PENAPISAN MUTASI GEN BETA GLOBIN...

PENAPISAN MUTASI GEN BETA GLOBIN

PADASISWI SMAN 1 SUKARAJA SUKABUMI

Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA KEDOKTERAN

OLEH :

RAISSYA ARMILLA

11141030000012

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI

SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

1439 H / 2017 M

iv

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum Wr. Wb

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat

dan nikmat yang telah diberikan sehingga penulis dapat belajar higga tepat pada

waktunya penulis harus menuliskan laporan penelitian ini. Penulis menyadari, tanpa

bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak maka penelitian ini tidak akan pernah

terselesaikan. Oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih:

1. Kepada Prof. Dr. H. Arif Sumantri, SKM, M.Kes, Prof. Dr. dr. Sardjana, Sp.OG

(K), SH, Yardi, PhD, Apt, Fase Badriah, SKM, M.Kes, Ph.D selaku Dekan dan

Wakil Dekan FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Kepada dr. Nouval Shahab, SpU, Ph.D, FICS, FACS selaku Ketua Program

Studi Kedokteran dan Profesi Dokter atas kesempatan yang diberikan kepada

penulis untuk menggali ilmu di PSKPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Kepada Bapak Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD selaku pembimbing 1

yang telah mempercayai untuk bergabung dalam penelitian Beliau, serta tak

pernah lelah untuk mencurahkan waktu, tenaga, semangat, dan ilmunya untuk

berbagi bersama penulis dan timnya. Serta, selaku penanggung jawab modul

riset yang turut memupuk semangat penulis untuk menyelesaikan penelitian ini

tepat pada waktunya dan pembimbing akademik peneliti.

4. Kepada dr. Yanti Susianti SpA(K) selaku pembimbing 2 yang turut

mencurahkan waktu, tenaga, semangat, dan ilmunya serta tak pernah lelah untuk

mengoreksi laporan penelitian ini.

5. Kepada dr. Hari Hendarto, Sp.PD-KEMD, PhD, FINASIM selaku penguji 1 dan

Ibu Dr. Zeti Harriyati, S.Si, M.Biomed selaku penguji 2 yang telah

menyempatkan waktunya untuk menguji pada ujian skripsi.

6. Kepada dua orang tercinta, orang tua saya, Arif Sumantri dan Almarhumah

Jamilla Upik Noras yang mungkin tidak dapat melihat saya lagi dalam

menyelesaikan skripsi ini, namun saya berterima kasih atas limpahan kasih

sayang dan pengorbanan yang tak dapat terbalaskan oleh apapun. Terimakasih

v

banyak atas doa yang senantiasa mengiringi langkah putrimu, atas perjuangan

yang tak kenal lelah selama mencari responden satu per satu, dan atas kesabaran

yang telah mengajarkan putrimu banyak hal.

7. Kepada kakak tersayang, dr. Arifah Shabrina, terimakasih atas doa dan

dukunganmu, semoga kelak peneliti bisa mengikuti langkahnya sebagai dokter

muslim.

8. Kepada dr. Siti Nur Aisyah Jauharoh, Ph.D terimakasih atas perannya yang turut

serta memberikan dukungan dalam menyelesaikan laporan ini.

9. Kepada Nenek tersayang, R. Aisyah dan Hj. Satiti Ruslan Atmowiryo yang

senantiasa mengiringi langkah cucunda dengan doa hingga penulis kelak akan

menjadi seorang dokter.

10. Kepada saudara-saudara: Atha, Rahma, dan Zulfa, serta Pakde Uun dan Cik

Salma. Terimakasih atas doanya dan dukungan yang diberikan kepada penulis.

11. Kepada saudara-saudara yang ada di Jawa dan Sumatera yang mungkin tidak

dapat disebutkan satu per satu .

12. Kepada Ajeng Ristia yang telah senantiasa menemani penulis untuk menyusun

laporan ini, serta suka duka bersama membaca hasil sequence DNA.

