PENGARUH BUBUK DAUN CINCAU HIJAU Premna oblongifolia … · Pengukuran volume jaringan kanker...

PENGARUH BUBUK DAUN CINCAU HIJAU (Premna oblongifolia Merr.) TERHADAP GAMBARAN

HISTOPATOLOGI, SERTA EKSPRESI PROTEIN PROAPOPTOSIS DAN ANTIAPOPTOSIS PADA ADENOCARCINOMA MAMMAE MENCIT C3H

MUTIARA PRIHATINI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2012

PERNYATAAN MENGENAI TESIS

DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Pengaruh Bubuk Daun Cincau Hijau (Premna oblongifolia Merr.) terhadap Gambaran Histopatologi, Serta Ekspresi Protein Proapoptosis dan Antiapoptosis Adenocarcinoma Mammae Mencit C3H adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2012

Mutiara Prihatini F251080301

ABSTRACT

MUTIARA PRIHATINI. The Influence of Green Cincau Leaf (Premna oblingifolia Merr.) Powder on Cancer Tissue Histopatology and Expression of Proapototic and Antiapoptotic Proteins on Adenocarcinoma Mammae in C3H Mice. Supervised by FRANSISKA RUNGKAT-ZAKARIA and PUSPITA EKA WUYUNG.

Cancer is very closely associated with food consumption. Natural foods such as fruits and vegetables have been proven to have many benefit effects to body health. Bioactive compound from plants have antitumor activity. Green leaf of P.oblongifolia Merr. had been proven to have activity on tumor growth resistance in C3H mice. The purposes of this study were to know the influence of green P.oblongifolia Merr. leaf powder as anti cancer activity on C3H mice by analyzing tumor tissue histopatology, expression of JNK 1/2 and caspase-7 as proapoptosis protein and expression of ERK 1/2 and COX-2 as antiapoptosis protein.

C3H mice (n=25) were devided into 5 groups. The first is a standard negatif group (A) and the second group was a positif control group (B), both were treated with standard diet containing 0% green leaf powder. Group C, D and E were given standart diet containing green leaf powder 0,88%, 1,76%, and 2,64%. The diets were given for 30 days. At 31st day the mice in groups B,C, D and E were transplanted with MMTV cancer cells. The diet was continued to 52nd day and at 53rd day all mice were terminated to obtain the cancer tissue.

Parameters observed covering consumption of diet, body weight, tumor growth latent period, volume and weight of cancer tissue. Histopatology analysis was comprised of hematoxilin eosin (HE) and imunohistochemical (IHC) staining. The IHC were done using four antibodies which are anti-phospho-JNK 1/2, anti-COX-2, anticaspase-7, and anti-phospho-ERK 1/2.

Delta of mice body weight before and after transplantation was not significantly different (p>0,05). Cancer latency period was not significanly different (p>0,05). Cancer volume increased significantly in positif control group (p<0,05). Cancer tissue weight of groups D and E were significantly lower compared to the other groups (p<0,05). The results showed that the mice that given green leaf powder (P. oblongifolia Merr.) exhibited less development of cancer growth mainly in groups D and E, which was supported by HE score. The HE staining showed that the cancer tissues of groups D and E have the least average differentiation and mitotic scores. In this study IHC staining for proapoptotic markers as JNK 1/2 and caspase-7 and for antiapoptotic markers as ERK 1/2 and COX-2 have not yet indicated positive expression.

Keywords : C3H mice, green cincau leaf powder, Premna oblongifolia Merr,

Caspase-7, JNK1/2, ERK 1/2, and COX-2.

RINGKASAN

MUTIARA PRIHATINI. Pengaruh Bubuk Daun Cincau Hijau (Premna oblongifolia Merr.) terhadap Gambaran Histopatologi, Serta Ekspresi Protein Proapoptosis dan Antiapoptosis pada Adenocarsinoma Mammae Mencit C3H. Dibimbing oleh FRANSISKA RUNGKAT-ZAKARIA dan PUSPITA EKA WUYUNG.

Faktor eksternal menyebabkan penyakit kanker sebesar 90-95%, dimana 30-35% berasal dari makanan. Hal ini menunjukkan bahwa kanker merupakan penyakit yang dapat dicegah. Salah satu upaya pencegahan kanker adalah dengan memperbaiki pola konsumsi menjadi diet sehat. Konsumsi buah dan sayur merupakan langkah kongkrit memperbaiki pola diet. Komponen bioaktif dalam sayur dan buah memiliki aktivitas antioksidan, antiinflamasi, imunomodulator dan antikanker yang berpengaruh positif bagi kesehatan. Penelitian mengenai cincau hijau yang telah dilakukan sebelumnya menunjukkan bahwa cincau hijau memiliki aktivitas antikanker dengan kemampuan menghambat perkembangan jaringan kanker pada mencit C3H yang diberi bubuk daun cincau hijau P.oblongifolia Merr pada pakannya.

Tujuan dari penelitian ini adalah (1) mengetahui daya hambat bubuk daun cincau hijau Premna oblongifolia Merr. terhadap pertumbuhan sel kanker pada mencit C3H; (2) mengetahui profil jaringan kanker berdasarkan analisa pewarnaan hematoksilin-eosin (HE); (3) mengetahui ekspresi protein JNK-1/2 dan kaspase-7 sebagai penanda proapoptosis sel kanker; (4) mengetahui ekspresi protein ERK-1/2 dan COX-2 sebagai penanda antiapoptosi sel kanker.

Pengujian aktivitas antikanker pada penelitian ini menggunakan mencit C3H sebagai hewan coba. Mencit C3H sebanyak 25 ekor dibagi menjadi lima kelompok yang terdiri atas lima individu pada setiap kelompok. Kelompok A adalah kelompok kontrol negatif yang diberi pakan standar (0% bubuk daun cincau) dan tidak ditransplantasi sel kanker payudara. Kelompok B adalah kelompok kontrol positif yang diberi pakan standar (0% bubuk daun cincau) dan ditransplantasi sel kanker payudara. Kelompok C, D dan E adalah kelompok perlakuan yang diberi pakan dengan penambahan bubuk daun cincau masing-masing sebesar 0,88%, 1,76% dan 2,64% serta diberi perlakuan transplantasi sel kanker payudara.

Pemberian pakan coba dilakukan selama 52 hari, dimana pada hari ke-1 sampai hari ke-30 belum dilakukan proses transplantasi. Pada hari ke-31 dilakukan proses transplantasi sel kanker payudara pada kelompok B,C,D dan E. Pemberian pakan dilanjutkan sampai hari ke-52. Pada hari ke-53 dilakukan proses terminasi, dan pengambilan jaringan kanker pada mencit. Parameter yang diamati meliputi berat badan mencit, konsumsi pakan, masa laten, volume jaringan kanker dan berat jaringan kanker. Berat badan mencit ditimbang dua kali dalam sepekan. Pengamatan masa laten dilakukan setiap hari setelah proses transplantasi dilakukan dengan cara perabaan menggunakan tangan. Pengukuran volume jaringan kanker dilakukan dua kali sepekan menggunakan jangka sorong. Jaringan kanker diambil dan ditimbang pada saat terminasi. Jaringan kanker diproses lebih

lanjut untuk dibuat sediaan histopatologi untuk keperluan uji pewarnaan jaringan meliputi pewarnaan hematoksilin-eosin (HE) dan imunohistokimia (IHK). Pengamatan histologi hasil pewarnaan HE meliputi diferensiasi sel yang terdiri atas kepadatan sel, pleomorfisme sel dan mitosis sel. Pewarnaan IHK digunakan untuk mengetahui ekspresi protein proapoptosis menggunakan antibodi antikaspase-7 dan antiphospho-JNK 1/2, serta ekspresi protein antiapoptosis menggunakan antiphospho-ERK 1/2 dan anti-COX2.

Data pada penelitian ini dianalisa menggunakan analisis ragam dengan rancangan percobaan rancang acak lengkap (RAL). Sebelumnya, data dianalisis normalitas dan homogenitasnya kemudian dilanjutkan dengan uji sidik ragam (ANOVA), jika hasilnya berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan. Hasil pewarnaan jaringan kanker menggunakan metode IHK dianalisa secara deskriptif.

Hasil uji sidik ragam terhadap konsumsi pakan sebelum transplantasi menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol negatif (A) dan keempat kelompok lainnya (p<0,05), konsumsi pakan kelompok A sebesar 2,24 ±0,28 g/hari relatif lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok B (1,78±0,19 g/hari),C (1,77±0.21 g/hari), D (1,80±0,31 g/hari) dan E (1,83±0,13 g/hari). Konsumsi pakan pada masa setelah transplantasi yaitu hari ke-31 sampai dengan hari ke 52 pada kelompok B mengalami penurunan yaitu 1,66±0,25 g/hari. Hasil uji sidik ragam terhadap konsumsi pakan setelah transplantasi menunjukkan hasil yang berbeda nyata (p<0,05). Konsumsi pakan kelompok perlakuan yang diberi bubuk daun cincau yaitu C, D dan E lebih tinggi dari pada kelompok kontrol positif (B) yang tidak diberi bubuk daun cincau pada pakannya.

Perkembangan berat badan sebelum transplantasi (hari 1 sampai dengan hari 30) secara keseluruhan mengalami kenaikan berat badan, walaupun pada pengukuran awal terjadi penurunan. Berat badan mencit kelompok A adalah 19,6±1,7 g; B 19,5±2,0 g; C 21,1±1,6g; D 20,8±1,4 g dan E 17,2±1,0 g. Hasil uji sidik ragam menunjukkan bahwa berat badan mencit kelompok C tidak berbeda nyata dengan D, namun keduanya nyata lebih besar dari kelompok A dan B. Mencit kelompok E nyata lebih kecil terhadap kelompok A, C dan D. Pengamatan berat badan setelah transplantasi secara umum mengalami kenaikan dengan nilai kelompok A adalah 22,7±1,4 g; B 21,2±0,5 g; C 22,5±0,5g; D 22,0±0,4 g dan E 18,4±1,3 g. Hasil uji sidik ragam menunjukkan bahwa mencit kelompok A, C, dan D memiliki berat badan yang tidak berbeda nyata.

Pengamatan masa laten kelompok B adalah 4,6 hari, C 5,4 hari, D 4 hari, dan E 4,8 hari. Volume jaringan kanker dari kelompok B, C, D, dan E masing-masing adalah 0,55±0,69 cm3; 0,21±0,11 cm3, 0,15±0,08 cm3 dan 0,20±0,06 cm3. Pengamatan volume jaringan kanker menunjukkan bahwa pertumbuhan volume jaringan kanker secara umum mengalami kenaikan. Peningkatan volume jaringan kanker secara jelas terlihat pada mencit kelompok kontrol positif dengan cincau hijau 0% (B) setelah hari ke-44. Pengukuran berat jaringan kanker dilakukan setelah terminasi pada hari ke-52. Hasil uji sidik ragam terhadap berat jaringan kanker menunjukkan perbedaan yang signifikan (p<0,05). Berat jaringan kanker kelompok perlakuan D dan E yang diberikan cincau 1,76% dan 2,64% pada pakannya menunjukkan berat jaringan kanker yang lebih kecil dibandingkan kelompok B dan C.

Hasil uji sidik ragam pada tingkat HE untuk setiap kelompok mencit perlakuan menunjukkan bahwa kepadatan sel tumor pada kelompok kontrol positif (B) berbeda nyata (p<0,05) dengan kelompok perlakuan lainnya. Nilai rata-rata kepadatan sel tumor kelompok B sebesar 2,5±0,469. Parameter pleomorfisme sel walaupun skor rata-rata kelompok B paling besar yaitu 1,8±0,74, tetapi tidak berbeda nyata dengan kelompok perlakuan yang lain (p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa semua kelompok perlakuan, selnya sudah mengalami perubahan bentuk sel dari sel asal, komposisi perbandingan antara sitoplasma dan inti sel sudah terjadi, serta perubahan warna inti sel.

Hasil uji IHK menggunakan empat jenis antibodi primer yaitu antiphospho-JNK 1/2, anti-COX-2, antikaspase-7, dan antiphospho-ERK 1/2. Pada penelitian ini sediaan jaringan kanker yang diuji dengan IHK adalah jaringan kanker yang memiliki berat yang terkecil dan terbesar dari masing-masing kelompok perlakuan.

Pewarnaan menggunakan IHK memiliki spesifitas yang lebih baik dibandingkan dengan pewarnaan HE, namun pewarnaan IHK menuntut ketelitian yang cukup tinggi. Hasil pengamatan histopatologis pada sampel yang telah diwarnai menggunkan teknik pewarnaan IHK menunjukkan lesi yang mengarah pada lesi kanker, dan ekspresi protein penanda proapoptosis dan protein penanda antiapoptosis namun menunjukkan hasil negatif secara imunohistokimia, karena ekspresi warna coklat yang terbentuk tampak belum terlalu kontras. Ekspresi warna coklat yang nampak belum tentu merupakan hasil dari ekspresi dari protein target (false positif).

Kata kunci: mencit C3H, cincau hijau, Premna oblongifolia Merr, HE, IHK, JNK 1/2, COX-2, kaspase-7 dan ERK 1/2.

© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta dilindungi Undang-undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

PENGARUH BUBUK DAUN CINCAU HIJAU (Premna oblongifolia Merr.) TERHADAP GAMBARAN

HISTOPATOLOGI, SERTA EKSPRESI PROTEIN PROAPOPTOSIS DAN ANTIAPOPTOSIS PADA ADENOCARSINOMA MAMMAE MENCIT C3H

MUTIARA PRIHATINI

Tesis sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar

Magister Sains pada Program Mayor Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2012

Penguji luar komisi pada Ujian Tesis:

Dr. Dra. Suliantari, M.S

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Penelitian :Pengaruh Bubuk Daun Cincau Hijau (Premna oblongifolia Merr.) terhadap Gambaran Histopatologi Serta Ekspresi Protein Proapotosis dan Antiapoptosis pada Adenocarsinoma Mammae Mencit C3H.

Nama : Mutiara Prihatini NRP : F251080301 Program Studi : Ilmu Pangan

Disetujui

Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Fransiska Rungkat-Zakaria, M.Sc Ketua Anggota

Dra. Puspita Eka Wuyung, M.S

Diketahui

Ketua Program Mayor Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi, M.Sc

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

Tanggal Ujian: 31 Juli 2012 Tanggal Lulus:

PRAKATA Alhamdulillahi Rabbil ‘Alamin, Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT atas

semua kemudahan, berkat dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyusun tesis

dengan judul “Pengaruh Bubuk Daun Cincau Hijau (Premna oblongifolia

Merr.) terhadap Gambaran Histopatologi, Serta Ekspresi Protein

Proapoptosis dan Antiapoptosis pada Adenocarsinoma Mammae Mencit

C3H”.

Penelitian ini dibiayai oleh dana Hibah Kompetisi Dikti tahun 2008. Dalam proses

penyusunan tesis ini ada berbagai hambatan yang dihadapi penulis, namun atas

bantuan, bimbingan, dan kerjasama dari berbagai pihak Alhamdulillah tesis ini

dapat diselesaikan. Oleh karena itu perkenankan penulis menyampaikan ucapan

terima kasih dan penghargaan kepada :

1. Prof. Dr. Ir. Fransiska Rungkat-Zakaria, M.Sc, selaku dosen pembimbing

pertama yang telah memberi perhatian, masukan dan saran selama proses

penelitian.

2. Dra. Puspita Eka Wuyung, M.S, selaku dosen pembimbing kedua yang telah

memberi perhatian, masukan dan saran selama proses penelitian.

3. Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan

Republik Indonesia yang telah memberi kesempatan untuk melanjutkan

pendidikan S2.

4. Dr. Dra. Suliantari, M.S, selaku penguji atas masukan dan saran untuk

kesempurnaan tesis ini.

5. Prof. drh. Bambang Pontjo Priyosoeryanto, Ph.D, AP.Vet, yang telah

memberikan banyak masukan terkait teknik analisis imunohistokimia di

Laboratorium Patologi FKH IPB.

6. dr.Nurjati Chairani Siregar, PhD, Sp.PA(K) Departemen Patologi Anatomik

FK UI, yang telah memberikan bimbingan pembacaan sediaan HE.

7. Keluarga besar: Program Mayor Ilmu Pangan, Departemen Ilmu dan

Teknologi Pangan Fateta IPB, SEAFAST Centre IPB, Departemen Patologi

Klinik, Reproduksi dan Patologi FKH IPB, Laboratorium Patologi

Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran

Universitas Indonesia.

8. Alm.Bapak, Ibu, Mas Andi suamiku tercinta, Banyubening dan Jenar buah

hatiku, Lik Tati, Mbak Intan, Berlian adikku, atas dukungan materi dan moril,

do’a dan semangat yang tak hentinya selalu dicurahkan padaku.

9. Teman-teman terbaik : Nindira, Anto, Anas, Zatil, Bu Emma, Pak Slamet,

Mbak Nelis, Mbak Elisa dan Mbak Nunung.

10. Seluruh pihak yang turut membantu dalam penulisan tesis ini, hingga tidak

dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan tesis ini.

Saran dan kritik sangat penulis harapkan, semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi

semua pihak yang membutuhkan.

Bogor, Agustus 2012

Mutiara Prihatini

RIWAYAT HIDUP

Penulis bernama lengkap Mutiara Prihatini, dilahirkan di Ogan Komering

Ulu, Sumatera Selatan, pada tanggal 9 Februari 1980, sebagai anak kedua dari

pasangan Bapak R.Basuki Soepriadhy (Alm, kembali ke rahmatullah pada

19 Oktober 2010) dan Ibu Siti Aminah. Penulis adalah istri dari Andi

Krisyunianto,ST dan memiliki dua anak yaitu Banyubening Adwa’ Bhadrika dan

Jenar Widhi Ramadhani.

Tahun 1998 penulis lulus dari SMA Negeri I Karawang. Tahun 1998-

2001 penulis melanjutkan pendidikan di Poltekkes Depkes Jurusan Gizi di

Yogyakarta. Kemudian melanjutkan ke jenjang S-1 jurusan Gizi Kesehatan pada

tahun 2003-2005 di Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. Penulis

bekerja sebagai staf di Pusat Penelitian Gizi dan Makanan sejak tahun 2006, yang

kemudian menjadi Pusat Teknologi Terapan Kesehatan dan Epidemiologi Klinik

pada tahun 2011. Kesempatan melanjutkan pendidikan ke program Pascasarjana

pada program studi Ilmu Pangan diperoleh pada tahun 2008. Beasiswa pendidikan

diperoleh dari Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan Republik

Indonesia.

DAFTAR ISI Halaman

DAFTAR TABEL ................................................................................................. vi DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ viii 1. PENDAHULUAN ............................................................................................ 1

1. 1. Latar Belakang ........................................................................................... 4 1.2. Rumusan Masalah ………………………………………………………… 4 1. 3. Hipotesis. .................................................................................................... 4

1.4. Tujuan ......................................................................................................... 4 2. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................... 7

2. 1. Tanaman Pangan Anti Kanker..................................................................... 7 2. 2. Tanaman Cincau Hijau ……....................................................................... 8 2. 3. Khasiat Biologis Cincau Hijau…………………………………………..... 10 2. 4. Siklus Sel ..................................................................................................…...... 11 2. 5. Kanker………………………………………………………...... ............... 13

2. 5. 1.Karsinogenesis......................................................……………… 14 2. 5. 2.Jalur Sinyal Transduksi...................................................................... 16 2. 5. 3. Jalur Sinyal Apoptosis ..................................................................... 18 2. 5. 4. Peranan COX-2 pada Apoptosis dan Proliferasi............................. 21

2.6. Mencit (Mus musculus L) C3H ................................................................... 23 2. 7. Metode Analisa Histopatologi…….....……………………………………. 24 2.7.1. Metode Hematoksilin Eosin…......…………………………………. 24 2.7.2. Metode Imunohistokimia…..…....…………………………………. 25

3. BAHAN DAN METODE PENELITIAN ....................................................... 27 3. 1. Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................... 27 3. 2. Bahan dan Alat .......................................................................................... 27 3. 3. Tahapan Penelitian ..................................................................................... 29

3. 3. 1. Pembuatan bubuk daun cincau hijau............................................... 29 3. 3. 2. Pembuatan pakan uji......................................................................... 30 3. 3. 3. Pemeliharaan mencit........................................................................ 31 3. 3. 4. Transplantasi................................................................................... 32 3. 3. 5. Pengamatan konsumsi pakan dan monitorin berat badan mencit..... 33 3. 3. 6. Pengamatan masa laten dan volume jaringan kanker..................... 33 3. 3. 7. Terminasi dan penimbangan jaringan kanker................................. 34 3. 3. 8. Pembuatan preparat histologi.......................................................... 35 3. 3. 9. Pewarnaan HE................................................................................ 35 3. 3.10. Pewarnaan IHK.............................................................................. 37

3. 4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data ……………………................ 40 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 41

4. 1. Pakan Mencit C3H ..................................................................................... 41 4. 2. Perkembangan Berat Badan dan Jaringan Kanker Mencit C3H................. 41 4. 2. 1. Berat Badan Mencit ..................................................................... 41 4. 2. 2. Masa Laten …….......................................................................... 46 4. 2. 3. Volume Jaringan Kanker .............................................................. 47 4. 2. 4. Berat Jaringan Kanker ................................................................... 49 4. 2. 5. Gambaran Histopatologi Jaringan Kanker Menggunakan

Pewarnaan HE............................................................................... 50

4. 2. 6. Gambaran Histopatologi Jaringan Kanker Menggunakan Pewarnaan IHK ............................................................................

53

5. SIMPULAN DAN SARAN ........................................................................ 57 5. 1. Simpulan ............................................................................................ 57 5. 2. Saran ................................................................................................... 57

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 59 LAMPIRAN ...................................................................................................... 67

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Kandungan gizi daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. ....................... 9

2 Komposisi mineral pakan mencit C3H..................................................... 28

3 Komposisi pakan standar dan pakan uji……………………………….. 30

4 Rincian hasil pewarnaan HE mencit C3H……………………………… 50

5 Hasil skoring IHK………………………………………………………. 53

DAFTAR GAMBAR Halaman

1 Cincau hijau P. oblongifolia Merr. ........................................................... 9

2 Siklus sel (Alberts et al. 2002)…………................................................ 12

3 Skema utama karsinogenesis zat kimia (Hodgoson & Levi 2000)........ 15

4 Jalur sinyal kaskade MAPK (Takekawa et al. 2011)............................... 17

5 Jalur apoptosis ekstrensik dan intrinsik (Elmore 2007)........................... 19

6 Proses transplantasi sel kanker C3H…………………………………….. 33

7 Proses pengukuran berat badan, volume jaringan kanker dan jaringan kanker segar mencit C3H.......................................................................... 34

8 Proses terminasi dan pembedahan……………………………………… 35

9 Grafik pertumbuhan berat badan mencit……………………………….. 42

10 Grafik ukuran volume jaringan kanker mencit C3H...……………......... 47

11 Grafik berat jaringan kanker mencit C3H...................………........…….. 49

12 Contoh hasil pewarnaan HE jaringan kanker......................................... 51

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Diagram alir proses pembuatan bubuk daun cincau hijau........................ 67

2 Uji normalitas berat badan mencit sebelum transplantasi........................ 68

3 Uji homogenitas berat badan mencit sebelum transplantasi..................... 68

4 Tabel berat badan mencit sebelum transplantasi (g) ............................... 69

5 Analisis statistik berat badan mencit sebelum transplantasi..................... 71

6 Uji sidik ragam rata-rata delta pertumbuhan berat badan mencit............. 72

7 Tabel berat badan mencit sebelum transplantasi...................................... 73

8 Uji sidik ragam jumlah pakan yang dikonsumsi sebelum transplantasi.... 74

9 Uji korelasi delta berat badan dan konsumsi pakan sebelum transplantasi.............................................................................................. 75

10 Tabel jumlah pakan yang dimakan sebelum transplantasi........................ 76

11 Analisis statistik berat badan mencit setelah transplantasi (g).................. 78

12 Uji sidik ragam rata-rata delta pertumbuhan berat badan setelah transplantasi.............................................................................................. 79

13 Tabel jumlah pakan yang dikonsumsi setelah transplantasi..................... 80

14 Uji sidik ragam jumlah pakan yang dikonsumsi setelah transplantasi .... 82

15 Uji korelasi delta berat badan dan konsumsi pakan setelah transplantasi. 83

16 Uji normalitas berat badan setelah transplantasi...................................... 84

17 Uji homogenitas berat badan setelah transplantasi................................... 84

18 Tabel masa laten ...................................................................................... 85

19 Uji sidik ragam masa laten........................................................................ 85

20 Tabel volume jaringan kanker mencit (cm3 86 ).............................................

21 Analisis statistik volume jaringan kanker mencit (cm3 86 )...........................

22 Tabel berat jaringan kanker mencit........................................................... 87

23 Analisis statistik berat jaringan kanker mencit (g).................................... 87

24 Uji korelasi delta berat badan akhir dan berat jaringan kanker................. 88

25 Uji sidik ragam HE dengan kepadatan sel................................................. 89

26 Uji sidik ragam HE dengan pleomorfisme.............................................. 90

27 Uji sidik ragam HE dengan mitosis.......................................................... 91

28 Contoh perhitungan dosis bubuk daun cincau hijau P.oblongifolia Merr 92

29 Reagen yang digunakan untuk pewarnaan HE......................................... 93

30 Reagen yang digunakan untuk pewarnaan IHK........................................ 94

31 Contoh hasil pewarnaan dan skoring IHK................................................. 95

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kanker payudara merupakan keganasan pada wanita. Kanker payudara

ditemukan diseluruh dunia, diperkirakan lebih dari 1,2 juta jiwa menderita kanker

payudara. Di Indonesia kanker payudara menduduki urutan ke dua tertinggi

setelah kanker leher rahim. Sampai saat ini kanker payudara masih menjadi

masalah kesehatan dan menjadi salah satu penyebab kematian di dunia.

