PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak...

44
PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS BUFFER SERTA KECEPATAN SENTRIFUGASI TERHADAP KUALITAS PRODUK DNA PADA SAPI FRIESIAN HOLSTEIN (FH) SKRIPSI KOKOM KOMALASARI DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2009

Transcript of PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak...

Page 1: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN

LISIS BUFFER SERTA KECEPATAN SENTRIFUGASI

TERHADAP KUALITAS PRODUK DNA PADA

SAPI FRIESIAN HOLSTEIN (FH)

SKRIPSI

KOKOM KOMALASARI

DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2009

Page 2: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

RINGKASAN

KOKOM KOMALASARI. D14051702. 2009. Pengaruh Perbandingan Volume

Darah dan Lisis Buffer serta Kecepatan Sentrifugasi Terhadap Kualitas Produk

DNA pada Sapi Friesian Holstein (FH). Skripsi. Departemen Ilmu Produksi dan

Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.

Pembimbing Utama : Prof. Dr. Ir. Ronny Rachman Noor, MRur.Sc

Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Endang Tri Margawati, M. Agr.Sc

Deoxyribonucleic Acid (DNA) adalah molekul terkecil dari suatu sel

berbentuk untai panjang yang membawa informasi genetik dan mengontrol semua

fungsi seluler pada semua bentuk kehidupan. DNA diperoleh dengan cara ekstraksi

dari jaringan atau darah segar hewan. Terdapat berbagai metode ekstraksi DNA,

salah satunya adalah phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI) yang digunakan dalam

penelitian ini. Tujuan penelitian ini yaitu mencari perbandingan yang optimal antara

volume darah segar dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi untuk memperoleh

produk DNA yang berkualitas tinggi.

Materi penelitian berupa darah segar Friesian Holstein (FH) yang diperoleh

dengan cara penyedotan dengan jarum suntik (G18) dari pembuluh darah ekor sapi

yang dialirkan ke dalam tabung vacum berisi 15% EDTA, sebanyak ±5 ml per ekor.

Darah diperoleh dari 4 ekor sapi sesuai dengan jumlah ulangan (4). Rancangan

percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua

factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume darah dan lisis buffer (µl darah

: µl lisis buffer), terdapat 3 kombinasi, yaitu 100 : 800, 200 : 700, dan 300 : 600.

Faktor kedua yaitu kecepatan sentrifugasi (10.000 rpm dan 12.000 rpm). Dengan

demikian terdapat 6 kombinasi perlakuan. Masing-masing perlakuan diulang 4 kali.

Data yang dikoleksi berupa konsentrasi DNA dan kemurnian DNA pada rasio OD

260/280 yang diukur dengan GeneQuant DNA calculator. Sementara kualitas DNA

dicek melalui gel agarose (1%) yang dialiri listrik 100 voltage selama 1 jam. Data

dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA). Perbedaan antara perlakuan diuji dengan

Tukey pada taraf perbedaan 5% (p<0,05).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi volume darah dan lisis buffer

dengan dua kecepatan sentrifugasi yang berbeda tidak berpengaruh terhadap

konsentrasi DNA. Konsentrasi DNA relatif lebih tinggi diperoleh pada perlakuan

perbandingan volume darah : lisis buffer (300µl : 600µl), konsentrasi DNA relatif

meningkat dengan meningkatnya volume darah. Tingkat kemurnian DNA yang

diperoleh rata-rata 1,3 (260/280), artinya DNA yang diperoleh masih terbawa bahan

kimia lain. Tingkat kemurnian yang optimal yaitu 1,8. Kualitas DNA pada hasil

elektroforesis menunjukan hasil berbanding lurus dengan konsentrasi DNA, dan

menunjukkan pita tunggal.

Kata-kata kunci : darah, ekstraksi DNA, phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI),

lisis buffer, kecepatan sentrifugasi

Page 3: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

ABSTRACT

THE EFFECT OF BLOOD AND BUFFER LYSIS COMPOSITION AND

SPINNING SPEED ON DNA YIELDS OF Friesian Holstein (FH)

Komalasari, K., R. R. Noor and E. T. Margawati

Deoxyribonucleic Acid (DNA) is smallest part (molecule) of a cell in the form of a

long chain that carries genetic information and controlling all cellular functional in

all life form. The DNA can be obtained by extracting tissue or fresh whole blood of

animal. There are several methods of DNA extraction, one of which is phenol-

choroform-isoamyl alcohol (PCI) that used in this research. The aim of this research

was to determine the best combination of fresh blood and buffer lysis with two

differences of spinning speed on DNA quantity and quality. The fresh whole blood

of Friesian Holstein (FH) dairy cattle was collected using a vacuum tube

(vacutainer) containing 15% EDTA with a 18G needle to suck the blood of tail vena

with the amount of ±5 ml per head. A 3x2 factorial completely random design was

used. First factor was three combinations of fresh whole blood and buffer lysis

volume (µl), i.e., 100 : 800, 200 : 700, and 300 : 600. Second factor was spinning

speeds, i.e., 10.000 rpm and 12.000 rpm. There were 6 combination treatments used

in this research which replicated 4 times of each treatment. Data of DNA

concentration was collected by a GeneQuant DNA calculator at the 260 nm and 280

nm wave length of optical density (OD). The quality of DNA was obtained by

running the DNA through electrophoresis with 1% gel agarose and electricity flow of

100 voltage for an hour. The DNA purity was examined at OD 260/280 ratios. DNA

concentration and purity were analyzed by using ANOVA, the differences between

theatments were tested by tukey test at the level of 5% (p<0.05). The result showed

that there was no significant effect of combination of fresh blood and buffer lysis at

both spinning speeds (p>0.05). The highest DNA concentration was obtained from

the treatment of ratio of 300 µl blood and 600 µl buffer lysis. The DNA

concentration tended to increase with the increase of blood volume. The DNA purity

was obtained at the ratio of 1.3 (260/280) meaning that the DNA was a slighty

contaminated by the chemical used. A ratio of 1.8 is the optimal purity of DNA. The

DNA quality linearly correlated to DNA concentration and showed a single band.

Keywords: blood, DNA extraction, phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI),

buffer lysis, spinning speed

Page 4: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN

LISIS BUFFER SERTA KECEPATAN SENTRIFUGASI

TERHADAP KUALITAS PRODUK DNA PADA

SAPI FRIESIAN HOLSTEIN (FH)

KOKOM KOMALASARI

D14051702

Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk

memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada

Fakultas Peternakan

Institut Pertanian Bogor

DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2009

Page 5: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN

LISIS BUFFER SERTA KECEPATAN SENTRIFUGASI

TERHADAP KUALITAS PRODUK DNA PADA

SAPI FRIESIAN HOLSTEIN (FH)

Oleh

KOKOM KOMALASARI

D14051702

Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan

Komisi Ujian Lisan pada tanggal 18 Juni 2009

Pembimbing Utama

Prof. Dr. Ir. Ronny R. Noor, MRur.Sc.

Pembimbing Anggota

Dr. Ir. Endang T. Margawati, M.Agr.Sc.

Dekan

Fakultas Peternakan

Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Luki Abdullah, M.Sc.Agr.

Ketua Departemen

Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan

Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc.

Page 6: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 8 Desember 1986 di Pangkalan Boros,

Sumedang. Penulis anak kedua dari dua bersaudara dari pasangan Bapak Wiharya

dan Ibu Uka. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1999 di SD Negeri Boros,

Sumedang. Pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun 2002 di

SLTP Negeri II Buahdua, Sumedang dan pendidikan menengah atas diselesaikan

pada tahun 2005 di SMU Negeri I Cimalaka, Sumedang. Penulis diterima sebagai

mahasiswa Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Departemen

Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian

Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun 2005.

Penulis aktif di berbagai organisasi meliputi Staf ahli divisi Unggas,

Himpunan Mahasiswa Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (HIMAPROTER),

Fakultas Peternakan (2006-2007), sekertaris umum Famm Al An’Am, Fakultas

Peternakan Institut Pertanian Bogor (2007-2008), dan aktif pada berbagai kegiatan

kampus (2005-2008) serta pernah menjadi asisten mata kuliah Tingkah Laku dan

Kesejahteraan Ternak (2009).

Penulis aktif menulis beberapa karya ilmiah diantaranya Chicken Jelly Drink

sebagai Inovasi Minuman Instant Sumber Protein (2005), Pemanfaatan Telur Busuk

sebagai Bahan Peningkat Mutu Pupuk Organik Cair Berbahan Baku Effluent Biogas

(2006), Persilangan Puyuh dan Ayam (Puyam) (2007) dan Pengaruh Perbandingan

Volume Darah dan Lisis Buffer serta Kecepatan Sentrifugasi terhadap Kualitas

Produk DNA pada Sapi Friesian Holstein (FH). Penulis juga merupakan salah satu

penerima beasiswa BP POM tahun 2005-2007 dan beasiswa Gudang Garam 2007-

2009 serta memperoleh hibah dana dari Dikti dalam rangka mengikuti Program

Kreativitas Mahasiswa-Penelitian (PKM-P) tahun 2006 dan Program Kreativitas

Mahasiswa-Ilmiah (PKM-I) tahun 2008.

Page 7: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

KATA PENGANTAR

Bismillahirrahmaniirahim,

Alhamdulillah setelah disiapkan dalam waktu yang cukup singkat akhirnya

skripsi ini telah diselesaikan. Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah

SWT yang telah memberikan rahmat, karunia, rizki, dan nikmat iman dan islam yang

telah diberikan sehingga penulis memperoleh kemudahan dalam menyusun dan

menyelesaikan skripsi ini yang berjudul “Pengaruh Perbandingan Volume Darah

dan Lisis Buffer serta Kecepatan Sentrifugasi terhadap Kualitas Produk DNA

pada Sapi Friensian Holstein (FH)”. Shalawat dan salam semoga tetap tercurahkan

ke junjungan kita Nabi Muhammad SAW.

Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana

Peternakan di Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Di samping itu

penulisan skripsi ini bertujuan untuk memberikan satu sumbangan untuk kemajuan di

dunia peternakan, khususnya bioteknologi molekuler hewan.

Penelitian dilaksanakan di Laboraturium Biologi Molekuler Hewan, Pusat

Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong pada bulan Februari-April 2009. Sampel

darah diambil dari sapi FH dengan jarum G-18 pada pembuluh halus di ekor

kemudian diekstraksi dengan metode phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI)

dengan modifikasi volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi yang

berbeda. Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh dan mengetahui kombinasi

optimal antara volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi dalam

mengoptimalkan produk DNA yang dihasilkan.

Akhirnya tiada gading yang tak retak, penulis menyadari bahwa karya kecil

ini masih belum sempurna. Penulis mengharapkan semoga skripsi ini dapat

bermanfaat bagi pembaca dan menjadi salah satu sumber ilmu pengetahuan.

Bogor, Juli 2009

Penulis

Page 8: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

DAFTAR ISI

Halaman

RINGKASAN .................................................................................................. i

ABSTRACT ..................................................................................................... ii

RIWAYAT HIDUP ......................................................................................... iii

KATA PENGANTAR ..................................................................................... iv

DAFTAR ISI .................................................................................................... v

DAFTAR TABEL ............................................................................................ vii

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... ix

PENDAHULUAN ........................................................................................... 1

Latar Belakang ..................................................................................... 1

Tujuan .................................................................................................. 1

TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................. 3

Sapi Fresian Holstein........................................................................... 3

Darah .................................................................................................... 3

Sejarah dan Perkembangan Teknologi DNA ....................................... 5

Perkembangan Penelitian DNA pada Hewan ...................................... 6

DNA (Deoxyribonucleic Acid) ............................................................. 7

Ekstraksi DNA ..................................................................................... 9

Phenol-Choroform-Isoamyl alkohol (PCl)........................................... 10

Penentuan Kuantitas DNA ................................................................... 10

Penentuan Kualitas DNA ..................................................................... 11

METODE ......................................................................................................... 12

Lokasi dan Waktu ................................................................................ 12

Materi ................................................................................................... 12

Sampel dan Bahan .................................................................... 12

Peralatan ................................................................................... 12

Rancangan Statistik .............................................................................. 13

Analisis Data ............................................................................ 13

Prosedur ............................................................................................... 14

Koleksi Darah Segar................................................................. 14

Koleksi Darah Putih ................................................................. 14

Pemisahan Protein ................................................................... 14

Presipitasi dan Koleksi DNA ................................................... 14

Kuantifikasi DNA .................................................................... 15

Kualifikasi DNA ...................................................................... 15

HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 16

Kuantitas DNA ..................................................................................... 16

Konsentrasi DNA ..................................................................... 16

Page 9: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Rasio ......................................................................................... 17

Kualitas DNA ....................................................................................... 19

KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................... 21

Kesimpulan .......................................................................................... 21

Saran..................................................................................................... 21

UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................... 22

DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 23

LAMPIRAN ..................................................................................................... 26

Page 10: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dengan

Kecepatan Sentrifugasi terhadap Konsentrasi DNA (Rataan ± SE) .. 16

2. Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dengan

Kecepatan Sentrifugasi terhadap Rasio OD 260/280 (Rataan ± SE) . 18

Page 11: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

1. Sel-sel dalam Darah Mamalia ............................................................ 4

2. Struktur Adenin, Guanin, Sitosin, Urasil, dan Timin ........................ 8

3. Hasil Pemotretan Elektroforesis dari DNA Marker (1 Kb dan Enam

Sampel DNA (T1-T6) ........................................................................ 20

Page 12: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1. Diagram Alir Prosedur Ekstraksi DNA Metode Sambrook et

al.,1989 .............................................................................................. 27

2. Reagent-reagent yang Digunakan untuk Ekstraksi DNA Metode

Phenol-Choroform-Isoamyl alkohol (PCI) ........................................ 29

3. Data Kuantifikasi DNA (Kosentrasi DNA, Rasio OD 260/280, 260

nm, dan 280 nm) ................................................................................ 31

4. Analisis Ragam Kosentrasi DNA terhadap Pengaruh Perbandingan

Volume Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan Sentrifugasi

yang Berbeda ..................................................................................... 32

5. Analisis Ragam Rasio 260/280 DNA terhadap Pengaruh

Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan

Sentrifugasi yang Berbeda ................................................................. 32

Page 13: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kesenjangan yang cukup besar antara persediaan susu dan permintaan susu

menjadi masalah yang penting dalam penyediaan protein hewani bagi masyarakat

luas. Sampai saat ini permintaan susu semakin terus meningkat dengan

bertambahnya jumlah penduduk pada setiap tahunnya. Peternakan sapi merupakan

salah satu komponen subsektor peternakan yang mampu meningkatkan kesejahteraan

sebagian masyarakat pedesaan dan memberikan perbaikan gizi bagi generasi

mendatang. Namun, rendahnya produktivitas sapi perah dibandingkan laju

kebutuhan, rentannya terhadap penyakit dan keterbatasan kemampuan peternakan

untuk memanajemen perusahaan menjadi suatu kendala untuk memenuhi kebutuhan

tersebut. Rataan produksi susu sapi Friesian Holstein (FH) di Indonesia sekitar 10

liter per hari per ekor (Sudono et al., 2003). Rendahnya produktivitas ini disebabkan

beberapa faktor diantaranya faktor lingkungan, faktor genetik dan faktor interaksi

antara lingkungan dan genetik. Usaha-usaha perlu dilakukan untuk meningkatkan

produktivitas sapi perah domestik.

Perbaikan mutu genetik sapi Friesian Holstein yang banyak dilakukan pada

saat ini adalah secara konvensional, yaitu berdasarkan seleksi morfologi. Namun,

cara ini belum memberikan hasil yang optimal karena disamping membutuhkan

waktu yang lama juga mengeluarkan biaya yang cukup besar. Menghadapi masalah

itu, perlu adanya terobosan baru yang dapat dilakukan untuk mempercepat proses

peningkatan mutu genetik adalah melalui teknologi DNA. Teknologi tersebut dapat

memberikan solusi lebih tepat melalui identifikasi gen-gen berasosiasi dengan sifat-

sifat bernilai ekonomi tinggi seperti tingginya produksi susu dapat diidentifikasi dan

ditelusuri pada sapi FH.

DNA (Deoxyribonucleic Acid) sebagai penyusun utama gen yang membawa

informasi genetik yang merupakan makromolekul yang menjadi pusat perhatian

dalam berbagai penelitian bioteknologi rekayasa DNA dan bioteknologi akhir-akhir

ini. DNA harus disiapkan dengan kualitas yang baik yaitu murni dan utuh serta

tersedia dalam jumlah yang cukup merupakan langkah awal yang sangat penting

dalam keberhasilan berbagai penelitian bioteknologi tersebut. Selain itu, DNA yang

Page 14: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

berkualitas baik dapat diperoleh dengan waktu dan biaya yang minimal merupakan

satu hal yang menarik dalam penelitian genetika molekuler.

Berdasarkan keperluan dan jumlah DNA yang diperlukan, maka banyak

prosedur-prosedur ekstraksi yang telah dilakukan dan dikembangkan dalam

menghasilkan DNA yang berkualitas tinggi. Setiap prosedur memiliki keunggulan

dan kelemahan tersendiri. DNA dapat diperoleh dari berbagai sumber umumnya

diperoleh dari daging, darah, dan organ-organ tubuh lainnya (Sambrook et al., 1989).

Darah merupakan sumber DNA yang sering dilakukan karena kemudahan dalam

koleksi sampel.

Ekstraksi DNA yang dilakukan pada studi ini berasal dari darah segar sapi

FH dengan menggunakan metode phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI) dengan

modifikasi komposisi volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi

yang berbeda. Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh dan mengetahui efisiensi

kombinasi antara volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi dalam

mengoptimalkan produk DNA yang lebih baik untuk diaplikasikan pada penelitian

berikutnya.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kombinasi optimal antara volume

darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi terhadap kuantitas dan kualitas

produk DNA yang dihasilkan dari darah segar sapi Friesian Holstein.

Page 15: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

TINJAUAN PUSTAKA

Sapi Friesian Holstein

Sapi perah Friesian Holstein (FH) berasal dari Netherland, propinsi

Friesland, Belanda. Sapi Friesian Holstein (FH) merupakan bangsa sapi perah tertua

kedua setelah Brown Swiss. Di Indonesia sapi FH sudah banyak dikembangkan

karena telah banyak disilangkan dengan sapi lokal. Hasil persilangan dikenal dengan

nama sapi Grati, sapi perah jenis baru yang sesuai dengan kondisi di Indonesia.

Produksi susu sapi FH di Indonesia mencapai rata-rata 3.660 liter per laktasi dengan

bobot sapi dewasa mencapai ± 700 kg (Eko et al., 2009). Sedangkan menurut

Sudono et al. (2003) produksi rata-rata sapi FH 10 liter per ekor per hari atau ± 3.050

kg per laktasi.

