Penentuan Kadar Riboflavin dan Uji Pendahuluan Aktivitas ... 2016/PDF/108-113... · Penentuan Kadar...

ISBN 978-602-73435-1-1 PROSIDING SEMINAR NASIONAL KIMIA

DAN PEMBELAJARAN KIMIA UNPAD | 2016

108 v |The Development Of Chemistry

vi To Improve National Competence

Penentuan Kadar Riboflavin dan Uji Pendahuluan Aktivitas Antibakteri Yogurt

yang Difermentasi dengan Bakteri yang Diisolasi dari Yogurt Komersial

Saadah D. Rachman1, Sadiah Djajasoepena

1, Ida Indrawati

2, Leksono Bangun

1,

Dian S. Kamara1, Safri Ishmayana

1,*

1Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran

Jln. Raya Bandung-Sumedang km. 21 Jatinangor, Sumedang, Jawa Barat 45363 2Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran

Jln. Raya Bandung-Sumedang km. 21 Jatinangor, Sumedang, Jawa Barat 45363

*Penulis koresponden: [email protected]

ABSTRAK

Riboflavin (vitamin B2) merupakan salah satu komponen vitamin yang ada pada susu dan

memperkaya nilai nutrisinya. Proses fermentasi susu dengan menggunakan bakteri asam laktat

(BAL), dapat mengubah kadar riboflavin pada yogurt. Selain itu, pada proses fermentasi juga

dihasilkan senyawa antibakteri sebagai metabolit sekunder fermentasi susu menjadi yogurt. Pada

penelitian ini dilakukan fermentasi susu menggunakan bakteri kultur starter yang diisolasi yogurt

komersial. Kadar riboflavin ditentukan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT) menggunakan kolom C18 dan detektor UV pada panjang gelombang 254 nm, sedangkan

uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumur melawan Eschericia coli dan

Bacillus subtilis. Kadar riboflavin berkurang seiring dengan berjalannya fermentasi sedangkan

aktivitas antibakteri ditunjukkan oleh semua sampel yogurt yang diuji dengan tingkat

penghambatan yang berbeda. Hasil penelitian menunjukkan bahwa riboflavin kemungkinan besar

digunakan oleh BAL sebagai nutrisi dalam proses fermentasi, sehingga terjadi penurunan kadar

riboflavin setelah fermentasi. Selain itu, senyawa antibakteri dihasilkan selama proses fermentasi

susu menjadi yogurt.

Kata Kunci: yogurt, riboflavin, kromatografi cair kinerja tinggi, senyawa antibakteri

ABSTRACT

Riboflavin (vitamin B2) is one of vitamin components in milk that enriched its nutritional value.

Milk fermentation process using lactic acid bacteria (LAB) may change riboflavin content in its

fermentation product (yogurt). Furthermore, in the fermentation process antibacterial compounds

can be produced as secondary metabolite. The present study was conducted to investigate the

change of riboflavin content after milk fermentation process and to examine the presence of

antibacterial compounds in the yogurt at different fermentation time points. In the present study,

milk was fermented using bacterial starter culture isolated from commercial yogurt. Riboflavin

content was determined using high performance liquid chromatography (HPLC) with C18 column

and UV detector at 254 nm. While the presence of antibacterial compounds was assayed with

agar diffusion method against Eschericia coli and Bacillus subtilis. Riboflavin content was found

to decrease in line with fermentation period, while antibacterial compounds was detected in all

tested samples with different inhibition degree. The results of the present study indicate that it is

most likely that riboflavin is used by LAB as nutrition during fermentation process, which lead to

reduction of riboflavin content after fermentation. Furthermore, antibacterial compounds is also

produced during fermentation of milk to yogurt.

