstrak Ki Urat 92

DAFTAR GAMBAR

1 Skema kerangka pemikiran 52 Kurva regresi yang menghubungkan konsentrasi larutan ekstrak Temu

Ireng dengan persentase TACDPPH28

3 Kurva regresi yang menghubungkan konsentrasi larutan ekstrak Ki Uratdengan persentase TACDPPH

28

4 Kromatogram hasil kromatografi gas ekstrak Temu Ireng 395 Kromatogram hasil kromatografi gas ekstrak Ki Urat 406 Mekanisme antiphotoaging ekstrak 467 Ekspresi MMP-1 pada penentuan dosis paparan UV yang diberikan pada

sel HaCaT62

8 Grafik pengukuran SPF Ekstrak Temu Giring 659 Grafik pengukuran SPF Ekstrak Temu Ireng 6510 Grafik pengukuran SPF Ekstrak Curcuma zeodaria 6611 Grafik pengukuran SPF Ekstrak Ki Urat 6612 Ekspresi prokolagen tipe I pada penentuan dosis paparan UV yang

diberikan pada sel HDFs.69

13 Pita ekspresi, surface plot dan interactive 3D surface plot MMP-1 padauji potensi kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging terpilih untukmenghambat pembentukan MMP-1 pada media kultur sel HaCaT ulangan1

70


71


72

16 Ekspresi prokolagen tipe I pada uji potensi kandidat ekstrak bahan aktifantiphotoaging terpilih untuk menghambat penurunan pembentukanprokolagen tipe I pada sel HDFs ulangan 1

74


75


76

19 Kurva baku larutan gallic acid 8320 Kurva baku larutan quercetin 8521 Sprektra massa Peak 40 waktu retensi 27.105 menit (a) dan spektra

massa rujukan (b)88

22 Sprektra massa peak 49 ekstrak Temu Ireng waktu retensi 28.288 menit(a) dan spektra massa rujukan (b)

89


89


89

25 Sprektra massa peak 74 ekstrak Temu Ireng waktu retensi 31.633menit (a) dan spektra massa rujukan (b)

90


90


90

28 Sprektra massa peak 82 ekstrak Temu Ireng waktu retensi 32.836 (a)dan spektra massa rujukan (b)

91

29 Sprektra massa peak 44 ekstrak Temu Ireng waktu retensi 32.836 (a)dan spektra massa rujukan (b)

91


91

31 Spektra massa peak 4 ekstrak Ki Urat waktu retensi 4.439 menit menit(a) dan spektra massa rujukan (b)

93

32 Spektra massa peak 66 ekstrak Ki Urat waktu retensi 29.380 menitmenit (a) dan spektra massa rujukan (b)

93

DAFTAR LAMPIRAN

1 Hasil Identifikasi Sampel 602 Penentuan Konsentrasi Larutan Uji dan Dosis Paparan UV pada Penapisan

Aktivitas Penghambatan Pembentukan MMP-161

3 Hasil Pengolahan Data Ekspresi MMP-1 Ekstraseluler Kultur Sel Hacatpada Penapisan Potensi Aktivitas Penghambat Pembentukan MMP-1

63

4 Data Hasil Penapisan Potensi Antioksidan 645 Grafik Hasil Pengukuran SPF 656 Hasil Pengukuran SPF 677 Penentuan Konsentrasi Larutan Ekstrak dan Dosis Paparan UV untuk

Penentuan Potensi Penghambatan Penurunan Pembentukan ProkolagenTipe I

68

8 Anaslisis Surface Plot dan Interactive 3D Surface Plot Ekspresi MMP-1pada Penentuan Potensi Kandidat Ekstrak Bahan Aktif AntiphotoagingTerpilih untuk Menghambat Pembentukan MMP-1

70

9 Data Hasil Penentuan Potensi Kandidat Ekstrak Bahan AktifAntiphotoaging Terpilih untuk Menghambat Pembentukan MMP-1

73

10 Anaslisis Surface Plot dan Interactive 3D Surface Plot EkspresiProkolagen Tipe I pada Penentuan Potensi Kandidat Ekstrak Bahan AktifAntiphotoaging Terpilih untuk Menghambat Penurunan PembentukanProkolagen Tipe I

74

11 Data Hasil Penentuan Potensi Penghambatan Penurunan PembentukanProkolagen Tipe I Kandidat Ekstrak Bahan Aktif Antiphotoaging

77

12 Data Hasil Penentuan Inhibition Concentration 50 (IC50) KandidatEkstrak Bahan Aktif Antiphotoaging

78

13 Data Hasil Uji Antioksidan Intraselular Kandidat Ekstrak Bahan AktifAntiphotoaging

80

14 Hasil Analisis Kualitatif Fitokimia pada Kandidat Ekstrak Bahan AktifAntiphotoaging

81

15 Penentuan Fenol Total 8316 Penentuan Flavonoid Total 8517 Hasil GCMS Ekstrak Temu Ireng 8718 Hasil GCMS Ekstrak Ki Urat 92

1

1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kulit merupakan organ tubuh yang bersentuhan langsung denganlingkungan luar. Kondisi lingkungan yang buruk akan berpengaruh langsungpada kesehatan kulit. Paparan sinar matahari merupakan salah satu faktorlingkungan yang dapat berpengaruh buruk pada kesehatan kulit dan menjadipenyebab utama penuaan dini (premature aging). Penuaan kulit didefinisikansebagai proses penurunan fungsi maksimum dan kapasitas cadangan kulit.Merujuk pada definisi penuaan kulit maka penuaan dini kulit dapatdidefinisikan sebagai proses penurunan fungsi maksimum dan kapasitascadangan kulit yang terjadi lebih cepat. Penuaan dini kulit yang disebabkanoleh paparan radiasi ultraviolet (UV) matahari secara berlebihan dikenaldengan istilah photoaging (Audonneau et al.1999; Fisher et al. 2002; Yaar etal.2002; Agius et al. 2007).

Radiasi UV didefinisikan sebagai radiasi elektromagnetik denganpanjang gelombang antara 100 dan 400 nm. Radiasi UV dibedakan menjadi 3kelompok panjang gelombang, yaitu UVA (320-400 nm), UVB (290-320 nm),dan UVC (100-290 nm). Radiasi UV dari sinar matahari yang mencapaipermukaan bumi terdiri atas 95-98% UVA dan 2-5% UVB, sedangkan UVCdiserap oleh lapisan ozon. Photoaging disebabkan oleh paparan radiasi UVAdan UVB dari sinar matahari (Herrling et al. 1999; Ho 2001; Edlich et al.2004; Chen et al. 2009; Masnec dan Pojube 2008).

Photoaging merupakan gejala kronis yang berlangsung dalam hitungandekade, namun photoaging harus dibedakan dari penuaan alami. Photoagingsecara klinik dan histologi sangat berbeda dari penuaan alami. Penuaan padakulit akibat photoaging memiliki karakteristik yang berbeda dari penuaanalami. Salah satu karakteristik photoaging pada kulit adalah kerutan yangdalam. Pembentukan kerutan yang dalam pada kulit ini disebabkan olehkerusakan dan penurunan pembentukan kolagen akibat paparan sinar UV(Nishigori et al. 2003; Chung 2003; Helfrich et al. 2008; Laga dan Murphy2009; Philips et al. 2009).

Kerutan kulit pada photoaging merupakan manifestasi dari kehilanganintegritas struktur kolagen matriks ekstraseluler dermis. Pada prosesphotoaging, terjadi kerusakan matriks ekstraseluler yang dapat diamati daripeningkatan ekspresi atau aktivitas matrix metalloproteinases (MMPs) yangmerusak struktur kolagen. Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) merupakanMMPs utama yang merusak kolagen tipe I sebagai komponen utama matriksekstraseluler dermis. Pada proses photoaging, selain terjadi kerusakan kolagentipe I akibat aktivitas MMP-1, juga terjadi penurunan pembentukan prokolagentipe I sebagai prekusor kolagen tipe I. Akumulasi kerusakan dan penurunanpembentukan kolagen tipe I pada photoaging ini menyebabkan terjadinyakehilangan integritas struktur kolagen matriks ekstraseluler dermis (Brodsky etal. 1994; Fisher et al. 1996; Fisher et al. 1997; Fisher et. al. 2009; Philips etal. 2009).

2

Photoaging pada kulit tidak hanya mengurangi fungsi normal kulit,tetapi juga mengurangi kecantikan kulit. Fungsi normal kulit sangat eratkaitannya dengan kesehatan tubuh secara keseluruhan. Kerutan yang terbentukpada photoaging sangat berpengaruh pada kecantikan kulit. Kecantikan kulitsangat erat hubungannya dengan rasa percaya diri yang berpengaruh padaperforma dan kinerja seseorang. Oleh karena itu, diperlukan suatu produkkosmetik yang dapat mencegah photoaging (antiphotoaging).

Pemakaian tabir surya (sunscreen) sangat disarankan untuk melindungikulit dari photoaging. Tabir surya merupakan standar utama yang selama inidigunakan untuk melindungi kulit dari kerusakan akibat paparan cahayamatahari, namun komposisi tabir surya kemungkinan menghasilkan radikalbebas ketika terpapar radiasi UV. Bahan kimia tabir surya dapat saja terserapoleh kulit dan berpotensi menyebabkan kerusakan kulit (Pinnell 2003; Cross etal. 2007; Mller et al. 2008). Pada kondisi ini, tabir surya tidak dapat berperandalam mencegah photoaging, tetapi justru berperan sebagai pencetusphotoaging. Oleh karena itu, diperlukan suatu bahan aktif yang dapatmencegah photoaging tanpa menyebabkan efek samping yang merusak kulitketika terpapar sinar matahari.