Ciri-ciri yang paling menonjol pada sapi perah Friesian Holstein (FH) yaitu

warna tubuhnya memiliki dua warna, hitam dan putih atau merah dan putih. Sapi

perah Friesian Holstein (FH) menghasilkan produksi susu yang paling besar diantara

sapi perah yang lainnya (Tyler and Ensminger, 2006). Sedangkan menurut Santoso

(2008), ciri-ciri sapi Friesian Holstein (FH) yang baik adalah tubuh luas ke belakang

seperti gergaji, sistem dan bentuk perambingan baik dan puting simetris, efesiensi

pakan yang dialihkan untuk produksi susu tinggi, dan sifatnya baik dan bijak.

Kendala-kendala pengembangan sapi Friesian Holstein (FH) ada dua faktor

diantaranya, faktor teknis dan faktor pemerintah. Faktor teknis meliputi pemuliaan,

tata laksana pemberian pakan dan tata laksana pemeliharaan. Sedangkan faktor

pemerintah adalah dalam memperhatikan kegiatan persusuan, memelihara kebijakan

yang kondusif dengan memberikan fasilitas dan dana untuk mengembangkan

peternakan (Prahasta et al., 2008).

Darah

Darah tersusun atas plasma dan sel darah, sel darah terdiri dari eritrosit (sel

darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit (keeping darah). Plasma darah

mengandung sekitar 90 % air dan berbagai zat terlarut di dalamnya seperti, protein

plasma dan sari makanan (Isnaeni, 2006). Menurut Frandson (1992) volume darah

sapi 7,7 % dari berat badan dengan jumlah sel darah merah 7 juta/mm3

dan sel darah

putih 7-10 ribu/mm3. Sel darah merah lebih berat dari sel darah putih, dan kedua

jenis sel itu lebih berat dibandingkan plasma. Pembagian sel-sel darah mamalia

Page 16: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

terdiri dari eritrosit, leukosit dan trombosit digambarkan seperti Gambar 1

(Wardhani, 2008).

Gambar 1. Sel-sel dalam Darah Mamalia

Sel darah putih sangat berbeda dengan sel darah merah. Sel darah putih

memiliki bentuk yang khas terdiri dari nukleus, sitoplasma, organel dan bersifat

mampu bergerak pada keadaan tertentu. Sedangkan sel darah merah tidak berinti,

berbentuk cawan bikonkaf dan bersifat pasif (Dellman dan Brown, 1989). Dua

bentuk leukosit yang berbeda yaitu, granulosit yang memiliki butir khas dan jelas

dalam sitoplasma dan agranulosit yang tidak memiliki butir khas dalam sitoplasma.

Termasuk dalam bentuk granulosit diantaranya neutrofil, eosinofil, dan basofil.

Sebaliknya yang termasuk agranulosit diantaranya monosit dan limfosit (Frandson,

1992).

Page 17: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Sejarah dan Perkembangan Teknologi DNA

Teknologi DNA rekombinan merupakan hasil dari sejumlah pemotongan

DNA dan penyambungan kembali potongan-potongan DNA tersebut. Masalah yang

berhubungan dengan bioteknologi dan perbaikan mutu genetik ternak yaitu pertama

mengidentifikasi gen-gen yang bermanfaat dan mengintroduksikannya ke dalam

genome ternak sehingga dapat diwariskan secara mantap dari generasi ke generasi

(Martojo, 1992). Menurut Susanti dan Ariani (2004) teknologi DNA rekombinan

atau rekayasa genetika merupakan suatu metode yang dilakukan untuk memanipulasi

DNA suatu makhluk hidup tertentu guna memperoleh sifat-sifat tertentu dalam

organisme tersebut.

Tahun 1926 Muller, seorang Pelopor ilmu biologi molekuler mulai

mengenalkan peran gen. Dalam bukunya yang berjudul “The Gene as the Basis of

Life”, Muller menyatakan bahwa gen dapat dipandang sebagai sebuah atom biologis

yang bertanggung jawab sepenuhnya untuk ciri-ciri fisiologis dan morfologis dari

bentuk-bentuk kehidupan (Hardjosubroto, 1999).

Perkembangan teknologi DNA rekombinan dimulai dari berbagai penemuan

dan penelitian oleh para ahli genetika melokuler. Penelitian Griffith yang menjadi

titik awal bagi penelitian 14 tahun untuk mencari identitas substansi pentransformasi

yang dilakukan oleh Avery. Avery memurnikan berbagai macam zat kimia dari

berbagai bakteri-bakteri patogenik yang telah dimatikan dengan panas, kemudian

mencoba mentransformasikan bakteri nonpatogenik hidup dengan setiap zat kimia,

hanya DNA yang mampu melakukan transformasi tersebut. Oleh karena itu tahun

1944, Avery dan koleganya mengumumkan bahwa agen pentransformasi tersebut

adalah DNA. berikutnya pada tahun 1952, Alfred Hershey dan Martha Chase

menemukan bahwa DNA merupakan materi genetik dari suatu fase yang dikenal T2.

Bukti lain oleh ahli biokimia Erwin Chargaff menganalisis komposisi basa DNA dari

sejumlah organisme yang berbeda diperoleh bahwa komposisi DNA dari setiap

spesies berbeda-beda dan menemukan keteraturan yang khas dalam rasio dari basa-

basa nukleotida (Campbell et al., 2002)

Penemuan struktur double heliks DNA oleh Watson dan Crick pada tahun

1953 yang mempermudah penelitian tentang fungsi dan mekanisme kerja DNA.

Penemuan-penemuan selanjutnya seperti nuklease restriksi, enzim yang dapat

Page 18: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

memotong fragmen DNA, pada tahun 1962 adanya DNA ligase, enzim yang dapat

menyambung fragmen DNA yang telah dipotong. Tahun 1967 telah diletakkan dasar

bagi terbentuknya DNA rekombinan (Alberts et al., 1994). Selanjutnya, teknologi

rekombinan DNA semakin sempurna dengan ditemukan teknik perunutan DNA

(Sequencing) pertengahan 1970 yang dapat menentukan urutan fragmen DNA secara

cepat. Teknologi DNA berfungsi dalam studi ekspresi gen yang menguntungkan

seperti hormon, enzim pembentukan organisme transgenik dengan sifat unggul yang

lainnya (Nicholl, 1996).

Perkembangan teknologi DNA rekombinan berfungsi dalam studi ekspresi

gen, produksi protein yang sangat menguntungkan seperti hormon dan enzim, serta

pembentukan organisme transgenik (tumbuhan, hewan dan manusia). DNA

rekombinan juga bermanfaat untuk teknologi, kesehatan dan aplikasi yang lainnya

yang biasa dimanfaatkan (Nicholl, 1996).

Perkembangan Penelitian DNA pada Hewan

Tahun 1972, ketika Cohen, Berg, dan Boyer yang melakukan penelitian

bersama di Universitas Stanford berhasil menggabungkan gen dari seekor katak pada

bakteri (Djojosoebagio, 1996). Perkembangan selanjutnya dari DNA adalah

pembentukan hewan trasngenik, yaitu hewan yang telah mengalami rekayasa dalam

susunan DNA-nya melalui introduksi gen asing. Tahun 1981 Palmiter dan Brinster

berhasil memproduksi tikus transgenik, kemudian diikuti oleh Spradling dan Rublin

yang menghasilkan lalat buah transgenik. Pembentukan hewan transgenik pada

ternak domestik berhasil dilakukan pada penghujung tahun 1980 dan pada awal 1990

(Boyd dan Samid, 1993).

Keberhasilan manusia merekayasa ternak untuk digunakan sebagai ‘pabrik’

pengganda protein yang dibutuhkan oleh manusia, misalnya protein laktoperin yang

terdapat pada air susu ibu (ASI) telah berhasil diproduksi oleh sapi yang telah

direkayasa. Keberhasilan yang sangat memuaskan juga terjadi pada tikus sebagai

hewan transgenik pada tahun 1986 sebagai model untuk merekayasa ternak-ternak

lainnya. Contoh lain, kambing transgenik mampu memproduksi Tissue Plasminogen

Aktivator (TPA) secara luas untuk pengobatan penyakit jantung (Muladno, 2002).

Muladno (2002) menjelaskan kembali paling tidak, ada dua teknologi tinggi

dilibatkan dalam upaya manusia merekayasa ternak. Pertama, teknologi untuk

Page 19: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

mengisolasi molekul DNA manusia yang member kode genetika untuk pembentuan

suatu protein. Kedua, teknologi untuk menyusun molekul DNA tersebut ke dalam

embrio ternak.

Bioteknologi Peternakan di Indonesia telah dirumuskan dalam lokakarya

Nasional I Bioleknologi peternakan tahun 1995, bahwa pengertian bioteknologi

peternakan dapat diartikan memanfaatkan proses biologi melalui rekayasa genetik

dan rekayasa proses untuk menghasilkan ternak dan produk ternak yang berkualitas.

Bioteknologi peternakan di Indonesia ruang lingkupnya meliputi: inseminasi buatan,

transfer embrio, dan rekayasa genetik (Saefuddin, 1996). Sedangkan Direktorat

Jendral Peternakan mendefinisikan bioteknologi peternakan sebagai pemanfaatan

proses biolgis melalui rakayasa genetika dan proses untuk menghasilkan ternak dan

produk peternakan yang berkualitas (Hardjosubroto, 1999).

DNA (Deoxyribonucleic Acid)

Deoxyribonucleic Acid (DNA) adalah bagian terkecil molekul dari suatu sel

berbentuk untai panjang yang membawa informasi genetik dan mengontrol semua

fungsi seluler pada semua bentuk kehidupan (Zaid et al., 1999). Gen disusun oleh

suatu substansi yang disebut dengan DNA (Deoxyribonucleic Acid). Substansi DNA

terdiri dari dua untaian panjang terpilin yang membentuk double helix (seperti tangga

pilin). Setiap dua untaian DNA disusun oleh ribuan unit nukleotida. Setiap

nukleotida disusun oleh basa nitrogen, gula deoksiribosa (deoxyribose) dan asam

fosfat. Basa nitrogen dalam DNA ada empat macam yaitu adenine (A), guanine (G),

sitosin (C), dan timin (T). Sitosin selalu berpasangan dengan guanin dan adenin

selalu berpasang dengan timin (Noor, 2008). Struktur basa nitrogen yaitu adenin,

guanin, sitosin, urasil, dan timin Gambar 2 (Jusuf, 2001).