Keywords: yogurt, riboflavin, high performance liquid chromatography, antibacterial compounds

I. PENDAHULUAN

Yogurt merupakan suatu minuman yang telah dikenal lama karena nilai nutrisinya yang tinggi. Banyak

penelitian telah dilakukan untuk mengetahui kandungan nutrisi, kandungan senyawa-senyawa yang memiliki

aktivitas terapi bagi kesehatan serta mempelajari variasi terbaik pada proses pembuatan yogurt, seperti variasi

inkubasi, perbandingan kultur dan suhu pasteurisasi. Pada proses fermentasi yogurt dapat digunakan kultur

C-04





tunggal atau campuran dari bakteri asam laktat (BAL). Rajagopal & Sandine (1988) mempelajari simbiosis

dua kultur bakteri asam laktat yang sering digunakan pada proses fermentasi yogurt, yaitu Streptococcus

thermophilus dan Lactobacillus bulgaricus. Mereka menemukan bahwa L. bulgaricus menghasilkan asam-

asam amino untuk pertumbuhan S. thermophillus, sedangkan S. thermophillus menghasilkan asam formiat

yang digunakan untuk pertumbuhan L. bulgaricus.

Riboflavin (vitamin B2) merupakan vitamin yang berperan pada reaksi teransfer elektron pada sistem

reaksi biologis. Namun manusia tidak bisa menyintesis vitamin ini secara in vivo, sehingga vitamin ini harus

diperoleh dari asupan makanan (Ball 2005; Burgess et al., 2004). Alm (1982) telah melakukan penelitian

mengenai perubahan kandungan vitamin B pada susu setelah proses fermentasi. Hasil penelitiannya

menunjukkan bahwa terjadi peningkatan kadar asam folat dan penurunan kadar vitamin B12. Selain itu,

Toluine et al. (2013) menemukan bahwa kadar riboflavin yang difermentasi dengan menggunakan S.

thermophillus dan Lactobacillus delbrueckii tidak berubah signifikan, namun meningkat ketika digunakan

kultur L. acidophilus dan Bifidobacterium lactis. Hal ini menunjukkan bahwa kultur bakteri yang digunakan

pada proses fermentasi yogurt dapat menentukan perubahan kadar vitamin dalam produk akhirnya.

Senyawa-senyawa yang memiliki aktivitas antimikroba dan dihasilkan pada proses fermentasi yogurt

diantaranya adalah asam lakat, asam asetat, hidrogen peroksida, karbon dioksida, dan bakteriosin. Senyawa-

senyawa tersebut dihasilkan oleh bakteri asam laktat dan dapat menghambat mikroorganisme patogen yang

berperan pada proses pembusukan, sehingga dapat meningkatkan masa simpan dan meningkatkan keamanan

pangan (Cleveland et al., 2001; Aymerich et al., 2000). Selain itu, Nurdiana (2002) melaporkan adanya

aktivitas antibakteri yang dihasilkan pada proses fermentasi yogurt yang menggunakan tiga kultur bakteri (L.

bulgaricus, Streptococcus facealis dan Bifidobacterium bifidum).

Pada penelitian ini dilakukan analisis kadar riboflavin susu sebelum dan setelah difermentasi dengan

menggunakan BAL yang diisolasi dari yogurt komersial untuk menentukan perubahan kadar ribovlafin.

Selain itu dilakukan analisis pendahuluan untuk menentukan waktu terbaik pembentukan senyawa antibakteri

pada proses fermentasi yogurt dengan BAL hasil isolasi.

II. METODE PENELITIAN

Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah inkubator, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

Hewlett Packard yang dilengkapi detector UV, laminar flow cabinet (Forma Scientific), mikroskop (Nikon),

pH meter (Mettler Toledo MP220), termometer, dan alat-alat gelas yang umum digunakan di laboratorium

Bahan yang digunakan

Bahan yang digunakan antara lain adalah susu skim, susu murni, yogurt plain (Columbia Yogurt,

Bandung) untuk digunakan sebagai kultur starter, agar bakto, ekstrak ragi, pepton, glukosa, air suling,

natrium klorida, asetonitril, natrium dihidrogen fosfat, dinatrium hidrogen fosfat, dan standar riboflavin.

Isolasi bakteri

Sebanyak satu ose yogurt plain ditumbuhkan pada cawan petri dengan media agar PYG (0,125%

pepton, 0,125% ekstrak ragi, 0,3% glukosa, 2% agar bakto). Koloni yang tumbuh kemudian diambil dengan

menggunakan kawat ose dan diidentifikasi dengan menggunakan mikroskop setelah diwarnai dengan

menggunakan metilen biru. Koloni yang diperoleh dimurnikan dengan cara digores pada media agar PYG

sebanyak 5 generasi.