Penelitian dan pengembangan produk kosmetik antiphotoaging masihterus dilakukan. Tumbuhan merupakan sumber daya alami hayati yangpotensial untuk dikembangkan sebagai sumber bahan aktif antiphotoaging.Pengembangan bahan asal tumbuhan diharapkan dapat menghasilkan bahanaktif antiphotoaging yang dapat mencegah photoaging tanpa menyebabkanefek samping yang merusak kulit ketika terpapar sinar matahari.

Pengamatan awal dan penelusuran literatur memperoleh informasitentang beberapa bahan tumbuhan yang secara empirik telah digunakansebagai bahan kosmetik tradisional, antara lain: rimpang Temu Putih(Curcuma zedoaria), rimpang Temu Giring (Curcuma heyneana), rimpangTemu Ireng (Curcuma aeruginosa roxb), dan daun Ki Urat (Plantago major).Penelusuran literatur lebih lanjut belum menemukan informasi mengenaiupaya penapisan aktivitas antiphotoaging yang pernah dilakukan terhadapbahan tumbuhan tersebut.

Permasalahan yang perlu diselesaikan untuk mengembangkan bahanaktif antiphotoaging dari bahan tumbuhan kosmetik tradisional Indonesiatersebut adalah penentuan potensi dan mekanisme antiphotoaging sertapenentuan senyawa yang berkaitan dengan aktivitas antiphotoaging padabahan tumbuhan tersebut. Oleh karena itu, perlu dilakukan penapisan aktivitasantiphotoaging terhadap bahan tumbuhan kosmetik tradisional Indonesiatersebut. Penapisan ini dilanjutkan dengan penentuan potensi dan mekanismeantiphotoaging dari kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging. Penapisan inijuga diperkuat dengan karakterisasi kimia kandidat ekstrak bahan aktifantiphotoaging, khususnya terhadap senyawa yang berkaitan denganmekanisme antiphotoaging. Pada akhir penelitian diharapkan diperoleh suatukandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging yang diketahui potensi khasiat danmekanisme kerjanya.

3

1.2 Tujuan Penelitian

Tujuan utama penelitian ini adalah menentukan potensi khasiat danmekanisme antiphotoaging kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging daribeberapa bahan tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia. Berdasarkan tujuanutama tersebut, maka tujuan khusus penelitian ini antara lain: (i) Menentukankandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging dari rimpang Temu Putih,rimpang Temu Giring, rimpang Temu Ireng, dan daun Ki Urat; (ii)Menentukan potensi khasiat dan mekanisme antiphotoaging kandidat ekstrakbahan aktif antiphotoaging; (iii) Menentukan metabolit sekunder padakandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging yang terkait dengan mekanismeantiphotoaging.

1.3 Manfaat Penelitian

Manfaat utama penelitian ini adalah diperoleh suatu kandidat ekstrakbahan aktif antiphotoaging dari tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia yangdiketahui potensi dan mekanismenya dalam mencegah photoaging. Manfaatilmiah penelitian ini untuk pengembangan ilmu pengetahuan, antara lain: (i)Diperoleh fakta tentang ekspresi MMP-1 ekstraseluler kultur sel HaCaT padaaplikasi ekstrak etanol rimpang Temu Putih, rimpang Temu Giring, rimpangTemu Ireng, dan daun Ki Urat; (ii) Diperoleh fakta tentang potensi kandidatekstrak bahan aktif antiphotoaging dalam menghambat penurunanpembentukan prokolagen tipe I pada kultur sel Human Dermal Fibroblast(HDFs); (iii) Diperoleh fakta tentang aktivitas antioksidan intraselulerkandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging pada kultur sel HDFs di bawahpaparan sinar UV.

1.4 Tingkat Kebaharuan (Novelty)

Kebaharuan yang diperoleh dari penelitian ini adalah suatu kandidatekstrak bahan aktif antiphotoaging berupa ekstrak etanol tumbuhan kosmetiktradisional asal Indonesia dengan parameter penghambatan pembentukanMMP-1 dan penghambatan penurunan pembentukan prokolagen tipe I.

1.5 Kerangka Pemikiran

Penuaan kulit adalah proses penurunan fungsi maksimum dankapasitas cadangan kulit. Penuaan kulit yang disebabkan oleh paparan sinarUV pada kulit secara berlebihan dikenal dengan istilah photoaging. Salah satukarakteristik photoaging pada kulit adalah kerutan yang dalam. Terbentukkerutan yang dalam ini disebabkan oleh kerusakan kolagen tipe I oleh sinarUV (Chung et al. 1996; Fisher et al. 2002; Yaar et al. 2002; Nishigori et al.2003; Chung 2003; Agius et al. 2007; Helfrich et al.2008; Philips et al. 2009).

Pada proses photoaging terjadi kerusakan dan penghambatanpembentukan kolagen tipe I yang berakhir dengan pembentukan kerutan yangdalam pada kulit. Terdapat dua pengatur penting selama proses ini, yaituTransforming Growth Factor- (TGF-) dan Activator Protein-1 (AP-1).

4

Transforming growth factor- adalah suatu sitokinin yang memacupembentukan kolagen tipe I, sedangkan AP-1 merupakan suatu transcriptionfactor yang berperan dalam proses perusakan kolagen tipe I (Fisher et al. 1996;Exposito et al. 2002; Kadler et al. 2007; Dong et al. 2008; Helfrich et al. 2008;Philips et al. 2009; Fisheret al. 2009; Lee et al. 2009a).

Ketika kulit terpapar sinar matahari, radiasi UV diserap oleh molekulkulit dan menghasilkan suatu kelompok senyawa yang berbahaya yang biasadisebut sebagai reactive oxygen species (ROS). Akumulasi pembentukan ROSakan memacu kerusakan kolagen dengan memacu pembentukan AP-1 danmenurunkan aktivitas TGF-. Peningkatan AP-1 pada dermis dan epidermisyang menyebabkan peningkatan aktivitas MMP-1 yang selanjutnyameningkatkan perusakan kolagen tipe I. Penurunan aktivitas TGF-menyebakan penurunan pembentukan prokolagen tipe I. Hal ini menyebabkanterjadinya kerutan yang berasosiasi dengan photoaging (Fisher et al. 1999;Nishigori et al. 2003; Quan et al. 2004; Lin et al. 2005; Huang et al. 2007;Almaida et al. 2008; Dong et al. 2008; Helfrich et al. 2008; Lee et al. 2009a).

Untuk mencegah terjadinya photoaging, diperlukan suatu bahan aktifyang dapat menghambat terjadinya photoaging (Antiphotoaging). Bahan aktifantiphotoaging ini diharapkan menghambat pembentukan MMP-1 danmencegah penurunan pembentukan prokolagen tipe I akibat paparan UV.Eksplorasi terhadap bahan aktif antiphotoaging terus dilakukan, khususnyadari sumber bahan alami, termasuk dari bahan tumbuhan.

Indonesia memiliki banyak kekayaan sumber daya hayati tumbuhankosmetik. Rimpang Temu Putih, rimpang Temu Giring, rimpang Temu Ireng,dan daun Ki Urat merupakan bahan tumbuhan yang secara empirik telahdigunakan sebagai kosmetik tradisonal, namun hingga saat ini belum diketahuipotensinya sebagai bahan aktif antiphotoaging. Pengembangan bahantumbuhan kosmetik tradisional Indonesia tersebut sebagai bahan aktifantiphotoaging memerlukan upaya penapisan yang dapat memberikangambaran mekanisme kerja antiphotoaging. Berdasarkan tujuan penelitianyang akan dicapai, maka penelitian ini akan dibatasi pada tahapan-tahapanpenelitian sebagai berikut: (i) Penapisan kandidat ekstrak bahan aktifantiphotoaging. Tahap penelitian ini meliputi penapisan potensi aktivitaspenghambatan pembentukan MMP-1, penapisan potensi antioksidan, danpenapisan aktivitas tabir surya dari ekstrak etanol rimpang Temu Putih,rimpang Temu Giring, rimpang Temu Ireng, dan daun Ki Urat; (ii) Penentuanpotensi dan mekanisme antiphotoaging kandidat ekstrak bahan aktifantiphotoaging; (iii) Karakterisasi metabolit sekunder pada kandidat ekstrakbahan aktif antiphotoaging.

5

Gambar 1 Skema kerangka pemikiran

Bahan sintesisBahan alami

Kosmetik Tradisional

Temu Putih (Curcuma zedoaria)Temu Giring (Curcuma heyneana)Temu Ireng (Curcuma aeruginosa roxb)Ki Urat (Plantago major)

Aktivitas antiphotoaging?

Penapisan kandidat ekstrakbahan aktif antiphotoaging

Kandidat Ekstrak BahanAktif Antiphotoaging Terpilih

Penentuan potensi khasiatdan mekanismeAntiphotoaging

Karakterisasi

Kandidat Ekstrak Bahan Aktif Antiphotoagingyang diketahui potensi dan mekanismenya

6

2 PENAPISAN KANDIDAT EKSTRAK BAHAN AKTIFANTIPHOTOAGING DARI TUMBUHAN KOSMETIK

TRADISIONAL INDONESIA

2.1 Pendahuluan

Penuaan kulit merupakan proses biologi yang sangat kompleks.Penuaan kulit secara garis besar dibagi menjadi dua bagian, yaitu intrinsicaging (penuaan dari dalam) dan extrinsic aging (penuaan dari luar). Intrinsicaging sebagian besar ditentukan oleh faktor genetik. Extrinsic agingdisebabkan oleh faktor lingkungan, terutama paparan radiasi UV dari sinarmatahari. Penuaan kulit secara lebih rinci dibedakan menjadi 7 tipe, antaralain: kronologikal, genetik, photoaging, kebiasaan atau cara hidup, katabolik,endokrin, dan gravitasional. Tipe photoaging adalah penuaan kulit yangdisebabkan oleh paparan radiasi UV pada kulit secara berlebihan. Meskipunphotoaging bukan satu-satunya penyebab penuaan dini pada kulit, tipe penuaanini sangat populer sebagai bentuk penuaan dini pada kulit, sehingga penuaandini pada kulit sering kali diasosiasikan sebagai photoaging (Jenkins 2002;Agius et al. 2007).