Muladno (2002) menjelaskan bahwa DNA terdapat pada semua makhluk

hidup mulai dari mikroorganisme sampai organisme tingkat tinggi seperti manusia,

hewan dan tumbuhan. DNA terdapat di dalam sel dan di dalam inti sel. DNA yang

terdapat di dalam sel dapat berupa DNA mitokondria, DNA kloroplast atau DNA

penyusun kromosom, sedangkan DNA yang terdapat dalam inti sel disebut juga

sebagai DNA inti. Sedangkan menurut Maclean (1987) DNA (Deoxyribonucleic

Acid) merupakan materi genetik yang ada di dalam semua organisme yang hidup.

Namun, ada beberapa virus yang materi genetiknya adalah RNA. Jumlah DNA

Page 20: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

dalam sel berbeda-beda tiap organisme. Rentang jumlah DNA yaitu dari 4 x 106

pasang di dalam E. coli sampai kira-kira 109 pasang di dalam manusia.

Gambar 2. Struktur Adenin, Guanin, Sitosin, Urasil, dan Timin

Basa nitrogen menempel pada posisi karbon 1’ dari pentose, sedangkan gugus

phospat pada posisi karbon 3’ atau karbon 5’ dari pentose. Satu nukleotida dan

nukleotida lainnya dapat dibedakan pada basa nitrogennya. Serangkaian nukleotida

dapat terbentuk dengan mengikatkan gugus hidroksi pada karbon 3’ dari satu pentose

dan gugus phosphat pada gugus 5’ dari pentose sebelahnya. Struktur molekul DNA

terdiri atas dua rangkaian nukleotida yang tersusun secara linier. Kedua rangkaian

yang saling berikatan itu terbentuk seperti tali terpilin. Oleh karenanya molekul DNA

dikatakan double heliks atau heliks ganda (Alberts et al., 1994).

DNA dapat terdenaturasi oleh temperatur dan pH yang ekstrim. Denaturasi

ini dapat melepaskan ikatan double heliks seperti diantara ikatan hidrogen yang

saling melengkapi dapat terganggu. Denaturasi DNA dapat menyebabkan melting

dan dapat memisahkan untaian DNA (Sheeler dan Bianchi, 1987). Sifat kimia yang

dimiliki DNA heliks ganda yaitu kelenturan dan kestabilan. Kelenturan terdapat

dalam perpasangan kedua utasan yang pasangan basanya diikat oleh ikatan hidrogen.

Guanin

O

C C

C N

N

C

N

HC

N

H

A

H

NH2

HNH

C C

C N

N

C

N

HC

N

H

A

H

Adenin

HNH

C

HC

N

N

C

O

Sitosin

HC

H

O

C

HC

N

N

C

O

Urasil

HC

H

H

O

C

C

N

N

C

O

Timin

HC

H

H H3C

Page 21: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Ikatan hidrogen merupakan ikatan yang lemah sehingga mudah lepas dan mudah

terbentuk kembali. Sehingga pasangan utas ganda DNA mudah terurai dan mudah

terbentuk kembali tanpa merusak ikatan polipeptidanya. Sifat ini sangat penting

karena DNA akan mengalami replikasi atau transkripsi. Sedangkan sifat kimia yang

stabil dilihat dari adanya pilinan utas ganda yang menempatkan pasangan basa pada

bagian dalam dan ikatan fosfat pada bagian luar. Molekul fosfat merupakan melekul

yang bersifat hidrofolik dan basa-basa merupakan molekul yang bersifat hidrofobik.

Sifat ini cukup memelihara kesetabilan DNA (Jusuf, 2001).

Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA merupakan suatu langkah awal dalam teknologi DNA.

Molekul DNA ini harus diekstraksi dari asal usul tempatnya. Banyak molekuler

termasuk DNA bersifat labil dan mudah kehilangan aktifitas biologinya. Oleh karena

itu ekstraksi harus dilakukan dalam kondisi ringan yaitu dengan menggunakan

larutan encer dan menghindari kondisi pH, tekanan osmotik yang ekstrim dan suhu

tinggi (Murray, 1995). Proses ekstraksi DNA sel hewan biasanya diawali dengan

merusak dinding sel menggunakan proteinase-K, EDTA dan SDS, yang diikuti

ekstraksi menggunakan phenol (Sambrook et al., 1989). Senyawa-senyawa tersebut

akan merusak integrasi dinding sel secara kimiawi.

Cara ekstraksi DNA dari berbagai sumber berbeda namun pada prinsipnya

sama. Hanya ada beberapa modifikasi tertentu yang biasa dilakukan untuk

menghancurkan inhibitor yang ada di dalam masing-masing sumber. Isolasi DNA

dari organisme eukaryote biasanya dilakukan melalui penghancuran sel, pemisahan

protein dan RNA, dan pemurnian DNA. Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan

dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti lisozim, EDTA (etilendiamin

tetraasetat) dan SDS (sodium dodesil sulfat). Fungsi dari EDTA adalah sebagai

perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium sementara SDS berfungsi untuk

merusak membram sel (Muladno, 2002). Metode yang sering digunakan untuk

pengendapan DNA adalah etanol (Brown, 1996).

Metode-metode ekstraksi DNA yang biasa dilakukan diantaranya phenol-

choroform-isoamyl alcohol (PCI), hight salt method dan choroform iso amyl alcohol

(CIAA). Hight salt method hanya menggunakan NaCl jenuh untuk mengendapkan

materi pengotor, sedangkan phenol-choroform-isoamyl alcohol (PCI) selain

Page 22: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

menggunakan NaCl konsentrasi tinggi juga mengunakan fenol dan iso amyl alcohol

(CIAA). Keuntungannya hight salt method tidak menggunakan bahan beracun atau

non-toksik ( Prasetyo, 2005).

Phenol-Choroform-Isoamyl alkohol (PCI)

Phenol-Choroform-Isoamyl alkohol (PCI) merupakan senyawa kimia yang

digunakan untuk mengekstraksi DNA yaitu untuk memisahkan protein dari asam

nukleat. Metode ini menguntungkan karena dapat mengdeproteinnasi secara efisien

karena penggunaan dua macam larutan yaitu fenol dan klorofrom yang lebih efektif

dalam mengendapkan protein dan menghambat aktifitas RNAase dibandingkan

dengan menggunakan satu larutan (Sambrook et al., 1989). Keunggulan lainnya yaitu

tidak membutuhkan waktu yang lama untuk pemurnian DNA. Penambahan Phenol-

Choroform-isoamyl Alkohol (PCI) diharapkan akan menghasilkan DNA yang murni

dan tidak terkontaminasi oleh protein dan akan dihasilkan rasio Optimal Density

(OD) 260/280 yang berada diantara 1,8-2,0. Hasil yang terbaik untuk memperoleh

DNA, yaitu melakukan pencucian dua kali dengan menggunakan Phenol-Choroform-

isoamyl Alkohol (PCI) ( Khosravinia et al., 2007).

Penentuan Kuantitas DNA

Konsentrasi DNA diukur secara Sprektrofotometri dengan menggunakan

GeneQuant DNA calculator. Dasar teknik ini adalah DNA yang dapat menyerap

sinar ultraviolet dengan kuat pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan 280 nm

merupakan daerah serapan protein. Panjang gelombang dengan nilai serapan 1,0

(A260=1,0 ) setara dengan 50 mg DNA utas ganda per milliliter larutan. Oleh karena

itu, didapatkan bahwa konsentrasi DNA (µg/ml) diperoleh dari perkalian antara

faktor pengencer, faktor konversi (50 µg/ml) dan Absorbansi (A260). Tingkat

kemurnian DNA baik jika nilai rasio yang diperoleh adalah antara 1.8-2.0 (Sambrook

et al., 1989).

Muladno (2002) menyarankan apabila jumlah DNA yang dihasilkan terlalu

sedikit sehingga konsentrasinya tidak dapat diukur dengan alat spektrofotometer atau

DNA yang diperolah tidak terlalu murni, konsentrasi DNA dapat diestimasi dengan

melihat intensitas fluorescen yang dapat dipancarkan oleh etidium bromide.

Intensitas DNA standar yang telah diketahui jumlahnya dibandingkan dengan

intensitas DNA sampel, dengan asumsi jenis DNA standar harus sama dengan DNA

Page 23: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

sampel. Rasio 260 nm dan 280 nm yang kurang dari 1.8 kemungkinan

terkontaminasi protein atau terkontaminasi oleh phenol. Rasio 260/280 nilainya 1.8

mengindikasikan murni untuk DNA dan 2.0 murni untuk RNA (Nicholl, 1996).

Rasio optical density (OD) menurut Montgomery and Sise (1990) apabila 260 nm

dan 280 nm berada di antara 1.8-2.0 menunjukkan bahwa proses deproteinasi pada

metode tersebut baik.

Penentuan Kualitas DNA

Elektroforesis adalah sutu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas

ukurannya. Elektroforesis menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu

medium yang mengandung sempel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat

digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,

misalnya DNA yang bermuatan negatif (Triwibowo, 2008). Menurut Winarno dan

Agustinah (2007) elektroforesis adalah suatu cara pemisahan campuran dan beberapa

senyawa dengan melakukan suspensi ke dalam air dan kemudian diberikan aliran

listrik. Gel yang ditempatkan ke dalam sumur elektroforesis yang mengandung

larutan buffer dan dialiri listrik, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH

netral akan bergerak kearah positif. DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang

berbeda tergantung ukurannya.