Pembuatan kultur starter

Ke dalam 5 mL susu skim yang telah dipasteurisasi pada suhu 85°C selama 15 menit ditambahkan satu

ose koloni bakteri hasil isolasi. Campuran ini kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Kultur

hasil inkubasi dipindahkan ke dalam susu sapi murni yang telah dipasteurisasi dan diinkubasi pada suhu 37°C

selama 24 jam.

Fermentasi yogurt

Sebanyak 50 mL susu sapi murni yang telah dipasteurisasi pada suhu 85°C selama 15 menit

dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL yang telah disterilisasi. Ke dalam Erlenmeyer tersebut





ditambahkan 5 mL kultur starter kemudian diinkubasi pada suhu 45°C. Sampel diambil pada waktu

fermentasi 5, 7 dan 9 jam.

Analisis kadar riboflavin

Kadar riboflavin ditentukan dengan menggunakan KCKT sesuai yang dijelaskan oleh Barna &

Dworschák (1994) dengan modifikasi. Sebanyak 10 mL yogurt ditambahkan dengan 10 mL HCl 0,1 N dan

diautoklaf untuk mengekstraksi vitamin pada tekanan 15 psi selama 30 menit. Setelah diautoklaf, dibiarkan

sampai mencapai suhu ruangan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 15 menit.

Supernatan diambil, kemudian disaring dengan milipore ukuran 0,2 µm. Kadar riboflavin ditentukan dengan

menyuntikkan sampel ke alat KCKT dengan fasa diam µ-Bondapak-C18, fasa gerak asetonitril : buffer fosfat

pH 7 (12,5:87,5) dan detektor UV pada panjang gelombang 254 nm.

Analisis kualitatif senyawa antibakteri

Media agar nutrien (0,5% pepton, 0,3% ekstrak ragi, 1,5% agar bakto, 0,5% natrium klorida) dilarutkan

dalam air suling kemudian diautoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Bakteri uji (E. coli dan B. subtilis)

yang tumbuhkan pada agar miring disuspensikan dengan air suling steril, kemudian diencerkan 10 kali.

Sebanyak 20 mL larutan agar nutrien yang sudah diautoklaf dimasukkan ke cawan petri steril dan ditunggu

sampai suhu tidak terlalu panas dan media belum memadat. Kemudian sebanyak 0,1 mL bakteri uji yang

telah diencerkan ditambahkan dan dikocok kemudian ditunggu sampai memadat. Pada agar yang telah

memadat, dibuat lubang dengan diameter 6 mm. Kemudian sebanyak 20 µL hasil ekstraksi yogurt dengan

etanol pH 2 (1:1) diteteskan pada lubang. Untuk kontrol positif digunakan ampisilin 10 µg/mL sedangkan

kontrol negatif digunakan susu murni dengan volume yang sama. Cawan petri kemudian diinkubasi pada

suhu 37°C selama 24 jam. Adanya aktivitas antibakteri ditandai dengan daerah bening yang menunjukkan

terhambatnya pertumbuhan bakteri. Semakin besar diameter daerah bening, maka semakin besar juga

aktivitas antibakterinya.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi bakteri dan produksi yogurt

Untuk menentukan jenis bakteri yang diisolasi, dilakukan analisis morfologi dengan meggunakan

mikroskop. Hasil fotomikro bakteri hasil isolasi yang diwarnai dengan metilen biru menunjukkan bakteri

dengan bentuk yang bulat (coccus) seperti ditunjukkan pada Gambar 1. Adapun spesies bakteri yang diisolasi

belum dapat ditentukan karena memerlukan analisis yang lebih lanjut. Isolat ini diuji dengan menggunakan

media cair yang mengandung indikator bromfenol biru. Larutan media berubah warna menjadi kuning yang

menunjukkan nilai pH berubah menjadi dibawah 5 setelah inkubasi selama 20 jam. Sedangkan menurut

Tamime & Robinson (1999) suatu BAL dikatakan memiliki kualitas yang baik jika ketika diuji pada media

cair dapat menurunkan pH dibawah 5 setelah 3 jam inkbubasi. Hal ini menunjukkan bahwa isolat BAL yang

diperoleh, meskipun memiliki kemampuan fermentasi asam laktat, tetapi tidak sebaik yang disyaratkan oleh

Tamime & Robinson (1999).