Bagian kulit tubuh yang terpapar sinar matahari akan mengalamikedua proses penuaan, baik intrinsic aging dan terutama extrinsic aging.Pengaruh paparan radiasi UV dari matahari sangat besar dalam proses extrinsicaging dan menjadi penyebab utama penuaan dini pada bagian kulit ini,sehingga pada bagian kulit tubuh ini photoaging mendominasi proses penuaankulit (Gilchrest 1989; Jenkins 2002; Chung et al. 2002a; Chung et al. 2002b;Seo dan Chung 2006; Agius et al. 2007; Fisher et al. 2009).

Photoaging harus dibedakan dari penuaan alami. Secara klinik danhistologi, photoaging sangat berbeda dari penuan alami, meskipun keduanyaberlangsung dalam hitungan dekade. Photoaging merupakan proses biologiskompleks yang mempengaruhi berbagai lapisan kulit dan menyebabkankerusakan besar pada jaringan ikat dermis. Kerusakan besar pada jaringan ikatdermis ini berasosiasi dengan kerutan kulit. Kerutan kulit pada kulit akibatphotoaging lebih dalam dan kasar dibandingkan kerutan kulit pada prosespenuaan alami. Terbentuknya kerutan yang dalam ini disebabkan olehkerusakan kolagen akibat paparan radiasi UV (Chung et al. 2002a; Nishigoriet al. 2003; Chung et al. 2003; Helfrich et al. 2008; Laga dan Murphy 2009;Jang et al. 2011).

Semua segmen radiasi UV dapat menyebabkan kerusakan pada kulit.Radiasi UVC memiliki daya penetrasi kuat ke dalam kulit, namun segmen UVini dihalangi oleh lapisan ozon atmosfer. Radiasi UVA memiliki energi yanglebih kecil dibandingkan UVB namun penetrasinya ke dalam kulit jauh lebihdalam. Radiasi UVA dan UVB menyebabkan efek photoaging (Herrling et al.1999; Edlich et al. 2004; Masnec dan Pojube 2008; Chen et al. 2009).

Dasar patofisiologi photoaging pada kulit manusia belum dipahamidengan baik (Laga dan Murphy 2009), namun telah banyak penelitian yangbertujuan untuk mengembangkan tindakan preventif photoaging. Mencegahterjadinya keriput pada kulit merupakan inti dari tindakan preventif photoaging

7

yang dikaji dalam banyak penelitian. Hal ini berkaitan dengan efek radiasi UVpada kerusakan dan penghambatan pembentukan (degenerasi) kolagen tipe Isebagai penyebab timbulnya kerutan pada kulit yang mengalami photoaging.

Eksplorasi terhadap bahan yang dapat mencegah photoaging(antiphotoaging) merupakan aktivitas utama pada penelitian yang berorientasipada tindakan preventif photoaging. Eksplorasi bahan potensialantiphotoaging terus dilakukan terhadap bahan kosmetik yang telah adamaupun terhadap bahan baru, termasuk bahan kosmetik alami yang berasaldari bahan tumbuhan. Berdasarkan penelusuran literatur yang dilakukan,belum diperoleh informasi tentang upaya eksplorasi bahan aktifantiphotoaging dari tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia. Hal inimerupakan peluang yang harus segera dimanfaatkan untuk mengoptimalkankekayaan sumber daya hayati Indonesia.

Pengembangan tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia sebagai bahanaktif antiphotoaging diawali dengan penapisan terhadap aktivitaspenghambatan pembentukan MMP-1, aktivitas antioksidan, dan aktivitas tabirsurya. Terdapat hubungan yang erat antara ketiga parameter ini dalam prosesphotoaging dan pencegahan photoaging.

Peran MMP-1 dalam photoaging berkaitan dengan terbentuknyakerutan pada kulit sebagai ciri utama photoaging. Kerutan pada kulit ini terjadiakibat kerusakan dan penghambatan pembentukan matriks ekstraseluler akibatpeningkatan aktivitas enzim-enzim MMPs. Matrix metalloproteinasesmerupakan kelompok enzim-enzim matrix-degrading yang berperan pentingpada berbagai proses penuaan kulit. Matrix metalloproteinases utama adalahMMP-1. Matrix metalloproteinase-1 merupakan suatu enzim utama yangbertanggung jawab atas kerusakan kolagen tipe I. Kolagen tipe I merupakanhasil sintesis sel fibroblast yang menjadi komponen utama matriksekstraseluler hewan. Oleh karena itu, MMP-1 memiliki peran yang sangatbesar dalam kerusakan matriks ekstraseluler (Exposito et al. 2002; Chung2003; Seo dan Chung 2006; Kadler et al. 2007; Helfrich 2008; Dong et al.2008; Philips et al. 2009; Pluemsamran et al. 2012).

Paparan radiasi UV menginduksi MMPs pada berbagai sel, sepertikeratinocyte dan fibroblast. Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwapaparan radiasi UV pada kultur biakan sel fibroblast maupun secara in vivodapat menyebabkan peningkatan MMP-1 dan menurunkan pembentukankolagen tipe I. Hal ini memberikan kontribusi nyata pada photoaging.Pemahaman mengenai peran MMP-1 dalam photoaging dapat dimulai darikajian tentang pembentukan kolagen tipe I. Fibroblast dermal membuatprokolagen tipe I yang kemudian dikonversi menjadi kolagen tipe I.Peningkatan MMP-1 terkait erat dengan keberadaan ROS. Pembentukan ROSini menjadi pencetus aktivitas AP-1 selama proses photoaging. Peningkatanaktivitas AP-1 memacu MMP-1 yang berakhir dengan perusakan kolagen danpenurunan sintesis kolagen (Chung et al. 2003; Sies dan Stahl 2004; Kim et al.2005; Seo dan Chung 2006; Helfrich et al. 2008).

Peran antioksidan dalam mencegah photoaging berkaitan dengankemampuan meredam radikal bebas yang dipicu oleh paparan UV. Antioksidandidefinisikan sebagai senyawa yang dapat memperlambat, menghambat,mencegah oksidasi suatu senyawa dengan meredam radikal bebas.

8

Pembentukan radikal bebas yang dipicu oleh paparan UV dimulai dariinteraksi foton dengan asam trans-urokanik atau komponen kimia lainnya padakulit sehingga membentuk oksigen tunggal. Oksigen tunggal dapatmenghasilkan oksigen radikal bebas yang menyebabkan kerusakan oksidatifpada berbagai komponen seluler dan berperan penting sebagai pencetusphotoaging (Traikovich 1999; Nishigori et al. 2003; Lin et al. 2005; Huang etal. 2007; Almeida et al. 2008; Dai dan Mumper 2010).

Berdasarkan uraian tersebut di atas, diketahui bahwa radikal bebasberperan penting dalam pembentukan MMP-1 sehingga penggunaan senyawaantioksidan sangat penting dalam menghambat pembentukan MMP-1. Hasilpenelitian pada hewan coba tikus menunjukkan bahwa kemampuan sistempertahanan antioksidan pada kulit terhadap ROS menurun seiring denganpenuaan. Hal ini berarti semakin cepat penuaan yang terjadi semakin cepatpenurunan kemampuan sistem pertahanan antioksidan kulit. Penurunankemampuan sistem pertahanan antioksidan kulit memerlukan solusi aplikasitopikal antioksidan. Aplikasi topikal antioksidan memberikan manfaat dalammencegah pengaruh buruk radikal bebas akibat paparan radiasi UV pada kulit(Yasui dan Sakurai 2003; Almeida et al. 2008).

Antioksidan asal tumbuhan memperlihatkan kemampuan mengurangiROS yang menyebabkan photoaging. Hal ini telah memacu penelitianpenggunaan bahan tumbuhan yang kaya antioksidan untuk mencegahphotoaging. Perlindungan menggunakan sistem pertahanan antioksidan untukmencegah kerusakan yang disebabkan paparan radiasi UV telah diusulkansebagai mekanisme bagi senyawa asal tumbuhan dalam memperlambat prosespenuaan kulit. Penggunaan antioksidan asal tumbuhan terbukti dapatmenghambat pembentukan MMP-1, khususnya pada fibroblast dermis manusia(Pluemsamran et al. 2012; Huang et al. 2007; Afaq dan Mukhtar 2006; Moonet al. 2004). Hal ini menunjukkan bahwa antioksidan sangat berperan dalammencegah photoaging.

Potensi tabir surya yang dimiliki suatu bahan juga berperan pentingdalam pencegahan photoaging. Tabir surya yang memadai merupakankebutuhan yang esensial untuk mengontrol kerusakan kulit yang disebabkanoleh radiasi UV, di antaranya kulit terbakar, photoaging dan kanker akibatpaparan sinar UV atau photocarcinogenesis (Cross et al. 2007; Mller et al.2008; Korac dan Khambholja 2011). Pengertian bahan tabir surya berdasarkankeputusan Kepala BPOM RI no: HK.00.05.42.1018 didefinisikan sebagaibahan yang digunakan untuk melindungi kulit dari radiasi sinar UV dengancara menyerap, memancarkan, dan menghamburkan.

Tabir surya merupakan standar utama untuk melindungi kulit darikerusakan akibat paparan radiasi matahari, namun komposisi bahan kimia yangdigunakan pada formulasi tabir surya memiliki kemungkinan untukmenghasilkan radikal bebas ketika terpapar radiasi UV. Bahan kimia tabirsurya dapat saja terserap oleh kulit dan berpotensi menyebabkan kerusakankulit (Pinnell 2003).

