11

PENDAHULUANLatar Belakang

Salah satu pendekatan untuk melakukan penghematan dalam pemakaian pupuk anorganik, yakni meningkatkan efisiensi penggunaan N tersedia dalam tanah melalui penambatan N2, baik secara langsung ataupun melalui interaksi antara tanaman legum denganbakteri penambat N2, baik yang diaplikasikan melalui tanah atau benih (seed coating) mampu meningkatkan efisiensi pemupukan N (Azizah, 2011).

Bakteri penambat nitrogen yang terdapat didalam akar kacang-kacangan adalah jenis bakteri Rhizobium. Bakteri ini masuk melalui rambut-rambut akar dan menetap dalam akar tersebut dan membentuk bintil pada akar yang bersifat khas pada kacang kacangan. Belum diketahui sepenuhnya bagaimana rhizobium masuk melalui rambut rambut akar, terus ke dalam badan akar dan selanjutnya membentuk bintil bintil akar (Ratna, 2007).

Rhizobium yang berasosiasi dengan tanaman legum mampu menfiksasi 100-300 kgN/ha dalam satu musim tanam dan meninggalkan sejumlah N untuk tanaman berikutnya. Rhizobium mampu mencukupi 80% kebutuhan nitrogen tanaman legum dan meningkatkanproduksi antara 10-25%. Tanggapan tanaman sangat bervariasi tergantung pada kondisi tanah dan efektifitas populasi mikroorganisme tanah (Azizah, 2011).

Inokulasi dilakukan bila di dalam tanah tidak ada spesies Rhizobium atau kalau terdapat sedikit jumlahnya dan tidak efektif. Dalam kondisi seperti ini, inokulasi dapat membentuk populasi galur yang efektif sehingga menghasilkan tanaman legum yang lebih baik perbintilannya. Inokulasi Rhizobium pada kedelai juga bertujuan agar menghasilkan nodulasi yang efektif serta untuk menempatkan populasi Rhizobium ke dalam tanah dalam jumlah cukup besar dan bertahan hidup sebagai sumber inokulum tanaman berikutnya. Namun demikian, inokulasi Rhizobium hanya efektif bilamana pupulasi Rhizobium alam rendah, sehingga diperlukan takaran inokulasi yang tepat untuk mengoptimalkan fungsi Rhizobium sebagai agen pemfiksasi nitrogen (Nasikah, 2007).Tujuan Percobaan

Adapun tujuan percobaan ini adalah untuk mengetahui cara mengisolasi dan mempurifikasi rhizobium.

Kegunaan Percobaan

Sebagai salah satu syarat untuk dapat mengikuti praktikal test di Laboratorium Ekologi dan Biologi Tanah Departemen Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan.

Sebagai bahan informasi bagi pihak yang membutuhkan.

TINJAUAN PUSTAKA

Rhizobium

Rhizobium termasuk divisi Protophyta, kelas Schizomycetes, order Eubacteriales, famili Rhizobiaceae dan genus Rhizobium. JORDAN (1982) mengklasifikasikan genus Rhizobium menjadi dua grup yaitu Rhizobium dengan ciri tumbuh cepat dan bereaksi asam pada medium agar dan Bradyrhizobium dengan ciri tumbuh lambat dan bereaksi alkalin pada media agar. Morfologi koloni Rhizobium pada media agar berdiameter 2 4 m sedangkan Bradyrhizobium adalah genus bakteri dengan diameter 1 m dan mempunyai kecepatan pertumbuhan lebih lambat pada agar mannitol ekstrak khamir dibandingkan dengan Rhizobium Rhizobium mempunyai kecepatan tumbuh 3 5 hari, sedangkan Bradyrhizobium 5 7 hari (Armiadi, 2009).