Kanker payudara merupakan tumor ganas pada jaringan payudara.

Kanker payudara terjadi karena adanya perubahan pada gen pengatur

pertumbuhan, diferensiasi dan apoptosis, sehingga pertumbuhan dan perkembang

biakan sel tidak dapat dikendalikan. Etiologi dan patogenesis kanker payudara

sampai saat ini belum jelas, namun beberapa penelitian menunjukkan pengaturan

regulasi jalur mitogen activated protein kinase (MAPK) turut berperan.

MAPK adalah jalur transduksi sinyal ekstraseluler yang diperantarai

melalui thyrosin kinase-growth factor dan G protein-linked reseptor untuk

meregulasi faktor transkripsi yang dapat mengontrol pertumbuhan, proliferasi,

diferensiasi, migrasi dan apoptosis. Terdapat tiga subfamili protein yang termasuk

dalam MAPK yaitu : JNK/SAPK (c-jun-NH2

Beberapa penelitian melaporkan ekspresi cyclooxigenase-2 (COX-2)

meningkat pada kanker korektal, pankreas, tulang dan payudara. Overekspresi

COX-2 pada kanker payudara menunjukkan tingkat agresifitas yang tinggi.

COX-2 memainkan peranan berbeda pada setiap tahapan progresi dari kanker,

dengan meningkatkan proliferasi dari sel yang termutasi (Cao dan Prescott 2002).

-kinase / stress-activated protein

kinase), p38 dan ERK (extraselullar signal regulated kinase). ERK 1/2 adalah

subfamili MAPK yang diaktivasi untuk merespon faktor pertumbuhan. ERK 1/2

berkontribusi pada pembentukan kanker (McCubrey et al. 2007). JNK dan p38

merupakan anggota MAPK lain yang dapat diaktifkan dalam menanggapi

berbagai tekanan selular dan stress seperti perubahan osmolaritas atau

metabolisme, kerusakan DNA, heat shock, iskemia, peradangan, sitokin, shear

stress, ultaviolet, iradiasi, atau stres oksidatif yang dapat menyebabkan

differensiasi dan kematian sel (Zhou 2006 dan Takekawa et al. 2011).

2

Induksi COX-2 berhubungan dengan peningkatan produksi PGE2, yang

merupakan salah satu produk mayor dari COX-2 yang diketahui memiliki peranan

memodulasi proliferasi sel, kematian sel, invasif kanker pada beberapa jenis

kanker seperti kanker kolon, tulang dan payudara.

Tingginya COX-2 membuat sel kanker resisten terhadap apoptosis.

Peningkatan COX-2 dapat diinduksi oleh tumor, sitokin, faktor pertumbuhan dan

inflamasi (Wendum 2004). Peningkatan COX-2 dapat menghambat apotosis

melalui peningkatan ekspresi gen antiapoptosis (Bcl2) dan menurunkan ekspresi

gen proapoptosis yaitu Bax. Kadar COX-2 yang meningkat juga memiliki korelasi

positif dengan ukuran tumor dan peningkatan laju proliferasi sel terutama pada

tumor padat seperti prostat, korektal dan payudara (Singh et al. 2007).

Pertumbuhan tumor dapat menyebabkan gangguan keseimbangan antara

kecepatan proliferasi dan apoptosis. Gangguan yang terjadi pada jalur apoptosis

menyebabkan sel tumor bertahan hidup untuk waktu yang lebih lama dan

akumulasi kelainan genetik. Selain itu mekanisme apoptosis juga berperan dalam

resistensi terapi dengan cara membuaat sel menjadi sulit untuk mati akibat

kemoterapi atau radiasi. Apoptosis merupakan salah satu target dalam penanganan

kanker. Kaspase merupakan protease sitokin seluler yang berperan penting pada

proses apoptosis. Kaspase-7 adalah salah satu jenis kaspase efektor yang berperan

dalam proses proteolitik selama proses apoptosis. Apoptosis melalui jalur

mitokondria melibatkan protein kinase yaitu JNK untuk meregulasi apoptosis.

JNK akan mengaktifkan gen Bcl-2 dan Bcl-xL untuk menghasilkan protein, di

mana protein tersebut akan merusak membran mitokondia dan menyebabkan

sitokrom-C keluar dari mitokondria dan membentuk molekul komplek dengan

Apaf-1 yang selanjutnya mengaktivasi kaspase-9 menuju kaspase efektor, yaitu

kaspase-3 dan kaspase-7 dan akhirnya terjadi apoptosis (Wada & Peninger 2004).

Kanker dapat disebabkan 90-95% oleh faktor eksternal dan 30-35%

diantaranya berhubungan dengan asupan diet (WHO 2008). Diet sehat dan

seimbang berpengaruh terhadap kejadian penyakit termasuk kanker. Pengurangan

konsumsi pangan hewani terutama daging merah dan lemak hewan serta

meningkatkan konsumsi sayur dan buah merupakan diet sehat yang dianjurkan

(WCRF/AICR 2008). Hal ini memperlihatkan adanya korelasi positif antara pola

3

konsumsi pangan dengan status kesehatan. Selain itu beberapa penelitain

memperlihatkan pencegahan kanker dapat dilakukan dengan cara mengontrol diet.

Namun hubungan antara diet dengan kanker masih banyak diperdebatkan, ada

yang melaporkan diet mempunyai efek preventif, imunomodulator atau sitotoksik.

Upaya pencegahan kanker melalui konsumsi sayuran dan buah merupakan cara

yang aman karena tanaman mengandung senyawa kimia yang memiliki khasiat

bagi kesehatan tubuh. Komponen bioaktif pada tumbuhan memiliki aktivitas

antioksidan , anti-inflamasi, antibakteri, imunomodulator, dan aktivitas lainnya.

Beberapa jenis tanaman yang memiliki aktivitas antikanker adalah kunyit

(Curcuma longa) (James & Muhtar 2007), mengkudu (Morinda citrifolia L)

(Winarti dan Nurdjanah 2005), kedelai (Farina et al. 2006), pinang

(Areca catechu L) (Meiyanto et al. 2008), brokoli (Brassica oleracea)

(Brandi et al. 2004), teh hijau (Camellia sinensis) (Nugroho 2009) dan cincau

hijau (Cyclea barbata L Miers dan Premna oblingifolia Merr) (Chalid 2003,

Pranoto 2003).

Cincau hijau merupakan salah satu minuman yang umum dikonsumsi

sebagai minuman segar, dan secara tradisional diyakini memiliki khasiat untuk

penyakit panas dalam dan penurun demam. Beberapa penelitian yang telah

dilakukan memperlihatkan cincau hijau dapat meningkatkan jumlah limfosit

(Setiawati 2003), ekstrak batang dan daun cincau hijau dapat meningkatkan sistim

imun dengan meningkatnya proliferasi sel limfosit manusia secara in vitro

(Koessitoresmi 2002), menurunkan kadar sitokrom P-420 dan meningkatkan

enzim S-transferase (Nugraheni 2003), mengandung betakaroten dan memiliki

aktivitas antioksidan (Jacobus 2003), tidak toksik bagi tubuh (Arisudana 2003),

bioaviabilitas klorofil pada tikus sparague daeley (SD) (Hendriyani 2003),

bioaviabilitas flavonoid pada tikus SD (Raharjo 2004) dan bersifat antikanker

(Pranoto 2003, Chalid 2003).

Sifat antikanker cincau hijau telah diteliti secara in vitro pada galur sel

kanker K-562 dan Hela di mana ekstrak cincau hijau memiliki efek toksik dan

menghambat proliferasi sel kanker (Ananta 2000). Chalid (2003) menguji

aktivitas antikanker cincau hijau Cyclea barbata L.Miers dan

P.oblingifolia Merr. pada mencit C3H, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa

4

bubuk gel daun cincau hijau yang ditambahkan pada pakan mampu menghambat

pertumbuhan volume jaringan kanker payudara. Daun cincau hijau

Cyclea barbata L.Miers memiliki kandungan zat utama turunan alkaloid seperti

limasin, thalrugosin, homoaromlin, tetrandin, cycleapeltin (Saxena et al. 2003).

Sedangkan sifat antikanker cincau hijau P.oblingifolia Merr. karena mengandung

bioaktif alkaloid, fenol dan tanin (Aryudhani 2011).

1.2. Rumusan Masalah

Dari penelitian terdahulu yang menunjukkan bubuk daun cincau hijau

P.oblongifolie Merr dan Cyclea barbata L Miers dapat menghambat pertumbuhan

adenocarsinoma mammae mencit C3H, maka pada penelitian ini ingin diketahui

apakah pemberian bubuk daun cincau hijau P.oblogifolia Merr dapat menghambat

proliferasi dan meningkatkan apoptosis pada adenocarsinoma mammae mencit

C3H ?

1.3. Hipotesis

Hipotesis yang disajikan pada penelitian ini adalah :

1) bubuk daun cincau hijau P.oblingifolia Merr. memicu apoptosis pada sel

kanker dengan peningkatan ekspresi JNK 1/2 dan kaspase-7 pada

adenocarsinoma mammae mencit C3H.

2) bubuk daun cincau hijau P.oblingifolia Merr. menghambat proliferasi pada

sel kanker dengan penurunan ekspresi ERK 1/2 dan COX-2 pada

adenocarsinoma mammae mencit C3H.

1.4. Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui mekanisme

antikanker cincau hijau melalui induksi apoptosis dan penghambatan proliferasi

dengan cara :

1) analisis profil jaringan kanker berdasarkan pewarnaan HE

(hematoksilin-eosin).

5

2) analisis ekspresi enzim kaspase-7 dan protein kinase JNK 1/2 sebagai

penanda proapoptosis sel kanker dengan metode analisa

imunohistokimia (IHK).

3) analisis ekspresi protein kinase ERK-1/2 dan enzim COX-2 sebagai penanda

antiapoptosis sel kanker dengan metode analisa imunohistokimia (IHK).

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tanaman Pangan Antikanker

Fungsi pangan yang utama bagi manusia adalah untuk memenuhi

kebutuhan zat gizi tubuh sesuai dengan jenis kelamin, usia, aktivitas fisik, dan

berat badan. Sejalan dengan meningkatnya kesadaran masyarakat akan hidup

sehat, maka tuntutan konsumen terhadap bahan pangan adalah untuk memperoleh

tingkat kesehatan dan kebugaran yang optimal.

Bahan pangan yang banyak diminati, selain memiliki komposisi gizi

yang baik, serta penampakan dan citarasa yang menarik, juga harus memiliki

fungsi fisiologis bagi tubuh, seperti menurunkan tekanan darah, menurunkan

kadar kolesterol dan menurunkan kadar gula darah. Hal ini dinyatakan oleh

Golberg (1994) bahwa pemilihan bahan pangan bertumpu pada kandungan gizi,

kelezatan, serta pengaruhnya terhadap kesehatan tubuh. Bahan pangan yang dapat

menyembuhkan atau menghilangkan efek negatif dari suatu penyakit dikenal

dengan pangan fungsional. Kandungan gizi dan non gizi pada pangan fungsional

memiliki khasiat untuk kesehatan dan kebugaran tubuh atau sebagai pencegah

penyakit termasuk kanker.

Makanan yang tidak sehat dengan kandungan gizi tidak seimbang dapat

memicu timbulnya penyakit. Makanan dengan lemak tinggi, minuman beralkohol,

daging merah, makanan yang dibakar, serta makanan yang mengandung zat

karsinogen dapat meningkatkan resiko terjadinya penyakit kanker

(Wijayakusuma 2005). Anan et al. (2008) menyatakan pangan yang dikonsumsi

memiliki andil pada kejadian kanker sebesar 30-35%. Sebagai contoh, konsumsi

daging merah meningkatkan kejadian kanker saluran cerna, prostat, empedu dan

payudara. Begitu juga dengan bahan tambahan pangan seperti nitrat dan nitrit

pada daging olahan merupakan karsinogen kuat.

Konsumi pangan berbasis tanaman dapat mencegah penyakit, menurut

WHO (2008) konsumsi buah dan sayur minimal 400 gr/hari atau lima kali

penyajian dapat mencegah penyakit degeneratif seperti jantung, diabetes dan

kanker. Keberadaan komponen bioaktif yang terdapat dalam sayuran diduga

berhubungan dengan induksi enzim detoksifikasi, penghambatan proses

8

karsinogenesis, efek antioksidan, dan pengikatan karsinogen oleh serat pada

saluran cerna (Brandi et al. 2004).

Beberapa jenis tumbuhan diantaranya brokoli (Brassika oleracea)

memiliki sifat antikanker (Brandi et al. 2004). Ekstrak mahkota dewa

(Phaleria macrocarpa) dapat menghambat laju perkembangan kanker yang

bekerja melalui mekanisme imunostimulator dan sitotoksik pada mencit C3H

(Suryanto 2007). Teh hijau (L-theanin) dapat menghambat pertumbuhan kanker

payudara pada mencit C3H yang ditunjukkan oleh peningkatan skor porfirin dan

indeks apoptosis (Nugroho 2009). Selain itu, kurkumin yang berasal dari kunyit

dapat menghambat pertumbuhan dan menginduksi aktivasi apoptosis melalui

kaspase-3 pada galur sel T47D (Yadav 2011).

2.2. Tanaman Cincau Hijau

Cincau telah dikenal secara luas di Indonesia. Jenis cincau hijau yang

digunakan masyarakat ada dua yaitu Cyclea barbata L. Miers dan

Premna Oblongifolia Merr. Kedua tanaman cincau hijau tersebut berbeda

Cyclea berbata L.Miers merupakan tanaman merambat dari famili

Menispermaceae (de Padua & Bunyapraphatsara 1990), sedangkan tanaman

cincau hijau P. oblongifolia Merr. dari famili Vebernaceae termasuk tanaman

perdu (Sosef & Hong 1998).

Tanaman cincau hijau Premna Oblongifolia Merr. berasal dari Asia

Tenggara dan tersebar dari dataran rendah hingga ketinggian 800 m di atas

permukaan laut (Kusharto et al. 2008). Cincau hijau jenis P. oblongifolia Merr

merupakan tumbuhan semak-semak, pohon tegak atau liana yang dapat tumbuh

mencapai tinggi 4 meter. Tumbuhan P. oblongifolia Merr. memiliki daun

berbentuk oval, dengan panjang daun kurang lebih 1,5 kali lebarnya. Tulang daun

membujur (oblong) atau bulat telur berujung runcing. Gambar cincau hijau

Premna oblongifolia Merr. disajikan pada Gambar 1.

9

Berikut adalah klasifikasi P. oblongifolia Merr. (Sosef & Hong 1998).

Kingdom : Plantae (tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (tumbuhan berpembuluh)

Super Divisi : Spermatophyta (menghasilkan biji)

Divisi : Magnoliophyta (tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua/dikotil)

Sub Kelas : Asteridae

Ordo : Lamiales

Famili : Verbenaceae

Genus : Premna

Spesies : P. oblongifolia Merr.

Gambar 1. Tanaman cincau hijau P. oblongifolia Merr. (Sumber : Dokumentasi pribadi)

Secara tradisional, daun tanaman cincau hijau digunakan untuk membuat

makanan sejenis gel (hidrikoloid) dan banyak dijual sebagai bahan pengisi

minuman segar. Kandungan gizi daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. disajikan

dalam Tabel 1.

Tabel 1 Kandungan gizi daun cincau hijau Premna oblongifolia Merr.

Komponen Bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr (%) b/k Jacobus (2003) Chalid (2003) Pranoto (2003)

Kadar protein 18,17 17,64 18,08 Kadar air daun segar 79,45 79,45 - Kadar air bubuk daun 2,93 2,45 2,51 Kadar serat kasar 52,55 51,01 52,00 Kadar lemak 2,15 2,12 2,14 Kadar abu 8,11 8,11 8,31

http://www.plantamor.com/index.php?plantsearch=Verbenaceae�

http://www.plantamor.com/index.php?plantsearch=Premna�

10

2.3. Khasiat Biologis Cincau Hijau P.oblongifolia Merr.

Pada cincau hijau Cyclea barbata mengandung alkaloid isoquinolines yaitu

tetandrin yang berkhasiat dan digunakan sebagai pengobatan penyakit Malaria

(Plasmodium falcifarum I) (Saxena et al. 2003). Daun cicau hijau Cyclea barbata

juga mengandung beberapa jenis bis-benzyl-isoquinoline alkaloid seperti

berbamine, chondocurine, alpha dan beta cyclanoline, fangchinoline,

homoaromoline, isochondocurine, isotetrandine, lemacine dan tetrandine

(Tantisewie 1986 diacu dalam Siregar 2011). Premna odorata Blanco

mengandung senyawa fitokimia yang bersifat antiinflamasi, serta flavonoid yang

dapat digunakan sebagai agen kemoterapeutik yaitu diosmetin dan acacetin

(Pinzon et al. 2011), selain itu daun Premna integrifolia Linn mengandung

verbascoiside dan tiga monoacyl-6-0-alpha-Lrhamnopyranosylcatalpols yang

memiliki aktivitas antibakteri (Karmakar et al. 2011).

Cincau hijau P. oblongifolia Merr. mengandung klorofil yang relatif tinggi

(1.709 ppm) dibanding dengan jenis daun lainnya seperti murbei (884 ppm),

katuk (1.509 ppm) dan pegagan (832 ppm) (Kusharto et al. 2008). Kadar serat

pada cincau hijau Premna oblongifolia Merr. lebih tinggi dibandingkan

C. barbata L. Miers. Hal ini menjadikan cincau hijau P. oblongifolia Merr. lebih

berpotensi sebagai bahan pembuatan minuman instan berserat. Penelitian

mengenai kandungan serat cincau hijau P. oblongifolia Merr juga dilakukan oleh

Nurdin et al. (2005) yang menyatakan bahwa cincau hijau P. oblongifolia Merr

merupakan sumber serat yang potensial dijadikan sumber pengayaan pangan.

Selain kandungan seratnya lebih tinggi, cincau hijau P. oblongifolia Merr. juga

mengandung beta karoten yang dapat berfungsi sebagai prekursor vitamin A dan

antioksidan dengan cara menghambat peroksidase lipid secara nonenzimatik

(Jacobus 2003).

Ananta (2000) menyatakan bahwa ekstrak daun cincau hijau

C. barbata L. Miers. mengandung senyawa polar terdiri atas komponen fenol,

protein dan alkaloid. Senyawa polar tersebut mampu menghambat proliferasi sel

kanker galur sel kanker K-562 dan Hela. Sedangkan Aryudhani (2011) melakukan

uji fitokimia pada bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. Hasil penelitian

11

tersebut menunjukkan bahwa kandungan alkaloid pada daun P. oblongifolia Merr.

baik segar maupun bubuk menunjukkan hasil yang positif.

Alkaloid merupakan kelompok besar metabolit sekunder tanaman yang

terdiri dari berbagai jenis senyawa kimia yang berbeda dengan diversivitas

sifatnya sebagai obat. Alkaloid memiliki struktur cincin dengan substansi yang

mengandung nitrogen (Jiang & Hu 2009). Hal ini sesuai dengan pernyataan

Meiyanto et al. (2008) bahwa alkaloid merupakan senyawa yang dapat berperan

sebagai antikanker. Hasil penelitian Setiawati (2003) menunjukkan bahwa cincau

hijau dapat meningkatkan limfosit. Cincau hijau mengandung alkaloid sejenis

scopolamin dan alkaloid semipolar sejenis tropic acid yang keduanya tidak

bersifat toksik pada tubuh manusia (Arisudana 2003).

Nugraheni (2003) menyatakan bahwa cincau hijau P.oblongifolia Merr.

mampu menurunkan kadar sitokrom p-420 sebesar 0,20 nmol/mg dan

meningkatkan aktivitas glutation peroksidase pada darah sebesar 12,72

nmol/min/mg protein. Penelitian secara in vivo yang dilakukan Chalid (2003)

memperlihatkan bahwa aktivitas antikanker cincau hijau P.oblongifolia Merr.

dan C. barbata L. Miers. dapat menghambat laju pertumbuhan kanker yang

dicerminkan dari volume jaringn kanker yang lebih rendah dibandingkan dengan

pembanding yang diberi pakan tidak mengandung ekstrak daun cincau hijau.

2.4. Siklus Sel

Siklus sel adalah serangkaian proses pembelahan sel menjadi dua. Proses

proliferasi sel diawali adanya stimulus eksternal seperti faktor pertumbuhan untuk

memasuki G1, satu sel akan mengalami replikasi sampai akhir G1 kemudian

faktor pertumbuhan akan menetap menjadi faktor pertumbuhan yang menginduksi

atau penghambat faktor pertumbuhan seperti TGFβ. Perubahan tersebut

tergantung dari protein yang mengatur siklus sel. Mitogen dan faktor

pertumbuhan menginduksi sel untuk memasuki siklus sel melalui kontrol poin G1.

Proses pembelahan sel menjadi dua sel identik melalui dua proses utama

yaitu replikasi DNA yang dikenal sebagai fase S dan penggandaan kromosom

menjadi dua sel, yang dikenal dengan fase M. Pembelahan sel secara umum dapat

dibagi menjadi dua tahap yaitu Mitosis (M) dan Interfase. Tahap mitosis terdiri

atas profase, metafase, anafase dan telofase, sedangkan tahap interfase terdiri atas

12

fase G1, S dan G2. Hal yang mendasari siklus sel menjadi empat fase yaitu fase

presynthetic growth phase I (G1), fase sintesis DNA (S), premitotic growth phase

(G2) dan fase mitosis (M) (Vermeulen et al. 2003). Pada siklus sel terdapat pula

fase quiescent cells atau fase istirahat yang dibut G0. Siklus sel disajikan pada

Gambar 2.

Gambar 2. Siklus Sel (Alberts et al. 2002).

Fase G adalah “gap” antara fase M dan fase S. Terdapat dua fase G yaitu

G1 dan G2 yang berfungsi sebagai penundaan waktu pertumbuhan sel. Fase G

juga menyediakan waktu untuk sel memonitor keadaan internal maupun eksternal

untuk memastikan bahwa kondisi memungkinkan dan cocok untuk melakukan

perbanyakan pada fase S dan pembelahan pada fase M. Fase G1 memiliki peran

sangat penting pada masa ini. Jika kondisi ekstraseluler tidak menguntungkan,

maka sel akan memasuki fase G0 di mana sel berhenti berkembang. Jika kondisi

lingkungan mendukung dan terdapat sinyal untuk tumbuh maka sel akan memulai

proses perkembangan pada fase G1. Fase G1 merupakan fase terpanjang setelah

sel mengalami mitosis. Selama fase ini sel menyiapkan diri untuk sintesis DNA

dan biosintesis RNA dan protein.

Fase G1 akan dilanjutkan dengan fase S. Pada fase S terjadi proses

replikasi DNA dengan bantuan enzim DNA polimerase dan sintesa histone, pada

fase akhir DNA mengandung sel ganda dan replikasi kromosom. Selanjutnya sel

memasuki fase G2, pada fase ini terjadi pembentukan RNA, protein serta enzim

13

untuk persiapan fase M sebagai fase berikutnya. Jika terjadi kerusakan DNA atau

DNA tidak bereplikasi dengan sempurna, maka proliferasi sel menuju fase M

diberhentikan pada fase G2. Jika pada fase G2 tidak terjadi hambatan, maka sel

akan memasuki fase M yang terdiri dari profase, metafase, anafase dan telofase,

sehingga satu sel membelah menjadi dua sel identik (Alberts et al. 2002).

G0 adalah fase istirahat, tidak ada mitogen, sel matur/akhir diferensiasi.

Keluar dan masuknya sel kedalam siklus sel dikontrol oleh perubahan

tingkatan dan aktivitas protein yang disebut cyclins. Protein yang berhubungan

dengan siklus sel yaitu cyclins dependent kinase (CDKs) dan cyclin-dependent

kinase inhibitor (CKIs). Cyclins memiliki peranan penting pada sinyal transduksi

dan koordinasi pada tiap fase siklus sel. Sintesis dan degradasi dari CDKs diatur

oleh ikatan CDK inhibitors, hal ini penting untuk pengaturan cek poin pada siklus

sel (G1 S dan G2 M) yang berfungsi untuk menahan siklus sel bila terjadi

kerusakan DNA supaya tidak terjadi replikasi.