Penelitian untuk menemukan kandidat ekstrak bahan aktif tabir suryabaru yang bersumber dari alam terus dilakukan dan ditujukan untukmemperoleh suatu bahan aktif tabir surya yang dapat mencegah photoaging,namun tidak memiliki efek samping yang dapat menyebabkan kerusakan kulit.

9

Sun protection factor (SPF) merupakan suatu nilai yang digunakan untukmengukur aktivitas suatu tabir surya dan digunakan secara luas untukmengevaluasi potensi perlindungan suatu material terhadap sinar matahari.Istilah SPF diperkenalkan pertama kali pada dekade 1930-an dan dapat diukurdengan cara pengujian secara in vitro atau in vivo (Ho 2001; Gonzalez 2006;Oliveira et al. 2008).

Pada tahun 2002, COLIPA (The European Cosmetic Toiletry andParfume Association), JCIA (Japan Cosmetic Industry Association), danCTFA-SA (Cosmetic Toiletry and Fragrance Association of South Africa)bersama-sama menyepakati metode penentuan SPF. Metode ini didasarkanhasil perbandingan dosis minimum sinar UVA dan UVB yang menyebabkanerythermal (MED) pada punggung sukarelawan (tipe kulit I, II dan III) yangmenggunakan tabir surya dan tidak menggunakan tabir surya. Namun,pengujian ini memerlukan biaya yang besar dan waktu yang cukup lama.Pertimbangan ekonomi, teknis, dan etis menyebabkan pengukuran SPF secarain vitro lebih dapat diterima dan lazim digunakan dalam penapisan tabir suryauntuk pengembangan produk (Pissavini et al. 2003; Gonzalez 2006; Oliveiraet al. 2008).

Pada mulanya, nilai SPF hanya ditujukan untuk menyatakan potensiperlindungan kulit terhadap paparan UVB. Namun, kenyataan menunjukkanbahwa UVA dapat menyebabkan kerusakan pada kulit. Terkait dengankerusakan kolagen tipe I, telah diketahui bahwa paparan sinar UVA dan UVBdapat memacu pembentukan MMP-1. Fokus pembuatan produk tabir surya saatini ditujukan untuk melindungi kulit dari paparan UVA dan UVB (Evelson etal. 1997; Chung 2003; Baron et al. 2008).

Berdasarkan uraian di atas, maka penentuan aktivitas penghambatanpembentukan MMP-1, aktivitas antioksidan, dan aktivitas tabir surya sangatpenting untuk dilakukan dalam upaya penapisan ekstrak bahan aktifantiphotoaging dari tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia. Data aktivitasantioksidan, dan data aktivitas tabir surya dapat digunakan sebagai acuanuntuk menentukan kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging. Pada tahappenelitian ini dilakukan penapisan kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoagingdari ekstrak etanol rimpang Temu Putih, rimpang Temu Giring, rimpang TemuIreng, dan daun Ki Urat. Penapisan yang dilakukan meliputi potensi aktivitaspenghambatan pembentukan MMP-1, potensi antioksidan, dan aktivitas tabirsurya terhadap ekstrak tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia tersebut.

2.2 Bahan dan Metode

Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari 2011 hingga bulan Februari2012 di beberapa lokasi, yaitu (1) Laboratory of Cutaneous Aging Research,Clinical Research Institute, Seoul National University Hospital, Korea Selatan;(2) Laboratorium Kimia Instrumen, Jurusan Kimia, Universitas PendidikanIndonesia Bandung; (3) Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran HewanInstitut Pertanian Bogor.

10

2.2.1 Bahan dan AlatBahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: etanol (Merck),

metanol (Merck), aquadest, Transpore Tape (3M, USA), DulbeccosModified Eagle Medium (DMEM; WelGENE), Trypan Blue Stain 0.4%(GIBCO), Acrylamide/Bis Solution 30% (BIO-RAD), Protein MarkersProSieve Color (Lonza), polyvinylidene fluoride membranes (AmershamBiosciences, Buckinghamshire, England), Antibodi primer rabbit monoclonalanti-MMP-1 (Laboratory for Cutaneous Aging Research, Clinical ResearchInstitute, Seoul National University Hospital, Seoul, Republic of Korea)antibodi sekunder anti-rabbitIgG-HRP conjugates (Santacruz company),AmershamECL Prime Western Blotting Detection Reagent (AmershamPharmacia Biotech),film X-ray (AFGA), 2,2diphenylpicrylhydrazyl (DPPH;Sigma Aldrich). Bahan biologis yang digunakan dalam penelitian ini adalahkultur sel human keratinocyte cell line (HaCaT) yang diperoleh dariLaboratory for Cutaneous Aging Research, Clinical Research Institute, SeoulNational University Hospital, Seoul, Korea Selatan.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: freeze dryer FD-5N (EYELA), penangas air WB-20E (JEIO TECH), optometrics SPF-290sanalyzer, microplate reader VERSA Max (Tunable), sterilizer (Han Shin Co.LTD), Kodak X-OMAT processor, UV meter (Waldman Medizintechnik),water bath (JEIO TECH), inkubator CO2 Series II (Thermo Forma),biological safety cabinets 1300 Series A2 (Thermo Scientific), lampu UVPhillips TL 20W/12 RS florescent sun lamps (Einthoven, Netherlands), filterUV C Kodacel filter TA401/407, mikroskop IX50 (Olympus), neraca HarvardTrip (OHAUS), micro high speed centrifuge MICRO 17R (Hanil ScienceIndustrial), spektrofotometer UV-vis UV-mini 1240 (Shimadzu), tangkielektroforesis (EzCell), spektrometer gas kromatografi QP 2010 ULTRA(Shimadzu), multitask plate reader model 1420 Victor3 (PerkinElmer),pencatu daya (PowerPac HC BIO-RAD). Perangkat Lunak yang digunakandalam penelitian ini antara lain: ImageJ 1.43u (Wayne Rasband NationalInstitutes of Health, USA), SPSS 17.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois, USA), MS.Exce 2007 (Microsoft).

2.2.2 Ekstraksi sampelSampel rimpang Temu Giring, rimpang Temu Ireng, dan rimpang

Temu Putih dikoleksi dari daerah Lembang pada bulan Desember 2010.Sampel daun Ki Urat dikoleksi dari daerah Ciampea Bogor pada bulan Januari2011. Sampel telah diidentifikasi oleh Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi,Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia dengan nomor surat identifikasi159/IPH.1.02/If.8/II/2011 (Lampiran 1).

Sampel dibersihkan dengan menggunakan air kran yang bersumber dariair tanah, selanjutnya dibilas dengan menggunakan aquadest sebanyak 3 kalidan ditiriskan dengan mengalirkan udara panas bertemperatur 40C selama 25menit. Sebanyak 500 g sampel ditambahkan 500 mL pelarut etanol 80% dandigiling dengan menggunakan blender komersial. Slurry hasil gilingan sampelditempatkan dalam botol berwarna gelap dan dimaserasi dengan menambahkan1000 mL pelarut etanol 80%. Maserasi dilakukan selama 3 x 24 jam. Maseratdipisahkan dengan penyaringan menggunakan kertas saring. Maserat

11

dipekatkan dengan menggunakan evaporator pada temperatur 35C hinggadiperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental dikeringkan lebih lanjut denganmenggunakan freeze dryer untuk memperoleh ekstrak kering.

2.2.3 Penyiapan kultur sel HaCaTCryovial kultur sel HaCaT dikeluarkan dari nitrogen cair, lalu

ditempatkan dalam wadah yang berisi dry ice, dicairkan denganmenempatkannya pada penangas air bertemperatur 37C. Ditambahkan 2 mLmedia DMEM, kemudian kultur sel HaCaT dipindahkan pada 100 mm cellculture dish yang telah berisi 10 mL media DMEM yang mengandung 10%Fetal Bovine Serum, 2 mM glutamin, antibiotik penisilin 100 U/mL danstreptomisin 100 g/mL. Kultur sel diinkubasi selama 24 jam pada 37Cdengan kadar CO2 5% di inkubator. Setelah 24 jam, media diganti dandiinkubasi selama 48-72 jam. Setelah 48-72 jam diamati kultur sel HaCaT dibawah mikroskop, bila kultur sel HaCaT mencapai subkonfluen (80-90%)maka dilakukan subkultur.

Media dibuang dan kultur sel HaCaT dibilas dengan 7 mL Phosphatebuffered saline (PBS). Setelah PBS dibuang, ditambahkan 3 mL trypsin-EDTdan diinkubasi selama 5-7 menit pada 37oC, 5% CO2. Setelah diinkubasi,ditambahkan 5-8 mL media DMEM dan dipindahkan pada tabung 15 mL, laludisentrifugasi pada 1.500 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan kultursel diresuspensi dengan menambahkan 10 mL media DMEM. Sel HaCaTdihitung dengan menggunakan hemasitometer, bila perlu dilakukanpengenceran hingga diperoleh suspensi sel HaCaT 106 sel/mL denganmenambahkan media DMEM.

Sebanyak 2 mL suspensi sel ditempatkan pada 100 mm cell culturedish, lalu ditambah sebanyak 8 mL media DMEM dan inkubasi selama 48-72jam. Subkultur dilanjutkan hingga diperoleh kultur sel dalam jumlah yangcukup untuk percobaan yang akan dilakukan.