Gambar 1 Morfologi bakteri yang diisolasi dari yogurt komersial dan diwarnai dengan metilen biru.





Setelah dilakukan fermentasi selama 5, 7 dan 9 jam pH susu hasil fermentasi diukur dan hasilnya

ditunjukkan pada Tabel 1. Nilai pH susu murni berada pada rentang 6,0 – 6,7 (Gemechu et al. 2015). Hasil

pengukuran pH menunjukkan adanya penurunan pH seiring dengan meningkatnya waktu fermentasi. Hal ini

menunjukkan bahwa semakin lama fermentasi, maka semakin banyak asam laktat yang dihasilkan. Selain itu,

menurut Askar & Sugiarto (2005) nilai pH produk yogurt biasanya berkisar antara 3,7 – 4,2. Sedangkan

yogurt hasil fermentasi pada penelitian ini paling rendah memiliki pH 5,26. Hal ini sesuai dengan uji media

cair, bahwa untuk mencapai pH < 5 dengan menggunakan bakteri yang telah diisolasi, maka diperlukan

waktu mencapai 20 jam. Oleh karena itu, untuk mencapai nilai pH yang sesuai dengan saran Askar &

Sugiarto (2005), maka diperlukan waktu fermentasi yang lebih lama.

Tabel 1 pH yogurt hasil fermentasi dengan perbedaan waktu inkubasi.

Waktu Inkubasi (jam) pH

5 5,98

7 5,62

9 5,26

Kadar riboflavin

Kadar riboflavin ditentukan dengan menggunakan metode KCKT sesuai dengan metode yang

disarankan oleh Barna & Dworschák (1994) dengan beberapa modifikasi. Hasil analisis kadar riboflavin

ditunjukkan pada Tabel 2. Hanya 2 waktu fermentasi yang ditentukan kadar riboflavinnya pada penelitian ini,

yaitu 5 dan 7 jam. Hasil analisis menunjukkan bahwa kadar riboflavin berkurang seiring dengan

meningkatnya waktu fermentasi. Hal ini sesuai dengan hasil yang diungkapkan oleh Alm (1982), yaitu terjadi

penurunan kadar riboflavin setelah proses fermentasi. Meskipun penurunan kadar riboflavin yang teramati

oleh Alm (1982) tidak terlalu drastis. Penurunan kadar riboflavin dapat terjadi karena riboflavin digunakan

oleh bakteri sebagai salah satu nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan baketri tersebut. Meskipun pada

umumnya BAL menurunkan kadar riboflavin ketika digunakan untuk fermentasi susu, namun ada juga BAL

yang mampu meningkatkan kadar riboflavin (Kneifel et al. 1992). Hal ini menunjukkan adanya perbedaan

kemampuan sintesis riboflavin yang tergantung jenis bakteri yang digunakan.

Tabel 2 Kadar riboflavin yogurt hasil fermentasi dengan perbedaan waktu inkubasi.

Sampel Waktu retensi (menit) Luas puncak Kadar riboflavin

(ppm)

Standar riboflavin 4,936 1019,75 200

Susu murni 4,937 26,37 5,17

Yogurt 5 jam 4,947 24,04 4,17

Yogurt 7 jam 4,893 15,54 3,04

Aktivitas antibakteri

Hasil uji aktivitas antibakteri ditunjukkan pada Gambar 2A (B. subtillis) dan Gambar 2B (E. coli). B .

subtilis mewakili bakteri Gram positif, sedangkan E. coli mewakili bakteri Gram negatif. Hasil uji

menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri tertinggi ditunjukkan pada yogurt setelah inkubasi selama 7 jam.

Pada yogurt yang diinkubasi selama 9 jam, aktivitas antibakteri terdeteksi turun. Hal ini kemungkinan terjadi

karena senyawa antibakteri yang dihasilkan sebelumnya mulai mengalami degradasi sehingga aktivitas

antibakterinya berkurang.





(A) (B)

Gambar 2 Hasil uji aktivitas antibakteri yogurt yang difermentasi dengan bakteri hasil isolasi dari yogurt

komersial selama 5, 7 dan 9 jam terhadap (A) B. subtilis dan (B) E. coli. Tanda (+) menunjukkan

kontrol positif menggunakan ampisilin 10 µg/mL dan (-) menunjukkan susu murni.