13. Teman-teman satu kelompok penelitian: Ajeng Ristia, Nurul Fathimah, M. Rizki

Ramadhan. Terimakasih atas kerjasama dimulai dari tahun 2014 setelah modul

riset tingkat 1 hingga sekarang yang luar biasa selama melakukan penelitian dan

menyusun laporan penelitian. Tidak pernah mengenal lelah dalam kegagalan

membaca hasil PCR dan Elfor. Kegagalan kami adalah canda tawa dan

pembelajaran yang berharga untuk kami.Tiga tahun sudah kita berjalan bersama,

terhitung cukup lama namun berbuah hasil yang menyenangkan.

14. Sahabat-sahabat yang turut mewarnai hari-hari selama masa kuliah; Putri Rahma

Azizah, Desy Islamiati, Amalina Fitrasari, Selvia Oktaviani A, Harningtyas

Alifin Jasmin, Nida Rania, dan Sherly Trisna. Terimakasih untuk selalu ada saat

suka dan duka. Terimakasih untuk tak pernah lelah untuk mengingatkan.

15. Sahabat yang setia menemani saat down ataupun saat hampir menyerah untuk

melanjutkan penelitian: Witha Novialy dan Putri Rahma Ajizah. Tawa dan

vi

semangat kalian tidak pernah terlupakan oleh penulis untuk melanjutkan

penelitian hingga tuntas, dengan kalian penulis merasakan artinya persahabatan.

Terimakasih Pujah dan Witha.

Penulis menyadari bahwa laporan penelitian ini masih jauh dari kata sempurna. Oleh

karena itu saran dan kritik dari berbagai pihak sangat penulis harapkan. Demikian

laporan penelitian ini penulis susun, semoga bermanfaat bagi perkembangan ilmu

kedokteran di Indonesia. Aamiin.

Wassalamu’alaikum Wr. Wb

Ciputat, 16 Juni 2017

Penulis

vii

ABSTRAK

Raissya Armilla. Program Studi Kedokterandan Profesi Dokter. Penapisan Mutasi Gen

Beta Globin pada Siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi.

Mutasi beta globin merupakan mutasi yang menyebabkan penyakit thalassemia. Thalassemia

adalah suatu penyakit herediter yang ditandai dengan berkurangnya produksi hemoglobin (Hb)

yang tidak adekuat sebagai akibat berkurangnya atau tidak adanya sintesis rantai polipeptida

globin. Tujuan penelitian ini untuk melakukan penapisan mutasi gen beta globin pada siswi

SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. Penelitian ini menggunakan metode deskriptif, jumlah sampel

sebanyak 81 orang dari satu sekolah dengan rentang usia 15-18 tahun yang telah dipilih secara

Simple Random Sampling. Pengambilan darah dilakukan untuk memeriksa kadar hemoglobin,

dan mutasi beta globin dengan menggunakan PCR dan sequencing DNA. Tipe mutasi yang

terbanyak yaitu heterozigot IVSI-5 G>C frekuensi 5% dengan sifat patogenik. Sedangkan untuk

non patogenik kami dapatkan pada mutasi kombinasi CD 2 T>C dan IVSII-16 G>C.

Kata kunci: Beta globin, Hb, IVSI-5 G>C, CD 2 T>C, IVSII-16 G>C.

ABSTRACT

Raissya Armilla. Medical Education Study Program and Doctor Profession. Screening

Mutation of Beta Globin Gene on the Students of SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi.

Beta globin mutation is a mutation which causes thalassemia disease. Thalassemia is a

hereditary disease characterized by inadequate production of hemoglobine (Hb) as a result of

reduced or absent globin polypeptide chain synthesis. The purpose of this research is to screen

the mutation of beta globin gene on the students of SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. This

researched used descriptive method the amount of samples is 81 people from one school with

the age range 15-18 years that have been choosen by simple random sampling. Blood taking is

done to check hemoglobine levels and beta globin mutation by using PCR and DNA

sequencing.The type of mutation that we get the most is heterozygot IVSI-5 G>C frequency 5%

with pathogenic nature. As for non pathogenic we get on the combinationof CD 2 T>C and

IVSII-16 G>C.

Keywords: Beta globin, Hb, IVSI-5 G>C, CD 2 T>C, IVSII-16 G>C.

viii

DAFTAR ISI

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .... Error! Bookmark not defined.

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ............. Error! Bookmark not defined.

PENGESAHAN PANITIA UJIAN ............................ Error! Bookmark not defined.