Cek poin pada siklus sel berfungsi untuk merespon kerusakan DNA,

proses ini penting untuk menjaga integritas sel. Pada siklus sel terdapat beberapa

cek poin yaitu cek poin G1 pada fase S, cek poin G2 menahan siklus sel sebagai

respon kerusakan DNA yang tidak bereplikasi selama fase S, cek poin M untuk

menginaktifkan chromosomal segregation sebagai respon dari misalignment

pada mitotic spindel. Gangguan fungsi pada cek poin akan mengakibatkan mutasi

pada sel yang dapat menginduksi karsinogenesis.

Pada kanker terjadi perubahan genetik yang mendasar dalam mengontrol

pembelahan sel, sehingga menghasilkan proliferasi sel yang tidak terkendali.

Perubahan genetik tersebut disebabkan oleh mutasi pada protoonkogen maupun

tumor supresor gen. Mutasi pada protoonkogen menjadi onkogen memicu

pertumbuhan tumor, sedangkan inaktivasi tumor supresor gen menghasilkan

disfungsi protein yang terlibat dalam menghambat progresi siklus sel

(Vermeulen et al. 2003).

2.5. Kanker

Kanker adalah suatu penyakit yang diakibatkan oleh sel yang telah

kehilangan pengendalian dan mekanisme normalnya, sehingga mengalami

pertumbuhan yang tidak terkendali. Pertumbuhan sel kanker tidak mengikuti pola

14

sel yang normal (Kumar et al. 1997). Pertumbuhan sel abnormal diklasifikasikan

sebagai pertumbuhan nonneoplastik dan neoplastik. Kanker mengikuti pola

pertumbuhan neoplastik dimana memiliki ciri anaplasia. Pola pertumbuhan

neoplastik bersifat nonreversibel. Pertumbuhan neoplastik dibagi menjadi

neoplasma benigna dan neoplasma maligna. Neoplasma benigna meliputi

papiloma atau kutil, sedangkan neoplasma maligna meliputi tumor padat dan

leukemia.

Kanker adalah istilah umum untuk semua neoplasma maligna. Sifat

mikroskopik dari sel kanker adalah pleomorfisme di mana sel kanker bervariasi

ukuran dan bentuknya, hiperkromatin, polimorfisme, dan aneuploidi. Pada kanker

payudara penamaannya mengikuti tempat dan bentuk jaringan. Kanker payudara

termasuk tumor jaringan epitel, dengan susunan sel berbentuk epitel glandular

maka diberi nama adenocarsinoma (Otto 2003).

2. 5. 1 Karsinogenesis

Karsinogenesis adalah proses perubahan sel normal menjadi sel

kanker, proses ini memerlukan waktu yang lama. Pada umumnya kanker timbul

karena paparan karsinogen secara berlebihan yang menyebabkan kerusakan DNA.

Karsinogenesis dapat dibagi dalam tiga tahap utama yaitu inisiasi, promosi dan

progresi (Gambar 3). Tahap inisiasi berlangsung cepat. Karsinogen yang masuk

ke dalam tubuh akan berikatan dengan DNA, menyebabkan DNA mengalami

mutasi (Hodgson & Levi 2000).

Pada akhir tahap inisiasi belum terlihat perubahan histologis dan

biokimiawi, hanya terlihat nekrosis dan peningkatan proliferasi sel

(Hejmadi 2010). Sel berusaha mengoreksi mutasi yang terjadi. Jika perbaikan

DNA mengalami kegagalan, maka sel yang termutasi merupakan cikal bakal

kanker dan menandai dimulainya tahap promosi (Zakaria 2001).

15

Gambar 3. Skema utama karsinogenesis zat kimia (Hodgson & Levi 2000).

Sel terinisiasi yang terpapar promotor akan memperpendek masa laten

dan mempercepat pembentukan tumor. Selanjutnya, induksi promotor pada sel

terinisiasi, menyebabkan sel kehilangan kontrol terhadap pertumbuhan, sehingga

sel mengalami pertumbuhan tidak normal. Tahap promosi adalah proses yang

menyebabkan sel termutasi berkembang menjadi sel preneoplasma oleh stimulus

promotor (lihat Gambar 3). Senyawa karsinogenik, senyawa hasil oksidasi selama

proses detoksifikasi dan senyawa polutan dapat berperan sebagai promotor.

Tahap promosi berlangsung bertahun-tahun dan reversibel sebelum

terbentuknya sel tumor yang otonom. Sel prenoeplasma dapat tumbuh terus,

sedangkan sel normal akan berhenti tumbuh. Sel preneoplasma lebih tahan

terhadap lingkungan dan memiliki kemampuan berkembang biak lebih besar dari

pada sel normal. Pada tahap ini sebagian sel mengalami perkembangan progresif

Pembentukan tumor

Aktivasi metabolik

Zat kimia karsinogen Reaksi detoksifasi (konjugasi, dsb)

Karsinogen utama Detoksifikasi selular (berikatan dengan nukleofil yang lain)

Berikatan dengan DNA (INISIASI)

Perubahan DNA

Perbaikan DNA

Replikasi

Sel tumor laten

Pertumbuhan (PROMOSI)

PROGRESI

Kanker (Malignan)

Metastasis

16

menjadi sel neoplasma yang ireversibel (Hejmadi 2010). Pada akhir tahap

promosi terdapat gambaran histologis dan biokimiawi yang abnormal.

Sel neoplasma yang ireversibel masuk pada fase progresi, pada fase ini

terjadi ekspansi populasi sel secara spontan. Akibatnya, sel menjadi kurang

responsif terhadap sistim imunitas tubuh dan regulasi sel. Pada akhir fase ini

gambaran histologis dan klinis menunjukkan keganasan. Sel kanker terus

berkembang dan menuju tahap metastasis.

Metastasis adalah migrasi sel kanker dari lokasi inti ke jaringan atau

organ lain yang melibatkan proses biologis kompleks pada tingkat molekuler

(Hejmadi 2010). Metastasis diawali dengan invasi lokal. Invasi lokal adalah

proses sel kanker memisahkan diri melalui membran barier, kemudian berlanjut

pada tahapan intravasion dimana sel kanker akan menembus dinding kapiler dari

limfatik dan ikut sirkulasi limfatik. Transportasi sel kanker dalam tubuh dapat

menggunakan sirkulasi darah atau sirkulasi limfatik, sel kanker dapat beredar ke

seluruh bagian tubuh. Tahap akhir dari migrasi sel kanker adalah ekstravasion.

Tahap ini sesungguhnya mirip dengan tahap intravasion, hanya saja pada tahap

ini perpindahan sel kanker terjadi dari sirkulasi limfatik menembus dinding

kapiler untuk berkembanag biak pada jaringan atau organ yang baru

(Hejmadi 2010). Setelah melalui fase ekstravasion, sel kanker reaktif terhadap

jalur proliferasi dan mulai membentuk massa tumor yang baru, baik pada lumen

maupun kapiler melalui pembuluh darah (Hodgson & Levi 2000).

2. 5. 2 Jalur Sinyal Transduksi

Ketidakseimbangan antara proliferasi dan apoptosis pada sel yang

termutasi merupakan penanda yang cukup signifikan pada kejadian kanker.

Pertumbuhan dan proliferasi sel adalah dua hal yang berkaitan pada fenomena

koordinasi biologis sel. Kendali pertumbuhan yang penting adalah penginduksian

sel istirahat (resting cell) pada fase G0 ke siklus sel.

Aktivasi protein kinase merupakan mekanisme dari transduksi sinyal

pada berbagai proses seluler. Jalur transduksi sinyal MAPK memodulasi banyak

peristiwa seluler baik apoptosis, diferensiasi, proliferasi dan metabolisme sel

(Imajo et al. 2006). Jalur sinyal transduksi merupakan jalur komunikasi sel yang

17

komplek. Transduksi sinyal berlangsung dalam beberapa tahap yang disebut

dengan kaskade. Sinyal intraseluler kaskade adalah jalur komunikasi utama antara

membran sel dengan target pada kompartemen intraseluler.

Deregulasi sinyal sel merupakan bagian penting pada perkembangan

kanker. Tirosin kinase, faktor pertumbuhan dan protein G-reseptor/reseptor-G

merupakan perantara bagi MAPK dalam jalur sinyal transduksi ekstraseluler, hal

ini berperan untuk meregulasi faktor transkripsi yang dapat mengontrol

diferensiasi, pertumbuhan dan apoptosis pada sel (Takekawa et al. 2011).

Tiga famili protein yang termasuk dalam MAPK yaitu : stress-activated

protein kinase (SAPK/c-jun-NH2

Aktivator utama ERK 1/2 adalah rangsangan mitogen yang berupa faktor

pertumbuhan, ERK 1/2 yang teraktivasi menyebabkan pertumbuhan dan

kelangsungan hidup sel. Sedangkan, JNK dan p38 diaktifkan oleh reaksi ultra

violet, kerusakan DNA dan hidrogen peroksida. JNK dan p38 yang

teraktivasi menyebabkan sel mengalami apoptosis (Zhou et al. 2006 dan

Takekawa et al. 2011).

-kinase (JNK), p38 dan extraselullar signal

regulated kinase (ERK). Mekanisme aktivasinya melalui fosforilasi baik treonin

maupun residu tirosin. Perbedaan stimulus yang mengaktivasi peristiwa reaksi

MAPK kaskade mengakibatkan perbedaan respon yang bisa ditimbulkan yaitu

proliferasi, differensiasi dan apoptosis. Perbedaan stimulus yang mengaktivasi

jalur MAPK disajikan pada Gambar 4.

Gambar 4. Jalur sinyal MAPK kaskade (Takekawa et al. 2011).

18

Pada Gambar 4. ERK 1/2 teraktivasi oleh mitogen. Jalur ERK dikenal

juga dengan mitogen kinase kaskade klasik karena dipengaruhi oleh stimulus

faktor pertumbuhan (Roux 2004). ERK 1/2 diaktifkan oleh berbagai faktor

pertumbuhan dapat menginduksi sel saat berada pada fase istirahat (G0), menuju

siklus sel, proliferasi, diferensiasi dan migrasi sel. Aktivasi ERK 1/2 merupakan

proses penting pada pertumbuhan kanker. Beberapa jenis faktor pertumbuhan

seperti EGF (epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), PDGF

(platelet derived growth factor) dan VGFG (vaskuler endotilial growth factor)

setelah berikatan dengan reseptor tirosin kinase yang spesifik, kemudian bekerja

melalui ERK 1/2 kinase dan menyebabkan proliferasi (Brandon et al. 1997).

Sebagai contoh EGF ketika berikatan dengan reseptor EGF, akan menyebabkan

reseptor melakukan otofosforilasi pada residu tirosin dan mengikat komplek

Grb2-Sos untuk mengaktivasi ligan pada membran sel yang berikatan dengan Ras,

yang selanjutnya akan mengaktivasi Ras/Raf-Mek1/2-ERK 1/2 kinase kaskade

(Takekawa et al. 2011).

Peranan JNK pada sel tumor terjadi melalui induksi Ras yang

membutuhkan c-Jun, sehingga menjadi komplek yang terfosforilasi oleh JNK.

JNK yang telah aktif menginduksi Bcl-2 yang kemudian akan mengaktivasi Bax

yang menyebabkan membran mitokondria rusak. Kerusakan membran

mitokondria ini akan menyebabkan Sitokrom C (sebagai protein proapoptosis)

keluar dari mitokondria. Bersamaan dengan pelepasan sitokrom C, energi ATP

terbentuk menjadi kompleks molekul Apaf-1. Kompleks tersebut akan

mengaktifkan kaspase-9 sebagai protein inisiator. Aktivasi kaspase-9 bekerja

bersama kompleks sitokrom-C, ATP dan Apaf-1 membentuk apoptosom, yang

akan mengaktifkan kaspase-3 dan kaspase-7, kaspase-3 dan kaspase-7 ini

merupakan protein efektor yang akan mendegradasi sel menuju apoptosis

(Wada & Penninger 2004).

2. 5. 3 Jalur Sinyal Apoptosis

Apoptosis merupakan jalur kematian sel yang dipacu oleh mekanisme

pengaturan intraseluler. Sel yang akan mati mengaktifkan enzim untuk

mendegradasi DNA inti dan protein sitoplasma. Pada apoptosis, membran plasma

masih utuh, tetapi terjadi perubahan struktur menjadi sel apoptosis yang akan

19

menjadi target fagositosis oleh makrofag. Apoptosis dapat diamati pada

perubahan sel baik secara morfologi dan biokimiawi.

Aktivasi apoptosis akan menyebabkan reaksi enzimatis intraseluler.

Stimulus yang dapat menginduksi apotosis bisa berasal dari luar maupun dalam

sel. Stimulus apoptosis diantaranya adalah terbentuknya ligan pada reseptor

permukaan sel, faktor pertumbuhan, kerusakan DNA, paparan radiasi, obat-obatan

kemoterapi dan stres (Gewies 2003). Proses apotosis bisa terjadi melalui dua jalur,

yaitu jalur intrinsik (mitochondrial pathways) dan jalur ekstrinsik (death

resceptor-initiated pathways), sebagaimana disajikan pada Gambar 5

(Huang & Manel 2010).

Gambar 5. Jalur apoptosis ekstrinsik dan intrinsik (Elmore 2007).

Kaspase merupakan homolog cystein protease, sebagai pusat sinyal

apoptosis yang mengaktifkan mayoritas kejadian pada apoptosis. Kaspase-2, -3,

-6, -7, -8, -9 dan -10 telah dikenal memiliki peran penting pada jalur sinyal

apoptosis. Proapoptosis kaspase dikelompokkan menjadi kaspase inisiator yang

terdiri dari kaspase -2, -8, -9 dan -10 dan kaspase yang termasuk dalam kelompok

eksekusioner yaitu kaspase-3,-6 dan -7. Proses apoptosis terdiri atas fase inisiasi

20

dan fase eksekusi. Pada fase inisiasi, kaspase menjadi aktif secara katalitik, pada

fase eksekusi terdapat enzim-enzim yang berperan pada proses kematian sel.

Inisiasi apoptosis terjadi karena terdapat sinyal dari dua jalur yang berbeda, yaitu

sinyal jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik (Gewies 2003).

Pada Gambar 5, terlihat bahwa proses apoptosis melibatkan proses

berbagai tingkatan sel. Pada jalur ekstrinsik, molekul sinyal dikenal sebagai ligan

yang dilepas oleh sel. Ligan tersebut akan berikatan dengan reseptor kematian

pada membran sel target dan akan menginduksi apoptosis melalui kaspase

kaskade. Selanjutnya, jalur apoptosis ekstrinsik disebut juga jalur reseptor

kematian. Jalur ini diinisiasi oleh pengikatan reseptor kematian pada membran sel

yang membentuk ligan. Ligan FADD (fas-associated via death domain) dan

TRADD (tumor necrosis factor reseptor-1-associated death domain) yang

berinteraksi mengaktifkan prokaspase-8 menjadi kaspase-8 melalui death

domain. Kaspase-8 mengaktifkan prokaspase-3 menjadi kaspase-3 sehingga

terjadi kaspase kaskade yang berujung pada apoptosis sel (Gewies 2003).

Jalur intrinsik dipicu oleh stres seluler khususnya stress mitokondria

yang disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain kerusakan DNA dan stres

oksidatif. Protein antiapoptosis yaitu Bcl-2 dean Bcl-X pada keadaan normal

berada disekitar membran mitokondria dan sitoplasma. Ketika sel kehilangan

kemampuan mempertahankan diri atau mengalami stres, maka Bcl-2 dan atau

Bcl-X akan menghilang dari membran mitokondria dan digantikan oleh kelompok

protein pro-apoptosis seperti Bax, Bak dan Bim. Ketika Bcl-2 dan Bcl-X sudah

tidak berada disekitas membran, maka akan terjadi peningkatan permeabilitas

membran mitokondria yang menyebabkan mitokondria akan mengeluarkan

protein yang akan mengaktifkan kaspase kaskade. Salah satu dari protein tersebut

adalah sitokrom-C yang akan membentuk komplek dengan apoptotic-protease-

activating factor-1 (apaf-1) dan prokaspase-9 membentuk apoptosom. Proses ini

akan mengaktivasi prokaspase-9 menjadi kaspase-9 yang selanjutnya akan

mengaktivasi kelompok kaspase eksekusioner (kaspase-3 dan kaspase-7) yang

selanjutnya akan melepaskan substrat protein spesifik untuk menghasilkan sinyal

kematian menuju apoptosis ( Gewies 2003).

21

Sel yang sudah mengalami apoptosis memiliki tanda molekul pada

permukaan, yang membuat sel tersebut dapat dikenali oleh sel didekatnya untuk

difagosit. Makrofag reseptor akan berikatan dengan sel apoptosis yang

menyebabkan sel apoptosis dapat difagositosis. Proses fagositosis ini efisien

untuk menghilangkan sel yang mati tanpa menimbulkan proses inflamasi.

2. 5. 4 Peranan COX-2 Pada Apoptosis dan Proliferasi

Proses apoptosis pada kanker dapat dihambat salah satunya dengan

induksi enzim siklooksigenase-2 (COX-2). Pada keadaan normal COX-2 tidak

terekspresi secara signifikan. Metabolisme asam arakidonat melalui jalur

siklooksigenase (COX) menghasilkan eicosanoids yang berimplikasi pada

patogenesis penyakit pada manusia, termasuk kanker (Hu at al. 2003). COX

adalah enzim pertama pada jalur ini yang memproduksi prostaglandin (PG) dan

tromboksan (Tx) dari asam arakidonat. Enzim siklooksigenase (COX) terdapat

dalam dua isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. Kedua enzim tersebut mengkatalisis

reaksi dan menghasilkan produk yang sama, yaitu prostaglandin, tetapi dengan

fungsi biologis yang berbeda.

COX-1 merupakan enzim konstitutif yang diekspresikan pada hampir

semua jaringan yang mengkatalisis pembentukan prostanoid regulatoris pada

berbagai jaringan, terutama pada selaput lendir traktus gastrointestinal,

ginjal, platelet dan epitel pembuluh darah. COX-1 menyebabkan

pembekuan/penggumpalan darah secara normal. Sebaliknya COX-2

tidak konstitutif tetapi dapat diinduksi, antara lain bila ada stimulus oleh

berbagai faktor antara lain tumor promotor, sitokin, faktor pertumbuhan dan

stimuli inflamasi, viral onkogen dan mitogen (Kujubu 1991, Bahkle 2001,

Howe & Dannenberg 2003, Wendum et al. 2004, Nakamura et al. 2004).

COX-2 dikenal sebagai prostaglandin H2 synthase-2 (PGHS-2). Enzim

ini berperan pada katalisasi awal saat terjadi proses oksidasi dari asam arakidonat

menjadi prostaglandin yang terlibat pada reaksi inflamasi dan rasa nyeri. COX-2

merupakan protein yang biasanya tidak ada pada keadaan sel normal, namun

jumlahnya akan meningkat secara cepat (2-4 jam) jika sel mengalami gejala

patologis seperti inflamasi (Bakhle 2001).

22

COX-2 terekspresi secara kuat sebagai respon dari faktor pertumbuhan

dan beberapa endotoksin. COX-2 memainkan peranan penting pada proses

tumorgenesis. Selain terinduksi pada proses inflamasi, ekspresi COX-2 secara

berlebih juga ditemukan pada banyak tipe premalignan dan neoplasma malignan

pada manusia dan organisme lain, seperti pada kanker prostat, payudara dan liver

(Hu et al. 2003), dan kolorektal (Moore & Simmons 2000). Prostaglandin hasil

aktivitas COX-2 terlibat dalam karsinogenesis melalui stimulus dari proses

proliferasi sel, angiogenesis dan penghambatan apoptosis(Koki & Masferrer 2002,

Singh et al. 2007).

COX-2 berkontribusi pada perkembangan berbagai jenis tumor

(Juuti et al. 2006). Peningkatan kadar PGE2

Howe & Dannenberg (2003), Wendum et al. (2004), menyatakan bahwa

COX-2 pada kanker payudara memiliki peranan pada beberapa proses seperti

berikut :

telah diduga memiliki hubungan

dengan kanker payudara (Liu & Rose 1996) dan merupakan indikator dari

metastasis/keganasan kanker ( Lin et al. 2009). Peningkatan COX-2 dan

produksi PG diinduksi oleh viral dan transformasi Ras termediasi dari sel epitel

payudara (Liu & Rose 1996). Pada mencit model transgenik, ekspresi COX-2

berlebih dalam sel epitel payudara merupakan indikasi bahwa COX-2

menginduksi tumorgenesis kanker payudara (Lane & Hla 2001). Pada tikus model

metastasis kanker payudara, kadar prostaglandin (PG) memiliki korelasi positif

dengan kejadian tumorigenesis dan potensial metastasis (Kundu et al. 2001,

Lin et al. 2009).

1. Penghambatan apoptosis dengan cara induksi PGE2, yang kemudian akan

meningkatkan ekspresi protein anti apoptosis Bcl2

2. Meningkatkan angiogenesis melalui peningkatan kadar PGE2, yang diikuti

dengan peningkatan VEGF, endotelin-1 dan produksi PDGF.

dan menurunkan ekpresi

protein proapoptosis yaitu Bax dan melemahkan sinyal NO (nitrit oksida).

3. Peningkatan invasif melalui ekspresi berlebih dari CD44.

4. Meningkatkan perkembangan sel melalui aktivasi reseptor estrogen.

5. Produksi mutagen dengan cara memetabolisme asam arakidonat.

23

Induksi COX-2 pada kanker berhubungan dengan peningkatan produksi

PGE-2, dimana PGE-2 merupakan salah satu produk mayor dari COX-2 yang

dikenal memiliki peran dalam proliferasi sel. Prostaglandin E2 beraksi melalui

reseptor membran yang berbeda yaitu EP reseptor. Terdapat empat jenis EP

reseptor yaitu : EP1, EP2, EP3 dan EP4. Reseptor ini terletak pada permukaan sel.

PGE-2 memodulasi pertumbuhan kanker tulang ( Yamaki et al. 2004). Pada

penelitian tersebut memperlihatkan bahwa aktivitas PGE-2 sarkoma (Scr) kinase

pada sel A549 yang memodulasi proliferasi sel. Sel ini mengekspresikan EP3

yang mengaktivasi Scr kinase. Scr menginduksi aktivasi secara fosforilasi dari

STAT3 yang merupakan faktor transkripsi yang dikenal meregulasi cyclin D1

transkripsi, yang memegang peranan pada proses proliferasi sel. Apoptosis dapat

dihambat oleh regulasi STAT3 yang mengatur transkripsi dari Bcl-XL yang

merupakan protein anti-apoptosis. Selain itu, Scr memfosforilasi p27 yang

merupakan protein penghambat siklus sel terutama pada fase G1 menuju fase S.

Protein ini memiliki fungsi ganda sebagai bentuk unphosphorilated p27

menghambat siklus sel sekaligus memiliki peran pada proliferasi sel. PGE-2

meningkatkan proliferasi sel melalui fosforilasi p27 lewat EP4 reseptor.

2. 6. Mencit C3H

Mencit C3H berasal dari WE Heston National Cancer Institute di

Amerika Serikat. Mencit ini berwarna abu-abu tua. Mencit galur ini memiliki

insiden tumor kelenjar susu yang tinggi yaitu 81% pada mencit betina yang

beranak. Kanker payudara pada mencit C3H pertama kali ditemukan oleh Bittner

(1936). Mencit tersebut mengandung virus yang dikenal sebagai milk transmitter

mouse mamary tumor virus (MMTV). Virus tersebut dapat dipindahkan pada

keturunannya melalui air susu ibunya. Kanker payudara pada galur mencit ini

tidak bergantung pada hormon (Fantozzi & Gergard 2006).

Tumor kelenjar susu mencit C3H dapat ditransplantasikan secara

berulang. Tumor hasil transplantasi tetap tumbuh progresif sampai tahap tertentu,

kemudian mengalami regresi spontan secara berangsur-angsur. Hal ini dapat pula

terjadi secara sebaliknya. Tumor tidak diregresi namun tetap tumbuh progresif

dan membunuh inangnya. Besarnya persentase regresi spontan tergantung dari

jumlah sel tumor yang ditransplantasikan (Busch 1967).

24

2. 7. Metode Analisa Histopatologi

2. 7. 1 Hematoksilin-Eosin (HE)

Teknik pewarnaan jaringan merupakan proses pemberian warna pada

jaringan, sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat diamati dengan

mikroskop (Stevens & Bancroft 1990). Salah satu teknik pewarnaan jaringan

adalah hematoksilin-eosin (HE). Pewarnaan jaringan dengan HE melibatkan dua

macam zat pewarna, yaitu Hematoksilin Mayer atau Elrich dan Eosin alkohol.