Dalam melakukan penanaman kacang-kacangan di daerah yang baru dibuka atau lahan yang lama tidak ditanami dengan tanaman kacang-kacangan seperti kedelai, kacang tanah, kacang hijau dan lain-lain maka inokulasi dengan bakteri Rhizobium selalu dianjurkan. Dewasa ini inokulasi dapat dilakukan dengan bahan penular bakteri Rhizobium diantaranya Legin, Nitragin, Rhizobium japonicum, Rhizobium leguminosarum, dan lain-lain. Bahan inkulum tersebut mengandung biakan bakteri Rhizobium yang berfungsi sebagai pengikat nitrogen udara karena adanya proses simbiosa bakteri dan tanaman (Azizah, 2011).

Bakteri Rhizobium memiliki keunikan dibanding dengan mikroorganisme tanah lainnya dalam kemampuannya bersimbiosis dengan penambatan N2 dengan tanaman polong-polongan. Agar dapat melakukan simbiosis, Rhizobium tidak hanya harus bisa hidup secara saprofit, tetapi juga harus dapat mengalahkan (berkompetisi) dengan Rhizobium yang lain dalam memperoleh tempat infeksi pada akar tanaman polong-polongan. Oleh karena itu kemampuan fisiologisnya untuk bertahan dalam keadaan yang bagaimanapun merupakan syarat yang penting agar dapat beradaptasi pada lingkungan yang banyak persaingan dan lingkungan tanah yang kompleks. Suhu optimal untuk Rhizobium berkisar antara 180C-260C, minimal 30C dan maksimal 450C. Sedangkan kisaran pH optimal untuk Rhizobium adalah sedikit di bawah netral hingga agak alkali, kendati demikian pada pH 5.0 beberapa strain Rhizobium masih dapat bertahan hidup (Nasikah, 2007).

Bakteri Rhizobium leguminosarum terdapat pada hampir semua tanaman kacang-kacangan. Bakteri Rhizobium phaseoli dapat ditemukan pada bintil akar tanaman buncis dan Rhizobium japonicum pada tanaman kedelai. Tanaman kacang-kacangan yang memiliki banyak bintil akar dapat menambat nitrogen dari udara lebih banyak sehingga dapat menyebabkan peningkatan produksi (Surtiningsih, dkk, 2009).Inokulasi Rhizobium

Inokulasi dilakukan bila di dalam tanah tidak adanya spesies Rhizobium, atau kalau terdapat sedikit jumlahnya sehingga tidak efektif. Dalam kondisi seperti ini, inokulasi dapat membentuk populasi galur yang efektif yang menghasilkan tanaman legum yang lebih baik perbintilannya. Inokulasi Rhizobium pada kedelai juga bertujuan agar menghasilkan pembintilan secara tepat dan efektif serta untuk menempatkan populasi Rhizobium kedalam tanah dalam jumlah cukup besar dan bertahan hidup sebagai sumber inokulum tanaman berikutnya (Risnawati, 2010).

Keberhasilan dari suatu proses inokulasi sangat ditentukan oleh kemampuan adaptasi, toleransi serta aktifitas dari inokulan itu sendiri terhadap lingkungannya. Tidak ada satupun perangkat kondisi yang memuaskan bagi pembiakan semua bakteri di laboratorium. Bakteri amat beragam baik dalam persyaratan nutrisi maupun fisiknya. Beberapa bakteri mempunyai persyaratan nutrien yang sederhana, sedangkan yang lain mempunyai persyaratan yang rumit. Beberapa spesies tumbuh pada suhu serendah 0oC, sedangkan yang lain tumbuh pada suhu sampai 75oC. Maka kondisi lingkungan tumbuh harus disesuaikan sehingga dapat menguntungkan bagi kelompok bakteri tertentu. Selain menyediakan nutrien yang sesuai untuk biakan bakteri, juga perlu disediakan kondisi fisik yang memungkinkan pertumbuhan optimum. Bakteri tidak hanya bervariasi dalam persyaratan nutrisinya, tetapi juga menunjukkan respons yang berbeda-beda terhadap kondisi fisik di dalam lingkungannya. Untuk berhasilnya kultivasi berbagai tipe bakteri, dibutuhkan suatu kombinasi nutrien serta lingkungan fisik yang sesuai (Yani, 2011).