IV. KESIMPULAN

Bakteri yang berhasil diisolasi pada penelitian ini berbentuk bulat, namun untuk menentukan

taksonominya lebih lanjut diperlukan penelitian lebih lanjut. Bakteri yang berhasil diisolasi menghasilkan

yogurt dengan pH yang lebih tinggi dari yang diharapkan.

Kadar riboflavin yogurt hasil fermentasi dengan menggunakan bakteri yang diisolasi berkurang seiring

dengan meningkatnya waktu fermentasi, yang menunjukkan kemungkinan digunakannya riboflavin sebagai

nutrisi untuk pertumbuhan bakteri. Aktivitas antibakteri paling tinggi terdeteksi pada sampel yogurt yang

diinkubasi selama 7 jam.

V. UCAPAN TERIMA KASIH

Kami mengucapkan terima kasih kepada U. Juharia dan Maman Tardi sebagai teknisi Laboratorium

Biokimia FMIPA Unpad yang telah membantu terlaksananya penelitan ini.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Alm, L. 1982. Effect of Fermentation on B-Vitamin Content of Milk in Sweden. Journal of Dairy Science.

65(3): 353–359.

Askar, S. & Sugiarto. 2005. Uji kimiawi dan organoleptik sebagai uji mutu yogurt. Prosiding Temu Teknis

Nasional Tenaga Fungsional Pertanian. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan. Bogor,

13-14 September 2005. 108-113.

Aymerich, T., Artigas, M.T., Monfort, J.M. & Hugas, M. 2000. Effect of sausage ingredients and additives

on the production of enterocins A and B by Enterococcus faecium CTC492. Optimization of in

vitro production and anti-listerial effect in dry fermented sausages. Journal of Applied

Microbiology. 88: 686 - 694.

Ball, G.F.M. 2005. Vitamins in foods: analysis, bioavailability, and stability. CRC Press; New York.

Barna, É. & Dworschák, E. 1994. Determination of thiamine (vitamin B1) and riboflavin (vitamin B2) in

meat and liver by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A.

668(2): 359–363.

Burgess, C., O'connell-Motherway, M., Sybesma, W., Hugenholtz, J. & van Sinderen, D. 2004. Riboflavin

production in Lactococcus lactis: potential for in situ production of vitamin-enriched foods.

Applied and Environmental Microbiology. 70: 5769 - 5777.

Cleveland, J., Montville, T.J., Nes, I.F. & Chikindas, M.L. 2001. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials

for food preservation. International Journal of Food Microbiology. 71: 1 – 20.

Gemechu, T., Beyene, F. & Eshetu, M. 2015. Physical and chemical quality of raw cow's milk produced and

marketed in Shashemene Town, Southern Ethiopia. ISABB-Journal of Food and Agricultural

Sciences. 5(2): 7 – 13.





Kneifel, W., Kaufmann, M., Fleischer, A. & Ulberth, F. 1992. Screening of commercially available

mesophilic dairy starter cultures: biochemical, sensory, and microbiological properties. Journal of

Dairy Science. 75: 3158 - 3166.

Nurdiana, M. 2002. Aktivitas dan identifikasi golongan senyawa antibakteri yogurt dari tiga kultur campuran

bakteri. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Rajagopal, S.N. & Sandine, W.E. 1988. Associative growth and proteolysis of Streptococcus thermophillus

and Lactobacillus bulgaricus in skim milk. Journal of Dairy Science. 73: 894 – 899

Tamine, A.Y. & Robinson, R.K. 1999. Yogurt: Science and Technology. 2nd

ed. CRC Press: New York.

Tolouie, H., Toloun, S.H.H., Ejtahed, H.S. & Jalaliani, H. 2013. Assessment of Vitamin B2 and B3 Contents

of Conventional and Probiotic Yogurt after Refrigeration by High Performance Liquid

Chromatography. Journal of Pakistan Medical Students. 3(3): 148 – 151.

Penentuan Kadar Riboflavin dan Uji Pendahuluan Aktivitas ... 2016/PDF/108-113... · Penentuan Kadar...

Documents

Transcript of Penentuan Kadar Riboflavin dan Uji Pendahuluan Aktivitas ... 2016/PDF/108-113... · Penentuan Kadar...