KATA PENGANTAR ................................................................................................. iii

ABSTRAK .................................................................................................................. vii

DAFTAR ISI .............................................................................................................. viii

DAFTAR TABEL ........................................................................................................ xi

DAFTAR GAMBAR .................................................................................................. xii

DAFTAR GRAFIK .................................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................................. xiv

BAB I PENDAHULUAN ............................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ........................................................................................................... 3

1.3 Pertanyaan penelitian ...................................................................................................... 3

1.3 Tujuan Penulisan ............................................................................................................ 3

1.4 Manfaat Penulisan .......................................................................................................... 4

1.4.1 Peneliti ......................................................................................................................... 4

1.4.2 Civitas Akademika ...................................................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................. 5

2.1 Landasan Teori ............................................................................................................... 5

2.1.1 Thalassemia ............................................................................................................. 5

2.1.2 Klasifikasi Thalassemia ........................................................................................... 9

2.1.3 Patogenesis Thalassemia ....................................................................................... 11

2.2 Hemoglobin .................................................................................................................. 23

ix

2.3 Diagnosis Molekular ..................................................................................................... 27

2.4 Kerangka Teori ............................................................................................................. 31

2.5 Kerangka Konsep ......................................................................................................... 32

BAB III METODE PENELITIAN .......................................................................... 36

3.1 Desain Penelitian .......................................................................................................... 36

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................................... 36

3.3 Populasi dan Sampel ..................................................................................................... 36

3.3.1 Populasi Target ...................................................................................................... 36

3.3.2 Populasi Terjangkau .............................................................................................. 36

3.3.3 Perkiraan Besar Sampel ........................................................................................ 36

3.3.4 Kriteria Pemilihan Sampel .................................................................................... 37

3.3.5 Teknik Pengambilan Sampel ................................................................................. 37

3.4 Alat dan Bahan ............................................................................................................. 39

3.5 Cara Kerja Penelitian .................................................................................................... 40

3.5.1 Pengumpulan Data ................................................................................................ 40

3.5.2 Isolasi DNA ........................................................................................................... 41

3.5.3 Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA .............................................. 43

3.5.4 PCR ....................................................................................................................... 43

3.5.5 Analisis Fragmen DNA Menggunakan Elektroforesis .......................................... 46

3.5.6 Analisis Hasil Sequencing ..................................................................................... 46

3.5.7 Alur Kerja Penelitian ............................................................................................. 47

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................. 49

4.1 Hasil Pengamatan ......................................................................................................... 49

4.1.1 Hasil Isolasi Genom dari Darah Responden .......................................................... 49

4.1.2 Amplifikasi Gen β-globin Menggunakan PCR dan Sequencing ........................... 51

4.2 Pembahasan .................................................................................................................. 56

4.2.1 Analisa Mutasi Gen β-Globin ............................................................................... 56

4.2.2 Keterbatasan Penelitian ......................................................................................... 61

BAB V SIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... 61

5.1 Simpulan ....................................................................................................................... 61

5.2 Saran ............................................................................................................................. 61

x

PERNYATAAN PENELITIAN ................................................................................. 62

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 63

LAMPIRAN ................................................................................................................ 68

Lampiran 1. Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian .................................... 68

Lampiran 2. Lembar Persetujuan Responden ................................................................. 69

Lampiran 3. Alat dan Bahan Penelitian .......................................................................... 71

Lampiran 4. Gel Documentation Hasil Elektroforesis Agarose dari Produk PCR

Genom DNA Sampel. ............................................................................... 73

Lampiran 5. Hasil Sequence DNA yang Tidak Terbaca ................................................ 75

Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel. ...................................... 76

Lampiran 7. Hasil Sequencing DNA dan Pemeriksaan Hb ............................................ 79

xi

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Jenis Thalassemia Berdasarkan Sifat Homozigot dan Heterozigot ............ 10

Tabel 2.2 Parameter Hematologi Thalassemia ß......................................................... 22

Tabel 2.3 Diagnosis Banding Thalassemia dan Anemia Defisiensi Besi. .................. 22

Tabel 2.4 Perbedaan Fisik dan Kimia Antara Oksihemoglobindan Dioksihemoglobin.