Hematoksilin adalah bahan pewarna yang merupakan ekstrak dari pohon

longwood.

Pengolahan jaringan terdiri dari beberapa proses yang saling menentukan

satu dengan yang lain dimulai dengan urutan fiksasi, dehidrasi, penjernihan,

parafinisasi, perendaman dalam parafin, pemotongan, deparafinisasi, dan

pewarnaan. Masing-masing tindakan memiliki tujuan untuk menghasilkan

jaringan yang dapat dipotong dan diwarnai dengan pewarnaan tertentu.

Hematoksilin berfungsi untuk memberi warna biru pada inti sel,

sedangkan eosin digunakan untuk mewarnai sitoplasma sel menjadi warna merah

muda. Prinsip dari penggunaan teknik ini adalah afinitas sifat asam dan basa dari

sitoplasma dan inti sel untuk memberi warna pada berbagai macam dan struktur

jaringan.

Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai

unsur basofilik jaringan. Hematoksilin memulas inti dan struktur asam lainnya

dari sel (seperti bagian sitoplasma yang kaya-RNA dan matriks tulang rawan)

menjadi biru. Eosin bersifat asam akan memberikan warna pada komponen

asidofilik jaringan, seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen. Tidak

seperti hematoksilin, eosin mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi warna

merah muda (Junqueira 2007).

Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila

ditambahkan senyawa lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga.

Pewarnaan dengan metode HE hanya dapat digunakan untuk mengamati

sitoplasma dan nukleus dari jaringan yang diamati (Leeson et al. 1996). Dengan

menggunakan pewarnaan hematoksilin-eosin dapat diamati profil dari jaringan,

25

baik yang menunjukkan kenormalan maupun yang menunjukkan ketidaknormalan

pada jaringan yang sedang diamati.

Pewarnaan dengan menggunakan HE biasa digunakan oleh laboratorium

patologi-anatomi dan histologi. Teknik ini juga bisa digunakan untuk semua

spesimen dan merupakan inti dari semua diagnosis secara mikroskopik. Hal

tersebut karena semua pewarnaan khusus pada umumnya didasarkan pada

diagnosis dari jaringan yang diwarnai dengan pewarnaan HE terlebih dahulu. Para

ahli patologi-anatomis menggunakan HE untuk mendiagnosis penyakit,

mengidentifikasi kanker, mengkonfirmasi kesalahan metabolisme dan

mengidentifikasi jenis jaringan.

Penggunaan campuran dari pewarna tersebut merupakan variasi dari

teknik pewarnaan irisan jaringan. Adakalanya pewarnaan HE dilengkapi dengan

teknik pewarnaan yang lain. Jika pewarnaan HE tidak cukup digunakan sebagai

data pada diagnosis kanker, maka teknik lain seperti histokimia, pengamatan

dengan mikroskop elektron, imunohistokimia, dan flow cytometry bisa digunakan.

2. 7. 2 Imunohistokimia (IHK)

Imunohistokimia adalah metode pewarnaan untuk mendeteksi protein di

dalam sel suatu jaringan dengan prinsip ikatan antara antibodi dan antigen.

Pewarnaan imunohistokimia banyak digunakan pada pemeriksaan sel abnormal

seperti sel kanker. Pada prosesnya, molekul spesifik akan mewarnai sel-sel

tertentu seperti sel yang membelah atau sel yang mati sehingga dapat dibedakan

dari sel normal (Robinson et al. 1990).

Imunohistokimia adalah salah satu metode pewarnaan jaringan kuantitatif

untuk mendeteksi reaksi ikatan antigen-antibodi. Pada reaksi imunohistokimia ini

sifatnya sangat spesifik karena bahan yang ingin dideteksi akan direaksikan

dengan antibodi spesifik yang dilabel dengan enzim. Enzim yang digunakan untuk

melabel antibodi tersebut antara lain peroksidase, alkali fosfatase dan

b-galaktosidase. Imunohistokimia merupakan metode alternatif yang baik,

spesifik dan sensitif dan relatif cepat. Imunohistokimia telah menjadi metode

terpercaya untuk diagnosis rutin dan aktivitas penelitian (Damayanti et al. 2005).

26

Imunohistokimia terdiri atas dua metode dasar, yaitu metode langsung

dan metode tidak langsung. Metode langsung melibatkan satu tahap pewarnaan

dan antibodi yang berlabel bereaksi dengan antigen dalam bagian jaringan. Teknik

ini hanya menggunakan satu macam antibodi, sehingga prosedurnya pendek dan

cepat. Metode ini kurang sensitif karena hanya menampilkan sedikit sinyal.

Selanjutnya, metode tidak langsung adalah metode yang menggunakan dua jenis

antibodi. Antibodi pertama adalah antibodi primer sebagai antibodi yang tidak

berlabel. Antibodi ini digunakan pada lapisan pertama. Pada prosesnya, antibodi

ini bereaksi dengan antigen jaringan. Antibodi kedua adalah antibodi sekunder

sebagai antibodi yang berlabel. Antibodi ini digunakan pada lapisan kedua yang

bereaksi dengan antibodi primer. Kompleks yang terbentuk dapat divisualisasikan

dengan menginkubasi potongan jaringan pada substrat kromogen yang cocok

(Robinson et al. 1990).

3. BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3. 1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini berlangsung dari bulan Maret 2009 sampai dengan

Februari 2011. Analisis proksimat bubuk daun cincau hijau P.oblongifolia Merr.

dilaksanakan di Laboratorium Biokimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi

Pangan, Fateta, Institut Pertanian Bogor. Pembuatan pakan hewan coba mencit

C3H dilaksanakan di Pilot Plant SEAFAST Centre, Institut Pertanian Bogor.

Pewarnaan hematokxilin-eosin (HE) dilakukan di Laboratorium Patologi

Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia. Pewarnaan imunohistokimia (IHK) untuk melihat ekspresi enzim

kaspase-7 dan protein kinase JNK1/2 sebagai penanda proapoptosis dan ekspresi

protein kinase ERK 1/2 dan COX-2 sebagai penanda antiapoptosis dari jaringan

kanker payudara mencit C3H dilakukan di Laboratorium Riset Patologi, Fakultas

Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

3. 2. Bahan dan Alat

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman cincau

hijau P. oblongifolia Merr. yang diperoleh dari daerah Balumbang Jaya,

Kecamatan Bogor Barat, Jawa Barat. Bahan untuk membuat pakan mencit terdiri

dari bubuk daun cincau hijau P.oblongifolia Merr. tepung kasein sebagai sumber

protein, minyak jagung sebagai sumber lemak, tepung maizena (alpha corn

starch) merk Honig sebagai sumber energi, dan carboxyl methyl cellulose (CMC)

sebagai sumber serat. Sumber vitamin yang digunakan adalah vitamin (merk

Fitkom) yang pada tiap tabletnya mengandung vitamin A 1500 SI, 1 mg tiamin,

0,5mg riboflavin, 0,5mg piridoksin, 10mg niasin, 5mg vitamin B, 0,5 mg asam

folat, 0,5 mg vitamin B12 , 25 mg vitamin C, vitamin B5 dan vitamin D2

150 SI.

Mineral mix diperoleh dari Laboratorium Biokimia Pangan dan Gizi, Fakultas

Teknologi Pertanian IPB dengan komposisi seperti pada Tabel 2 berikut ini :

28

Tabel 2 Komposisi mineral pada ransum mencit C3H.

Jenis mineral Jumlah (dalam 100 g) NaCl 139,30 KI 0,79 KH2PO 389 4 MgSO4.7H2 57,30 O CaCO 381,40 3 FeSO4. 7H2 27 O MnSO4. 7H2 4,01 O ZnSO4. 7H2 0,55 O CuSO4. 5H2 0,48 O CoCl2. 6H2 0,02 O

Peralatan dalam pembuatan pakan meliputi: drum dyer, blender, freezer,

plastik kiloan, wadah (baskom), spatula, kantong plastik klip, oven, grinder, dan

timbangan.

Hewan coba yang digunakan adalah mencit (Mus musculus) strain C3H

sebanyak 25 ekor sebagai resepien dengan umur kurang lebih dua bulan dengan

berat badan 20-22 gr dan tiga ekor mencit donor yang diperoleh dari laboratorium

Patologi Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran,

Universitas Indonesia

Bahan yang digunakan untuk analisa HE dan IHK adalah jaringan kanker

payudara mencit C3H. Bahan kimia yang digunakan untuk pengolahan jaringan

adalah buffer formalin 10%, paraffin cair/histoplast, xylol, alkohol, hematoksilin

dan eosin. Peralatan untuk pengolahan jaringan meliputi oven, base mould dan

cassette base, forsep, lemari pendingin serta gelas objek dan penutupnya.

Bahan kimia yang digunakan untuk analisa IHK pada penelitian ini

meliputi, xylol, alkohol absolut, metanol, phosphate buffer saline (PBS),

hematoksilin, eosin, neofren, hidrophobic marker, citrat buffer, destilated water

(DW), Tween 20 0,1%, dan H2O2

Antibodi primer yang digunakan meliputi antiphospho-JNK1/2 (SAPK)

yang berasal dari manusia dikembangkan pada kelinci dari Sigma (nomor produk

J4644) dan anti COX-2 yang berasal dari kelinci dikembangkan pada tikus dari

Cayman Chemical (nomor katalog 160116), antibodi primer antikaspase-7 yang

berasal dari manusia dikembangkan pada kelinci dari Sigma (nomor produk

C7724), antiphospho-ERK1/2 yang berasal dari manusia yang dikembangkan

3%.

29

pada kelinci dari Sigma (nomor produk E7028). Antibodi sekunder IgG kambing

anti kelinci yang dilabeli dengan enzim HRP dari Cell Signaling Technology

(nomor katalog 7074) dan substrat DAB (diaminobenzidine).

Peralatan untuk pewarnaan IHK meliputi gelas objek dan kaca penutup,

gelas piala, pipet, mikropipet, pemanas air, mikrotom, inkubator, alat penghitung

waktu (timer), lemari pendingin, lembar protokol IHK dan mikroskop.

3. 3. Tahapan Penelitian

Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap. Tahap pertama meliputi preparasi

sampel daun cincau hijau P.oblogifolia Merr, pembuatan bubuk daun cincau hijau

dan pembuatan pakan yang digunakan untuk uji pada mencit C3H. Tahap kedua

merupakan pengujian aktivitas antikanker dari bubuk daun cincau hijau

P. oblongifolia Merr. pada mencit C3H, meliputi tahapan penerapan pakan uji,

transplantasi, dan terminasi. Tahap ketiga merupakan analisis histopatologis

secara HE dan tahap deteksi ekspresi enzim kaspase-7 dan protein kinase JNK-1/2

sebagai protein penanda proapoptosis dan enzim COX-2 dan protein kinase

ERK 1/2 sebagai protein penanda antiapoptosis dari jaringan kanker payudara

mencit C3H dengan menggunakan metode IHK.

3. 3. 1. Pembuatan Bubuk Daun Cincau Hijau (Chalid 2003)

Pembuatan pakan mencit diawali dengan pembuatan bubuk daun cincau

hijau P. oblongifolia Merr. Pembuatan bubuk daun cincau hijau diawali sortasi

agar didapatkan daun yang bersih dari tangkai dan batang daun. 200 g daun cincau

hijau yang telah bersih dicuci dan ditiriskan, setelah itu dilakukan penghalusan

menggunakan blender dengan perbandingan antara daun cincau dan air 1:3. Bubur

daun cincau yang dihasilkan sampai menghasilkan gel, didiamkan semalam

dilemari es. Keesokan harinya gel dikeringkan menggunakan drum dryer,

sehingga diperoleh bubuk daun cincau hijau kasar. Bubuk kasar daun cincau hijau

yang diperoleh dihaluskan menggunakan blender maka diperoleh bubuk daun

cincau hijau P. oblongifolia Merr. halus yang siap digunakan sebagai campuran

pada pakan mencit. Tahapan pembuatan tersebut secara lebih detil dapat dilihat

pada Lampiran 1.

30

3.3.2. Pembuatan Pakan Mencit C3H (AIN 1976)

Pakan mencit yang digunakan pada penelitian ini merujuk pada penelitian

Chalid (2003) dengan modifikasi pada persentase bubuk daun cincau yang

ditambahkan pada pakan mencit seperti yang telah dilaporkan oleh

Widyanto (2010) dan Aryudhani (2011). Kelompok hewan coba yang diberi

bubuk daun cincau pada pakannya adalah kelompok C (0,88%), D (1,76%) dan

E (2,64%).

Komposisi pakan secara lengkap disajikan dalam Tabel 3.

Tabel 3 Komposisi pakan standar dan pakan uji mencit C3H (Chalid 2003).

Komponen Komposisi (AIN1976)

(%)

Kelompok mencit perlakuan

A (gr) B (gr) C (gr) D (gr) E (gr)

Bubuk gel daun cincau hijau 0 0 0 0,88 1,76 2,64

Kasein 20 21,90 21,90 21,74 21,57 21,40 Lemak (minyak jagung merek Mazola) 5,0 4,95 4,95 4,93 4,91 4,90

Selulosa (carboxyl methyl cellulose) 5,0 5,0 5,0 4,55 4,10 3,65

Mineral mix 3,50 2,85 2,85 3,28 3,21 3,14 Vitamin mix (vitamin merek Fitkom) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Air 10,0 8,31 8,31 8,29 8,28 8,26

Karbohidrat (maizena merek Honig)

Untuk membuat

100 55,99 55,99 55,33 55,17 55,02

Pembuatan pakan mencit sesuai dengan komposisi pada Tabel 3, diawali

dengan proses pencampuran bahan yang komposisinya paling kecil, yaitu vitamin

dan mineral, kemudian ditambahkan selulosa (CMC) dan kasein secara berurutan.

Sementara itu pada wadah yang lain dilakukan pencampuran air dan tepung

maizena yang kemudian dibagi menjadi dua bagian yaitu 2/3 bagian disebut basis

air dan 1/3 bagian disebut basis minyak. Pencampuran selanjutnya adalah vitamin,

mineral dan CMC dicampurkan pada basis minyak, diaduk sampai rata dan

homogen, baru kemudian dilanjutkan dengan menyampurkan basis air. Setelah

tercampur rata kemudian dibuat pelet dan dikeringkan menggunakan cabinet

dryer selama 4-5 jam.

31

3.3.3. Pemeliharaan Mencit

Pengujian pada mencit C3H merupakan kerja tim yang terdiri dari empat

orang peneliti, yaitu Emma Rochima, Nindira Aryudhani, Rachmat Widyanto dan

Mutiara Prihatini. Pemeliharaan mencit dilakukan selama 52 hari. Mencit C3H

yang digunakan sebanyak 25 ekor mencit umur ±2 bulan. Mencit dibagi menjadi 5

kelompok perlakuan dimana setiap kelompok terdiri dari 5 individu. Hal ini sesuai

dengan jumlah minimum ulangan untuk setiap perlakuan dengan rumus Federer :

Dimana t : jumlah perlakuan

n : jumlah ulangan minimum yang diperlukan

Sehingga untuk 5 kelompok perlakuan minimum ulangan yang diperlukan adalah

5 ekor mencit. Setiap individu menempati satu kandang yang terbuat dari plastik.

Setiap kelompok ditempatkan dalam rak bersusun. Semua hewan coba diletakkan

dalam ruang yang telah diatur siklus udara dan cahaya. Mencit dikelompokkan

dengan perlakuan sebagai berikut :

Kelompok Keterangan

A = Kontrol negatif, yaitu mencit diperi pakan standar (0% bubuk daun cincau hijau) dan tidak ditransplantasi tumor.

B = Kontrol positif, yaitu mencit diperi pakan standar (0% bubuk daun cincau hijau) dan ditransplantasi tumor

C,D,E = Kelompok mencit perlakuan yang pada pakannya ditambahkan bubuk daun cincau hijau P.oblongifolia Merr 0,88%, 1,76% dan 2,64% serta ditransplantasi tumor

Masa uji pada penelitian ini berlangsung selama 52 hari. Pada hari ke-1

sampai hari ke-30 semua hewan coba sudah diberi perlakuan pakan uji namun

belum dilakukan proses transplantasi sel kanker. Proses transplantasi sel kanker

dilakukan pada hari ke-31. Pemeliharaan hewan coba dilanjutkan sampai hari

ke-52 dan pada hari ke-53 dilakukan terminasi.

Pada penelitian ini tidak dilakukan masa adaptasi karena pemeliharaan

hewan coba yang digunakan tidak mengalami perubahan yaitu berasal dari

Laboratorium Patologi Eksperimental, Departemen Patologi Anatomik, Fakultas

32

Kedokteran Universitas Indonesia dan pada masa uji masih dipelihara di tempat

yang sama. Selain itu, pakan uji yang digunakan telah digunakan oleh Chalid

(2003) dan tidak memberikan dampak negatif pada hewan coba.

Pemberian pakan uji sebelum transplantasi dilakukan selama 30 hari.

Jumlah pakan yang diberikan ± 5g/ekor/hr. Pemberian pakan dilakukan tiap hari

antara pukul 07.00-09.00 WIB. Banyaknya pakan yang dikonsumsi dihitung

berdasarkan jumlah sisa pakan. Pada masa sebelum transplantasi ini dilakukan

pengamatan meliputi jumlah pakan yang dikonsumsi perhari, pengukuran berat

badan dua kali dalam sepekan.

3.3.4. Transplantasi

Proses transplantasi dari mencit donor ke mencit resepien disesuaikan

dengan metode yang biasa digunakan di Laboratorium Patologi Anatomi FKUI

(Liebelt dan Liebelt 1967). Transplantasi suspensi sel kanker dilakukan pada hari

ke-31 setelah diberi pakan uji. Proses transplantasi dilakukan dengan cara

menyuntikan suspensi sel kanker yang berasal dari mencit C3H donor ke mencit

resepien. Mencit donor yang digunakan untuk proses transplantasi ini adalah

mencit yang sudah mencapai tahap pasasi ke-13.

Proses transplantasi diawali dengan mematikan mencit donor

menggunakan eter, kemudian mencit ditelentangkan pada papan fiksasi dengan

menggunakan jarum. Pada permukaan tubuh mencit diusap menggunakan alkohol

70%, kemudian dibuat sayatan dengan gunting lurus untuk mengeluarkan jaringan

kanker. Jaringan kanker diambil menggunakan gunting dan pinset steril yang

berbeda dengan yang digunakan pada proses pembedahan.

Jaringan kanker selanjutnya dibersihkan menggunakan larutan PBS di

gelas arloji yang diletakkan di atas es, kemudian dilakukan pencacahan

menggunakan gunting steril sambil menambahkan larutan PBS sebanyak

volume jaringan kanker dan diaduk hingga homogen. Homogenasi dilakukan

sampai terbentuk suspensi jaringan kanker. Suspensi jaringan kanker yang

dihasilkan kemudian dilakukan penghitungan jumlah sel dengan menggunakan

petroff-hauser counting chamber atau haemocytometer dan tripan biru kemudian

diamati di bawah mikroskop dan dihitung jumlah sel hidupnya setiap 0,20 ml

33

suspensi mengandung ± 106

sel tumor hidup. Sel yang hidup terlihat berwarna

bening sedangkan yang mati berwarna biru. Suspensi jaringan kanker yang telah

dihitung siap disuntikkan di aksila kanan mencit menggunakan jarum trokar

sebanyak 0,2 ml. Proses transplantasi sel kanker dilakukan seperti terlihat pada

Gambar 6.

Mencit donor Pengambilan

jaaringan kanker

Jaringan kanker

Proses Homogenasi jaringan kanker

Suspensi sel kanker yang digunakan untuk transplantasi

Proses transplantasi

Gambar 6. Proses transplantasi sel kanker pada mencit C3H resepien.

Setelah proses transplantasi, pemberian pakan dilanjutkan kembali sampai

hari ke-52 untuk selanjutnya dilakukan terminasi, pengambilan jaringan kanker

untuk dilakukan analisa selanjutnya.

3.3.5. Pengamatan Konsumsi Pakan dan Monitoring Berat Badan Mencit

Monitoring konsumsi pakan tetap dilakukan setiap hari dan pengukuran

berat badan tetap dilakukan dua kali dalam sepekan baik pada masa sebelum

transplantasi maupun pada masa setelah transplantasi sampai saat terminasi yaitu

hari ke-52.

3.3.6. Pengamatan Masa Laten dan Volume Jaringan Kanker

Pengukuran parameter lain setelah proses transplantasi adalah masa laten,

volume jaringan kanker dan berat jaringan kanker. Masa laten adalah waktu

pertumbuhan kanker pada individu baru dari awal transplantasi hingga jaringan

kanker dapat diraba dengan tangan. Pengamatan masa laten dilakukan pada

mencit resepien menggunakan perabaan pada subkutan aksila kanan, tempat

transplantasi dilakukan. Pengamatan masa laten ini dilakukan setiap hari. Setelah

jaringan kanker pada inang baru dapat diraba dengan tangan, selanjutnya

34

pengukuran volume jaringan kanker dapat dilakukan menggunakan jangka

sorong digital. Volume jaringan kanker diukur dengan menggunakan jangka

sorong digital untuk mengukur panjang (cm), lebar (cm) dan tinggi kanker (cm)

dan dihitung berdasarkan rumus ( Coletta et al.2004) :

Berat badan mencit ditimbang dengan neraca OHAUS. Pengukuran berat badan,

volume jaringan kanker dilakukan seperti pada Gambar 7.

(a) (b)

(Sumber : dokumentasi probadi) Gambar 7. Proses pengukuran berat badan (a) dan volume jaringan kanker (b).

3.3.7. Terminasi dan Penimbangan Jaringan Kanker

Pengukuran berat jaringan kanker dilakukan pada akhir masa perlakuan

diawali dengan terminasi mencit dan kemudian jaringan kanker diambil dan

ditimbang.

Kemudian mencit ditelentangkan pada papan fiksasi dan keempat kakinya

difiksasi dengan jarum. Penelentangan mencit bertujuan memudahkan

pengambilan jaringan kanker. Selanjutnya, kulit mencit pada tubuh bagian

bawah diusap dengan alkohol 70%. Pengambilan jaringan kanker dilakukan

dengan menggunakan gunting steril. Proses pembedahan mencit dilakukan

sebagaimana Gambar 8.

Proses terminasi mencit dilakukan dengan secara fisik (dislokasi

vertebral) yaitu perusakan hubungan antara tulang leher dan kepala yang

menyebabkan rusaknya jaringan syaraf pengatur kesadaran seperti tampak pada

Gambar 8.

Volume jaringan kanker (cm2) = p x l2 x 0,52

35

(a) (b) (c) (d)

Gambar 8. Proses pembedahan/pengambilan jaringan kanker mencit meliputi terminasi (a), peletakan mencit di papan fiksasi (b), proses pengambilan jaringan kanker (c) dan jaringan kanker (d).

(Sumber : dokumentasi pribadi).

Jaringan kanker yang diambil kemudian dibungkus menggunakan

aluminium foil yang sebelumnya dilakukan penimbangan. Jaringan kanker yang

telah ditimbang kemudian dimasukkan dalam larutan buffer formalin 10% selama

24 jam untuk selanjutnya dibuat preparat histologi.

3.3.8 Pembuatan Preparat Histologi

Proses pembuatan preparat dan pewarnaan histologi ini disesuaikan

dengan metode yang biasa digunakan di Laboratorium Patologi Anatomi FKUI

(Stevens & Bancroft 1990). Pemrosesan jaringan untuk dibuat menjadi preparat

histopatologi melalui tahapan-tahapan sebagai berikut: fiksasi jaringan, dehidrasi,

clearing, infiltrasi, embedding, trimming.

Jaringan kanker difiksasi dengan cara direndam dalam larutan formalin,

kemudian dilakukan dehidrasi, penjernihan, infiltrasi lalu dibuat blok paraffin

melalui proses yang disebut embedding agar jaringan yang sudah dalam bentuk

blok parafin dapat dipotong menggunakan microtom rotary. Proses pemotongan

jaringan dalam bentuk blok paraffin disebut dengan trimming. Sampel yang telah

dipotong dengan ketebalan ± 4µm dilekatkan pada gelas objek, sampel dapat

digunakan untuk proses pewarnaan seperti HE.

3.3.9. Pewarnaan HE (Stevens & Bancroft 1990)

Blok sampel jaringan dipotong, kemudian sampel siap digunakan untuk

pewarnaan HE. Proses pewarnaan HE dimulai dengan penjernihan menggunakan

36

xylol, kemudian rehidrasi menggunakan alkohol dengan konsentrasi menurun dari

100% sampai 70%, kemudian direndam aquades selama 5 menit.

Pewarnaan inti dimulai dengan perendaman menggunakan hematoxylin

selama 5-10 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir. Hematoxylin akan

mewarnai inti sel pada sampel jaringan dengan warna biru. Pewarnaan dilanjutkan

dengan alkohol asam jika terlalu biru, dibilas dengan air mengalir, dan dilanjutkan

dengan litium karbonat untuk memperjelas warna biru yang terbentuk.