2.2.4 Penentuan aktivitas penghambatan pembentukan MMP-1Disiapkan 50 mL suspensi sel HaCaT dengan konsentrasi 105sel/mL

dalam media DMEM yang mengandung 10% FBS, 2 mM glutamin, antibiotikpenisilin 100 U/mL, dan streptomisin 100 g/mL. Disiapkan 15 buah 35 mmcell culture dish. Sebanyak 2 mL suspensi sel HaCaT ditumbuhkan padamasing-masing 35 mm cell culture dish, lalu diinkubasi selama 24 jam pada37C dengan kadar CO2 5%. Setelah 24 jam, media dibuang, kultur sel dicucidengan PBS dan diberikan 2 mL media DMEM tanpa serum, selanjutnyadiinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, kultur sel dibagi menjadi 4perlakuan dan kontrol yang masing-masing terdiri atas 3 buah 35 mm cellculture dish. Perlakuan 1 merupakan kultur sel HaCaT yang mendapat ekstrakrimpang Temu Giring 100 ppm dalam DMEM. Perlakuan 2 merupakan kultursel HaCaT yang mendapat ekstrak rimpang Temu Ireng 100 ppm dalamDMEM. Perlakuan 3 merupakan kultur sel HaCaT yang mendapat ekstrakrimpang Temu Putih 100 ppm dalam DMEM. Perlakuan 4 merupakan kultursel HaCaT yang mendapat ekstrak daun Ki Urat 100 ppm dalam DMEM.Kontrol merupakan kultur sel HaCaT yang hanya mendapat DMEM.

12

Konsentrasi larutan uji ekstrak sebesar 100 ppm dan dosis paparan UV60 mJ/cm2 yang digunakan ditentukan berdasarkan hasil penentuan konsentrasilarutan uji dan dosis paparan UV (Lampiran 2).

Perlakuan dan kontrol diinkubasi selama 2 jam. Setelah 2 jam, mediaDMEM dibuang dan digantikan dengan 200 L PBS dan dilakukan paparanradiasi UV 60 mJ/cm2. Sumber radiasi UV yang digunakan adalah lampuPhillips TL 20W/12 RS florescent sun lamps dengan spektrum emisi 275 nmhingga 380 nm. Bagian UV C dihilangkan dengan menggunakan filter UV CKodacel filter TA401/407. Kuat radiasi UV diukur dengan menggunakan UVmeter Waldmand model 585100.

Setelah paparan UV diberikan, larutan PBS dibuang dan kultur selHaCat diberikan media DMEM. Kultur sel HaCaT diinkubasi selama 48 jam.Setelah 48 jam, sebanyak 200 L media kultur sel dipisahkan untuk penentuanekspresi MMP-1 yang dikeluarkan sel HaCaT ke media dengan metodewestern blott.

2.2.5 Western blottingSebanyak 200 L media disentrifugasi pada 13000 rpm 4C.

Supernatan dipisahkan, selanjutnya 150 L supernatan dicampur dengan 50 LSDS buffer sample, lalu divorteks. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan3000 rpm pada temperatur ruang. Bila masih terdapat endapan, campurandivorteks kembali. Selanjutnya campuran dipanaskan pada suhu 90C selama5-10 menit. Bila masih terdapat endapan campuran divorteks kembali,kemudian dipanaskan lagi pada suhu 90C selama 5-10 menit. Sampel dapatdisimpan pada lemari pendingin sampai digunakan kembali. Protein dipisahkandengan menggunakan 10% SDS-PAGE, kemudian ditransfer pada membranpolyvinylidene fluoride. Setelah proses transfer selesai, membran dicuci duakali dengan menggunakan Tris Buffer Saline Tween 20 (TBS/T), selanjutnyamembran diblok dengan skim milk 5% dalam TBS/T selama 1 jam padatemperatur ruang. Setelah proses blok, membran diinkubasi dengan antibodiprimer rabbit monoclonal anti-MMP-1 (1:1000) pada temperatur 4 C selama12 jam. Selanjutnya membran diinkubasi dengan antibodi sekunder anti-rabbitIgG-HRP conjugates (Santacruz company; 1:5000), selama 2 jam padatemperatur ruang dan kemudian dicuci dua kali dengan TBST. Proteindivisualisasi dengan pereaksi Amersham ECL Prime Western BlottingDetection Reagent yang dipandu Protein Markers, kemudian dikembangkanpada film X-ray dengan menggunakan peralatan Kodak X-OMAT Processor(Chung et al. 2001; Shin et al.2005a). Ekspresi MMP-1 yang telahdikembangkan pada film X-ray dianalisis dengan menggunakan perangkatlunak ImageJ 1.43u. Data ekspresi MMP-1 dianalisis dengan analisis sidikragam satu arah (One-way analysis of variance/ANOVA) menggunakanperangkat lunak SPSS 17.0. Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncanuntuk menentukan keberartian perbedaan antara dua rataan.

2.2.6 Penentuan aktivitas antioksidanPotensi antioksidan ekstrak tumbuhan kosmetik tradisional yang diuji

diukur sebagai kapasitas total antioksidan. Kapasitas total antiokasidan diukurberdasarkan kemampuan bahan tersebut dalam meredam (Scavenging) radikal

13

bebas DPPH. Prosedur yang digunakan mengadaptasi metode yangdikemukakan oleh Nepote et al. (2005), Que et al. (2006), Villano et al.(2006), Stef et al. (2009).

Uji ini menggunakan rancangan acak lengkap yang terdiri atas 4perlakuan. Perlakuan 1 merupakan larutan ekstrak rimpang Temu Giringdengan konsentrasi akhir 100 ppm dalam metanol. Perlakuan 2 merupakanlarutan ekstrak rimpang Temu Ireng dengan konsentrasi akhir 100 ppm dalammetanol. Perlakuan 3 merupakan larutan ekstrak rimpang Temu Putih dengankonsentrasi akhir 100 ppm dalam metanol. Perlakuan 4 merupakan larutanekstrak daun Ki Urat dengan konsentrasi akhir 100 ppm dalam metanol.Masing-masing perlakuan dilakukan 3 kali pengulangan. Setiap perlakuandiberikan larutan radikal DPPH dengan konsentrasi akhir 0.1 mM dalammetanol, kemudian diinkubasi selama 40 menit. Absorbansi DPPH diukur pada517 nm. Prosedur yang sama dilakukan terhadap blanko yang berupa larutanmetanol. Parameter yang diukur adalah % kapasitas total antioksidan (TAC)yang dihitung dengan cara :

TACDPPH (%) = (Ablanko Asampel)/Ablanko x 100Data persentase kapasitas total antioksidan dinyatakan sebagai rataan

dari 3 kali pengulangan. Data dianalisis dengan analisis sidik ragam satu arah(One-way analysis of variance / ANOVA) menggunakan perangkat lunak SPSS17.0. Perbedaan rataan persentase kapasitas total antioksidan diuji lanjutdengan uji Duncan.

2.2.7 Penentuan Aktivitas Tabir SuryaPenapisan aktivitas tabir surya ekstrak yang diuji dilakukan dengan

menggunakan peralatan SPF meter. Perlakuan terdiri atas: perlakuan 1 ekstraketanol rimpang Temu Giring; perlakuan 2 ekstrak etanol rimpang Temu Ireng;perlakuan 3 ekstrak etanol rimpang Temu Putih; perlakuan 4 ekstrak etanoldaun Ki Urat. Sampel dalam jumlah kecil dioleskan ke pita/plaster Transpore.Sampel disebar secara tipis dan merata pada area 50 cm2 yang setara dengan 2L/cm2. Kemudian pita/plaster Transpore ditempatkan pada bingkai logamterbuka. Selanjutnya dilakukan pengukuran menggunakan peralatan SPF meterOptometrics SPF-290s Analyzer dengan range panjang gelombang 290-400nm. Setiap perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak 10 kali. Parameteryang diukur adalah SPF. Pengukuran ini dilakukan pada selang panjang 290nm hingga 400 nm. Data nilai SPF dinyatakan sebagai rataan dari 10 kalipengulangan. Data dianalisis dengan analisis sidik ragam satu arah (One-wayanalysis of variance / ANOVA) menggunakan perangkat lunak SPSS 17.0. Ujilanjut yang digunakan adalah uji Duncan untuk menentukan keberartianperbedaan antara rataan.

2.3 Hasil

Tabel 1 berikut merangkum data rataan ekspresi MMP-1 pada aplikasiekstrak terhadap sel HaCaT, kapasitas total antioksidan dan nilai SPF ekstraktumbuhan kosmetik tradisional Indonesia yang diuji.

14

Tabel 1 Rataan ekspresi MMP-1 pada aplikasi ekstrak terhadap selHaCaT, kapasitas total antioksidan, dan nilai SPF ekstrak

Perlakuan ekspresi MMP-1(103 pixel)

kapasitas totalantioksidan (%)

nilai SPF

Kontrol 42.403.46a - -Temu Putih 33.994.73b 26.45 1.122d 1.470.298c

Temu Giring 33.132.44b 28.80 1.760c 1.620.244c

Temu Ireng 26.874.70bc 55.75 0.289b 3.020.326b

Ki Urat 24.373.60c 60.72 0.599a 3.990.702a

Ket: Data dinyatakan sebagai rataan simpangan baku. Huruf yang sama pada kolom yang samamenunjukkan tidak berbeda nyata berdasarkan hasil uji Duncan pada taraf keberartian 0.05

Hasil analisis MMP-1 dengan western blotting menunjukkan bahwaaplikasi ekstrak tumbuhan kosmetik tradisional Indonesia pada konsentrasi 100ppm berpotensi menghambat ekspresi MMP-1 pada sel HaCaT yang mendapatperlakuan dosis UV 60 mJ/cm2.