..................................................................................................................................... 24

Tabel 2.5 Tabel Definisi Operasional ......................................................................... 33

Tabel 3.1 Alat dan Bahan Penelitian ........................................................................... 39

Tabel 3.2 Langkah Isolasi DNA.................................................................................. 41

Tabel 3.3 Komposisi mix PCR ................................................................................... 45

Tabel 3.4 Teknik PCR ................................................................................................. 45

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Diagnosis Hemoglobinopati Dengan Pemeriksaan DNA. .................. 7

Gambar 2.2 Prevalensi Hemoglobinopati di Dunia. ............................................... 8

Gambar 2.3 Patofisiologi Gejala Klinis Anemia pada Thalassemia ..................... 11

Gambar 2.4 Situs Splicing pada Gen ß Globin. .................................................... 16

Gambar 2.5 Lokasi Mutasi Penyebab Thalassemia- ß. ......................................... 17

Gambar 2.6 Apusan darah tepi pasien thalassemia ß–HbE heterozigot. .............. 21

Gambar 2.7 Apusan darah tepi pasien Hb E homozigot dengan gambaran

mikrositik hipokrom, sel target dan poikilosit lain. .......................... 21

Gambar 2.8 Proses pembentukan hemoglobin. .................................................... 26

Gambar 2.9 Aliran informasi genetik. .................................................................. 27

Gambar 2.10 Kerangka Teori ................................................................................. 31

Gambar 2.11 Kerangka Konsep .............................................................................. 32

Gambar 4.1 Hasil PCR Gen β-globin ................................................................... 50

Gambar 4.2.1 Interetasi Hasil SequencingNormal………………………………...52

Gambar 4.2.2 Interpretasi Hasil SequencingMutasi Heterozigot IVS I-5 G>C...... 52

Gambar 4.3.1 Interpretasi Hasil Sequencing Normal ........................................... ...53

Gambar 4.3.2 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Heterozigot Codon 2 T>C . ...53

Gambar 4.3.3 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Homozigot Codon 2 T>C .. ...53


Gambar 4.4.2 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Heterozigot IVS II-16 G>C ...53

Gambar 4.4.3 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Homozigot IVS II-16 G>C ...53


Gambar 4.5.2 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Heterozigot IVS II-74 T>G ...54

Gambar 4.5.3 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Homozigot IVS II-74 T>G ...54


Gambar 4.6.2 Interpretasi Hasil Sequencing MutasiHeterozigot IVS-II-81 C>T ...55

xiii

DAFTAR GRAFIK

Grafik 4.1 Persentase Mutasi Gen β-Globin. .............................................................. 52

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian ..............................68

Lampiran 2 Lembar Persetujuan Responden ..........................................................69

Lampiran 3 Alat dan bahan penelitian ....................................................................71

Lampiran 4 Gel Documentation hasil elektroforesis agarose dari produk PCR

genom DNA sampel ............................................................................74

Lampiran 5 Hasil Sequence DNA yang Tidak Terbaca .........................................75

Lampiran 6 Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel ...............................76

Lampiran 7 Hasil Sequencing DNA dan Pemeriksaan Hb ....................................79

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Thalassemia adalah suatu penyakit herediter pada sel darah merah

yang ditandai dengan berkurangnya produksi hemoglobin (Hb) yang tidak

adekuat sebagai akibat berkurangnya atau tidak adanya sintesis rantai

polipeptida globin.1

Prevalensi gen thalassemia mencapai 30-40% di Thailand bagian

utara dan Laos, 4,5% di Malaysia, dan 5% di Filipina.2

Untuk Indonesia

sendiri WHO menyatakan bahwa di Indonesia terdapat 6-10% orang dengan

thalassemia beta minor.2

Menurut data statistik, prevalensi penyakit thalassemia di dunia

cenderung semakin meningkat dari tahun ke tahun, termasuk di Indonesia.