Sejumlah besar Rhizobium dapat hilang, (tidak berkembang) salah satunya

dapat disebabkan oleh keasaman tanah. Kisaran pH yang sangat rendah akan mempengaruhi perkembangan Rhizobium dan bahkan menghambat proses infeksi bakteri tersebut. Pada keadaan masam, agar perlakuan inokulasi Rhizobium efektif maka perlu dilakukan penambahan kapur untuk menaikkan pH tanah, mengurangi kelarutan Al dan menaikkan ketersediaan Mo (Risnawati, 2010).Purifikasi Rhizobium

Bintil akar diambil dari beberapa pohon Acacia mangium yang tumbuh pada tanah mineral dan Acacia crassicarpa pada tanah gambut. Pengumpulan isolat, pemurnian dan autentifikasi Rhizobium pada bintil akar menggunakan metode yang digunakan Somasegaran dan Hoben (Heryati, 2007).

Di dalam bintil akar tidak hanya terdapat satu galur bakteri Rhizobium saja, mungkin dua atau lebih galur hidup bersama-sama di dalam satu bintil akar. Galur Rhizobium. pada suatu tempat mungkin tidak terdapat di tempat lain. Dengan isolasi dan pemurnian ini diharapkan dapat diperoleh galur-galur Rhizobium yang murni, efektif dan dapat di pindahkan dari satu tempat ke tempat lain dengan prektis dan biaya murah. Dalam isolasi dan pemurnian ini digunakan media kaya manitol Ekstrak Khamir (MEK) di mana semua mikroorganisme (bakteri dan cendawan) dapat tumbuh di dalamnya. Sehingga untuk mencegah kontaminasi, harus diperhatikan kebersihan dan kesterilan meja kerja dan pelaksana (Prijono, 2012).

Isolasi bintil akar dilaksanakan secara langsung dari bintil akar yang telah dikumpulkan. Pemurnian bintil disterilkan dengan mencelupkan bintil akar ke dalam larutan etanol 95% selama 10 detik, dan kemudian direndam dalam larutan H2O2 5% selama 3 menit. Setelah itu bintil dibilas dengan air steril sebanyak 5 kali. Bintil-bintil tersebut kemudian dimasukkan ke cawan petri yang telah ditetesi dengan 2 tetes larutan fisiologis steril (NaCl 0.85%) dan digerus dengan menggunakan batang pengaduk steril sampai terbentuk suspensi. Dengan menggunakan jarum ose, suspensi tersebut digoreskan ke cawan petri yang berisi YEMA yang telah diberi pewarna Congo Merah (Heryati, 2007).BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu

Percobaan ini dilakukan di Laboratorium Ekologi dan Biologi Tanah Program Studi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara, Medan dengan ketinggian tempat 25 meter diatas permukaan laut. Percobaan ini dilakukan pada hari Rabu, pukul 09.20 WIB sampai dengan selesai.Bahan dan Alat

Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah bintil akar yang berwarna kemerahan yang akan diambil rhizobiumnya untuk diisolasi kemudian dipurifikasi, air digunakan untuk membersihkan bintil akar yang masih bercampur dengan tanah, alkohol 96% digunakan untuk mensterilkan bintil akar yang akan digunakan, larutan CaCl2 digunakan untuk pengoleksian bintil akar, kapas, aluminium foil dan cling warp digunakan untuk menutup media yang akan digunakan, K2HPO4, MgSO4, NaCl, Manitol, Yeast Extract, Aquadest dan agar digunakan untuk membuat media tempat tumbuh rhizobium, HCl digunakan untuk menurunkan pH jika pH media tinggi, NaOH digunakan untuk menaikkan pH jika pH media rendah, kertas koran digunakan sebagai pembungkus pada saat sterilisasi, tissue digunakan untuk membersihkan bintil akar, serta bahan-bahan lain yang mendukung dalam percobaan ini.