Muladno (2002) menyatakan hasil analisis DNA dapat dilihat melalui proses

elektroforesis. Komponen bahan kimia terpenting yang digunakan dalam proses

tersebut adalah gel. Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor yaitu

Ukuran melekul DNA, konsentrasi agarose, konformasi DNA, voltase yang

digunakan, adanya etidium bromide di dalam gel dan komposisi larutan buffer.

Kualitas DNA dapat ditentukan oleh elektroforesis. Selain itu, elektroforesis dapat

digunakan untuk analisis protein (Alberts et al., 2002). Gel yang biasa digunakan

yaitu gel agarose dan gel poliakrilamida. Gel agarose untuk memisahkan fragmen-

fragmen DNA yang ukurannya mempunyai rentang ratusan hingga sekitar 20.000

pasangan basa. Gel poliakrilamida biasa digunakan untuk fragmen-fragmen DNA

yang lebih kecil (Old dan Primrose, 1989).

Page 24: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

METODE

Lokasi dan Waktu

Penelitian ini dilaksanakan di Laboraturium Biologi Molekuler Hewan, Pusat

Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong. Penelitian dilaksanakan selama dua bulan

dari bulan Februari-April 2009.

Materi

Sampel dan Bahan

Sampel yang digunakan adalah darah segar sapi FH dari empat ekor sapi

yang berasal dari Laboratorium Lapang Hewan Pusat Bioteknologi-LIPI Cibinong.

Darah diambil dengan jarum G-18 pada pembuluh darah (vena) halus di ekor. Darah

dikoleksi langsung ke dalam tabung 10 ml mengandung 15 % EDTA (Etilendiamin

tetraaserat) sebagai antikoagulasi.

Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA yaitu, 5 ml darah segar

sapi FH, 16,8 ml lisis buffer (1M Tris HCl pH 8, 5M NaCl, 5M EDTA dan 1 %

SDS), Proteinase-K (Progen) 0,48 ml, phenol-choroform-isoamyl alkohol (PCI)

(25:24:1) 14,4 ml, 3M NaOAc (Natrium Acetat) pH 5,2 sebanyak 0,72 ml, 12 ml

etanol 70 %, 14,4 ml etanol 96 % dan buffer TE pH 8 (1M Tris dan 0,5M EDTA)

1,2 ml.

Bahan-bahan yang digunakan untuk kuantifikasi DNA yaitu, DNA 5 µl tiap

sempel, TE buffer, H2O steril dan etanol 70 %.

Bahan-bahan yang digunakan untuk elektroforesis yaitu, DNA 35 µl, gel

agarose 1 % (Invitrogen ultra pure +M Agarose), TBE 1x, ethidium bromida, 14 µl

loading dye (1 ml G190A 24267202), 10,5µl marker DNA 1 kb (Biolabs ladder

N32325), alkohol, H2O dan film polaroid.

Peralatan

Alat-alat yang digunakan untuk penelitian diantaranya Jarum G-18 (B-D

Precision Glidetm

needle) , holder, venoject vacutainer cont EDTA 10 ml (Nesco),

sentrifugasi (HERME 2300 k), vortex (Barnstead Thermolyne), mikrotube 1.5 ml,

mikropipet (Biorad), autocolave, oven, pH meter (Thermo Orion), pengering pellet

(Savant), thermometer, GeneQuant DNA calculator (Amersham Biosciences),

Page 25: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

refrigerator, elektroforesis (Biorad), ultraviolet light, dan timbangan analitik

(Precisa XT 120 A).

Rancangan Statistik

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial (3x2)

dengan dua faktor. Faktor pertama yaitu tiga kombinasi volume darah dan lisis buffer

(µl darah : µl lisis buffer), yaitu 100 : 800, 200 : 700, dan 300 : 600. Faktor kedua

yaitu kecepatan sentrifugasi, 10.000 rpm dan 12.000 rpm. Dengan demikian

penelitian ini melibatkan enam perlakuan (3x2), tiap perlakuan diulang empat kali.

Sebagai ulangan adalah sapi, sehingga penelitian ini menggunakan empat ekor sapi

dan jumlah sempel sebanyak 24. Model rancangan tersebut menurut Steel dan Torrie

(1991) adalah sebagai berikut:

Yijk = μ + Ai + Bj + ABij + εijk

Keterangan :

Yijk : Variabel respon akibat pengaruh komposisi lysis buffer ke-i dan taraf

kecepatan sentrifugasi ke-j pada ulangan ke-k

µ : Nilai tengah umum

Ai : Pengaruh komposisi lysis buffer level ke-i

Bj : Pengaruh kecepatan sentrifugasi levek ke-j

ABij : Pengaruh interaksi antara komposisi lsis buffer ke-i dengan kecepatan

sentrifugasi ke-j

Εij : Galat percobaan pada unit percobaan ke-k dalam kombinasi perlakuan

ke-ij

Analisis Data

Data berupa kuantitas dan kemurnian DNA yang diperoleh dari setiap

perlakuan akan dianalisis menggunakan sidik ragam (ANOVA). Sebelum dianalisis

data diuji kehomogenan, kenormalan dan kebebasan galat terlebih dahulu, apabila

data memenuhi uji asumsi maka data langsung dianalisis. Apabila data tidak

memenuhi asumsi maka data di transformasi. Perbedaan antar perlakuan akan diuji

dengan menggunakan Tukey pada taraf perbedaan 5 % (p<0,05).

Data berupa kualitas DNA yang diperoleh secara acak dari setiap perlakuan,

dibandingkan antar perlakuan dengan melihat kemunculan pita tunggal. Ukuran

Page 26: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

DNA yang digunakan adalah 1kb Biolabs DNA Ladder N32325, hanya sebagai

kontrol ukuran berat molekul.

Prosedur

Metode ekstraksi DNA yang digunakan adalah modifikasi phenol-choroform-

isoamyl alcohol (PCI) menurut Sambrook et al. (1989) adalah sebagai berikut:

Koleksi Darah Segar

Koleksi darah diperoleh sebanyak 5-6 ml dalam tabung 10 ml yang berisi

EDTA sebagai antikoagulasi.

Koleksi Darah Putih

Koleksi darah putih dilakukan dengan menggunakan lysis buffer, komposisi

yang digunakan adalah perbandingan volume darah segar dengan lisis buffer yaitu

100 µl : 800 µl, 200 µl : 700 µl, dan 300 µl : 600µl. Komposisi darah dan lisis buffer

yang telah dicampurkan kemudian dihomogenkan. Selanjutnya dilakukan presipitasi

protein.

Penghilangan Protein

Darah yang telah homogen ditambahkan 20 µl proteinase-K, diinkubasi pada

suhu 56oC selama 1 jam setiap 20 menit tabung digoyangkan. Ke dalam larutan

tersebut ditambahkan 600 µl phenol-choroform-isoamyl alkohol (PCI) dengan

perbandingan (25:24:1), inkubasi kembali pada suhu -20 oC selama 30 menit. Setelah

itu, disentrifugasi sesuai perlakuan (10.000 rpm dan 12.000 rpm) selama 10 menit

pada suhu 10 0C.

Presipitasi dan Koleksi DNA

Lapisan yang paling atas (supernatan) setelah disentrifugasi dipindahkan ke

tabung baru, tambahkan 30 µl 3M NaOAc dan 600 µl etanol 96 % lalu goyangkan

dan inkubasi pada suhu -20 oC selama 30 menit. Larutan disentrifugasi sesuai

perlakuan (10.000 rpm dan 12.000 rpm) selama 10 menit pada suhu 10 0C.

Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan 500 µl etanol 70 % dan disentrifugasi

kembali dengan kecepatan yang sama, supernatan dibuang. Pelet DNA dikeringkan

dengan vacum, kemudian dilarutkan dengan 50 µl TE buffer. DNA disimpan dalam

suhu -20 oC sebagai stok untuk kuantifikasi dan elektroforesis.

Page 27: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Kuantifikasi DNA

DNA terkoleksi dikalkulasi dengan mesin GeneQuant DNA calculator. Dasar

perhitungan kemurnian DNA tersebut dibandingkan pada panjang gelombang 260

nm dengan 280 nm. Mesin GeneQuant DNA calculator dinyalakan tunggu sinyal

sampai keluar instrument ready, tombol DNA ditekan dan dimasukan TE buffer

sebagai blanko, ditekan tombol set ref ditunggu sampai muncul pada layar niai 0,000

pada semua peubah. Sampel DNA yang telah diterapkan dalam kuvet sebanyak 5 µl,

kemudian tekan enter tunggu sampai nilai keluar. Nilai yang tertera pada layar yang

dicatat yaitu nilai konsentrasi (ng/µl), nilai absorbansi 260 nm, 280 nm dan nilai

rasio 260/280. Kuantifikasi dilanjutkan pada sampel berikutnya sebanyak 24 sampel.