Pewarnaan dilanjutkan dengan pewarnaan sitosol pada jaringan

menggunakan eosin, setelah tahap ini sampel melalui tahapan rehidrasi

menggunakan alkohol dengan konsentrasi meningkat dari 70% sampai 100%,

setelah itu dilakukan penjernihan menggunakan xylol, dan sampel jaringan

ditutup dengan gelas penutup dan direkatkan dengan entellan. Sampel

histopatologi siap diamati di bawah mikroskop dan difoto untuk selanjutnya

dianalisa.

Pembacaan sampel yang telah diwarnai menggunakan metode HE

dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran 200x dengan bimbingan

dokter spesialis patologi anatomi. Perubahan sel yang diamati meliputi

diferensiasi sel. Diferensiasi sel adalah perubahan bentuk sel dari bentuk aslinya.

Diferensiasi dikatakan baik jika bentuk sel atau struktur penyusun sel menyerupai

bentuk aslinya, dan dikatakan buruk jika sedikit atau bahkan tidak ada lagi sel

yang menyerupai bentuk aslinya. Mitosis menunjukkan pembelahan sel yang

terjadi pada jaringan kanker yang sedang diamati sedang aktif membelah.

Gambaran mikroskopis secara keseluruhan dilakukan dengan melihat 5x bidang

lapang pandang dengan pembesaran 200x hasilnya dirata-rata. Berikut merupakan

keterangan skoring terhadap pewarnaan HE (Elston & Ellis 1991). Skor derajat

diferensiasi merupakan penjumlahan dari tiga kategori yang meliputi tingkat

kepadatan sel, pleomorfisme sel dan mitosis sel.

Klasifikasi dari skor derajat diferensiasi setelah dijumlahkan meliputi

derajat diferensiasi antara 3-5, maka jaringan kanker termasuk dalam kelompok

terdiferensiasi baik. Jika skor derajat diferensiasi sel antara 6-7, maka jaringan

termasuk ke dalam kelompok diferensiasi sedang. Jika skor derajat diferensiasi

antara 8-9, maka jaringan termasuk dalam kelompok diferensiasi buruk yang

37

berarti bahwa bentuk sel sama sekali tidak mirip dengan sel asal.

Rincian kriteria penilaian skor derajat diferensiasi dijelaskan sebagai

berikut :

a. Tingkat Kepadatan Sel Tumor :

Skor 1 : tingkat kepadatan sel tumor rendah, ruang antar sel terlihat kurang

rapat.

Skor 2 : tingkat kepadatan sel tumor sedang, ruang antar sel terlihat cukup

rapat.

Skor 3 : tingkat kepadatan sel tumor tinggi, ruang antar sel terlihat sangat rapat.

b. Tingkat Mitosis Sel :

Skor 1 : sel yang mitosis dengan jumlah sedikit (5-10 sel)

Skor 2 : sel yang mitosis dengan jumlah sedang (6-10 sel)

Skor 3 : sel yang mitosis dengan jumlah banyak (≥ 11 sel)

c. Pleomorfisme Inti Sel :

Skor 1 : Bentuk sel beragam dan dapat dibedakan satu dengan yang lain,

ukuran sitoplasma besar, inti sel berukuran kecil, warna inti sel pada

bagian dalam mulai lebih gelap pada bagian lain masih berwarna

lebih terang.

Skor 2 : Bentuk sel mulai seragam, ukuran sitoplasma mulai mengecil, inti

sel mulai membesar dan semakin jelas duplikasidi dalam sel, warna

inti sel semakin gelap.

Skor 3 : Bentuk sel seragam, ukuran sitoplasma mengecil, inti sel berukuran

sangat besar, terlihat jelas duplikasi di dalam sel dan warna inti sel

gelap.

3.3.10. Pewarnaan Imunohistokimia (Robinson et al. 1990)

Pada pewarnaan imunohistokimia ada beberapa tahapan yang harus

dilakukan sebelum pewarnaan IHK dilakukan, yaitu preparasi gelas obyek disebut

pelapisan (coating) yang digunakan untuk penempelan sampel menggunakan

gelatin seperti pada Lampiran 31, pengirisan (sectioning) sediaan blok

embeding menggunakanan microtom rotary dengan ketebalan ± 4 µm, selanjutnya

dilanjutkan dengan proses penempelan (affixing) sampel ke gelas obyek dan

38

kemudian dilanjutkan dengan pewarnaan imunohistokimia.

Metode IHK meliputi tiga langkah utama yaitu deparaffinisasi (rehidrasi),

antigen unmasking dan pewarnaan (staining). Proses penjernihan dilakukan

sebelum proses rehidrasi menggunakan xylol. Rehidrasi diawali dengan

perendaman pro-analysis dengan konsentrasi menurun dari 100% sampai 70%.

Proses rehidrasi diakhiri dengan perendaman menggunakan aquades. Proses

selanjutnya adalah antigen unmasking. Pada proses ini dilakukan perebusan

menggunakan larutan buffer natrium sitrat (lampiran 31) yang bertujuan untuk

membuka epitop antigen. Suhu perebusan dijaga sekitar 850

Proses pewarnaan IHK diawali dengan perendaman sampel dengan

aquades, pada proses ini penggunaan pap-pen yang mengandung 1-bromopropan

untuk membatasi jaringan yang akan diwarnai. Hal ini agar larutan perendam

tidak tercecer dan jaringan yang akan dianalisa dipastikan terendam oleh larutan.

Proses selanjutnya gelas objek tidak lagi direndam melainkan ditetesi

menggunakan pipet tetes. Proses ini dilakukan di box yang dialasi menggunakan

tissu yang dibasahi agar dapat mempertahankan kelembaban supaya jaringan tidak

cepat kering.

C selama 10 menit

kemudian dilakukan proses pendinginan.

Proses selanjutnya inkubasi menggunakan larutan 3% H2O2 dalam dH2

Kemudian proses inkubasi dengan antibodi primer dilakukan pada suhu

4

O

selama 10 menit dengan cara diteteskan. Kemudian proses pencucian

menggunakan larutan PBS (phosphate buffer saline), pada larutan PBS tidak lupa

ditambahkan Tween 20 yang bertujuan untuk menyatukan PBS dan protein target

serta membersihkan protein-protein lain bukan menjadi target. Jaringan pada gelas

obyek ditetesi dengan larutan protein pemblok (skim milk dalam PBS) sebanyak

100 - 400 µL selama 60 menit pada suhu ruang.

0C selama semalam. Volume larutan antibodi primer yang diteteskan adalah

100-400 μL dengan pengenceran 1:100. Penetesan larutan antibodi primer

dilakukan dengan mikropipet. Perendaman ini bertujuan mengefektifkan reaksi

antara antigen yang terdapat pada jaringan dengan antibodi primer

(reaksi Ag-Ab). Pada penelitian ini, antibodi primer yang digunakan ada empat

macam, yaitu antiphospho-JNK1/2 yang berasal dari manusia dikembangkan

39

pada kelinci dari Sigma (nomor produk J4644) dan anti COX-2 yang berasal dari

kelinci dikembangkan pada tikus dari Cayman Chemical (nomor katalog 160116),

antibodi primer antikaspase-7 yang berasal dari manusia dikembangkan pada

kelinci dari Sigma (nomor produk C7724), antiphospho-ERK1/2 yang berasal dari

manusia yang dikembangkan pada kelinci dari Sigma (nomor produk E7028).

Setelah diinkubasi selama semalam, larutan antibodi primer dilarutkan

menggunakan larutan PBS sebanyak tiga kali, masing-masing selama 5 menit.

Perendaman selanjutnya adalah perendaman jaringan dalam larutan antibodi

sekunder dengan proses inkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Perendaman

dengan antibodi sekunder dilakukan dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan.

Volume larutan antibodi sekunder yang diteteskan adalah 100-400 μL dengan

pengenceran 1:1000. Pada penelitian ini, antibodi sekunder yang digunakan

adalah antibodi sekunder IgG kambing anti kelinci yang dilabel dengan enzim

HRP (horseradish peroxidase). Selanjutnya, jaringan diinkubasi dengan larutan

DAB (diaminobenzidine) sebagai substrat bagi enzim HRP. Reaksi antara DAB

dan enzim HRP menghasilkan warna coklat.

Selanjutnya dilakukan pencucian menggunakan aquades, kemudian

dilakukan perendaman menggunakan hematoksilin untuk mewarnai inti dan

jaringan terfiksasi dengan warna ungu. Perendaman dilanjutkan dengan proses

rehidrasi, clearing, dan mounting.

Sampel selanjutnya siap diamati di bawah mikroskop dan direkam dengan

foto digital. Pengamatan terhadap sampel dengan pewarnaan IHK adalah

menghitung jumlah sel yang positif yang telah diwarnai dengan antibodi primer

antiphospho-JNK 1/2, anti-COX-2, antikaspase-7 dan antiphospho-ERK 1/2

diberi skor secara terpisah oleh peneliti dengan dua kali pembacaan pada waktu

yang berbeda dan dilakukan secara semikuantitatif.

Skor IHK mengikuti cara Esteva et al. (2004). Distribusi sel yang positif

dan intensitas warna dievaluasi sebagai berikut:

0= tidak terdapat area berwarna coklat.

1= < 10% sel yang positif

2= 10-50% sel yang positif

3= >50% sel yang positif

40

3.4. Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Rancangan percobaan untuk penelitian ini menggunakan rancangan acak

lengkap (RAL) dengan perlakuan adalah prosentase bubuk cincau hijau yang

diberikan pada pakan hewan coba, yaitu 0,88%, 1,76% dan 2,64%. Analisis data

pada penelitian ini menggunakan analisis sidik ragam dan analisa deskriptif. Uji

statistik terhadap data terdiri dari uji homogenitas data menggunakan uji Barletts,

dan uji Kolmogorov Smirnov untuk uji normalitas pada taraf 5%. Analisa sidik

ragam (ANOVA) satu arah dilakukan untuk melihat beda antara perlakuan. Jika

tingkat signifikansi < 0,05 pada uji ANOVA maka kemudian dilanjutkan dengan

DMRT (duncan’s multiple range test) untuk melihat perlakuan yang memberikan

perbedaan nyata.

4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4. 1. Pakan Mencit C3H

Pakan pada penelitian ini menggunakan pakan standar AIN (1976). Pada

penelitian Chalid (2003) digunakan dua jenis perlakuan pakan uji yaitu perlakuan

bubuk cincau hijau dan seduhan cincau hijau dari C.berbata L.Miers dan

P.oblongifolia Merr. masing-masing jenis cincau dan perlakuan uji menggunakan

prosentase penambahan 0,88% baik pada bubuk daun cincau hijau maupun pada

pakan dengan seduhan daun cincau hijau.

Pada penelitian ini digunakan satu jenis cincau hijau yaitu

P.oblongifolia Merr. dengan prosentase bertingkat pada bubuk daun cincau hijau

pada perlakuan pakan uji yaitu : 0,88%, 1,76% dan 2,64%. Pemilihan jenis cincau

ini berdasar pada penelitian-penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa

bubuk daun cincau hijau P.oblongifolia Merr. memiliki beberapa kelebihan jika

dibanding dengan bubuk daun cincau hijau C.barbata L.Miers. Bentuk bubuk

daun dipilih karena lebih mudah disimpan. Komposisi dosis sendiri dibuat untuk

mengetahui lebih dalam mengenai pengaruh peningkatan dosis terhadap

perkembangan jaringan kanker payudara mencit C3H.

4. 2. Perkembangan Berat Badan dan Jaringan Kanker Mencit C3H

Parameter yang diamati untuk pertumbuhan mencit pada penelitian ini

meliputi berat badan mencit, masa laten, volume jaringan kanker dan berat

jaringan kanker. Untuk masing-masing parameter yang telah disebutkan

sebelumnya, perlu dilakukan uji normalitas dan homogenitas terlebih dahulu

sebelum dilakukan uji beda.

4. 2. 1. Berat Badan Mencit

Berat badan hewan coba diukur dua kali dalam sepekan selama perlakuan

pakan uji sebelum transplantasi yaitu selama 30 hari. Pada penelitian ini tidak

dilakukan masa adaptasi, karena hewan coba yang digunakan tidak mengalami

perubahan tempat pemeliharaan yaitu Laboratorium Patologi Eksperimental,

Departemen Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

42

Masa adaptasi untuk pakan uji juga tidak dilakukan karena pada penelitan Chalid

(2003) dengan menggunakan pakan uji yang diberi bubuk daun cincau hijau

P.oblongifolia Merr. tidak memberi dampak negatif bagi hewan coba dan disukai,

yang dibuktikan dengan data konsumsi pakan. Mencit menjalani masa uji sebelum

transplantasi selama 30 hari. Pergantian pakan dilakukan setiap hari agar mencit

selalu mendapat makanan yang segar dan untuk mengetahui jumlah konsumsi

pakan mencit setiap harinya.

Data berat badan mencit baik pada kelompok kontrol maupun kelompok

uji sebelum mendapat perlakuan dilakukan uji normalitas menggunakan

Kolmogorov-Smirnov, hasilnya menunjukkan data berdistribusi normal (p>0,5)

secara lebih rinci dapat dilihat pada Lampiran 2. Setelah diuji normalitas,

dilakukan pula pengujian homogenitas menggunakan metode Bartlett – Levene,

hasil analisis data memperlihatkan berat badan mencit homogen ditunjukkan oleh

nilai p>0,5 (Lampiran 3).

Pada masa sebelum transplantasi setiap kelompok mencit mengalami

variasi kenaikan berat badan, rata-rata semua mencit pada kelompok perlakuan

mengalami kenaikan berat badan hal ini dapat dilihat dari delta kenaikan berat

badan pada awal perlakuan (Lampiran 4). Hasil uji sidik ragam berat badan

mencit pada masa sebelum transplantasi memperlihatkan bahwa pada kelompok C

21,147±1,60 g dan D 20,818±1,40 g secara nyata lebih besar daripada mencit

kelompok kontrol A (19,567±1,70 g) dan B (19,531±2,00 g). Mencit kelompok E

memiliki rata-rata berat badan sebesar 17,227±1,00 g yang nyata lebih kecil

dibandingkan dengan kelompok kontrol, maupun kelompok perlakuan yaitu

kelompok C dan D secara lebih rinci dapat dilihat pada Lampiran 5. Grafik berat

badan mencit tersaji pada Gambar 9.

=kel kontrol

negatif = kel kontrol

positif = kel 0,88% = kel 1,76% = kel 2,64%

Gambar 9. Grafik pertumbuhan berat badan mencit C3H selama penelitian

0,05,0

10,015,020,025,030,0

1 6 9 13 16 20 23 27 30 31 34 37 41 44 48 52

Ber

at b

adan

(g)

Hari ke-

A

B

C

D

E

43

Berat badan mencit pada masa sebelum trasnplantasi, mengalami

perkembangan berat badan yang fluktuatif. Pada pengukuran hari ke-6 dan ke-9

rata-rata berat badan menurun, namun pada pengukuran berat badan hari ke-13

sampai hari ke-30 berat badan mecit mengalami peningkatan. Penurunan berat

badan yang terjadi disebabkan karena pengaruh adaptasi mencit terhadap pakan

yang diberikan, hal ini ditunjang oleh data delta berat badan yaitu selisih angka

rata-rata berat badan mencit pada pengukuran hari ke-30 dikurangi rata-rata berat

badan mencit pada pengukuran pertama, semua kelompok mencit percobaan

mengalami kenaikan berat badan. Rata-rata delta berat badan mencit pada awal

perlakuan kelompok A (1,30g), B (1,30g), C (1,80g), D (2,10g) dan E (2,10g)

secara lebih rinci dapat dilihat pada Lampiran 4.

Hasil analisis sidik ragam terhadap delta pertumbuhan berat badan

mencit pada masa sebelum transplantasi (Lampiran 6) menujukkan hasil yang

tidak beda nyata (p = 0,697). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian bubuk daun

cincau hijau tidak memberikan pengaruh terhadap kenaikan berat badan mencit,

hal ini dibuktikan dengan pertumbuhan mencit melalui pengukuran berat badan

yang diberi pakan dengan bubuk daun cincau hijau 0% yang merupakan

kelompok kontrol (mencit kelompok A dan B), maupun kelompok perlakuan yang

meliputi 0,88% (mencit kelompok C), 1,76% (mencit kelompok D) serta 2,64%

(mencit kelompok E) semua mengalami peningkatan berat badan pada awal

perlakuan. Hal ini menunjukkan bahwa penurunan dan kenaikan berat badan pada

pertumbuhan mencit C3H pada awal perlakuan merupakan hal yang normal dan

pada masa ini semua kelompok mencit belum dilakukan proses transplantasi sel

kanker.

Pertumbuhan mencit melalui pengukuran berat badan tersebut didukung

dengan hasil perhitungan jumlah konsumsi pakan. Rata-rata jumlah pakan yang

dikonsumsi mencit perlakuan kelompok C, D dan E secara berturut-turut adalah

1,77±0,21 g, 1,80±0,31 g dan 1,83±0,13 g dan mencit kontrol A dan B secara

berurutan adalah 2,24±0,28 g dan 1,78±0,19 g (Lampiran 7).

Jumlah konsumsi pakan tidak berbeda nyata dengan prosentasi bubuk

daun cincau hijau yang meningkat. Hasil uji sidik ragam terhadap jumlah

konsumsi pakan pada masa sebelum transplantasi tidak beda nyata antara

44

kelompok kontrol B dengan kelompok perlakuan C,D dan E. Pada kelompok A

konsumsi pakan paling besar yaitu sebesar 2,24±0,28 g (Lampiran 8) dibanding

kelompok lainnya namun jika diuji lebih lanjut menggunakan uji korelasi Pearson

antara delta kenaikan berat badan mencit pada masa sebelum transplantasi dan

rata-rata konsumsi pakan masa sebelum transplantasi tidak memiliki hubungan

yang signifikan dengan ditunjukkan oleh nilai p-value sebesar 0,386

(Lampiran 9). Hal ini menegaskan bahwa bubuk daun cincau yang ditambahkan

pada kelompok uji C, D dan E tidak mempengaruhi konsumsi pakan mencit

kelompok tersebut, karena tidak beda nyata dengan kelompok B dan A yang

diberi pakan standar tanpa penamhan bubuk daun cincau hijau.

Pada hari ke-31 dilakukan proses transplantasi sel kanker dari mencit

donor kepada mencit kelompok perlakuan (C,D dan E) dan kontrol positif (B),

pada masa ini tetap dilakukan monitoring perkembangan berat badan dua kali

dalam satu minggu.

Berat badan mencit secara umum mengalami peningkatan pada masa

setelah transplantasi sel kanker (Lampiran 10) karena pada masa ini terjadi

pertumbuhan jaringan kanker. Pengukuran berat badan berarti melakukan

pengukuran berat badan mencit ditambah dengan berat jaringan kanker. Hal ini

didukung dengan pernyataan Chalid (2003), yang menyatakan bahwa

pertambahan berat badan mencit diduga ditunjang oleh pertumbuhan jaringan

kanker yang juga membesar.

Rata-rata berat badan mencit pada pengukuran pada hari ke-31, yaitu hari

pertama setelah proses transplantasi meliputi mencit kelompok A sebesar

22,7+1,4 g , B (21,2+0,5g), C (22,5+0,5 g), D (22,0+0,4g) dan E (18,4+1,3g)

pada akhir perlakuan ini, sedangkan rata-rata delta berat badan mencit meliputi

mencit kelompok A (3,3 g), B (1,2g), C (1,3g), D (-1,3 g) dan E (2,5 g). Tanda

negatif pada nilai rata-rata delta menunjukkan terjadinya penurunan berat badan,

sedangkan tanda positif pada nilai rata-rata delta menunjukkan terjadinya

peningkatan berat badan.

Hasil uji sidik ragam pertumbuhan berat badan setelah transplantasi secara

detil dapat dilihat pada Lampiran 11. Mencit kelompok D memiliki berat badan

yang tidak berbeda nyata baik dengan kelompok kontrol negatif (A), kelompok

45

kontrol positif (B). Rata-rata berat badan mencit kelompok kontrol negatif (A),

dan kelompok kontrol positif (B) dan kelompok perlakuan D (1,76%)

secara berturut-turut adalah 22,731±1,40g, 22,220±0,50g dan 22,037±0,40g.

Pertumbuhan berat badan pada kelompok E adalah yang paling kecil yaitu

sebesar 18,429±1,3 g, dan berbeda nyata dengan keempat kelompok lainnya

Meskipun demikian jika dilihat dari perkembangan berat badan mencit

percobaan, dihitung dari delta kenaikan berat badan mencit pada masa setelah

transplantasi yaitu dengan cara menghitung selisih kenaikan berat badan mencit

pada akhir perlakuan dengan berat badan pada hari pertama setelah dilakukan

transplantasi, pada mencit kelompok D (1,76%) mengalami penurunan berat

badan sebesar 1,3 g sedangkan mencit kelompok lainnya mengalami kenaikan

berat badan. Kenaikan berat badan yang paling besar terjadi pada kelompok

kontrol negatif (A) yaitu sebesar 3,3 g. Kenaikan berat badan pada kelompok

kontrol negatif ini didukung dengan data konsumsi pakan pada kelompok A

setelah perlakuan sebesar 2,45±0,58 g merupakan rata-rata konsumsi pakan

mencit yang paling besar. Analisis sidik ragam dari rata-rata delta berat badan

mencit baik kelompok kontrol maupun kelompok perlakuan menunjukkan hasil

yang tidak berbeda nyata (p>0,05) tersaji pada Lampiran 12.

Konsumsi pakan mencit pada masa setelah transplantasi secara detil dapat

dilihat pada Lampiran 13. Rata-rata jumlah konsumsi pakan mencit kelompok

kontrol negatif (A) dan kontrol positif (B) berturut-turut adalah 2,45±0,58 g dan

1,66±0,25 g. Rata-rata jumlah konsumsi pakan pada mencit kelompok perlakuan

C, D dan E tidak berbeda nyata pada akhir perlakuan (Lampiran 14). Rata-rata

jumlah pakan yang dikonsumsi mencit kelompok C, D dan E secara berturut-turut

adalah 1,91±0,05 g, 1,83±0,23 g dan 1,91±0,21 g. Jumlah konsumsi pakan tidak

berbeda nyata dengan prosentase bubuk daun cincau hijau semakin meningkat.

Konsumsi pakan kelompok kontrol negatif (A) berbeda nyata dengan konsumsi

pakan kontrol positif (B) hal ini disebabkan karena pada masa ini kelompok B

sudah diberikan perlakuan transplantasi sedangkan kelompok A tidak. Perbedaan

inilah yang menyebabkan perbedaan konsumsi pakannya, walaupun pada kedua

kelompok tersebut sama-sama tidak diberikan bubuk daun cincau hijau pada

pakannya (0%). Hasil tersebut menunjukkan bahwa transplantasi sel kanker

46

memberikan pengaruh yang nyata terhadap jumlah konsumsi pakan dan

pertumbuhan mencit setelah transplantasi sel kanker. Hal ini ditunjang oleh hasil

uji korelasi antara delta berat badan akhir dan konsumsi pakan setelah

transplantasi (Lampiran 15) yang menunjukkan nilai p-value sebesar 0,023.

Terdapat korelasi positif dan signifikan antara delta berat badan setelah

transplantasi dan konsumsi pakan akhir.

Perbedaan delta berat badan mencit pada masa setelah transplantasi ini

kemungkinan disebabkan oleh interaksi antara metabolit sekunder yang

terkandung dalam cincau hijau dengan sel kanker yang di transplantasikan pada

mencit. Menurut Nahrstedt dan Butterweck (1997) kandungan metabolit sekunder

dari tumbuhan sangat bervariasi dalam jenis dan jumlahnya tergantung dari

lingkungan sekitar dimana tumbuhan itu hidup. Hasil uji fitokimia terhadap bubuk

daun cincau hijau dilakukan oleh Aryudhani (2011) yang menyatakan bahwa pada

bubuk daun cincau hijau P.oblongifolia Merr. memiliki hasil uji positif pada

alkaliod, saponin, fenol hidrokuinon, molisch, benedict dan tanin.

4. 2. 2. Masa Laten

Masa laten adalah waktu pertumbuhan kanker dari awal transplantasi

sampai jaringan kanker dapat diraba dengan menggunakan kepekaan tangan

(Liebelt & Liebelt 1967). Masa laten bisa berbeda-beda pada setiap individu.

Masa laten yang terdeteksi pada penelitian ini merupakan rata-rata dari waktu

pertama kali terasa munculnya benjolan jaringan kanker pada mencit dalam

hitungan hari. Perabaan untuk mengetahui munculnya benjolan tersebut mulai

dilakukan pada hari pertama setelah transplantasi sampai jaringan kenker dapat

diraba.

Masa laten jaringan kanker pada penelitian ini (Lampiran 18), sedangkan

hasil Analisis sidik ragam terhadap masa laten jaringan kanker pada semua

kelompok mencit tersaji pada Lampiran 19, hasil uji sidik menunjukkan hasil

yang tidak berbeda nyata (p>0,05), sebagaimana hasil penelitian yang dilakukan

Chalid (2003).