Berdasarkan Tabel 1 diketahui bahwa ekstrak tumbuhan kosmetiktradisional Indonesia yang diuji memiliki ekspresi MMP-1 di bawah ekspresiMMP-1 kontrol. Fakta ini menunjukkan bahwa ekstrak yang diuji memilikipotensi aktivitas penghambatan pembentukan MMP-1. Hasil uji Duncan(Lampiran 3, Tabel 10) menunjukkan bahwa kontrol menunjukkan ekspresiMMP-1 (42.40 x 103 pixel) tertinggi dan berbeda nyata dari ekspresi MMP-1pada perlakuan ekstrak. Ekspresi MMP-1 ekstrak Temu Putih (33.99 x 103

pixel), ekstrak Temu Giring (33.13 x 103 pixel), dan ekstrak Temu Ireng (26.8x 103 pixel) tidak berbeda nyata. Perlakuan ekstrak Ki Urat menunjukkanekspresi MMP-1 (24.37 x 103 pixel) terendah dan berbeda nyata dari ekspresiMMP-1 ekstrak Temu Putih dan ekspresi MMP-1 ekstrak Temu Giring.Ekspresi MMP-1 ekstrak Ki Urat tak berbeda nyata dari ekspresi MMP-1ekstrak Temu Ireng. Data lengkap hasil analisis MMP-1 dengan westernblotting ditampilkan pada Lampiran 3.

Dari Tabel 1 diketahui bahwa ekstrak tumbuhan kosmetik Indonesiayang diuji memiliki kapasitas total antioksidan di atas 20% pada konsentrasi100 ppm. Aktivitas antioksidan ini diduga berkaitan dengan keberadaansenyawa fenol, flavonoid, dan senyawa lain yang memiliki aktivitasantioksidan yang terdapat dalam ekstrak tumbuhan kosmetik tradisionalIndonesia tersebut.

Hasil anova menunjukkan perlakuan aplikasi ekstrak tumbuhankosmetik tradisional Indonesia yang diuji berpengaruh nyata pada kapasitastotal antioksidan (Lampiran 4). Hasil uji lanjut dengan uji Duncanmenunjukkan bahwa ekstrak Ki Urat pada konsentrasi 100 ppm memilikikapasitas total antioksidan tertinggi (60,72%) dan berbeda nyata dari kapasitastotal antioksidan ekstrak lain pada konsentrasi yang sama. Ekstrak Ki Urat danekstrak Temu Ireng memiliki kapasitas total antioksidan lebih dari 50%.

Berdasarkan nilai SPF pada Tabel 1 tersebut diketahui bahwa ekstraketanol daun Ki Urat memiliki rataan nilai SPF tertinggi (3.99) diikuti olehekstrak etanol rimpang Temu Ireng (3.02). Hasil analisis variansi (Anova)menunjukkan adanya perbedaan variansi nilai SPF antarekstrak yang diuji.Hasil uji lanjut dengan uji Duncan menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun Ki

15

Urat memiliki rataan nilai SPF tertinggi yang berbeda nyata dari rataan nilaiSPF ekstrak lainnya (Lampiran 6).

Ekstrak etanol rimpang Temu Ireng dan daun Ki Urat memilikikarakteristik perlindungan terhadap UV pada rentang panjang gelombang yangberbeda. Grafik dan data lengkap hasil penentuan SPF dapat dilihat padaLampiran 5 dan 6. Berdasarkan grafik pengukuran SPF (Lampiran 5, Gambar 9dan 11) diketahui bahwa ekstrak etanol rimpang Temu Ireng berpotensimemberikan proteksi terhadap UVB, sedangkan ekstrak etanol daun Ki Uratmemiliki potensi perlindungan terhadap UVA maupun UVB. Proteksi ekstraketanol daun Ki Urat terhadap UVA lebih baik dibandingkan UVB.

2.4 Pembahasan

Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa perlakuan ekstrak dapatmenghambat pembentukan MMP-1 pada sel HaCaT yang terpapar UV.Ekstrak Ki Urat memiliki potensi menghambat pembentukan MMP-1 yanglebih besar dibandingkan ekstrak lainnya. Kemampuan ekstrak dalam TemuIreng menghambat pembentukan MMP-1 tidak berbeda nyata dari ekstrak KiUrat. Kemampuan kedua ekstrak ini untuk menghambat ekspresi MMP-1diduga berkaitan erat dengan kapasitas total antioksidan kedua ekstrak ini yanglebih tinggi dibandingkan perlakuan lain.

Kapasitas total antioksidan ekstrak etanol Ki Urat dan Temu Ireng lebihtinggi dan berbeda nyata dari aktivitas antioksidan ekstrak etanol rimpangTemu Giring dan Temu Putih. Kapasitas total antioksidan ekstrak etanol KiUrat dan Temu Ireng pada konsentrasi 100 ppm lebih dari 50%.

Kapasitas total antioksidan kedua ekstrak dapat memberikan gambarankemampuan ekstrak tersebut untuk menghambat pembentukan MMP-1 padakultur sel HaCaT yang terpapar UV. Senyawa antioksidan memiliki peran yangpenting dalam melindungi kulit dari pengaruh buruk induksi ROS yang dipicuradiasi UV sehingga dapat mencegah photoaging (Huang et al. 2007; Almaidaet al. 2008). Hal tersebut dapat dijelaskan dari beberapa hasil penelitiansebelumnya yang menunjukkan fakta bahwa peningkatan ekspresi MMP-1dipicu oleh peningkatan ROS (Wertz et al. 2004; Kim et al. 2010), dengandemikian adanya senyawa antioksidan akan menghambat pembentukan ROSyang selanjutnya dapat menurunkan ekspresi MMP-1 pada media HaCaT.

Berdasarkan hasil penelitian diketahui bahwa ekstrak Ki Urat memilikiRataan nilai SPF tertinggi (3.99) diikuti oleh ekstrak Temu Ireng (3.02),sedangkan rataan nilai SPF ekstrak Temu Giring dan Temu putih lebih rendahdan berbeda nyata pada kedua ekstrak tersebut. Sediaan tabir surya dikatakandapat memberikan perlindungan apabila memiliki nilai SPF 2-8. Food andDrug Administration (FDA) Amerika Serikat membagi efektivitas tabir suryasuatu zat dalam lima kelompok, yaitu: proteksi minimal dengan nilai SPF 2-

16

SPF = 1.47) dan Temu Giring (Rataan SPF = 1.62) tidak memberikan efekperlindungan terhadap radiasi UV. Rataan SPF dari ekstrak etanol rimpangTemu Ireng dan daun Ki Urat berbeda secara nyata namun kedua nilai SPFtersebut berada pada kriteria perlindungan yang sama.

Ekstrak etanol rimpang Temu Ireng dan daun Ki Urat memilikikarakteristik perlindungan terhadap UV pada rentang panjang gelombang yangberbeda. Ekstrak etanol rimpang Temu Ireng berpotensi memberikan proteksiterhadap paparan radiasi UV B, sedangkan ekstrak etanol daun Ki Uratmemiliki potensi perlindungan terhadap UV A maupun UV B. Proteksiterhadap UV A dari ekstrak etanol daun Ki Urat lebih baik dibandingkan UVB. Karakteristik ini sangat penting karena bahan yang memberikanpelindungan terhadap UV A lebih jarang ditemukan dibandingkan bahan yangmemberikan pelindungan terhadap UV B (Korac dan Khambholja 2011).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa semakin tinggi nilai kapasitastotal antioksidan maka MMP-1 yang terbentuk semakin berkurang. Ekstrak KiUrat dan Temu Ireng memiliki kapasitas totalantioksidan yang berbeda nyata,namun kapasitas antioksidan kedua ekstrak pada 100 ppm di atas 50%.Kapasitas total antioksidan kedua ekstrak ini lebih tinggi dibandingkan ekstrakTemu Putih dan Temu Giring, sehingga dapat dipahami ekspresi MMP-1 yangterbentuk pada perlakuan kedua ekstrak ini lebih kecil dibandingkan aplikasiekstrak Temu Putih dan Temu Giring.

Fakta-fakta yang diperoleh pada tahap penelitian ini memperkuatdugaan bahwa potensi menghambat pembentuk MMP-1 yang dimiliki ekstrakKi Urat dan Temu Ireng disebabkan oleh aktivitas antioksidan. Ekstrak Ki Uratdan Temu Ireng memiliki potensi untuk mencegah photoaging dibandingkanekstrak lainnya.

2.5 Simpulan

Perlakuan ekstrak Ki Urat menunjukkan ekspresi MMP-1 yang lebihrendah dan berbeda nyata dibandingkan ekspresi MMP-1 kontrol, perlakuanekstrak Temu Giring dan Perlakuan ekstrak Temu Putih. Perlakuan ekstrak KiUrat menunjukkan ekspresi MMP-1 yang lebih rendah dan tidak berbeda nyatadibandingkan ekspresi MMP-1 perlakuan Temu Ireng. Perlakuan ekstrakTemu Ireng menunjukkan ekspresi MMP-1 yang lebih rendah dan berbedanyata dibandingkan ekspresi MMP-1 kontrol. Hal ini menunjukkan bahwaekstrak Ki Urat memiliki aktivitas penghambatan pembentukan MMP-1 yanglebih besar dibandingkan ekstrak Temu Giring dan Temu Ireng, namun tidakberbeda dari ekstrak Temu Ireng.

Kapasitas total antioksidan ekstrakKi Uratdan Temu Ireng lebih tinggidan berdeda nyata dibandingkan ekstrak Temu Giring dan Temu Putih.Kapasitas total antioksidan ekstrak Ki Urat dan Temu Ireng pada konsentrasi100 ppm yang mencapai lebih dari 50%. Aktivitas antioksidan ekstrak TemuIreng dan Ki Urat diduga berperan dalam mekanisme kerja penghambatanpembentukan MMP-1 pada sel HaCaT.

Nilai SPF ekstrak Temu Ireng dan Ki Urat berbeda nyata, namun nilaiSPF kedua ekstrak ini dalam kriteria yang sama. Berdasarkan kriteria nilai SPFdiketahui bahwa kedua ekstrak ini hanya dapat memberikan perlindungan

17

minimal terhadap UV sehingga aktivitas tabir surya diduga tidak memberikankontribusi nyata pada aktivitas penghambatan pembentukan MMP-1 yangditunjukkan kedua ekstrak tersebut.