Kualifikasi DNA

Gel agarosa 1% dilarutkan dalam TBE 1X (20 gram agarosa dan 200 ml TBE

1X) didihkan sampai larut, kemudian dibiarkan beberapa menit hingga suhunya turun

50-60 0C. Sisir elektroforesis dipasang di salah satu ujung baki, kemudian gel

agarosa dituangkan ke dalam baki cetakan, tunggu hingga gel mengeras, dimasukkan

ke dalam tanki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan buffer TBE 1X. Masing-

masing 5 µl sampel dicampurkan dengan 2 µl loading dye. Sedangkan untuk DNA

Ladder digunakan ladder 1 kb sebanyak 1.5 µl yang dicampurkan dengan 2 µl

loading dye. Selanjutnya dimasukkan ke dalam sumur, dicatat nomor sumur dan

sampel DNA yang dimasukkan. Elektroforesis dijalankan dengan alir listrik 100

voltage, selama 60 menit, tekan tombol run. Setelah itu, gel direndam dalam larutan

ethidium bromide selama 30 menit. Cuci gel yang telah direndam ethidium bromide

pada air yang mengalir kemudian dilihat diatas UV illuminator, hasil visualisasi

difoto dengan film Polaroid. Pita yang dihasilkan konfirmasikan dengan konsentrasi

DNA yang dihasilkan dari mesin GeneQuant DNA calculator.

Page 28: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

HASIL DAN PEMBAHASAN

Keperluan dasar penelitian di bidang biologi molekuler adalah adanya DNA

yang cukup. Oleh karenanya banyak metode ekstraksi DNA yang dilakukan untuk

memperoleh cara yang lebih efektif dalam menghasilkan DNA. Sampel yang

digunakan diperoleh dari darah segar sapi Friesian Holstein (FH) yang dikoleksi dari

Laboratorium Lapang Hewan Pusat Bioteknologi-LIPI Cibinong. Sampel tersebut

diekstraksi menggunakan metode Sambrook et al., (1989) yang telah dimodifikasi.

Indikasi keberhasilan ekstraksi DNA perlu diketahui kuantitas dan kualitas DNA

yang dihasilkan. Secara kuantitas bisa dilihat dari nilai konsentrasi DNA dan nilai

OD 260/280. Sedangkan secara kualitas bisa dilihat dari hasil elektroforesis dan

kemurnian DNA.

Kuantitas DNA

Konsentrasi DNA

Hasil Perhitungan konsentrasi DNA dengan GeneQuant DNA calculator dari

24 sampel tergantung dari volume darah yang digunakan. Semakin banyak volume

darah yang digunakan maka relatif semakin meningkat konsentrasi DNA yang

dihasilkan. Konsentrasi DNA yang diperoleh berkisar antara 84,200 ± 24 ng/µl-

151,550 ± 29 ng/µl. Volume darah 300 µl menghasilkan konsentrasi DNA yang

relatif lebih tinggi (151,550 ± 29 ng/µl) pada kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm.

Demikian juga pada kecepatan sentrifugasi 12.000 rpm menghasilkan DNA yang

relatif tinggi pada volume darah 300 µl yaitu rata-rata 121,070 ± 26 ng/ul

dibandingkan dengan volume darah 100 µl dan 200 µl . Konsentrasi DNA darah sapi

segar Friesian Holstein FH secara lengkap disajikan pada Tabel 1.

Tabel. 1 Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dengan

Kecepatan Sentrifugasi terhadap Konsentrasi DNA (Rataan ± SE)

Konsentrasi DNA (Rataan ± SE)

Kecepatan

sentrifugasi

Volume Darah(µl) : Lisis Buffer(µl)

100 : 800 200 : 700 300 : 600

………………………….ng/µl …………………………

10000 rpm 113,020 ±32 120,850 ±46 151,550 ±29

12000 rpm 94,574 ±27 84,200 ±24 121,070 ±26

Page 29: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Secara statistik konsentrasi DNA yang dihasilkan tidak berbeda nyata

(p>0,05) pada masing-masing kecepatan sentrifugasi. Hal ini menunjukkan nilai

konsentrasi DNA yang dihasilkan dari setiap perlakuan pada setiap kecepatan

sentrifugasi hampir sama. Hasil statistik tidak ada interaksi antara perbandingan

volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi yang berbeda terhadap

konsentrasi DNA yang dihasilkan. Namun, peningkatan konsentrasi DNA pada

perbandingan volume darah : lisis buffer (300 µl : 600 µl) pada kecepatan

sentrifugasi yang berbeda menunjukkan bahwa konsentrasi DNA yang dihasilkan

relatif meningkat berbanding terbalik dengan volume lisis buffer yang digunakan.

DNA terdapat di dalam inti sel, pada darah mamalia dewasa inti sel berada di

dalam sel darah putih (leukosit). Dellman dan Brown (1989) menyebutkan bahwa

eritrosit pada mamalia dewasa tidak berinti dan leukosit memiliki inti sel. Volume

darah yang digunakan lebih banyak menghasilkan leukosit yang lebih banyak dengan

demikian menghasilkan konsentrasi DNA yang relatif lebih tinggi. Kecepatan

sentrifugasi 10.000 rpm menghasilkan rata-rata konsentrasi DNA yang relatif lebih

tinggi dibandingkan pada kecepatan sentrifugasi 12.000 rpm. Sentrifugasi dilakukan

untuk memisahkan DNA dan komponen-komponen lain, tetapi kemungkinan DNA

dapat tercampur dengan komponen yang lain seperti protein, RNA, lipid, dan

polisakarida pada putaran sentrifugasi yang lebih cepat. Berdasarkan hasil ini

menunjukkan kecepatan dan lama sentrifugasi harus benar-benar diperhatikan.

Rasio DNA

Tingkat kemurnian DNA dapat ditentukan dengan cara menghitung rasio

antara nilai 260 nm dan 280 nm pada sampel DNA yang diukur melalui GeneQuant

DNA calculato. Nilai 260 merupakan nilai maksimal DNA dapat menyerap cahaya.

Nilai absorbansi pada panjang gelombang (A260) dapat digunakan untuk

memperkirakan konsentrasi DNA juga. Sedangkan nilai 280 merupakan nilai

maksimal residu tirosin dapat menyerap cahaya. Nilai absorbansi pada panjang

gelombang (A280) dapat digunakan untuk indikasi kontaminasi protein (Muladno,

2002). Nilai OD 260/280 menunjukkan kualitas DNA (tingkat kemurnian), DNA

dikatakan murni apabila rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8-2,0

(Khosravinia dan Ramesha, 2006). Rasio OD 260/280 pada penelitian ini rata-rata

berkisar antara 1,152 ± 0,052 sampai 1,394 ± 0,140, menunjukkan tingkat kemurnian

Page 30: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

DNA masih rendah. Rasio kurang dari 1,8 mengindikasikan adanya kontaminasi

protein dan phenol (Brown, 1996). Selain kontaminasi protein dan phenol, rasio

DNA yang kurang dari 1,7 disebabkan adanya kontaminasi bahan kimia lainnya

seperti Tris, EDTA, etanol, sodium asetat yang akan menyebabkan kontaminasi pada

sempel (Khosravinia et al., 2007). Hasil kemurnian DNA pada rasio 260/280

disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Pengaruh Perbandingan Volume Darah dan Lisis Buffer dan

Kecepatan Sentrifugasi terhadap Rasio OD 260/280 (Rataan ± SE)

Rasio OD 260/280 (Rataan ± SE)

Kecepatan

sentrifugasi

Volume Darah(µl) : Lisis Buffer(µl)

100 : 800 200 : 700 300 : 600

10000 rpm 1,394

a ±0,140 1,371

a ±0,082 1,340

a ±0,033

12000 rpm 1,258b ±0,073 1,153

b ±0,120 1,152

b ±0,052

Keterangan : huruf superskrip berbeda dalam kolom yang sama, berbeda nyata

(p<0,05) dan huruf superskrip sama dalam baris yang sama, tidak

berbeda nyata (p>0,05).

SE : Standard Error

Secara statistik tidak ada interaksi antara perbandingan volume darah dan

lisis buffer dengan kecepatan sentrifugasi terhadap kemurnian DNA (p>0,05).

Kemurnian DNA juga tidak dipengaruhi oleh perbandingan volume darah dan lisis

buffer. Sedangkan kecepatan sentrifugasi dapat mempengaruhi tingkat kemurnian

DNA, dengan kecepatan 10.000 rpm telah mampu mengendapkan lebih banyak dan

mampu memisahkan molekul DNA dengan molekul yang lainnya. Sedangkan pada

kecepatan sentrifugasi 12.000 rpm diperkirakan putaran terlalu cepat sehingga DNA

kemungkinan dapat tercampur lagi dengan komponen yang lain. Kecepatan

sentrifugasi 10.000 rpm menghasilkan kemurnian DNA rata-rata (1,368) sedangkan

pada putaran 12.000 rpm menghasilkan kemurnian DNA rata-rata (1,187).

Tingkat kemurnian relatif tinggi diperoleh pada perbandingan volume darah

dan lisis buffer 100 µl : 800 µl dengan kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm (1,394 ±

0,140) dan relatif rendah pada perbandingan 300 µl: 600 µl (1,153 ± 0,052). Dengan

dimikian, pada volume darah yang digunakan sedikit dengan penambahan lisis buffer

yang lebih banyak (100 µl : 800 µl) menghasilkan kemurnian yang relatif lebih

Page 31: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

tinggi. Lisis buffer pada penelitian ini berfungsi untuk melisis sel. Komposisi lisis

buffer diantaranya EDTA dan SDS, EDTA untuk merusak dinding sel dengan cara

mengikat ion magnesium. Ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel

maupun mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.

Sedangkan SDS untuk merusak membran sel (Muladno, 2002). Penambahan lisis

buffer yang lebih besar (800 µl) diduga lebih efektif melisis sel darah merah pada

volume darah yang lebih sedikit (100 µl). Kemurnian DNA relatif menurun dari

perbandingan volume darah dan lisis buffer 100 µl : 800 µl, 200 µl : 700 µl, dan 300

µl : 600 µl.