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah gunting digunakan untuk memotong bintil akar, petridish digunakan sebagai wadah atau tempat media, erlenmeyer digunakan sebagai wadah media sementara sebelum dituangkan ke dalam petridish, kompor digunakan untuk memasak media yang akan digunakan, panci digunakan sebagai wadah dalam memasak pembuatan media, pengaduk digunakan untuk mengaduk larutan media, penjepit digunakan untuk menjepit erlenmeyer yang berisi media yang akan dicairkan, jarum ose digunakan untuk mengisolasi rhizobium, bunsen digunakan untuk mensterilkan jarum ose, masker digunakan untuk menutup mulut pada saat mengisolasi dan purifikasi, laminar air flow digunakan sebagai tempat untuk mengisolasi dan purifikasi, timbangan digunakan untuk menimbang bahan-bahan yang akan digunakan dalam pembuatan media, pH meter digunakan untuk mengukur pH larutan media, sendok digunakan untuk mengambil bahan-bahan yang akan ditimbang, piset digunakan untuk memecahkan bintil akar, serta alat lain yang mendukung dalam percobaan ini.

Prosedur Percobaan

A. Pengambilan Bintil Akar

Dibersihkan akar tanaman kedelai (Glysine max L.) dengan menggunakan air kran yang mengalir.

Dipotong bintil akar dengan menggunakan gunting.

Dibersihkan akar dengan menggunakan aquadest, kemudian dengan alkohol dan dicuci kembali dengan menggunakan aquadest.

B. Pengoleksian Bintil Akar

Disiapkan tabung yang berukuran 10 mL.

Dimasukkan CaCl2 ke dalam tabung hingga 1/3 bagian.

Kemudian CaCl2 ditutupi dengan menggunakan kapas sampai menutupi seluruh bagian CaCl2.

Diletakkan bintil yang telah bersih ke dalam tabung, kemudian ditutup dengan kapas dan aluminium foil.

C. Pembuatan Media

Ditimbang masing-masing bahan yang akan digunakan dalam pembuatan media.

Diberi aquadest pada larutan bahan tersebut.

Diukur pH media dengan menggunakan pH meter.

Jika pH tinggi maka perlu ditambahkan HCl, dan apabila pH rendah maka perlu ditambahkan NaOH.

Dipenuhkan larutan dengan menambahkan aquadest hingga 500 mL.

Dimasak bahan tersebut dan ditambahkan agar hingga mendidih.

Setelah mendidih maka larutan tersebut dimasukkan ke dalam erlenmeyer.

Ditutup erlenmeyer dengan menggunakan kapas, aluminium foil dan cling warp.

Disterilisasi bahan tersebut dengan menggunakan autoklaf selama 30 menit.

Didiamkan hingga media tersebut dingin, kemudian dicairkan kembali dengan cara memasak media tersebut beserta erlenmeyernya.

Dituangkan media tersebut ke dalam petridish dan ditutup dengan cling warp.

Didinginkan media tersebut beberapa saat.

Setelah dingin media siap untuk dijadikan tempat inokulasi rhizobium.

D. Inokulasi Rhizobium

Bintil akar yang telah dibersihkan dibilas dengan aquadest, kemudian dicuci dengan alkohol 96% dan direndam dalam air steril.

Dipecahkan bintil akar dengan menggunakan pinset.

Digoreskan cairan campuran leghemoglobin pada media di laminar air flow.

Ditutup petridish dengan menggunakan cling warp.

E. Purifikasi Rhizobium

Setelah rhizobium tumbuh selama seminggu, maka perlu dilakukan purifikasi (pemurnian) agar tidak terkontaminasi dengan mikroba yang lainnya.

Diambil rhizobium yang telah tumbuh dengan menggunakan jarum ose.

Kemudian digoreskan pada media yang baru untuk mendapatkan hasil murni dari rhizobium.

Ditunggu beberapa saat hingga rhizobium tersebut tumbuh dan berkembang.DAFTAR PUSTAKA

Azizah. 2011. Pengaruh Tiga Inokulan Bakteri Rhizobium Terhadap Pembentukan Bintil Akar Tanaman Kedelai (Glycine max L. Merril). Universitas Andalas, Padang.

Dewi, I. R. A. 2007. Fiksasi N Biologis pada Ekosistem Tropis. Universitas Padjajaran, Bandung.