Masa laten pada kelompok B (kontrol positif) adalah 4,6 hari. Jaringan

kanker pada mencit dengan bubuk cincau hijau 0,88% (C) memiliki masa laten

47

5,4 hari, jaringan kanker pada mencit dengan bubuk cincau hijau 1,76% (D)

memiliki masa laten 4 hari, dan jaringan kanker pada kelompok mencit dengan

bubuk cincau hijau 2,64% (E) memiliki masa laten 4,8 hari. Hasil tersebut

menunjukkan bahwa walaupun secara uji statistik tidak beda nyata namun, secara

umum bubuk daun cincau hijau P. oblongifolia Merr. yang diberikan pada mencit

memiliki kemampuan menghambat munculnya pertumbuhan jaringan kanker pada

mencit. Mencit kelompok C (0,88%) dan E (2,64%) memiliki masa laten yang

lebih lama dari pada mencit kelompok kontrol positif (B), secara berturut-turut

masa laten nya adalah 5,4 hari, 4,8 hari dan 4,6 hari.

4. 2. 3. Volume Jaringan Kanker

Pertumbuhan jaringan kanker secara umum cenderung naik, kecuali pada

mencit kelompok E yang mengalami penurunan. Peningkatan pertumbuhan

jaringan kanker secara jelas terlihat pada mencit kelompok B (Gambar 10). Rata-

rata volume jaringan kanker secara berturut-turut dari mencit B, C, D, dan E

adalah 0,55±0,69 cm3, 0,21±0,11 cm3, 0,15±0,08 cm3 dan 0,20±0,06 cm3

(Lampiran 20). Hal ini sesuai dengan pernyataan Setiawati (2003), bahwa mencit

yang telah mengkonsumsi cincau tetap mengalami pertumbuhan pada jaringan

kankernya karena interaksi sel kanker di dalam tubuh sangat kompleks. Grafik

ukuran volume jaringan kanker disajikan pada Gambar 10.

= kel kontrol positif = kel 0,88 % = kel 1,76 % = kel 2,64%

Gambar 10. Grafik ukuran volume jaringan kanker menvit C3H yang diberi bubuk daun cincau hijau.

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,8

34 37 41 44 48 52

Volu

me

jarin

gan

kank

er (c

m3 )

Hari ke-

B

C

D

E

48

Gambar 10 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang cukup signifikan

pada pertumbuhan jaringan kanker antara mencit kelompok B dan mencit

kelompok perlakuan lain (C, D dan E). Volume jaringan kanker mencit B

meningkat secara signifikan pada 11 hari setelah tranplantasi sel kanker. Hal ini

sesuai dengan pernyataan Pranoto (2003), bahwa sel kanker yang

ditransplantasikan dari mencit donor sudah berada dalam tahap propagasi atau

mungkin metastasis. Pada tahap tersebut sel kanker bisa beredar ke seluruh tubuh

melalui pembuluh darah maupun limfatik sehingga sulit untuk dicegah. Walaupun

hasil analisis sidik ragam menunjukkan bahwa pertambahan volume jaringan

kanker pada mencit kontrol (B) dan perlakuan C, D dan E tidak berbeda nyata

(p>0,05) (Lampiran 21), namun jika dilihat dari data pengukuran volume jaringan

kanker (Lampiran 20) terlihat bahwa kelompok B memiliki volume jaringan

kanker dua kali lipat lebih besar jika dibandingkan dengan kelompok perlakuan C,

D dan E.

Ukuran volume jaringan kanker pada penelitian ini menunjukkan adanya

kemungkinan pengaruh konsumsi bubuk daun cincau hijau dalam menghambat

pertambahan volume jaringan kanker pada mencit perlakuan, sehingga diduga

bubuk daun cincau hijau mengandung senyawa atau komponen yang mampu

mengganggu pertumbuhan jaringan kanker yang dapat menghambat pertambahan

volume jaringan kanker. Sejalan dengan Chalid (2003) yang menyatakan bahwa

pemberian cincau hijau pada pakan mampu menekan pertumbuhan jaringan

kanker. Selain itu Pranoto (2003) melaporkan bahwa cincau hijau mampu

meningkatkan jumlah limfosit T dan B serta memiliki daya sitotoksik yang baik.

Komponen atau senyawa kimia seperti antioksidan, termasuk senyawa

fitokimia pada tanaman, menunjukkan kemampuan selektif dalam hal membunuh

sel kanker dengan cara apoptosis, serta mengambat angiogenesis tumor dan

metastasis (Borek 2004). Alkaloid yang terdapat pada tomat, baik hijau maupun

merah, menunjukkan kemampuan untuk menghambat pertumbuhan sel kanker.

Ekstrak tomat hijau aktif melawan semua galur sel kanker dan lebih mampu

menghambat sel kanker dibandingkan tomat merah. Komponen alkaloid yang

diduga bertanggung jawab dalam efek antikarsinogenik adalah glikoalkaloid, yang

memiliki mekanisme antikanker berbeda dengan likopen pada tomat

49

(Friedman et al. 2009). Reaksi biokimia kompleks juga berperan mempengaruhi

metabolisme seperti enzim pencernaan, senyawa pembawa untuk absorbsi, sistem

transportasi, dan gangguan metabolisme pada penderita kanker (Almatsier 2001).

Penjelasan tersebut menunjukkan bahwa adanya senyawa atau komponen yang

mampu mengganggu pertumbuhan jaringan kanker dapat menghambat

pertambahan volume jaringan kanker.

4. 2. 4. Berat Jaringan Kanker

Data berat jaringan kanker diperoleh pada akhir penelitian (pada akhir

masa pemeliharaan mencit) melalui proses terminasi mencit. Berat jaringan

kanker mencit kelompok B, C, D dan E secara berturut-turut adalah 0,87±0,81 g,

1,17±0,12 g, 0,15±0,09 g dan 0,27±0,28 g (Lampiran 22). Analisa sidik ragam

berat jaringan kanker secara lengkap tersaji pada Lampiran 23, hasil uji sidik

ragam menyatakan beda nyata antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.

Grafik berat jaringan kanker mencit disajikan pada Gambar 11.

Kelompok Mencit

Keterangan : A= kelompok kontrol negatif; B= kelompok kontrol positif; C= kelompok 0,88% cincau hijau; D= kelompok 1,76% cincau hijau; E= kelompok 2,64% cincau hijau.

Gambar 11. Grafik berat jaringan kanker mencit C3H.

Berat jaringan kanker pada kelompok perlakuan D dan E yang diberikan

prosentase bubuk daun cincau hijau meningkat secara berturut-turut 1,76% dan

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

B C D E

Bera

tjar

inga

nka

nker

(g)

50

2,64% menunjukkan berat jaringan kanker yang beda nyata dengan berat jaringan

kanker kelompok B (0%) dan C (0,88%).

Pada kelompok mencit yang diberikan bubuk cincau hijau pada pakan

sebanyak 0,88% belum bisa memberikan daya hambat yang signifikan terhadap

perkembangan jaringan kanker, hal ini didukung oleh hasil analisa sidik ragam

yang menyatakan bahwa tidak beda antara berat jaringan kanker kelompok mencit

C dan berat jaringan kanker kelompok mencit B. Daya hambat pertumbuhan

jaringan kanker secara nyata terjadi pada mencit yang diberikan bubuk daun

cincau hijau 1,76% (D) dan 2,64% (E). Hal tersebut menunjukkan bahwa telah

terjadi aktivitas penghambatan pertumbuhan jaringan kanker dengan prosentase

bubuk daun cincau yang digunakan.

4. 2. 5. Gambarn Histopatologis Jaringan Kanker Menggunakan Pewarnaan HE

Penentuan derajat diferensiasi jaringan kanker hasil pewarnaan HE

meliputi kepadatan sel tumot, tingkat mitosis sel dan tingkat pleomorfisme sel.

Profil umum jaringan kanker mencit C3H dianalisa menggunakan pewarnaan

hematoksilin eosin (HE) kemudian, diberi skor dan secara rinci disajikan pada

Tabel 4. Berikut ini merupakan keterangan terhadap skor yang diberikan pada

hasil pewarnaan HE :

Tabel 4 Rincian hasil pewarnaan HE jaringan kanker mencit C3H

Kelompok Mencit

Jumlah lapang

pandang

Derajat diferensiasi Skor

rata-rata

kepadatan sel tumor

rata-rata pleomorfisme

inti sel

rata-rata tingkat mitosis sel

B (5) 5 2,5 1,8 2

6,3 Stdev 0,469 0,374 0,616

C (5) 5 1,6 1,6 1,6

4,8 Stdev 0,316 0,268 0,409

D(5)

5 1,4 1,5 1,4 4,3

Stdev 0,414 0,219 0,296

E(5) 5 1,4 1,3 1,3

4 Stdev 0,296 0,279 0,228

Hasil pewarnaan HE dinilai dengan cara memberikan skor berupa angka

terhadap jaringan kanker berdasarkan derajat diferensiasi (Elston & Ellis 1991).

51

Diferensiasi pada sel kanker menunjukkan seberapa banyak kemiripan sel kanker

dengan sel asal yang normal, baik dalam hal morfologi maupun fungsi sel.

Diferensiasi pada sel kanker menunjukkan semakin tidak berdiferensiasi (beda

dengan sel asal) maka akan semakin mendekati keganasan. Sel yang tidak

berdiferensasi disebut dengan anaplasia. Perbedaan bentuk sel (pleomorfis) bisa

diamati dari hiperkromatik dimana sel akan berwarna lebih gelap dari sel normal,

bentuk dan ukuran inti sel tidak teratur, dan terjadi banyak mitosis.

Pada penelitian ini derajat diferensiasi menggunakan tiga parameter

meliputi kepadatan sel, pleomorfisme dan mitosis. Contoh hasil pewarnaan HE

pada kelompok B tersaji pada Gambar 12.

Gambar 12. Contoh hasil pewarnaan HE jaringan kanker mencit C3H perbesaran 200 kali.

Kelompok kontrol positif Kelompok 0,88% cincau hijau

Kelompok 1,76% cincau hijau

Kelompok 2,64% cincau hijau

B C

D E

52

Hasil analisa uji sidik ragam pada pewarnaan HE untuk setiap kelompok

mencit perlakuan menunjukkan hasil bahwa kepadatan sel kanker pada kelompok

kontrol positif (B) berbeda nyata dengan kelompok perlakuan lainnya yaitu C,D

dan E. Nilai rata-rata setiap kelompok adalah sebagai berikut : B (2,5±0,5),

C (1,6±0,3), D (1,4±0,14) dan E (1,5±1,22). Hal ini menunjukkan bahwa pada

jaringan kanker kelompok B merupakan jaringan kanker yang solid dan padat, hal

ini merupakan salah satu indikasi keganasan pada kanker. Hal ini diperkuat

dengan hasil skor pleomorfisme atau variasi nyata dalam bentuk maupun ukuran

sel, walaupun hasil uji sidik ragam tidak berbeda nyata namun skor pleomorfisme

kelompok kontrol positif (B) paling tinggi yaitu 1,8±0,4 dibandingkan kelompok

perlakuan C, D dan E. Keganasan pada kanker juga dapat dilihat dari banyaknya

pembelahan sel (mitosis). Prosentase bubuk daun cincau hijau pada pakan mencit

tidak berpengaruh nyata terhadap skor mitosis HE pada mencit, namun mitosis

terjadi lebih banyak pada kelompok B ditunjukkan dengan skor mitosis paling

tinggi yaitu 2±0,6 dibandingkan dengan kelompok C, D dan E.

Skor derajat diferensiasi pada jaringan kanker mencit kelompok B adalah

6,3 dimana skor tersebut termasuk dalam kelompok diferensiasi sedang. Pada

kelompok perlakuan (C, D dan E) memiliki skor derajat diferensiasi yang

termasuk dalam kelompok berdiferensiasi baik (nilai derajat diferensiasi 3-5)

dengan tren semakin menurun. Skor derajat diferensiasi pada kelompok perlakuan

secara berturut-turut adalah sebagai berikut, skor derajat diferensiasi untuk

kelompok C adalah 4,8, kelompok D adalah 4,3 dan kelompok E adalah 4. Hal ini

menunjukkan bahwa bertambahnya prosentase bubuk daun cincau hijau yang

ditambahkan pada pakan memiliki korelasi positif skor derajat diferensiasi

jaringan kanker.

Pada kelompok B dimana skor derajat diferensiasi termasuk dalam

kelompok sedang, ditandai dengan kepadatan sel kanker yang tinggi dan

pleomorfime sedang ke buruk karena ukuran dan bentuk sel tidak beraturan, serta

teridentifikasi banyak terjadi mitosis. Persentase bubuk daun cincau hijau yang

ditambahkan pada pakan mencit mampu mempertahankan derajat diferensiasi

pada kelompok D dan E lebih baik dibanding kelompok kontrol postif (B) dan

kelompok C.

53

4. 2. 6. Gambaran Histopatologis Jaringan Kanker Menggunakan Pewarnaan IHK

Untuk analisa IHK digunakan empat jenis antibodi primer yaitu

antiphospho-JNK 1/2, antikaspase-7, anti-COX-2, dan antiphospho-ERK 1/2,

namun tidak semua jaringan mencit digunakan hanya sediaan jaringan kanker

yang memiliki berat paling kecil dan yang paling besar pada setiap kelompok

perlakuan. Data hasil uji IHK dianalisa secara deskriptif.

Perubahan histopatologi yang terlihat pada jaringan berdasarkan

pewarnaan IHK dikelompokkan berdasarkan warna coklat DAB yang tersekpresi

pada setiap bidang pandang. Warna coklat DAB dihitung berdasarkan analisis

semikuantitatif. Hal ini dilakukan dengan memberikan skor terhadap tingkat

kepekatan warna coklat pada area yang terbentuk (Esteva et al. 2004). Skor

tersebut meliputi 0 (tidak terdapat area berwarna coklat, 0%), 1= <10% sel yang

positif, 2=10-50% sel yang positif, 3=> 50% sel positif. Data hasil uji IHK

dianalisa secara deskriptif. Data hasil uji IHK tersaji pada Tabel 5.

Tabel 5. Profil hasil analisa IHK jaringan kanker mencit C3H

Kelompok

mencit

Berat

tumor

(g)

Rata-rata skor

JNK ½ Kaspase-7 COX-2 ERK 1/2

B 1 0,10 0,00+0,00 1,29+0,49 1,20+0,35 1,60+0,70

2 2,15 0,00+0,00 1,71+1,25 1,53+ 0,24 1,88+0,62

C 1 1,17 1,00+0,29 0,57+0,54 1,30+0 2,20+0,79 ,52

2 1,19 0,00+0,00 1,80+0,45 1,82+0,32 1,07+0,78

D 1 0,06 1,00+0 1,00,28 +0 0,00+0,00 ,55 1,00+0,00

2 0,29 1,50+0 2,50,33 +0 0,38,18 +0 1,00+0,00 ,06

E 1 0,09 0,00+0,00 1,83+0,98 0,44+0,07 1,33+0

2

,58

0,77 0,00+0,00 1,17+0,75 0,38+0,04 1,38+0,92

Pengujian ekspresi kaspase-7 bertujuan untuk melihat ekspresi protein

penanda proapoptosis sebagai indikasi terjadinya apoptosis pada sel kanker yang

dipicu oleh bubuk daun cincau hijau. Hasil pengukuran IHK pada sediaan

menggunakan antibodi antikaspase-7 dan antiphospho-JNK 1/2 sebagai protein

penanda proapoptosis pada sediaan kelompok D memiliki skor 1,25 ±0,33 untuk

54

kaspase-7 dan 1,25 ±0,36 untuk JNK 1/2. Skor IHK penanda proapotosis pada

kelompok D merupakan yang paling baik karena kombinasi lainnya tidak sebaik

hasil yang diperoleh pada kelompok D. Hal ini membuktikan bahwa bubuk daun

cincau hijau berpotensi sebagai pangan dengan aktivitas antikanker yang dapat

memicu terjadinya apotosis melalui aktivasi kaspase-7.

Keberadaan ERK 1/2 pada jaringan kanker menunjukkan bahwa telah

terjadi proses fosforilasi. Proses fosforilasi memiliki dua peran penting yaitu

sebagai molekul pemulai atau penghenti suatu kaskade seluler dan sebagai

pengikat antara dua protein. Oleh karena itu, kinase berperan penting pada sistem

sinyal penghantar informasi antar dan di dalam sel. Gangguan ekspresi kedua

enzim ini berperan dalam pembentukan kanker dan penyakit proliferasi lain. Hal

ini diperkuat dengan laporan Takekawa et al. (2011) yang menyatakan bahwa

jalur MAPK p44/42 (ERK1/2) merupakan kelompok protein kinase serin/treonin

yang terlibat dalam program seluler seperti proliferasi, diferensiasi, motilitas dan

kematian. Pada penelitian ini ekspresi protein kinase ERK 1/2 tidak beda nyata

pada setiap kelompok, rata-rata memiliki skor 1 yang artinya hanya terdapat

<20% sel yang mengespresikan warna coklat sebagai gambaran ekspresi ERK 1/2.

Hasil ekspresi ERK 1/2 yang rendah seiring dengan ekspresi COX-2 yang rendah,

hanya pada kelompok B dan C terekpresi < 20% dengan skor rata-rata 1,

sedangkan pada kelompok D dan E ekspresi COX-2 sedikit sekali.

Penghambatan perkembangan jaringan kanker oleh bubuk daun cincau

hijau kemungkinan besar disebabkan oleh kandungan komponen biokatif yang

dimiliki cincau seperti alkaloid yang bekerja menekan perumbuhan sel kanker

dengan cara menginduksi apotosis yang terbukti dengan ekspresi kaspase-7 dan

menghambat proliferasi sel kanker dengan ekspresi ERK 1/2 dan COX-2 tidak

terekpresi dengan baik pada kelompok D dan E.

Pewarnaan IHK memiliki menuntut kualitas yang tinggi untuk reagen

yang digunakan, yakni dimulai dari saat pengambilan sampel, perlakuan sampel

pada saat dibuat blok hingga saat dilakukan pengujian. Beberapa sampel yang

dilalukan pewarrnaan menggunakan HE secara histopatologis mempunyai lesi

yang mengarah pada lesi kanker, namun penanda apoptosis dan proliferasi

menggunakan metode pewarnaan imunohistokimia menunjukan hasil negatif.

55

Kemungkinan antigen pada sediaan mencit perlakuan sudah mengalami degradasi

protein sehingga antibodi primer yang digunakan tidak bisa mengenali protein

target pada sediaan dan dimungkinkan terjadi false positif. Walaupun pada

beberapa bagian terlihat ekspresi warna coklat sebagai manifestasi dari warna

DAB namun secara keseluruhan belum dapat dikatakan positif.

5. SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan

Pada pengujian aktivitas bubuk daun cincau hikau P.oblongifolia Merr.

secara in vivo, maka dapat disimpulkan bahwa bubuk daun cincau hijau

P.oblongifolia Merr. memiliki aktivitas penghambatan pekembangan jaringan

kanker payudara pada mencit C3H yang ditrasnplantasi sel kanker MMTV. Hal

ini dibuktikan dengan data berat jaringan kanker pada kelompok perlakuan lebih

kecil dari kelompok kontrol yang tidak diberi bubuk daun cincau hijau pada

pakannya. Hasil pewarnaan HE menyatakan bahwa mencit kelompok perlakuan D

dan E memiliki profil diferensiasi yang lebih baik dibanding kelompok B dan C.

Selanjutnya, skor IHK untuk penanda apoptosis pada tahap awal yang

menggunakan JNK 1/2 dan kaspase-7 sebagai protein penanda proapoptosis

memiliki hasil negatif. Walaupun penanda proapoptosis pada sampel dapat

mengespresikan JNK 1/2 dan kaspase-7 terdapat ekspresi perubahan warna coklat

sebagai manifestasi warna DAB namun intensitas warna yang terbentuk belum

cukup kuat sehingga belum dapat dikatakan hasilnya positif.

Begitu juga dengan penanda antiapoptosis yang menggunakan penanda

antiapoptosis yaitu ERK 1/2 dan COX-2 menghasilkan warna coklat namun

belum terkspresi dengan kontras dan nyata, sehingga belum dapat dikatakan

positif. Dengan demikian hendaknya penelitian secara in vivo dapat diulang

dengan parameter yang lebih spesifik.

5. 2. Saran

Saran yang dapat disajikan dari penelitian ini adalah perlu dilakukan

penelitian lebih lanjut dengan menggunakan parameter protein penanda yang

berbeda dan lebih spesifik sebagai penanda antikanker pada jaringan kanker

dengan teknik pengerjaan yang lebih kuantitatif.

DAFTAR PUSTAKA

[AIN] American Institute of Nutrition. 1976. Report of the American Institute of

Nutrition ad-hoc committe for nutrition studies. J Nutr 107:1340-1348.

Alberts B, Johnson A, Lewis J et al. Molecular Biology of the Cell. 2002. 4th edition. New York: Garland Science; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26869/#A3181

Almatsier S. 2001. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka

Utama.

Anand P, Kunnumakara AB, Sundaram C, Harikumar KB, Tharakan ST, Lai OS, Sung B, Aggarwal BB. 2008. Cancer is a Preventable Disease that Recquires Major Lifestyle Changes. Pharm Res 25(9): 2097-2116.

Ananta E. 2000. Pengaruh ekstrak cincau hijau (Cyclea barbata L. Miers.)

terhadap proliferasi alur sel kanker K-562 dan Hela [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Arisudana IG. 2003. Mempelajari toksisitas subkronis bubuk gel daun cincau

hijau (Cylcea barbata L. Miers dan Premna oblongifolia Merr.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Aryudhani N. 2011. Mekanisme Aktivitas Antitumor Bubuk Daun Cincau Hijau

(Premna oblongofolia Merr.) Pada Mencit C3H yang ditransplantasi sel tumor payudara. [tesis]. Bogor : Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Bakhle YS. 2001. COX-2 and Cancer : a New Approach to an Old Problem. Brit

J Pharmacol 134:1137-1150. Borek C. 2004. Dietary antioxidants and human cancer. Integr Canc Ther 3(4):

333-341

Brandi G et al. 2004. Mechanisms of Action and Antiproliferative Properties of Brassica oleracea Juice in Human Breast Cancer Cell Lines. J Nutr 135:1503-1509.

Brandon EP, Idzerda RL, McKnight GS.1997. PKA isoforms, neural pathways,

and behaviour: making the connection. Curr Opin Neurol 7:397-403. Busch H, 1967. Methods In Cancer Research. Vol 1. Academic Press. New York

London. hlm143-226.

http://www.garlandscience.com/textbooks/0815341059.asp�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26869/#A3181�

60

Cao Y, Prescott SM. 2002. Many action of cyclooxigenase-2 in cellular dynamics and in cancer. J Cellular Physio 190 (3):279-286.

Chalid SY. 2003. Pengaruh ekstrak daun cincau hijau Cyclea barbata L. Miers dan Premna oblongifolia Merr. terhadap aktivitas enzim antioksidan dan pertumbuhan tumor kelenjar susu mencit C3H [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Coletta RD et al. 2004. The six1 homeoprotein stimulates tumorgenesis by reactivation of cyclin A1. Proceeding of the National academy of Science 101(17):6478-6483.

Damayanti R, Indriani A,Wiyono, Adjid A.2005. Monitorin Kasus Penyakit Avian Influenza Berdasarkan Deteksi Antigen Virus Subtipe H5N1 secara Imunohistokimiawi.Balai Penelitian Veteriner.Bogor. 2:25-31.

De Padua LS, Banyapraphatsara N. 1999. PROSEA Plant Resources of South East Asia-12 (1) Medicinal and Poisonous Plants 1. Backuys Publisher, Leiden, the Netherlands. hlm 221-223.

Elmore S. 2007. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicol Pathol 35:495-516.

Elston CW, Ellis IO. 1991. Pathological pronostic factor in breast cancer I. The

value of histopathological grade in breast cancer:experience from a large study with longterm follow up. Histopathology 19:403-410.

Esteva F J et al. 2004. Prognostic significance of phosphorylated p38 mitogen

activated protein kinase and HER-2 expression in lymph node-positive breast carcinoma. .Am Cancer Society 100(3):499-505.

Fantozzi A, Gerhard C. 2006. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res 8:212.

Farina HG, Pomies M, Alonso DF, Gomez DE. 2006. Antitumor and antiangiogenic activity of soy isoflavone genistein in mouse models of melanoma and breast cancer. Oncol Rep 16:885-891.

Friedman M, Levin CE, Lee SU, Kim HJ, Lee IS, Byun JO, Kozukue N. 2009.

Tomatine-containing green tomato extracts inhibit growth of human breast, colon, liver, and stomach cancer cells. J Agric Food Chem 57:5727-5733.