Banyak faktor yang menyebabkan kemurnian pada penelitian ini masih

sedikit rendah. Selain terkontaminasi bahan kimia, sampel juga masih terdapat RNA

dan protein, sehingga hasilnya bukan DNA murni. Dalam meningkatkan kemurnian

DNA yang diperoleh masih harus dilakukan tahap pemurnian dengan cara pencucian

dengan beberapa kali dan penambahan PCI dua kali (Khosravinia et al., 2007).

Selain itu, ketelitian dalam bekerja merupakan salah satu hal yang harus diperhatikan

karena dapat mempengaruhi kemurnian DNA yang dihasilkan juga.

Kualitas DNA

Kualitas DNA hasil ekstraksi bisa dilihat pada gel agarose 1% setelah

dielektroforesis pada 100 voltage selama 1 jam. Pengukuran panjang molekul DNA

diperlukan pengukur DNA yang disebut molecule weight dna marker (Muladno,

2002). Marker yang digunakan untuk membandingkan ukuran molekul DNA dalam

penelitian ini adalah berukuran 1 kb (kilobasa) DNA Ladder N32325. Ukuran DNA

sampel dapat diperkirakan dengan cara melihat posisi DNA terhadap DNA pengukur

yang memang sudah diketahui panjangnya. Namun, pengukuran seperti ini masih

bersifat perkiraan. Elektroforesis dalam penelitian ini tujuannya untuk melihat

ekspresi DNA dan melihat keberhasilan ekstraksi DNA yang dilakukan.

Ukuran dan kemurnian DNA menurut (Albert et al., 2002) dapat ditentukan

oleh elektroforsis. Satu sampel DNA diambil secara acak dari setiap perlakuan untuk

dielektroforesis. Gambar 3 menunjukkan DNA yang berasal dari darah segar sapi FH

berhasil diisolasi dengan baik, karena tidak ada pita-pita lainnya yang tampak di

bawah gambar pada setiap sampel (single band).

Page 32: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Perkiraan ukuran DNA pada keenam perlakuan (Gambar 3) lebih dari 1.000

pasang basa (pb) atau 1 kilobasa (kb). Besar kecilnya konsentrasi DNA dapat

ditunjukkan dengan tipis dan tebalnya pita DNA. Perbandingan darah dan lisis buffer

(100 µl : 800 µl) dan (300µl : 600 µl) dengan kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm

menunjukkan ukuran molekul besar. Pita-pita pada perlakuan tersebut terlihat smear

memperlihatkan molekul DNA tidak turun ke bawah karena konsentrasi yang tinggi.

Perbandingan darah dan lisis buffer 100 µl : 800 µl adalah 108.7 ng/ul dan 300 µl :

600 µl adalah 200 ng/ul. Pita yang paling tipis ditunjukkan pada perbandingan darah

dan lisis buffer 100 µl : 800 µl pada kecepatan sentrifugasi 12.000 rpm dengan

konsentrasi DNA yang paling rendah (74,5 ng/µl).

M T1 T2 T3 T4 T5 T6

Gambar 3. Hasil Pemotretan Elektroforesis dari DNA Marker (M) I Kb dan

Enam Sempel DNA (T1-T6)

DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda tergantung ukuran

atau marker DNA. Molekul yang berukuran kecil dapat dengan mudah melewati gel

karena bergerak lebih cepat dibandingkan molekul yang besar. Faktor lain yang

menentukan keberhasilan elektroforesis adalah konsentrasi gel. Nicholl (1996)

menyatakan konsentrasi gel yang normal untuk elektroforesis yaitu antara 0.3-2.0%.

Molekul DNA yang tidak turun ke bawah dapat ditentukan juga karena konsentrasi

agarose terlalu tinggi. Migrasi molekul DNA yang berkonsentrasi rendah lebih cepat

dibandingkan dengan molekul yang bekonsentrasi tinggi (Muladno, 2002).

Page 33: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Kombinasi perbandingan volume darah dan lisis buffer dengan kecepatan

sentrifugasi tidak mempengaruhi konsentrasi DNA

2. Konsentrasi DNA relatif tinggi diperoleh pada perlakuan yang menggunakan

darah paling banyak (300 ul). Konsentrasi DNA relatif tinggi sebanding dengan

banyaknya volume darah yang digunakan

3. Penambahan lisis buffer yang lebih banyak (800 µl) memberikan kemurnian

yang relatif lebih tinggi

4. Nilai kemurnian DNA rata-rata 1,3 masih sedikit terkontaminasi bahan-bahan

kimia lain

5. Kecepatan sentrifugasi 10.000 rpm dapat meningkatkan kemurnian DNA dan

menghasilkan konsentrasi DNA yang relatif lebih banyak

6. Berdasarkan elektroforesis ketebalan pita DNA berbanding lurus dengan

konsentrasi DNA

Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan perbandingan darah dan

lisis buffer yang berbeda dengan penambahan PCI dan pencucian lebih dari satu

kali

2. Perlu dicoba Ekstraksi DNA dengan materi yang berbeda, seperti semen, bulu,

feses dan jaringan

3. Perlu dicoba dengan PCR DNA yang dihasilkan pada penelitian ini

Page 34: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillah, dengan rasa syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT

yang telah melimpahkan nikmat, rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat

menyelesaikan studi ini. Shalawat serta salam semoga senantiasa tercurahkan kepada

Nabi Muhammad sebagai suri teladan kita.

Ayahanda, ibunda, dan teteh tercinta, terima kasih yang tak terhingga yang

senantiasa melimpahkan doa, nasehat, kasih sayang, motivasi dan kekuatan kepada

penulis untuk menjalani kehidupan hingga saat ini dan masa yang akan datang. Dede

lia dan dede engguh keponakanku yang selalu memberikan keceriaan.

Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya dan penghargaan

yang setinggi-tingginya kepada Prof. Dr. Ir. Ronny R. Noor, MRur.Sc dan Dr. Ir.

Endang T. Margawati, M. Agr.Sc selaku dosen pembimbing atas semua bimbingan,

masukan dan arahannya selama penulis melakukan penelitian dan penyusunan skripsi

ini hingga tahap akhir. Dr. Ir. Cece Sumantri M. Agr.Sc dan Dr. Ir. Nahrowi, MSc

penulis haturkan terima kasih selaku dosen penguji. Penulis juga mengucapkan

terima kasih kepada Dr. Ir. Sri Supraptini Mansjoer selaku dosen akademik, Ir. Niken

Ulupi, MS dan Dr. Ir. Henny Nuraini, MSi yang telah memberikan pengalaman

hidup selama perkuliahan, nasihat, masukan, arahan dan saran-sarannya akan selalu

penulis ingat.

Ucapan terima kasih, spesial penulis sampaikan kepada semua rekan-rekan

42, Sahabat-sahabatku Ayu (seperjuangan dalam penelitian), Heni, Uny, Oel, Tray,

Neng Ia, Hida, Ala, Ninu, Pipit, dan temen kos Bateng 23’ atas suasana kekeluargaan

dan kebersamaan yang telah diberikan sehingga selalu memberikan keceriaan.

Terima kasih kepada Prayogo Hadi dan keluarganya yang selalu memberikan kasih

sayang, motivasi, dan yang selalu ada di hati penulis.

Terakhir penulis ucapkan terima kasih kepada seluruh civitas akademik

Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Semoga skripsi ini bermanfaat bagi

penulis khususnya dan pembaca pada umumnya.

Bogor, Juli 2009

Penulis

Page 35: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

DAFTAR PUSTAKA

Alberts, B., A. Johnson., J. Lewis., M. Raff., K. Roberts dan P. Walter. 2002.

Molecular Biology of The Cell. Fourt Edition. Garland Science, a member of the

taylor and Francis Group 29 west 35th

, New York.

Alberts, B., D. Bray., J. Lewis., Raff., K. Robert dan J. D. Watson. 1994. Biologi

Molekuler Sel. Mengenal Sel. Edisi ke-2, Gramedia, Jakarta.

Boyd A. L. dan D. Samid. 1993. Molekuler biology of transgenic animals. Journal of

Animal Science. Vol. 71. Suppl. 3; 9-1.

Brown. 1996. Gene Cloning. An Introduction. third edition. Chapman dan Hall,

Boundrary Raw, London.

Campbell, N. A., J. B. Reece dan L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Edisi ke 5, Jilid 1.

Terjemahan: Rahayu. Erlangga, Jakarta.

Dellman, H. D dan E. M. Brown. 1989. Buku Teks Histologi Veteriner I.

Terjemahan: R. Hartanto. Universitas Indonesia Press, Jakarta.

Djojosoebagio, S. 1996. Peningkatan Produktivitas melalui penerapan bioteknologi.

Seminar Nasional Peternakan dan Veteriner. Puslitbangnak, Bogor.

Eko, T. S., M. E. Sawitri dan Murharlien. 2009. Budi Daya 22 Ternak Potensi.

Penebar Swadaya, Jakarta.

Frandson, R. D. 199. Anatomi dan Fisiologi Ternak. Terjemahan: Srigandono dan

Koen Praseno. Fakultas Peternakan Universitas Diponegoro. Gadjah Mada

University Press, Yogyakarta.

Hardjosubroto, W. 1999. Pengantar Genetika Hewan. Fakultas Peternakan Gadjah

Mada Yogyakarta. CV. Makmur, Yogyakarta.

Isnaeni, W. 2006. Fisiologi Hewan. Kanisius, Yogyakarta.

Jusuf, M. 2001. Genetika 1 Struktur dan Ekspresi Gen. Institut Pertanian Bogor,

Bogor.

Khosravinia, H dan K. P. Ramesha. 2006. Influence of EDTA and magnesium on

DNA extraction from blood samples and specificity of polimerase chain

reaction. African Journal of Biotechnolody, Vol. 6(3), pp. 184-187.