Nasikah. 2007. Pengaruh Inokulasi Rhizobium dan Waktu Pemberian Pupuk N (Urea) Terhadap Pertumbuhan dan Hasil Kedelai di Lahan Sawah Setelah Kedelai (Glycine max (L.) Merril). Universitas Islam Negeri Malang, Malang.

Armiadi. 2009. Penambatan Nitrogen Secara Biologis Pada Tanaman Leguminosa. Balai Penelitian Ternak, Bogor.

Surtiningsih, T., Farida., T, Nurhayati. 2009. Biofertilisasi Bakteri Rhizobium Pada Tanaman Kedelai (Glycine max (L.) Merr.). Universitas Airlangga, Surabaya.

Risnawati. 2010. Pengaruh Pemberian Pupuk Urea dan Beberapa Formula Pupuk Hayati Rhizobium Terhadap Pertumbuhan dan Hasil Kedelai (Glycine max (L.) Merril) di Tanah Masam Ultisol. Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang.

Yani, R. 2011. Karakteristik Kemampuan Melarutkan Fosfat Bakteri Pelarut Fosfat Asal Tithonia diversifolia pada Media Agar Ekstrak Tanah. Universitas Andalas, Padang.

Arsyad, R. H. 2007. Penggunaan Rhizobium dan Mikrob Pelarut Fosfat (MPF) untuk Memperbaiki Pertumbuhan Bibit Akasia (Acacia mangium dan Acacia crassicarpa). Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Prijono, S. 2012. Intruksi Kerja Laboratorium Biologi Tanah. Universitas Brawijaya, Malang.Inokulasi Rhizobium

Bakteri Rhizobium telah lama digunakan sebagai pupuk hayati terhadap tanaman kacang-kacangan karena dapat membentuk bintil akar sehingga dapat mengikat nitrogen bebas. Secara umum inokulasi dilakukan dengan memberikan biakan Rhizobium kedalam tanah agar bakteri ini berasosiasi dengan tanaman kedelai mengikat N2 bebas dari udara (Azizah, 2011).

Inokulum berisi bakteria yang harus senantiasa dijaga tetap hidup. Setiap paket yang berisi inokulum pada umumnya memiliki tanggal kadaluarsa. Setelah tanggal ini, bakteria tidak hidup dan inokulum seharusnya tidak diunakan lagi. Periode panas yang pendek dapat menurunkan jumlah Rhizobia yang hidup, paket yang berisi inokulum seharusnya disimpan di tempat dingin dan terhindar sinar matahari langsung. Penyimpanan yang lebih disukai oleh inokulum adalam dalam lemari es (tetapi bukan dalam freezer) (Dewi, 2007).

Keberhasilan dari suatu proses inokulasi sangat ditentukan oleh kemampuan adaptasi, toleransi serta aktifitas dari inokulan itu sendiri terhadap lingkungannya. Tidak ada satupun perangkat kondisi yang memuaskan bagi pembiakan semua bakteri di laboratorium. Bakteri amat beragam baik dalam persyaratan nutrisi maupun fisiknya. Beberapa bakteri mempunyai persyaratan nutrien yang sederhana, sedangkan yang lain mempunyai persyaratan yang rumit. Beberapa spesies tumbuh pada suhu serendah 0oC, sedangkan yang lain tumbuh pada suhu sampai 75oC. Maka kondisi lingkungan tumbuh harus disesuaikan sehingga dapat menguntungkan bagi kelompok bakteri tertentu. Selain menyediakan nutrien yang sesuai untuk biakan bakteri, juga perlu disediakan kondisi fisik yang memungkinkan pertumbuhan optimum (Yani, 2011).

Metode jarum ini terutama berguna apabila nodula segar dipanen berukuran 2 mm atau berdiameter besar. Nodula pertama kali dicuci menggunakan air, kemudian masukkan ke dalam alkohol dan dipegang menggunakan gunting tang dan lewatkan ke dalam api. Permukaan akan steril, nodule diletakkan ke dalam kertas saring steril (2x2 cm) dalam cawan petridis. Setiap kertas saring berlaku untuk satu jarum (Dewi, 2007).