Beberapa hasil riset menunjukkan angka kejadian thalassemia di Indonesia

cukup tinggi. Penelitian Injo LEL (1989) menyebutkan bahwa dari 36 pasien

thalassemia di RSCM yang berusia 3-22 tahun, ditemukan 23 pasien dengan

thalassemia dan 13 pasien thalassemia HbE.3

Data dari Pusat Thalassemia

Departemen Ilmu Kesehatan Anak (IKA) Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia (FKUI) Rumah Sakit Cipto Mangunkusomo (RSCM), sampai

dengan akhir tahun 2008 terdaftar 1.455 pasien thalassemia yang terdiri dari

50% thalassemia , 48,2% thalassemia /Hb-E, dan 1,8% pasien thalassemia

4

2

Diperkirakan tiap tahunnya di Indonesia lahir 2.500 anak dengan

thalassemia.4

Provinsi Jawa Barat merupakan daerah dengan prevalensi

thalassemia terbanyak se-Indonesia, yaitu sebanyak 42% dari total 6.647

orang.1,5

Di Sukabumi, berdasarkan informasi dari ketua Perhimpunan Orang

Tua Penderita Thalassemia Indonesia (POPTI) Cabang Sukabumi dr. Hasan

Basri mencatat sebanyak 150 anak di Sukabumi menderita thalassemia, yang

mengalami peningkatan cukup besar setiap tahunnya.3

Salah satu metode pencegahan adalah melakukan skrining pada

perempuan berusia 15-18 tahun, karena pada usia tersebut umumnya

perempuan sudah siap menikah.6

Metode skrining (penapisan) ini sangat

efektif dilakukan pada populasi masyarakat untuk menekan kejadian

thalassemia baru.7 Individu usia subur yang siap menikah mudah dijaring

melalui edukasi (penyuluhan) saat usia Sekolah Menengah Atas (SMA) dan

akan sangat bermanfaat sebagai “agent of change” untuk memutus rantai

thalassemia yang diturunkan dari perempuan atau calon ibu. Peneliti

melakukan diagnosis molekuler mutasi gen globin dengan menggunakan

metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dan sequencing DNA pada sampel

darah siswi SMAN 1 Sukaraja Sukabumi yang berusia 15-18 tahun sebagai

salah satu upaya deteksi dini terhadap kemungkinan penyakit thalassemia.

Penapisan mutasi gen globin ini diharapkan memberikan kontribusi dalam

peningkatan program promotif - preventif terhadap penekanan angka kejadian

thalassemia baru.

3

1.2 Rumusan Masalah

Bagaimana prevalensi individu dengan mutasi globin pada perempuan

berusia 15-18 tahun di wilayah Sukabumi?

1.3 Pertanyaan penelitian

1. Berapakah prevalensi mutasi globin pada remaja perempuan berusia 15-

18 tahun di wilayah Sukabumi?

2. Bagimana gambaran genotip remaja perempuan berusia 15-18 tahun di

Sukabumi?

3. Bagaimana variasi genetik globin pada remaja perempuan berusia 15-18

tahun di Sukabumi?

1.3 Tujuan Penulisan a. Tujuan Umum

Untuk mengetahui prevalensi mutasi globin pada remaja perempuan

berusia 15-18 tahun di wilayah Sukabumi.

b. Tujuan Khusus

Mengetahui gambaran genotip remaja perempuan berusia 15-18 tahun di

Sukabumi.

Mengetahui variasi genetik globin pada remaja perempuan berusia 15-

18 tahun di Sukabumi.

4

1.4 Manfaat Penulisan

Hasil penelitian diharapkan memiliki manfaat untuk:

1.4.1 Peneliti

a. Memiliki keterampilan bidang molekuler dalam mendeteksi adanya mutasi

genetik dengan menggunakan teknik PCR dan sequencing DNA.

b. Merupakan syarat kelulusan preklinik Program Studi Kedokteran dan

Profesi Dokter.

c. Menambah pengetahuan mengenai mutasi genetik globin.

1.4.2 Civitas Akademika

Sebagai sumber pengetahuan dan referensi bagi peneliti selanjutnya yang akan

melakukan penelitian genetik biomolekuler.

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Landasan Teori

2.1.1 Thalassemia

Thalassemia adalah suatu penyakit herediter yang ditandai dengan

berkurangnya produksi hemoglobin (Hb) yang tidak adekuat sebagai akibat

berkurangnya atau tidak adanya sintesis rantai polipeptida globin.