Berdasarkan aktivitas penghambatan MMP-1 dan aktivitas antioksidanyang ditunjukkan ekstrak Temu Ireng dan Ki Urat, maka kedua ekstrak inidipilih sebagai kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaging. Kedua kandidatekstrak bahan aktif antiphotoaging akan dipelajari lebih lanjut mekanismenyaberdasarkan aktivitas antioksidan.

18

3 POTENSI KHASIAT DAN MEKANISMEANTIPHOTOAGING DARI KANDIDAT EKSTRAK BAHAN

AKTIF ANTIPHOTOAGING TERPILIH

3.1 Pendahuluan

Hasil penapisan kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoagingmenghasilkan dua kadidat bahan aktif antiphotoaging terpilih, yaitu ekstraketanol rimpang Temu Ireng (ekstrak Temu Ireng) dan ekstrak etanol daun KiUrat (ekstrak Ki Urat). Aktivitas antioksidan kedua ekstrak ini diduga berperandalam mekanisme kerja penghambatan pembentukan MMP-1 pada sel HaCaT.Dugaan ini menjadi acuan dalam penentuan mekanisme antiphotoaging darikedua ekstrak sebagai kandidat ekstrak aktif antiphotoaging.

Pada tahap penelitian ini dilakukan penentuan potensi khasiat danmekanisme antiphotoaging kedua ekstrak tersebut. Penentuan mekanisme inidilakukan berdasarkan penentuan potensi khasiat menghambat pembentukanMMP-1 dan potensi khasiat menghambat penurunan prokolagen tipe I yangdidukung dengan penentuan kapasitas total antioksidan dan aktivitasantioksidan intraseluler.

Proses photoaging merupakan proses kompleks yang melibatkan prosesintraseluler dan ekstraseluler. Proses ini dimulai dari pembentukan radikalbebas akibat paparan UV dan berakhir dengan kerusakan komponen utamamatriks esktraseluler, yaitu kolagen tipe I. Pada penelitian ini, mekanismepenghambatan proses photoaging (antiphotoaging) oleh suatu bahanberdasarkan aktivitas antioksidan akan ditempatkan pada kerangka prosesphotoaging sebagai proses kerusakan kolagen tipe I.

Mekanisme antiphotoaging berdasarkan aktivitas antioksidan dapatdipahami dengan baik melalui 2 pengetahuan dasar yang terkait dengankerusakan kolagen tipe I. Pertama, pemahaman mengenai kolagen tipe Isebagai komponen utama matriks esktraseluler kulit. Kedua, pemahamantentang radiasi UV sebagai penyebab kerusakan dan penghambat pembentukankolagen tipe I.

Matriks ekstraseluler dapat dilihat sebagai perekat makromolekul yangberbeda dalam ruang ekstraseluler yang memberikan bentuk spesifik padasuatu jaringan dan merupakan pembangun integritasnya. Molekul-molekulmatriks ekstraseluler berguna sebagai kerangka struktur sehingga matriksekstraseluler sering didefinisikan sebagai substansi yang memberikanintegritas stuktur pada organisme multiseluler (Tsuchiya et al. 2008; Ottani etal. 2001; Exposito et al. 2002).

Integritas dan fungsi struktur kulit sangat bergantung pada matriksesktraseluler. Matriks ekstraseluler kulit manusia merupakan struktur tigadimensi yang terdiri atas kolagen, serat elastik, dan membran dasar yangberupa makromolekul seperti proteoglikan, heparin sulfat, entaktin,fibronektin, dan laminin. Kolagen, khususnya kolagen tipe I merupakankomponen utama matriks ekstraseluler kulit manusia (Ottani et al. 2001; Uittoet al. 1998; Fisher et al. 2009; varani et al. 2009).

19

Kolagen merupakan komponen protein terbesar dalam tubuh kita.Kolagen tipe I merupakan protein terbanyak dalam tubuh hewan danditemukan dalam setiap jaringan ikat, seperti tulang, kulit, dan tendon.Kolagen tipe I merupakan kolagen dominan pada jaringan kulit manusia danmerupakan 75-80% dari bobot kering kulit (Prockop dan Kivirikko 1995;Yaar et al. 1998; Exposito et al. 2002; Kotch dan Raines 2006; Agius et al.2007).

Pemahaman tentang peran radiasi UV sebagai penyebab kerusakan danpenghambat pembentukan kolagen tipe I sangat diperlukan untuk memahamiproses photoaging. Radiasi UV sangat berbahaya bagi kesehatan kulit manusiakarena dapat mempercepat penuaan kulit. Semua segmen radiasi UV yangsampai ke bumi (UVA dan UVB) dapat menyebabkan photoaging. Paparankronik UV pada kulit manusia dapat menyebabkan photoaging yang ditandaioleh kerutan pada kulit. Radiasi UV memainkan peran penting dalampatogenesis penuaan dini kulit melalui sitotoksisitas keratinosit dan degradasikolagen (Abeyama et al. 2000; Huang et al. 2007; Philips et al. 2009;Pluemsamran et al. 2012).

Kerusakan kolagen pada proses photoaging ditandai dengan terjadinyakerutan pada kulit. Pada photoaging terjadi degenerasi matriks ekstraseluleryang disebabkan oleh peningkatan ekspresi atau aktivitas matrixmetalloproteinases (MMPs) yang merusak struktur kolagen. PeningkatanMMPs akibat paparan UV berperan penting dalam kerusakan kolagen danprotein matriks ekstraseluler lainnya dan berhubungan langsung dengan efekphotoaging pada kulit manusia. Matrix metalloproteinases utama adalahMMP-1 yang menyebabkan kerusakan kolagen tipe I sebagai komponen utamadari matriks ekstraseluler kulit manusia (Fisher et al. 1996; Kim et al. 2005;Dong et al. 2008; Philips et al. 2009).

Peningkatan ekspresi MMP-1 sebagai awal dari kerusakan kolagen tipeI pada proses photoaging dipicu oleh paparan UV. Hasil penelitian Seo et al.(2001) menunjukkan bahwa paparan akut radiasi UV pada sel fibroblatmaupun secara in vivo meningkatkan MMP-1 dan menyebabkan kekurangankolagen tipe I sehingga memberikan kontribusi pada photoaging. Kolagen tipeI disintesis dari prokolagen tipe I yang dibentuk pada proses intraseluler. Padaproses photoaging, radiasi UV menyebabkan penurunan TGF- sehinggaterjadi penurunan pembentukan prokolagen tipe I. Hal ini menyebabkanpenurunan pembentukan kolagen tipe I pada ruang ekstraseluler (Brodsky etal. 1994; Fisher et al. 1999; Helfrich et al. 2008; Lee et al. 2009b).

Mekanisme terjadinya photoaging berlangsung dalam sel dan ruangekstraseluler. Fibroblast dermal membuat prokolagen tipe I di dalam sel yangkemudian dikonversi menjadi kolagen di ruang ekstraseluler. Dua pengaturpenting dalam pembentukan dan destruksi kolagen ialah TGF- dan AP-1.Peran AP-1 dalam proses photoaging berkaitan dengan peningkatan MMP-1yang menyebabkan kerusakan kolagen tipe I. Peran TGF- dalam prosesphotoaging berkaitan dengan penghambatan pembentukan prokolagen tipe I.Proses kerusakan dan destruksi kolagen tipe I akibat peningkatan AP-1 danpenurunan TGF- yang disebabkan oleh ROS yang dipicu paparan UVmerupakan mekanisme terjadinya photoaging (Chung et al. 1997; Fisher et al.

20

1999; Huang et al. 2007; Helfrich et al. 2008; Philips et al. 2009; Lee et al.2009a).

Antioksidan membantu sel dalam mengurangi ROS yang terbentukakibat paparan UV. Penggunaan antioksidan merupakan strategi efektif dalammemberikan dukungan mekanisme perlindungan seluler (Traikovich 1999; Linet al. 2005). Penggunaan antioksidan dapat mengatasi ROS yang dipicuradiasi UV sehingga mampu mencegah photoaging.

Berdasarkan uraian di atas, diketahui bahwa aktivitas penghambatanpembentukan MMP-1, aktivitas penghambatan penurunan prokolagen tipe I,dan aktivitas antioksidan merupakan parameter potensi antiphotoaging yangtepat untuk dikaji dalam menentukan mekanisme antiphotoaging suatu bahanberdasarkan aktivitas antioksidan. Potensi dan mekanisme antiphotoaging inidapat dipelajari secara in vivo dengan menggunakan hewan model ataumanusia maupun secara in vitro dengan menggunakan kultur sel. Metode invitro dengan menggunakan kultur sel telah lama digunakan dalam penelitianuntuk melakukan penapisan dan mempelajari mekanisme antiphotoaging suatubahan.

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mempelajari pembentukanMMP-1 dengan menggunakan kultur sel. Kim et al. (2005) menggunakan selHDFs untuk mempelajari pembentukan MMP-1. Lee et al. (2009a)menggunakan sel HaCaT untuk mempelajari fisiologi ekspresi MMP-1. Janget al. (2011) menggunakan sel HaCaT dan HDFs untuk mempelajari pengaruhcurcuminoids pada ekspresi MMP-1.

Kultur sel HDFs telah digunakan untuk mempelajari metabolismekolagen. Galicka dan Nazaruk (2007) menggunakan kultur sel HDFs untukmempelajari pengaruh apigenin 7-O-glucoronide pada peningkatan lajubiosintesis kolagen. Chen et al. (2009) menggunakan biakan sel fibroblastWS-1 untuk mempelajari metabolisme kolagen pada kondisi paparan UV.

Shin et al. (2005a) melakukan penelitian photoaging secara in vitromenggunakan kultur sel HDFs untuk melihat efek aplikasi topikaldehydroepiandrosterone (DHEA) pada kolagen pada kondisi paparan UV.Penelitian tersebut dilanjutkan dengan percobaan secara in vivo menggunakankulit mencit dan manusia yang memberikan hasil yang sama seperti yangditunjukkan oleh percobaan secara in vitro. Penggunaan metode in vitromenggunakan kultur sel dalam penelitian photoaging dapat memberikangambaran tentang hasil secara in vivo.