Gewies A. 2003. Introduction to Apoptosis. ApoReview. http:// www.celldeath.de/encyclo/aporev/aporev.htm (diakses 3 Augustus 2011)

61

Golberg I. 1994. Functional Foods, Designer foods, Pharmafoods, Nutraceutical. Newyork: Chapmal and Hall,Inc.

Hejmadi M.2010. Introduction to cancer biology. Ventus Publishing ApS. ISBN

978-87-761-47-6.http://grammars.grlmc.com/wsmbio2012/Download/Slides/Xu/introduction-to-cancer-biology.pdf

Hendriyani D. 2003. Kajian bioaviabilitas klorofil daun cincau hijau (Cyclea

barbata L.Mier) pada hati dan plasma tikus (Rattus norvegicus).[skipsi].Bogor:Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Hodgson E, Levi PE. 2000. A textbook of modern toxicology. MacGrew Hill,

Singapore. Howe LR, Dannenberg AJ. 2003. COX-2 inhibitors for the prevention of breast

cancer. J Mammary Gland Biol 8:31-43.

Hu K, Yu C, Mineyama Y, McCracken JD, Hillebrand DJ, Hasan M. 2003. Inhibited proliferation of cyclooxygenase-2 expressing human hepatoma cells by NS-398, a selective COX-2 inhibitor. Int J Oncol 22:757-763.

Huang THM, Manel E. 2010. Chromatin Remodelling in Mammary Gland

Differentiation and Breast Tumorgenesis.Cold Spring Harb Sym (2): 415-420.

Imajo M, Tsuchiya Y, Nishida E. 2006. Regulatory mechanisms and functions of

MAP kinase signaling pathways. IUBMB Life 58(5):312-317. Jacobus A. 2003. Pengaruh konsumsi bubuk gel daun cincau hijau Cyclea

barbata L. Miers dan Premna oblongifolia Merr. terhadap kadar β-carotene dalam hati tikus percobaan [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

James JJ, Mukhtar H. 2007. Curcumin for chemoprevention of colon cancer.

Letter 255:170-181. Jiang J, Hu C. 2009. Evodiamine: A Novel Anti-Cancer Alkaloid from Evodia

rutaecarpa. Molecules 14:1852-1859. Junqueira LC. 2007. Persiapan jaringan untuk pemeriksaan mikroskopik. Edisi 10.

Histology Dasar: teks dan atlas. Jakarta : EGC. hlm 3 – 5.

Juuti A, Louhimo J, Nordling S, Ristimaki A, Haglund C. 2006. Cyclooxygenase2 expression correlates with poor prognosis in pancreatic cancer. J Clin Pathol 59:382-386.

http://grammars.grlmc.com/wsmbio2012/Download/Slides/Xu/introduction-to-cancer-biology.pdf�



62

Karmakar UK, Pramanik S, Sadhu SK, Shill MC, Biswas SK. 2011. Assessment of analgesic and antibacterial activity of Premna Integrifolia Linn (Family : Verbenaceae) Leaves. IJPSR 2(6):1430-1435.

Koessitoresmi A. 2002. Kapasitas antioksidan ekstrak batang dan daun cincau

hijau Cyclea barbata L.Mier pada sel limfosit manusia secara in vitro. [skripsi].Bogor:Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Koki AT, Masferrer JL. 2002. Celecoxib: A Specific COX-2 Inhibitor with Anti

Cancer Properties. Cancer Control 9(2):28-35. Kujubu DA, Fletcher BS, Varnum BC, Lim RW, Herschmen HR. 1991. TIS10, a

phorbol ester tumor promoter-inducible mRNA from Swiss 3T3 cells, encodes a novel prostaglandin synthase/cyclo-oxygenase homologue. J Biol Chem 266:12866-12872.

Kumar V, Cotran RZ, Robbins SL. 1997. Basic Pathology. Ed-6. Philadelphia

London Newyork : W.B.Saunders Company. Kundu N, Yang Q, Dorsey R, Fulton AM. 2001. Increased cyclooxygenase-2

expression and activity in a murine model of metastatic breast cancer. Int J Cancer 93:681–686.

Kusharto C M, Tanziha I, Januwati M. 2008. Produk ekstrak klorofil dari berbagai daun tanaman untuk meningkatkan respon imun dan aplikasinya sebagai antiaterosklerosis [laporan penelitian]. Bogor: Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat (LPPM), Institut Pertanian Bogor.

Lane TF, Hla T. 2001. Overexpression of cyclooxygenase-2 is sufficient to induce

tumorigenesis in transgenic mice. J Biol Chem 276:18563–18569.

Leeson CR, Leeson TS, Paparo AA. Buku Ajar Histologi.1996. Ed-6. Jakarta:EGC.

Liebelt AG, Liebelt RA.1967. Transplantation of Tumor. Dalam Methode in Cancer Research. Vol-I:160-197. Academic Press. New York.London.

Lin HY et al. 2009.The pro-apoptotic action of stilbene-induced COX-2 in cancer cells Convergence with the anti-apoptotic effect of thyroid hormone. Cell Cycle 8(12):1877-1882.

Liu X, Rose D. 1996. Differential expression and regulation of cyclooxygenase-1 and -2 in two human breast cancer cell lines. Cancer Res 56:5125–5127.

McCubrey JA et al. 2007. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochim Biophys Acta 1773:1263-1284.

63

Meiyanto E, Susidarti EA, Handayani S, Rahmini F. 2008. Ekstrak etanolik biji buah pinang (Areca catechu L.) mampu menghambat proliferasi dan memicu apoptosis sel MCF-7. Farmasi Indonesia 19(1):12-19.

Moore BC, Simmons DL. 2000. Cox-2 Inhibition, Apoptosis, and

Chemoprevention by Nonsteroidal Anti-inflamatory Drugs. Curr Med Chem 7:1131-1144.

Nakamura S et al. 2004. COX-2 independent induction of apotosis by etodolac in

leukemia cells in vitro and growth inhibition of leukemia cells in vivo. Cancer Ther 2:153-166.

Nugraheni D. 2003. Pengaruh seduhan teh cincau cijau Cyclea barbata L.Mier

dan Premna oblongifolia Merr. terhadap kadar sitokrom P-420 dan aktivitas glutation S-transferase dari hati mencit C3H [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Nugroho HA. 2009. Pengaruh pemberian teh hijau terhadap ekspresi perforin dan

indekspoptosis adenokarsinoma mamma mencit C3H. [Tesis]. Pasca Sarjana.Magister Ilmu Biomedik dan Program Pendidikan Dokter Spesialis-I Ilmu Bedah, Universitas Diponegoro, Semarang.

Nurdin SU, Zuidar S, Suharyono. 2005. Dried extract from green cincau leaves as

potential fiber sources for food enrichment. African Crop Science Conference Proceedings 7:655-658.

Otto SE. 2003. Buku Saku Kepeerawatan Onkologi, Alih bahasa : Jane Freyana

Budi,S.Kep,MappSc. EGC. Jakarta. hlm 3-19. Pinzon LC, Mylene M, Sze KH, Wang M, Chu IK. 2011. Isolation and

characterization of antimicrobial, anti-inflamatory and chemopreventive flafones from Premna odorata Blanco. J Med Plant Res 5(13):2729-2735.

Pranoto BA. 2003. Aktivitas antitumor dan imunomodulator dari produk cincau

hujai Cyclea barbata L.Mier dan Premna oblingifolia Merr. terhadap pertumbuhan tumor kelenjar susu mencit C3H [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana Institu Pertanian Bogor.

Raharjo PC. 2004. Ketersediaan hayati flavonoid bubuk gel daun cincau hijau

(Cyclea barbata L.Miers) pada hati dan plasma darah tikus (Rattus norvegicus) yang diberi diet dengan atau tanpa vitamin A.[skripsi].Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Robinson G, Ellis IO, MacLennan KA. 1990. Immunocytochemistry dalam

Theory and Practise of Histological Techniques. 3rd Ed. Edinburgh London Melbourne and Newyork : Churcill Livingstone. hlm 413-428.

64

Roux PP.2004. ERK ang p38 MAPK-Activated ProteinKinases : a Family of Protein Kinases with Diverse Biological Functions. Microb and Mol Biol Rev 1:320-344.

Saxena S, Pant N Jain DC, Bhakuni. 2003. Antimalarial agents from plant

sources.Curr Sci 8(9):1312-1329. Setiawati R. 2003. Pengaruh produk daun cincau hijau Cyclea barbata L. Miers

dan Premna oblongifolia Merr terhadap kapasitas antioksidan limfosit mencit C3H bertumor kelenjar susu [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Singh B, Berry JA, Shoher A, Ayers GD, Wei C, Lucci A. 2007. COX-2

involvement in breast cancer metastasis to bone. Oncogene 26:3789–3796.

Siregar IM, Miladiyah I. 2011. Protective effect of Cyclea barbata Miers leaves against aspirin-induced gastric ulcer in mice. Universa Medicina 30(2):88-94.

Sosef MSM, Hong LT. 1989. PROSEA Plants Resources of South East Asia-5

(3) Timber trees: lesser-known timbers. Backhys publisher, Netherland. hlm 470-472.

Stevens A, Bancroft JD. 1990. Theory and Practise of Histological Techniques.

Ed-3. Churchill Livingstone Edinburgh London.

Suryanto T. 2007. Pengaruh pemberian ekstrak phaleria macrocarpa terhadap indeks apoptosis sel adenokarsinoma mamma dan perkembangan massa tumor payudara mencit C3H. [Tesis]. Pasca Sarjana.Magister Ilmu Biomedik dan Program Pendidikan Dokter Spesialis I Ilmu Bedah, UNDIP Semarang.

Takekawa M, Kubota Y, Nakamura T, Ichikawa K .2011. Regulation of stress-

activated Map Kinase Pathway During cell fate decisions. Nagoya J Med Sci 73:1-14.

Vermeulen K, Dirk R. Van Bockstaele., Zwi N. Berneman. 2003. The cell cycle: a

review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferat 36:131-149.

Wada T, Penninger JM. 2004. Mitogen-activated protein kinases in apoptosis

regulation. Oncogen 23:2838-2949.

65

WCRF/AICR. 2008. The World Cancer Reseach Fund & The American Institute of Cancer Research. Food, nutrition, physical activity and prevention of cancer: A global perspective. The American Institute of Cancer Research, Washington.

[WHO] World Health Organization. 2008. The Scene for a Global Approach to

Health Equity. Switzerland: WHO Press. Wendum D, Masliah J, Trugnan G, Flejou JF. 2004. Cyclooxygenase-2 and its

Roe in Colorectal Cancer Development. Virchows Arch 445:327-333. Widyanto R. 2010. Pengaruh pemberian bubuk daun cincau hijau (Premna

oblongifolia Merr) terhadap gambaran histopatologis jaringan hati mencit C3H yang ditransplantasi sel tumor kelenjar susu. [sripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Wijayakusuma MH. 2005. Atasi Kanker dengan Tanaman Obat. Jakarta:

PuspaSwara. Winarti C, Nurdjanah N. 2005. Peluang tanaman rempah dan obat sebagai sumber

pangan fungsional. Jurnal Litbang Pertanian 24(2):47-55. Yadav BD. 2011. Studi of new curcumin analogs for the treatment of Erα negatif

breast cancers. [Thesis]. Otago University, Dunedin. New Zealand. Yamaki et al. 2004.Prostaglandin E2 activities Src signaling in lung

adenocarsinoma cell via EP3. Cancer Lett 214(1):114-120 Zakaria FR. 2001. Pangan dan pencegahan kanker. J Teknol dan Industri Pangan

12(2):171-177. Zhou JY, Liu Y, Wu GS. 2006. The Role of Mitogen-Activated Protein Kinase

Phosphatase-1 in Oxidative Damage–Induced Cell Death. Cancer Res 66:4888-4894.

95 mpiran 31. Contoh hasil pewarnaan dan skoring IHK

Kel ERK 1/2 Skor COX-2 Skor B1

1

2

B2

0

1

C1

0

2

C2

1

2

96

D1

0

1

D2

2

3

E1

0

0

E2

0

1

97

Sediaan JNK 1/2 Skor Caspase-7 Skor

1

2

B2

0

0

C1

0

2

C2

0

1

98

D1

0

0

D2

0

2

E1

0

0

E2

1

1

67

LAMPIRAN

Lampiran 1. Diagram alir proses pembuatan bubuk daun cincau hijau

(Chalid 2003)

daun cincau hijau segar

buang tangkai daun

cuci bersih dengan air

tiriskan

timbang 200 g

disobek-sobek

dimasukkan ke dalam blender

ditambahkan air dengan perbandingan 1:3 (600 ml)

Dibekukan (frezer)

dikeringkan dengan drum dryer

bubuk daun cincau hijau kasar

dihaluskan dengan blender kering

bubuk daun cincau hijau siap digunakan sbg campuran pakan

68

Lampiran 2. Uji Normalitas Berat mencit sebelum transplantasi

Bbawal

Perc

ent

3025201510

99.9

99

9590

80706050403020

10

5

1

0.1

Mean

>0.150

19.66StDev 2.781N 225KS 0.048P-Value

Probability Plot of BbawalNormal

Lampiran 3. Uji Homogenitas Berat mencit sebelum transplantasi

peng

ukur

an-k

e

95% Bonferroni Confidence Intervals for StDevs

9

8

7

6

5

4

3

2

1

5.04.54.03.53.02.52.01.5

Bartlett's Test

0.808

Test Statistic 4.51P-Value 0.809

Levene's Test

Test Statistic 0.56P-Value

Test for Equal Variances for Bbawal

69

Lampiran 4.Tabel berat badan mencit pada masa sebelum transplantasi (g)

Kelp berat tiap ulangan (g) rata-rata berat tiap

ulangan (g) rata-rata

Kelp Delta berat

badan stdev 1 2 3 4 5

A

18,1 20,8 20,0 19,8 19,8 19,7

19,6 1,3 1,7

17,5 18,4 18,6 17,6 17,0 17,8 17,8 17,3 20,3 16,1 15,7 17,4 18,5 18,9 20,0 14,9 14,3 17,3 17,5 19,4 19,8 20,5 19,1 19,3 19,5 21,1 21,6 20,7 19,8 20,5 20,0 21,6 22,4 21,8 21,0 21,4 19,9 22,0 22,1 22,7 21,4 21,6 19,9 21,7 21,5 21,4 20,7 21,0

B

21,3 20,0 22,5 18,0 18,7 20,1

19,5 1,3 2,0

17,0 16,8 18,0 17,8 14,8 16,9 16,7 18,2 18,5 13,5 17,0 16,8 16,2 20,5 19,4 13,8 19,9 18,0 19,1 19,4 21,0 16,4 19,5 19,1 21,7 20,0 22,8 17,4 19,5 20,3 23,7 21,5 23,8 18,5 20,4 21,6 23,7 21,4 24,3 18,8 20,3 21,7 23,6 20,0 24,3 19,2 20,0 21,4

C

21,6 20,0 24,0 18,5 19,5 20,7

21,1 1,8 1,6

21,8 16,7 19,8 14,9 15,1 17,7 22,2 19,7 23,0 17,4 15,7 19,6 23,4 21,2 24,6 18,4 18,4 21,2 23,0 21,3 24,0 19,0 19,6 21,4 22,7 21,8 25,3 19,5 21,5 22,2 23,5 22,3 25,7 18,8 21,5 22,4 23,7 22,2 25,8 19,7 22,0 22,7 23,8 22,0 26,0 19,5 21,5 22,6

D

20,5 21,0 24,5 18,5 19,0 20,7

20,8 2,1 1,4

20,4 21,1 19,4 17,3 19,1 19,5 21,3 20,8 16,2 18,5 20,0 19,4 20,8 21,0 14,0 18,9 20,5 19,0 21,3 20,8 19,5 18,8 21,2 20,3 21,0 21,4 23,3 19,4 21,7 21,4 20,4 20,2 25,2 19,8 21,2 21,4 22,0 21,9 28,8 20,0 21,9 22,9 22,4 21,5 28,3 20,0 22,0 22,8

E 14,9 22,7 15,7 16,4 15,0 16,9

17,2 2,1 1,0 14,8 20,7 14,9 15,5 15,0 16,2

70

Kelp berat tiap ulangan (g) rata-rata berat tiap

ulangan (g) rata-rata

Kelp Delta berat

badan stdev 1 2 3 4 5

14,8 19,4 15,1 15,6 15,5 16,1 15,1 19,5 15,4 14,9 15,9 16,2 16,3 21,5 15,6 16,5 16,5 17,3 16,7 19,7 17,0 17,2 16,9 17,5 16,7 19,9 17,0 17,6 16,8 17,6 17,7 19,6 17,9 18,3 18,0 18,3 18,0 21,9 17,9 18,8 18,4 19,0

71

Lampiran 5. Uji sidik ragam dan uji lanjut Duncan berat badan mencit pada masa sebelum transplantasi

Sumber keragaman JK db KT F Sig.

Dosis bubuk CH pada pakan 427,367 4 106,842 21,742 ,000

Sisaan 1061,423 216 4,914

Total 88678,220 225

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada berat badan mencit sebelum tranplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada berat badan mencit sebelum tranplantasi.

Pengambilan Keputusan : - Jika probabilitas >0,05, maka H0- Jika probabilitas <0,05, maka H

diterima 0

ditolak

Kesimpulan : Dengan tingkat signifikansi (α) 5%, apabila probalititas (sig.) 0.000 <0,05, maka H0

ditolak dan dilanjutkan menggunakan uji Duncan.

Duncan Kelompok mencit N Rerata Kehomogenan

A 45 19,567 B

B 45 19,531 B

C 45 21,147 C

D 45 20,818 C

E 45 17,227 A

Keterangan : huruf yang sama pada kolom kehomogenan menunjukkan tidak beda nyata pada taraf 5%.

72

Lampiran 6. Uji sidik ragam rata-rata delta pertumbuhan berat badan mencit pada masa sebelum transplantasi


Dosis bubuk CH pada pakan 5.549 4 1.387 0.554 0.697 Sisaan 100.138 40 2.503

Total 105.716 45

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada rata-rata delta pertumbuhan berat badan mencit pada sebelum transplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada rata-rata delta pertumbuhan berat badan mencit pada sebelum trasnplantasi.


diterima 0

ditolak

Kesimpulan : Dengan tingkat signifikansi (α) 5% probalititas (sig.) >0,05, maka H0

diterima, artinya rata-rata delta pertumbuhan berat badan mencit tidak berbeda nyata antara kelompok mencit dan tidak perlu dilakuakn uji lanjut Duncan.

73

Lampiran 7. Tabel berat badan mencit pada masa setelah transplantasi (g)

Kelp berat tiap ulangan (g) rata-rata

berat tiap ulangan (g)

rata-rata Delta berat badan

stdev 1 2 3 4 5

A

19,2 20,8 22,8 23,0 21,0 21,4

22,7 3,3 1,4

18,0 21,8 22,6 23,7 21,1 21,4 18,8 21,5 23,0 21,4 23,9 21,7 17,0 21,9 24,8 25,3 22,3 22,3 20,1 24,3 24,9 24,8 23,9 23,6 21,0 25,0 25,0 24,7 24,6 24,1 22,7 24,7 25,9 24,9 25,2 24,7

B

23,0 19,8 24,3 18,1 19,0 20,8

21,2 1,2 0,5

22,3 20,3 24,5 18,2 18,8 20,8 22,4 20,3 24,2 18,0 18,0 20,6 22,2 20,8 25,0 18,2 19,5 21,1 22,6 21,2 24,8 18,2 19,6 21,3 24,3 20,5 26,0 18,7 20,0 21,9 23,4 20,6 26,3 19,2 20,4 22,0

C

24,5 20,5 25,4 19,5 20,3 22,0

22,5 1,3 0,5

23,8 21,2 25,0 19,9 20,4 22,1 24,4 21,4 25,0 19,7 20,6 22,2 24,1 21,7 25,2 20,0 20,0 22,2 24,7 22,1 25,6 19,8 20,3 22,5 25,0 23,9 25,5 20,1 21,5 23,2 24,9 23,8 25,4 20,7 21,8 23,3

D

22,5 21,1 28,0 19,2 22,0 22,6

22,0 -1,3 0,4

21,8 20,3 27,1 19,2 21,3 21,9 22,1 20,4 26,5 19,2 21,0 21,8 22,3 20,3 26,8 19,5 21,3 22,0 22,0 21,4 27,0 19,5 21,2 22,2 21,8 21,4 27,0 20,0 21,5 22,3 21,0 21,5 26,4 19,8 17,9 21,3

E

16,5 20,0 17,0 17,0 16,5 17,4

18,4 2,5 1,3

16,0 19,0 16,2 16,4 16,0 16,7 16,3 20,0 17,0 17,5 16,4 17,4 17,4 20,4 18,4 18,2 16,3 18,1 17,7 22,5 19,3 19,8 18,8 19,6 18,6 23,1 19,4 18,2 19,6 19,8 20,0 23,7 20,3 15,5 20,0 19,9

74

Lampiran 8. Uji sidik ragam dan uji lanjut Duncan jumlah pakan yang dikonsumsi pada masa sebelum transplantasi.


Dosis bubuk CH pada pakan 24.361 4 6.090 15.415 .000 Sisaan 294.328 745 .395 Total 2982.703 750

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada jumlah pakan yang dikonsumsi pada masa sebelum tranplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada jumlah pakan yang dikonsumsi pada masa sebelum tranplantasi.


diterima 0

ditolak




A 150 2.2426 B

B 150 1.7766 A

C 150 1.7739 A

D 150 1.7967 A

E 150 1.8335 A


75

Lampiran 9. Uji Korelasi Delta Berat Badan dan Konsumsi Pakan Sebelum Transplantasi

Konsumsi Pakan

Delta Berat Badan Sebelum Transplan

Pearson Correlation .386 Sig. (2-tailed) .056 N 25

Hipotesis : H0

H

: Delta berat badan mencit sebelum transplantasi tidak berhubungan dengan

konsumsi pakan sebelum transplantasi

1

: Delta berat badan mencit sebelum transplantasi berhubungan dengan

konsumsi pakan sebelum transplantasi

Pengambilan Keputusan : - Jika p-value >0,05 , maka Ho

- Jika p-value <0,05, maka H

diterima

o

ditolak

Kesimpulan : p-value 0.56 > 0.05 maka terima H0

, artinya tidak terdapat hubungan signifikan

antara delta berat badan sebelum trasnplantasi dengan konsumsi pakan sebelum

transplantasi.