Khosravinia, H., N. N. Murthy., D. T Parasad dan N. Pirany. 2007. Optimazing

factors influencing DNA extraction from fresh whole avian blood. African

Journal of Biotechnolody, Vol. 6(4), pp. 481-486.

Maclean, N. 1987. Macmillan Dictionary of Genetics and Cell Biology. The

Macmillan Press Ltd, London and Basingstoke.

Montgomery, G. W dan J. A. Sise. 1990. Enxtraction of DNA From Sheep White

Blood Cells. MAF Technology Moleculer Biology Unit. Departement of

Biochemistry. University of Otago, Dunedin, New Zealand. New Zealand

Journal of Agricultural Rsearch, Vol. 33-43.

Page 36: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Mortojo, H. 1992. Peningkatan Mutu Genetik Ternak. Departemen Pendidikan dan

Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Pusat Antar Universitas

Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan UCC

Faundation, Bogor.

Murray, R.K. 1995. Biokimia Harper. Edisi ke-22. EGC penerbit Buku Kedokteran,

Jakarta.

Nicholl, D. S. T. 1996. An Introduction to Genetic Engineering. Cambridge

University Press.

Noor, R. R. 2008. Genetik Ternak. Penebar Swadaya, Jakarta.

Old, R.W dan S.B. Primrose. 1989. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. Blackwell

Scientific Publications, London.

Prahasta, A., H. Masturi., T. Dhalika. 2008. Budidaya Usaha Pengolahan Agrobisnis

Ternak Sapi. CV Pustaka Grafika, Bandung.

Prasetyo, A. 2005. Metode ekstraksi DNA identifikasi gen kappa kasein (k- kasein)

pada sapi fresian holstein (FH) di peternakan rakyat. Skripsi. Departemen Ilmu

Produksi Ternak. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Saefudin. 1996. Ternak transgenik dan pandangan genetika kuantitatif. Kumpulan

Makalah Ilmiah Hasiil Penelitian Bioteknologi. Pusat antar Universitas

Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Sheeler, P dan D. E. Bianchi. 1987. Cell and Molecular Biology. California State

University, Northridge.

Sambrook, J., E. F. Fritsch, dan T. Maniatis. 1989. Moleculer Cloning. A Laboratory

Manual. Cold Spring Harbour Lab. CSH, New York.

Santoso. 2008. Mengelola Peternakan Sapi Secara Profesional. Penebar Swadaya,

Jakarta.

Steel, R. G. D. dan J. H. Torrie. 1991. Prinsip dan Prosedur Statistik. Terjemahan: B.

Sumantri. Gramedia, Jakarta.

Sudono., F. Rosdiana dan B. S. Setiawan. 2003. Beternak Sapi secara Intensif. Agro

Media Pustaka, Jakarta.

Susanti, E. VH dan S. R. D. Ariani. 2004. Kloning gen penisilin v asilase dari

Bacillus sp bac4 melalui pembuatan pustaka genom. Biodiservitas. Vol (5). Hal

1-6.

Triwibowo, Y. 2008. Biologi Molekuler. Erlangga, Jakarta.

Tyler, H. D dan M. E. Ensminger. 2006. Dairy Cattle Science. Pearson Prentice Hall,

Upper saddle River, New Jersey Columbus, Ohio.

Wardhani, S. 2008. Penyimpanan darah tali pusat prospek kebutuhan trend mimpi

bioteknologi. Program Master Graduate School of Phamaceutical Science,

Departement of Pharmacology, Tohoku university, Japan. http:

//www.beritaiptek.com [24 juni 2009].

Page 37: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Winarno dan W. Agustinah. 2007. Pengantar Bioteknologi. M-Brio Biotekindo

Press, Bogor.

Zaid, A., H. G. Hughes., E. Porceddu., dan F. W. Nicholas. 1999. Glossary of

Biotechnology and Genetic Engineering. Food and Agriculture Organization of

The United Natons. Rome, Italy.

Page 38: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

L A M P I R A N

Page 39: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Lampiran 1. Diagram Alir Prosedur Ekstraksi DNA Metode Sambrook et al.,1989

a. Lisis sel darah merah dan penghilangan protein

Tambahkan 20 µl proteinase K

Sentrifugasi sesuai perlakuan selama 10

menit pada suhu 10 0C.

Inkubasi pada suhu -20 oC selama 30

menit

Tambahkan 600 µl PCI (25:24:2)

Inkubasi pada suhu 56oC selama 1 jam,

setiap 20 menit tabung digoyangkan

Darah dan lisis buffer dihomogenkan

Page 40: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

b. Ekstraksi DNA

Lapisan yang paling atas pindahkan ke

tabung baru

Inkubasi pada suhu -20 oC selama

30 menit

Tambahkan 30 µl 3M NaOAc dan

600 µl etanol 96% dihomogenkan

Pelet dikeringkan dan tambahkan

50 µl TE buffer

DNA disimpan pada suhu -20oC sebagai

stok untuk kuantifikasi dan elektroforesis

Supernatan dibuang, pelet dicuci

dengan 500 µl etanol 70%

Sentrifugasi sesuai perlakuan

selama 10 menit pada suhu 10 0C.

Sentrifugasi sesuai perlakuan

selama 10 menit pada suhu 10 0C.

Page 41: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Lampiran 2. Reagent-reagent yang digunakan untuk ekstraksi DNA metode Phenol

Choroform-Isoamyl alkohol (PCI)

1. Lisis Buffer 50 ml

1M Tris HCl : 2,5 ml

5M NaCl : 10 ml

0,5 EDTA pH 8 : 2 µl

10 % SDS : 1 ml

Up to H2O : 50 ml

2. Proteinase K 20 mg/ml untuk 24 sempel tiap sempel 20 µl

Proteinase K : 13,4 mg

H2O destilasi : 666,6 µl

3. Phenol-Choroform-Isoamyl alkohol (PCI) 20 ml

Phenol : Choroform : Isoamyl alcohol

25 : 24 : 1

Phenol : 10 ml

Choroform : 9,6 ml

Isoamyl alcohol : 0,4 ml

4. 3M NaOAC 5 ml

3M NaOAC : 1,23045 gr

Up to H2O : 5 ml

5. TE Buffer pH 8 300 ml

1M Tris : 2,5 ml

0.5 EDTA : 50 ml

Mili Q : 247,5 ml

Autoclave

Page 42: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

6. 1M Tris 50 ml

1M Tris : 6,057 gr

Up to H2O : 50 ml

7. TBE 1X 100 ml

Tris : 5,4 gr

Boric Acid : 2,75 gr

0.5 M EDTA : 2 ml

Up to H2O : 100 ml

8. Gel agarose 1 %

Agarose : 2 gr

TBE 1X : 200 ml

Page 43: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Lampiran 3. Data Kuantifikasi DNA (Konsentrasi DNA, Rasio OD 260/280, 260nm,

dan 280 nm)

No Perlakuan Konsentrasi ng/ml Rasio 260/280 260 nm 280 nm

1 T1S1 61,8 1,168 0,618 0,528

2 T1S2 203 1,133 2,03 1,792

3 T1S3 78,6 1,572 0,786 0,5

4 T1S4 108,7 1,704 1,087 0,638

5 T2S1 128,5 1,428 1,285 0,9

6 T2S2 109,7 1,154 1,097 0,951

7 T2S3 57,7 1,468 0,577 0,393

8 T2S4 187,5 1,433 1,875 1,308

9 T3S1 89,6 1,12 0,896 0,8

10 T3S2 59,6 1,469 0,598 0,407

11 T3S3 200 1,464 2 1,366

12 T3S4 257 1,308 2,57 1,965

13 T4S1 42,2 1,431 0,422 0,295

14 T4S2 74,5 1,061 0,745 0,702

15 T4S3 152,1 1,056 1,521 1,441

16 T4S4 109,5 1,484 1,095 0,738

17 T5S1 45,1 1,229 0,451 0,367

18 T5S2 27,1 1,168 0,271 0,232

19 T5S3 111,1 1,148 1,111 0,968

20 T5S4 153,5 1,067 1,535 1,439

21 T6S1 78,7 1,151 0,787 0,684

22 T6S2 170,1 1,112 1,701 1,53

23 T6S3 161,7 1,051 1,617 1,539

24 T6S4 73,8 1,297 0,738 0,569

Page 44: PENGARUH PERBANDINGAN VOLUME DARAH DAN LISIS … · percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap faktorial dengan dua factor (3x2). Faktor pertama yaitu kombinasi volume

Lampiran 4. Analisis Ragam Konsentrasi DNA terhadap Pengaruh Perbandingan

Volume Darah dan Lisis Buffer dengan Kecepatan Sentrifugasi yang

berbeda

Sumber Keragaman db JK KT F P

lisis buffer 2 5867 2934 0,74 0,491

sentrifugasi 1 4882 4882 1,23 0,282

lisis buffer*sentrifugasi 2 343 171 0,04 0,958

Error 18 71374 3965

Total 23 82466

S = 62,9699 R-Sq = 13,45% R-Sq(adj) =0,00%

Lampiran 5. Analisis Ragam Rasio OD 260/280 DNA terhadap Pengaruh

Perbandingan Volume Darah Lisis Buffer dengan Kecepatan

Sentrifugasi yang berbeda

Sumber Keragaman db JK KT F P

Lisis buffer 2 0,000854 0,000427 0,36 0,700

sentrifugasi 1 0,00693 0,006936 5,91 0,026

Lisis buffer*sentrifugasi 2 0,000283 0,000142 0,12 0,887

Error 18 0,021118 0,001173

Total 23 0.029191

S = 0,0342523 R-Sq = 27,66% R-Sq(adj) = 7,56%