Penentuan aktivitas antioksidan sangat penting dalam menentukanmekanisme antiphotoaging. Penentuan aktivitas antioksidan secara in vitromenggunakan pereaksi kimia atau enzimatis hanya mampu mengungkapkanpotensi antioksidan secara umum. Penentuan aktivitas antioksidan dalamrangka menentukan mekanisme antiphotoaging memerlukan data pendukunglainnya berupa data antioksidan intraseluler. Penentuan aktivitas antioksidanintraseluler dalam kajian mekanisme antiphotoaging masih jarang dilakukan.Kultur HDFs telah digunakan beberapa peneliti untuk menentukan aktivitasantioksidan seluler.

Penggunaan metode in vitro dalam penentuan mekanismeantiphotoaging berdasarkan aktivitas antioksidan harus dapat membuktikankemampuan suatu bahan dalam menghambat pembentukan MMP-1 dan

21

menghambat penurunan pembentukan kolagen tipe I. Kedua proses inimelibatkan proses intraseluler dan ekstraseluler yang harus didukung oleh dataaktivitas antioksidan. Pembuktian aktivitas antioksidan ini harus dapatmengungkapkan adanya aktivitas antioksidan intraseluler.

Pada tahap penelitian ini dilakukan penentuan potensi dan mekanismeantiphotoaging ekstrak Temu Ireng dan ekstrak Ki Urat berdasarkan aktivitasantioksidan kedua ekstrak tersebut. Penentuan potensi dan mekanismeantiphotoaging kedua ekstrak dilakukan secara in vitro menggunakan selmodel. Penentuan potensi dan mekanisme antiphotoaging ini dimulai denganpenentuan potensi penghambatan pembentukan MMP-1 menggunakan selmodel HaCaT, sedangkan penentuan potensi penghambatan penurunanpembentukan prokolagen tipe I dengan mengunakan sel model HDFs.Penentuan aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH untukmenentukan kapasitas total antioksidan. Data aktivitas antioksidan dilengkapidengan data dari penentuan aktivitas antioksidan intraseluler yangmenggunakan sel model HDFs.

3.2 Bahan dan Metode

Penelitian dilaksanakan dari bulan September 2011 hingga bulanDesember 2012 di 3 lokasi, yaitu: (1) Laboratory For Cutaneous AgingResearch, Department of Dermatology, College of Medicine, Seoul NationalUniversity, Seoul, Korea Selatan; (2) Laboratorium Fisiologi, FakultasKedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor; (3) Laboratorium Kimia,Fakultas Sains dan Teknik, Universtas Nusa Cendana.

3.2.1 Bahan dan AlatBahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Metanol

(Merck), Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM; WelGENE),3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT),Acrylamide / Bis Solution 30% (BIO-RAD), X-Ray Film ( AFGA), Proteinmarkers ProSieve Color (Lonza), Antibody primer rabbit monoclonal anti-MMP-1 (Laboratory for Cutaneous Aging Research, Clinical ResearchInstitute, Seoul National University Hospital, Republic of Korea), antibodysekunder anti-rabbitIgG-HRP conjugates (Santacruz company),AmershamECL Prime Western Blotting Detection Reagent (AmershamPharmacia Biotech), antibodi primer mouse monoclonal anti-procollagen typeI (Laboratory for Cutaneous Aging Research, Clinical Research Institute,Seoul National University Hospital, Seoul, Republic of Korea), antibodisekunder anti-mouseIgG-HRP conjugates (Santacruz company),chemiluminescence SuperSignal West Pico Substrate (Thermo Scientific), filmX-ray (AFGA), 2-7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA; Sigma, St.Louis, MO) SuperSignal West Pico (Thermo Scientific),2,2diphenylpicrylhydrazyl (DPPH, Sigma Aldrich). Bahan biologis yangdigunakan adalah kultur sel human dermal fibroblast (HDFs), dan humankeratinocyte cell line (HaCaT) yang diperoleh dari Laboratory for CutaneousAging Research, Clinical Research Institute, Seoul National UniversityHospital, Seoul, Korea Selatan.

22

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Penangas air WB-20E (JEIO TECH), 100 mm cell culture dish, 35 mm cell culture dish, 12-wellmultiwell culture, Microplate Reader VERSA Max (Tunable), Sterilizer (HanShin Co. LTD), Tangki elektroforesis (EzCell), PowerPac HC (BIO-RAD),Kodak X-OMAT 2000 Processor, UV Meter (WaldmanMedizintechnik), Inkubator CO2 Series II (Thermo Forma), SentrifiusCentrifuge 5810 R (Eppendorf), Biological Safety Cabinets 1300 Series A2(Thermo Scientific), Shaker Boekel (Boekel Scientific) dan VS-95RK (RockerVision), Vortex Genie 2 (scientific Industries), lampu UV Phillips TL 20W/12RS florescent sun lamps (Einthoven, Netherlands), filter UV C Kodacel filterTA401/407, UV meter Waldmand model 585100, Mikroskop IX50(Olympus), Micro Centrifuge MICRO-12 (Hanil Science Industrial), MicroHigh Speed Centrifuge MICRO 17R (Hanil Science Industrial),Spektrofotometer UV-vis UV-mini 1240 (Shimadzu), SpektrofotometerCECIL-2000, Victor3 multilabel plate counter model 1420 (Perkin Elmer).Perangkat lunak yang digunakan antara lain: ImageJ 1.43u (Wayne RasbandNational Institutes of Health, USA), SPSS 17.0 (SPSS Inc. Chicago, Illinois,USA) ,MS. Exce 2007 (Microsoft).

3.2.2 Penentuan potensi kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaginguntuk menghambat pembentukan MMP-1.

3.2.2.1 Penyiapan kultur sel HaCaTProsedur penyiapan kultur sel HaCaT sama dengan prosedur yang

diuraikan pada bagian 2.2.3.

3.2.2.2 Prosedur penentuan potensi aktivitas penghambatan pembentukanMMP-1

Disiapkan 50 mL suspensi sel HaCaT dengan konsentrasi 105 sel/mLdalam media DMEM 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, antibiotikpenisilin 100 U/mL dan streptomisin 100 g/mL. Disiapkan 12 buah 35 mmcell culture dish. Sebanyak 2 mL suspensi sel HaCaT ditumbuhkan padamasing-masing 35 mm cell culture dish, lalu diinkubasi selama 24 jam pada37C dengan kadar CO2 5%. Setelah 24 jam, media dibuang, lalu kultur seldicuci dengan PBS dan diberikan 2 mL media DMEM tanpa serum. Kultur selHaCaT selanjutnya diinkubasi selama 24 jam.

Kultur sel dibagi menjadi 4 kelompok, yaitu kontrol, kontrol negatif,perlakuan ekstrak Temu Ireng, dan perlakuan ekstrak Ki Urat yang masing-masing terdiri atas 3 buah 35 mm cell culture dish. Kontrol merupakan kultursel HaCaT yang hanya mendapat media DMEM. Kontrol negatif merupakankultur sel HaCaT yang mendapat media DMEM dan paparan radiasi UV 60mJ/cm2. Perlakuan ekstrak Temu Ireng merupakan kultur sel HaCaT yangmendapat ekstrak Temu Ireng100 ppm dalam DMEM dan paparan radiasi UV60 mJ/cm2. Perlakuan ekstrak Ki Urat merupakan kultur sel HaCaT yangmendapat esktrak Ki Urat 100 ppm dalam DMEM dan paparan radiasi UV 60mJ/cm2. Sel dinkubasi selama 2 jam, kemudian media dibuang dan digantikandengan 200 L PBS. Dilakukan paparan radiasi UV 60 mJ/cm2 terhadapkontrol negatif dan perlakuan yang mendapat paparan UV. Larutan PBSdibuang dan kultur sel HaCat diberikan media DMEM, lalu diinkubasi selama

23

48 jam. Selanjutnya dilakukan pengukuran ekspresi MMP-1 yang dikeluarkansel HaCaT ke media dengan metode western blott. Ekspresi MMP-1 yang telahdikembangkan pada film X-ray dianalisis dengan menggunakan perangkatlunak ImageJ 1.43u.

3.2.2.3 Analisis dataParameter yang diamati adalah ekspresi MMP-1 dan kemudian dihitung

rataannya. Perbedaan rataan ekspresi MMP-1 antarperlakuan dianalisis denganuji Duncan menggunakan perangkat lunak SPSS 17.0. Suatu ekstrak dikatakanmemiliki potensi menghambat pembentukan MMP-1 bila memiliki rataanekspresi MMP-1 yang lebih kecil dan berbeda nyata dibandingkan kontrolnegatif.

3.2.3 Penentuan potensi kandidat ekstrak bahan aktif antiphotoaginguntuk menghambat penurunan pembentukan prokolagen tipe I

3.2.3.1 Penyiapan kultur sel HDFsKultur sel HDFs merupakan kultur sel HDFs passage 6 yang diperoleh

dari Laboratory of Cutaneous Aging Research, Clinical Research Institute,Seoul National University Hospital, Seoul National University. Vial kultur selHDFs passage 6 dikeluarkan dari pendingin beku dan segera dicairkan denganmenempatkannya pada penangas air bertemperatur 37C, kemudian kutur selHDFs dipindahkan pada tube 15 mL dan ditambahkan 10 mL media DMEMhingga volume 10 m. Tube di

PENGEMBANGAN KANDIDAT BAHAN AKTIF … · Degenerasi kolagen tipe I disebabkan oleh degenerasi...

Documents

Transcript of PENGEMBANGAN KANDIDAT BAHAN AKTIF … · Degenerasi kolagen tipe I disebabkan oleh degenerasi...