71

Lampiran 10. Tabel jumlah pakan yang dimakan mencit sebelum transplantasi

hari mencit

A B C D E 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 1.73 1.98 2.69 2.75 2.38 0.00 2.08 0.62 0.00 2.49 1.78 1.84 1.89 1.11 1.40 0.46 1.04 0.00 0.43 1.16 1.58 2.89 1.24 1.34 2.02

2 1.65 1.61 2.07 2.36 3.01 0.12 1.72 1.20 0.40 2.21 1.05 1.56 1.62 0.82 1.55 0.63 0.71 0.00 0.94 0.90 1.12 1.96 1.08 1.58 2.16

3 1.80 1.30 2.22 2.44 2.19 1.51 2.74 2.21 0.85 2.66 1.42 1.97 2.27 1.79 2.64 1.12 1.67 0.00 1.79 1.09 1.73 1.84 1.60 1.54 1.26

4 1.72 2.30 1.76 2.33 2.67 2.21 2.33 2.63 2.54 1.68 1.69 2.20 2.21 2.24 2.85 1.90 2.01 0.81 1.69 1.77 1.57 1.66 1.22 1.09 1.35

5 1.73 1.91 1.86 1.03 3.11 2.09 1.44 2.84 1.95 2.25 1.55 1.60 1.73 1.36 2.44 1.51 1.66 1.24 1.60 1.43 1.53 2.12 1.34 1.11 1.34

6 1.00 1.95 1.89 2.37 3.50 1.91 0.98 2.45 1.84 1.76 1.47 1.57 1.75 1.04 1.97 1.64 1.57 2.13 1.49 1.58 1.22 2.18 1.36 2.28 1.63

7 2.87 1.94 1.24 1.90 2.04 2.44 1.74 2.06 2.02 2.10 1.77 1.56 1.98 2.40 2.22 1.50 2.01 2.86 1.90 1.45 1.04 2.22 1.45 1.24 1.63

8 1.98 1.67 1.76 2.38 2.09 2.44 2.14 2.62 1.56 1.95 1.79 1.40 1.78 1.21 2.33 1.45 2.04 2.27 1.55 1.33 1.56 2.11 1.88 1.44 0.99

9 1.66 2.46 1.65 1.96 3.57 2.42 1.41 2.10 2.53 2.02 1.48 1.55 2.10 1.60 2.48 1.20 1.62 3.14 1.36 1.32 1.13 2.57 1.54 1.31 1.37

10 2.01 1.67 1.22 2.22 3.48 2.00 1.57 1.63 1.63 1.72 1.84 1.53 1.45 1.03 1.64 1.49 1.44 2.97 1.57 1.57 1.72 1.83 1.09 1.73 1.48

11 1.46 2.09 1.70 1.59 3.31 1.74 1.27 1.20 1.16 0.79 0.88 0.96 1.29 1.09 0.62 1.32 1.02 2.31 1.27 1.37 1.23 1.14 1.39 2.21 0.99

12 3.11 1.56 1.64 1.70 2.60 2.89 2.48 3.24 1.62 2.42 2.34 1.92 2.16 2.14 1.90 2.23 2.26 2.97 2.73 1.69 0.94 0.71 1.14 2.92 1.48

13 1.48 2.10 1.71 1.60 3.32 1.36 1.41 1.58 1.45 1.73 1.43 1.60 1.76 2.08 1.78 1.71 1.80 1.66 1.75 1.60 1.22 1.18 1.36 2.22 0.99

14 5.00 2.11 2.29 2.20 2.62 2.55 2.26 2.78 2.47 1.76 1.49 1.37 2.70 1.56 2.41 1.02 1.96 4.28 1.42 1.70 3.00 1.19 2.29 2.03 1.74

15 1.82 1.59 1.79 1.89 1.14 1.70 1.18 2.14 1.82 1.22 1.52 1.52 1.82 1.74 1.61 1.37 2.14 3.68 1.79 1.38 2.02 0.14 2.02 2.03 2.39

16 2.00 2.02 1.89 1.87 1.98 2.19 1.84 2.04 1.67 1.46 1.74 1.10 2.01 1.37 1.96 2.26 1.33 3.47 1.76 1.85 1.66 0.97 1.64 2.69 1.75

17 4.51 1.97 1.28 2.64 1.87 2.19 1.88 1.50 1.12 1.52 1.64 1.59 2.08 1.18 2.07 1.51 1.68 2.66 1.42 1.37 2.49 3.32 1.72 2.56 1.13

18 4.38 1.79 3.01 2.08 2.13 1.71 1.29 2.15 1.86 1.70 1.58 1.29 1.73 1.21 2.18 1.87 1.78 2.69 1.37 1.46 1.64 2.37 2.37 1.81 2.15

19 4.82 2.23 1.90 2.16 2.15 1.44 1.26 1.53 1.03 1.41 1.71 1.50 2.24 1.33 1.97 1.26 1.79 2.52 1.52 1.97 2.18 2.61 2.83 1.41 1.76

20 4.40 1.78 3.00 2.08 2.16 2.32 2.30 2.91 1.14 1.44 2.28 2.22 3.26 1.04 1.64 1.42 2.56 3.59 2.61 1.70 1.64 2.36 2.39 1.81 2.15

21 2.63 2.23 2.52 2.26 2.21 1.75 1.31 1.51 1.08 1.50 2.16 0.96 1.50 1.14 1.26 1.38 1.65 1.94 1.72 1.57 3.93 2.80 2.64 1.73 1.67

76

72

hari mencit

A B C D E 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

22 2.24 1.97 3.09 1.78 1.64 1.41 1.90 1.94 1.41 1.39 2.09 1.54 2.43 1.56 1.71 1.66 1.97 2.74 1.86 1.76 1.74 1.65 1.96 1.79 0.92

23 2.12 1.48 1.95 1.96 1.98 2.01 1.78 1.81 1.45 1.63 1.69 1.84 1.71 1.99 1.63 2.42 1.66 2.40 1.56 2.20 2.06 0.78 1.63 1.67 1.64

24 1.68 2.83 2.75 2.58 1.67 1.46 1.78 1.97 0.97 1.68 1.79 1.55 2.25 1.86 2.09 1.50 2.14 2.68 2.03 1.51 1.85 2.60 1.65 2.37 2.21

25 3.44 1.64 1.78 2.10 1.27 1.72 1.81 2.38 1.70 1.89 2.36 1.83 2.28 1.33 1.65 1.53 1.93 2.74 1.82 1.94 3.89 1.56 1.70 2.21 1.83

26 3.75 2.22 1.89 1.73 2.15 1.43 2.13 1.78 1.61 2.11 1.75 1.42 2.42 1.41 1.18 2.44 1.78 1.85 1.65 1.84 2.72 1.90 1.85 1.83 1.85

27 3.24 1.99 2.53 2.19 1.49 0.99 0.85 1.53 1.77 1.77 1.34 1.51 2.15 1.01 1.26 1.09 1.59 0.90 1.19 0.90 1.67 1.98 1.56 2.01 1.88

28 2.24 2.58 2.08 2.39 2.15 0.89 1.24 2.97 2.14 3.00 2.35 2.57 2.30 2.63 3.50 2.79 2.73 4.39 2.96 2.47 1.90 2.86 1.83 2.24 2.70

29 4.21 1.82 2.11 2.48 2.40 1.60 1.61 1.85 1.85 1.75 2.38 1.70 2.28 1.94 1.54 1.76 2.30 2.60 2.19 1.79 3.15 1.62 2.02 2.50 1.35

30 3.45 2.58 2.94 3.16 2.22 1.90 1.79 2.25 1.48 2.03 2.05 1.95 2.57 1.76 1.79 2.19 1.52 2.76 1.74 1.92 2.39 3.59 3.97 1.48 1.05

rerata ulangan 2.67 1.98 2.07 2.14 2.35 1.75 1.72 2.05 1.54 1.83 1.75 1.62 2.06 1.53 1.91 1.59 1.78 2.34 1.69 1.59 1.92 1.96 1.79 1.87 1.63

rerata kelomp

ok 2.24 1.78 1.77 1.80 1.83

st.dev 0.28 0.19 0.21 0.31 0.13

77

78

Lampiran 11. Uji sidik ragam dan uji lanjut Duncan berat badan mencit pada masa setelah transplantasi

Sumber keragaman JK Db KT F Sig.

Dosis bubuk CH pada pakan 429,165 4 107,291 18,669 0,000 Sisaan 954,022 166 5,747

Total 81417,190 175

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada berat badan mencit setelah tranplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada berat badan mencit setelah tranplantasi.


diterima 0

ditolak

Kesimpulan : Dengan tingkat signifikansi (α) 5%, apabila probalititas (sig.) <0,05, maka H0

ditolak, maka dilanjutkan dengan uji Duncan.

Duncan

Kelompok mencit N Rerata Kehomogenan

A 35 22,731 c

B 35 21,220 b

C 35 22,506 c

D 35 22,037 bc

E 35 18,429 a


79

Lampiran 12. Uji sidik ragam dan uji lanjut Duncan rata-rata delta pertumbuhan berat badan mencit pada masa setelah transplantasi


Dosis bubuk CH pada pakan 1.707 4 .427 2.036 .114 Sisaan 6.287 30 .210 Total 7.994 34

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada rata-rata delta pertumbuhan berat badan mencit setelah tranplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada rata-rata delta pertumbuhan berat badan mencit setelah tranplantasi.


diterima 0

ditolak

Kesimpulan : Dengan tingkat signifikansi (α) 5%, apabila probalititas (sig.) >0,05, maka H0

diterima, maka tidak perlu dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan.

76

Lampiran 13. Tabel jumlah pakan yang dimakan mencit pada masa setelah transplantasi

hari mencit

A B C D E 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 3.81 1.77 3.44 3.04 3.32 0.70 1.59 1.83 0.69 0.88 1.43 1.72 1.02 1.67 0.90 2.10 1.59 1.13 0.50 1.19 2.82 0.60 0.30 1.19 0.17

2 2.69 1.59 1.76 2.51 3.78 0.35 1.16 1.70 0.65 0.63 1.46 1.00 1.67 2.17 1.16 0.89 1.74 1.20 1.17 0.89 2.40 1.35 1.55 1.85 0.97

3 2.31 0.20 3.44 3.94 4.65 1.45 1.58 2.38 1.69 1.33 1.65 1.58 1.49 1.67 1.61 1.31 1.78 1.26 1.73 1.12 1.75 1.63 1.22 2.04 1.33

4 3.39 2.38 3.09 5.00 4.76 1.40 1.64 1.82 1.36 0.94 1.68 1.25 1.39 1.62 1.43 1.40 1.43 1.30 1.50 1.62 2.02 2.23 1.38 2.84 3.88

5 2.84 1.98 3.03 3.54 3.67 1.85 2.32 2.91 1.62 1.85 2.50 2.23 2.17 2.42 2.17 2.03 1.63 2.19 2.20 1.35 1.65 1.24 1.36 1.10 2.35

6 2.20 1.90 2.90 2.03 3.97 1.20 2.05 1.81 1.31 1.68 1.73 2.37 2.37 2.20 2.03 1.94 1.81 1.53 1.89 1.42 2.45 2.03 2.33 2.64 2.14

7 2.05 1.27 2.39 1.25 4.78 2.25 1.25 1.33 1.31 1.39 1.94 1.45 1.24 1.73 1.65 1.26 1.90 1.52 1.92 1.57 1.93 2.28 1.86 2.02 1.69

8 3.03 2.06 1.64 1.37 4.40 2.24 2.49 2.99 1.52 2.15 2.68 1.91 2.77 1.86 2.25 2.08 2.52 2.22 2.14 0.99 2.25 2.14 1.62 2.75 1.93

9 2.59 0.37 1.77 1.14 3.80 1.28 1.48 1.43 1.19 1.55 1.77 1.37 1.76 2.01 1.81 1.56 1.56 1.76 1.99 1.81 2.01 2.37 1.89 1.87 1.96

10 2.54 1.87 2.15 0.09 4.41 1.60 2.65 2.63 1.75 2.59 2.41 2.13 3.10 2.29 1.93 2.07 2.27 2.54 1.88 2.05 2.14 1.50 1.54 1.63 1.75

11 3.04 2.66 3.18 1.53 4.09 1.73 1.58 1.84 1.44 1.68 1.25 1.58 1.84 1.44 1.68 1.65 1.66 1.47 2.25 1.58 1.93 1.51 1.48 2.10 2.04

12 2.67 2.97 0.93 1.73 4.34 1.02 2.57 2.33 2.14 1.63 1.74 2.30 2.00 2.56 2.35 2.24 2.58 2.91 2.63 1.55 3.46 2.10 2.47 1.83 3.59

13 2.64 4.20 1.60 1.63 3.35 1.43 1.59 1.95 1.36 1.66 2.00 1.73 1.61 1.27 2.04 1.80 1.78 1.12 1.45 1.15 2.90 2.06 2.92 2.22 2.72

14 3.27 4.26 0.22 1.75 3.38 1.24 2.75 1.91 2.33 2.95 2.69 2.47 2.54 2.57 1.94 2.83 3.07 2.95 3.03 2.34 1.61 2.22 0.99 2.45 2.35

15 2.79 0.80 2.07 2.29 3.75 1.51 2.08 2.07 1.52 1.74 1.95 1.72 1.87 1.72 2.11 1.81 2.53 2.22 1.90 1.93 3.76 2.94 0.97 1.71 1.97

16 2.20 1.90 2.90 2.03 3.97 1.70 2.27 2.03 1.94 2.16 1.29 1.78 1.97 1.57 1.64 1.67 2.07 1.50 1.62 1.71 2.45 2.03 2.33 2.64 2.14

17 3.23 2.52 1.31 2.36 1.51 0.72 1.85 1.51 1.82 1.85 2.24 2.16 2.34 2.48 2.93 1.74 2.88 3.06 2.29 1.75 1.69 1.86 1.94 1.38 1.71

18 2.29 1.63 1.47 2.00 1.57 2.00 1.76 1.70 0.95 1.65 2.00 2.27 1.59 2.02 1.61 2.36 1.16 1.77 1.91 1.53 1.75 1.55 1.93 0.35 1.55

19 2.85 2.33 1.37 1.70 2.08 1.03 1.53 1.63 1.75 2.38 2.05 2.82 2.59 1.57 1.70 1.58 2.68 2.94 2.33 2.44 1.73 2.37 1.39 1.73 1.97

20 2.00 2.13 2.08 2.02 1.85 1.06 1.06 1.57 1.42 1.69 1.57 1.91 2.35 1.90 1.99 1.87 2.32 2.25 2.03 1.13 1.92 1.82 1.37 0.92 1.46

21 2.23 1.77 1.38 1.69 1.12 1.09 1.47 1.99 1.64 1.87 1.83 2.41 1.97 2.14 1.93 1.74 2.62 1.76 2.01 0.76 1.78 1.91 1.32 1.04 1.79

80

77

hari mencit

A B C D E 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

22 2.11 1.57 1.58 1.81 1.46 0.43 1.26 1.71 1.61 1.31 1.80 1.98 1.82 1.63 1.44 1.44 2.31 1.26 1.67 0.58 1.92 1.90 1.34 3.56 1.13

rerata ulangan 2.67 2.01 2.08 2.11 3.36 1.33 1.82 1.96 1.50 1.71 1.89 1.92 1.98 1.93 1.83 1.79 2.09 1.90 1.91 1.48 2.20 1.89 1.61 1.90 1.94

rerata kelomp

ok 2.45 1.66 1.91 1.83 1.91

st.dev 0.58 0.25 0.05 0.23 0.21

81

82

Lampiran 14. Uji sidik ragam dan uji lanjut Duncan jumlah pakan yang dikonsumsi pada masa setelah transplantasi.


Dosis bubuk CH pada pakan 38.015 4 9.504 20.372 .000 Sisaan 254.252 545 .467 Total 2387.817 550

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada jumlah pakan yang dikonsumsi pada masa setelah tranplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada jumlah pakan yang dikonsumsi pada masa setelah tranplantasi.


diterima 0

ditolak



Duncan


A 110 2.4460 C

B 110 1.6627 A

C 110 1.9098 B

D 110 1.8329 Bc

E 110 1.9083 B


83

Lampiran 15. Uji Korelasi Delta Berat Badan Setelah Transplantasi dan Konsumsi Pakan Setelah Transplantasi

Konsumsi Pakan

Delta Berat Badan Setelah Transplan


Hipotesis : H0

H

: Delta berat badan mencit setelah transplan tidak berhubungan dengan

konsumsi pakan setelah transplantasi

1

: Delta berat badan mencit setelah transplan berhubungan dengan konsumsi

pakan setelah transplantasi



diterima

o

ditolak

Kesimpulan : p-value 0.023 < 0.05 maka tolak H0

, artinya terdapat hubungan signifikan antara

delta berat badan setelah transplantasi dan konsumsi pakan setelah transplantasi.

84

Lampiran 16. Uji normalitas BB setelah transplantasi

bbakhir

Perc

ent

262422201816

99

95

90

80

70

60504030

20

10

5

1

Mean

0.040

21.38StDev 1.822N 35KS 0.155P-Value

Probability Plot of bbakhirNormal

Lampiran 17. Uji homogenitas BB setelah transplantasi

BBak

h

95% Bonferroni Confidence Intervals for StDevs

E

D

C

B

A

43210

Bartlett's Test

0.009

Test Statistic 13.37P-Value 0.010

Levene's Test

Test Statistic 4.11P-Value

Test for Equal Variances for bbakhir

85

Lampiran 18. Tabel masa laten jaringan kanker (hari)

Mencit Kelompok Mencit

B C D E 1 4 4 4 4 2 4 4 4 4 3 7 4 4 4 4 4 11 4 4 5 4 4 4 8

Rata-rata 4,6 5,4 4 4,8 SD 1,3 3,1 0,0 1,8

Lampiran 19. Uji sidik ragam Masa Laten Sumber keragaman JK db KT F Sig.

Dosis bubuk CH pada pakan 5,000 3 1,667 ,450 ,720

Sisaan 59,200 16 3,700

Total 64,200 19

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada masa laten pertumbuhan jaringan kanker mencit.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada masa laten pertumbuhan jaringan kanker mencit.


diterima 0

ditolak



86

Lampiran 20. Tabel volume jaringan kanker mencit (cm3

pengukuran ke-

) Kelompok mencit

B C D E 1 0,0654 0,1001 0,0635 0,1449 2 0,0599 0,1279 0,0727 0,2056 3 0,1258 0,1482 0,1120 0,3164 4 0,1949 0,2538 0,2544 0,2211 5 1,2649 0,2367 0,1922 0,1559 6 1,5848 0,3994 0,2137 0,1624

rata-rata 0,5493 0,2110 0,1514 0,2010 stdev 0,6875 0,1106 0,0795 0,0639

Lampiran 21. Uji sidik ragam dan uji lanjut Duncan volume jaringan

kanker mencit (cm3

)


Dosis bubuk CH pada pakan ,600 3 ,200 1,616 ,217

Sisaan 2,476 20 ,124 Total 3,076 23

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada volume jaringan kanker mencit.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada volume jaringan kanker mencit.


diterima 0

ditolak



87

Lampiran 22. Tabel berat jaringan kanker mencit (g)

mencit Kelompok Mencit

B C D E 1 2,1504 1,2089 0,2940 0,1614 2 0,6462 1,1683 0,1607 0,1747 3 1,1424 1,1888 0,1504 0,0872 4 0,0993 0,9897 0,1063 0,7653 5 0,3252 1,3341 0,0595 0,1859

rata-rata 0,8727 1,1780 0,1542 0,2749 st dev 0,8146 0,1235 0,0878 0,2768

Lampiran 23. Uji sidik ragam dan uji lanjut Duncan berat jaringan kanker

mencit (g)


Dosis bubuk CH pada pakan 3,556 3 1,185 6,213 ,005 Sisaan 3,053 16 ,191

Total 6,609 19

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada berat jaringan kanker mencit.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada berat jaringan kanker mencit.


diterima 0

ditolak

Kesimpulan : Dengan tingkat signifikansi (α) 5%, apabila probalititas (sig.) <0,05, maka H0

ditolak, perlu dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan.


B 5 0,8727 b

C 5 1,1780 b

D 5 0,1542 a

E 5 0,2749 a


88

Lampiran 24. Uji Korelasi Delta Berat Badan Setelah Transplantasi dan Berat Jaringan Kanker

Berat Kanker Delta Berat Badan Sesudah


Hipotesis : H0

H

: Delta berat badan mencit setelah transplan tidak berhubungan dengan berat

jaringan kanker.

1

: Delta berat badan mencit setelah transplan berhubungan dengan berat

jaringan kanker



diterima

o

ditolak

Kesimpulan : p-value 0.03 < 0.05 maka tolak H0

, artinya terdapat hubungan signifikan antara

delta berat badan setelah transplantasi dan berat jaringan kanker.

89

Lampiran 25. Uji sidik ragam HE dengan tingkat kepadatan sel


Dosis bubuk CH pada pakan 3,902 3 1,301 13,270 ,000

Sisaan 1,568 16 ,098

Total 66,370 20

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada kepadatan sel kanker pada masa setelah tranplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada kepadatan sel kanker pada masa setelah tranplantasi.


diterima 0

ditolak



Duncan


B 5 2,5 A

C 5 1,6 B

D 5 1,4 B

E 5 1,48 B


90

Lampiran 26. Uji sidik ragam HE dengan pleomorfisme sel


Dosis bubuk CH pada pakan ,520 3 ,173 1,605 ,228

Sisaan 1,728 16 ,108

Total 49,680 20

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada pleomorfisme sel pada masa setelah tranplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh pada pleomorfisme pada masa setelah tranplantasi.


diterima 0

ditolak

Kesimpulan : Dengan tingkat signifikansi (α) 5%, apabila probalititas (sig.) 0.000 > 0,05, maka H0

diterima dan dilakukan uji lanjut Duncan.

91

Lampiran 27. Uji sidik ragam HE dengan mitosis


Dosis bubuk CH pada pakan 1,078 3 ,359 2,444 ,102

Sisaan 2,352 16 ,147

Total 57,880 20

Hipotesis : H0

H

: Pemberian cincau hijau pada pakan tidak memberikan pengaruh pada mitosis sel pada masa setelah tranplantasi.

1

: Pemberian cincau hijau pada pakan memberikan pengaruh mitosis sel pada masa setelah tranplantasi.


diterima 0

ditolak

Kesimpulan : Dengan tingkat signifikansi (α) 5%, apabila probalititas (sig.) 0.000 > 0,05, maka H0

diterima dan dilakukan uji lanjut Duncan.

92

Lampiran 28. Contoh perhitungan dosis bubuk daun cincau hijau P, oblongifolia Merr.

Perhitungan ini didasarkan pada asumsi konsumsi gel cincau per hari sebagai dosis yang ditambahkan ke dalam pakan mencit, Dosis tersebut didasarkan pada dosis manusia yang telah dikonversi. Gel cincau hijau di pada penelitian ini dibuat dengan cara mencampur cincau dengan air 1:3 Kebutuhan rata-rata manusia dewasa per hari adalah satu gelas yang volumenya setara dengan 250 g gel:

= asumsi berat badan rata-rata manusia dewasa = 50 kg

= 5 g gel per kg BB

untuk mencit dengan berat badan rata-rata = 20 g:

=

= 0,1 g gel cincau = 100 mg gel cincau

Dengan demikian mencit yang mengkonsumsi 100 mg gel setara dengan manusia mengkonsumsi satu gelas gel cincau.Pada penelitian ini menggunakan pembuatan gel cincau hijau dengan perbandingan 1:3. Pembuatan 100 mg gel membutuhkan 33,3 mg daun cincau (bb/berat basah) dan 100 ml air.

Selanjutnya pengujian dilakukan pada dosis 3,78 kali konsumsi normal yaitu 125 mg daun cincau (bb) dengan mempertimbangkan faktor kerusakan bahan akibat pengolahan dan penyerapan zat gizi. Faktor kerusakan diperhitungkan 2 kali dan faktor penyerapan diperhitungkan minimal 40%, Berdasarkan analisis kadar air terhadap daun cincau hijau P, oblongifolia Merr, umumnya mengandung kadar air 79,4% sehingga 125 mg daun cincau berat basah setara dengan:

Jumlah P, oblongifolia Merr, = – = 25,75 mg daun (bk)

Jumlah bubuk daun cincau hijau P, oblongifolia Merr, (kadar air 2,85%) yang setara dengan 25,75 mg daun (bk) adalah:

Jumlah bubuk daun cincau hijau P, oblongifolia Merr,

= –

= 26,50 mg

Dosis bubuk daun cincau hijau P, oblongifolia Merr, dibuat dengan mempertimbangkan konsumsi pakan harian mencit dan berdasarkan pengamatan pendahuluan terhadap jumlah rata-rata pakan harian yang dimakan mencit adalah 3 g:

Dosis dalam pakan = = 088%

93

Lampiran 29. Reagen yang digunakan untuk pewarnaan HE (Alum Hematoxylin Mayer’s)

1. Hematoxylin 1 gr

2. Air destilasi 1000 cm

3. Potassium alum 50 gr

3

4. Asam sitrat 1 gr

5. Choral hydrat 50 gr

6. Sodium iodate 0,2 gr

Cara pembuatan : Hematoksilin, potasium alum dan sodium iodiat

dilarutkan dalam air terdestilasi dengan stirer dan dihangatkan, atau

didiamkan pada suhu ruang selama semalam. Choral hydrat dan asam

sitrat ditambahkan dan dicampur serta didihkan selama lima menit,

kemudian dinginkan dan saring. Larutan Hematoksilin siap digunakan.

94

Lampiran 30. Reagen yang digunakan untuk pewarnaan IHK

1. Coating : Pelapisan gelas objek

Menggunakan gelatin. 2,5g-3g gelatin dalam 300-400 ml air panas

(suhu 600C) dinginkan hingga mencapai suhu ruang. Tambahkan 0,25g

kromium potasium sulfat (CrK(SO4)2) dan homogenasi. Tambahkan

H2

Gelas objek yang telah dibersihkan diinkubasi pada larutan gelatin

selama 15-30 menit. Setelah kering gels objek disimpan dalam oven

dengan suhu 60

O sampai mencapai volume 500 ml.

0

2. Buffer Natrium Sitrat untuk perebusan pada saat antigen unmasking.

C untuk menghindari kotoran menempel pada gelas

objek.

2,94g C6H5Na3O7 . 2 H2O dalam 1 liter aquades.

3. DAB (3-3´-diaminobenzine tetrahydrochloride)

Tambahkan 5 gr DAB ke 10cm3 0,05 M TBS pH 7.6 dan campurkan

sampai rata. Tambahkan 0,1 cm3

4. Pap-pen (merk DAKO pen code no.S20002) mengandung :

1-Bromopropane (non polar / tdk larut air)

atau 1 % hidrogen peroksida. Harus

digunakan dan disiapkan dalam keadaan segar.

5. Blocking Solution :

0,1% skim milk in PBS.

6. 3% H2O2 : 10 ml H2O2 30% larutkan dalam 90 ml dH2O.

7. Xylene (C6H4(CH3)) Hidrokarbon non polar

8. Buffer Sitrat (Tri sodium sitrat)

2,94 gr C6H5Na3O7. 2H2O 1 liter dH2O pH 6

PENGARUH BUBUK DAUN CINCAU HIJAU Premna oblongifolia … · Pengukuran volume jaringan kanker...

Documents

Transcript of PENGARUH BUBUK DAUN CINCAU HIJAU Premna oblongifolia … · Pengukuran volume jaringan kanker...