Thalassemia merupakan suatu penyakit herediter. Seiring dengan

meningkatnya jumlah pasien thalassemia, membawa kecenderungan

terjadinya peningkatan angka kematian akibat penyakit ini. Hal tersebut

disebabkan karena thalassemia memunculkan beberapa komplikasi/penyulit di

antaranya adalah kerentanan terhadap infeksi, anemia berat, gangguan

pertumbuhan fisik (tulang), serta mental. Menurut Ratna Agung dikutip dari

tesis yang berjudul Kendala Deteksi Mutasi: Thalassemia-β Sebagai Model,

Thalassemia adalah suatu penyakit genetik pada sel darah merah, yang

menyebabkan gangguan pada sintesis hemoglobin. Berdasarkan reduksi rantai

globinnya, thalassemia dibedakan menjadi 2 jenis yaitu thalassemia a (alfa)

dan b (beta). Bila yang mengalami gangguan pada rantai a maka disebut

sebagai thalassemia a (alfa) dan apabila yang terganggu ada pembentukan

rantai b (beta) maka disebut sebagai thalassemia b (beta). 8

6

Kedua penyakit ini merupakan penyakit dari hemoglobinopati.

Hemoglobinopati ialah sekelompok kelainan herediter yang ditandai oleh

gangguan pembentukan molekul hemoglobin.10

Kelainan ini dibagi

menjadi 2 golongan besar, yaitu:

1. Hemoglobinopati struktural

Disini terjadi perubahan struktur hemoglobin (kualitatif) karena

subsitusi satu asam amino atau lebih pada salah satu rantai peptida

hemoglobin.10

Hemoglobinopati yang penting sebagian besar

merupakan varian rantai beta.11

Contoh hemoglobinopati struktural

adalah penyakit Hb C, Hb E, dan Hb S.10

2. Sindrom Thalassemia

Thalassemia adalah suatu sindrom yang ditandai oleh penurunan

kecepatan sintesis atau absennya pembentukan satu atau lebih rantai

globin sehingga mengurangi sintesis hemoglobin normal

(kuantitatif).10

Sebagai akibatnya timbul ketidakseimbangan sintesis

suatu rantai, salah satu rantai disintesis berlebihan sehingga mengalami

presipitasi, membentuk Heinz bodies.10

Eritrosit yang mengandung

Heinz bodies tersebut mengalami hemolisis intrameduler sehingga

terjadi eritropoiesis yang inefektif, disertai pemendekan hidup eritrosit

yang beredar.10

Hal tersebut diikuti dengan kompensasi pembentukan

rantai globin lain sehingga membentuk konfigurasi lain.12

Misalnya

pada thalassemia beta, rantai beta tidak terbentuk, sehingga rantai alfa

mengalami ekses atau perannya melampaui batas yang mengakibatkan

presipitasi pada rantai ini.10

7

Hemoglobinopati adalah kelainan bawaan akibat adanya mutasi pada

gen yang mengatur pembentukan rantai globin. Perubahan pada gen

tersebut dapat mengakibatkan adanya perubahan susunan asam amino

pada rantai globin sehingga terbentuk rantai globin yang abnormal atau

terjadi perubahan kecepatan pembentukan rantai globin normal. Apabila

terjadi perubahan susunan amino pada rantai globin, maka disebut sebagai

hemoglobin varian sedangkan bila terjadi perubahan kecepatan

pembentukan rantai globin normal maka disebut thalassemia.

Hemoglobin varian merupakan kelainan globin yang sifatnya

kualitatif sedangkan thalassemia merupakan kelainan yang sifatnya

kuantitatif.7,8,9,13,15,16

Gambar 2.1 Diagnosis Hemoglobinopati Dengan Pemeriksaan DNA. 14

8

Berikut prevalensi hemoglobinopati di populasi dunia, Indonesia

masuk ke daerah South-East Asia dengan gen pembawa 5-40%.

Gambar 2.2 Prevalensi Hemoglobinopati di Dunia.14

9

2.1.2 Klasifikasi Thalassemia

Secara klinis thalassemia dapat dibedakan menjadi thalassemia

mayor, intermedia, dan minor.

Klasifikasi thalassemia :17

Klinis

1. Hidrops fetalis

Thalassemia – dengan delesi empat gen.

2. Thalassemia mayor

Tergantung transfusi, homozigot.

Thalassemia o

atau kombinasi sifat thalassemia lain.

3. Thalassemia intermedia

- Thalassemia homozigot

Thalassemia +

ringan homozigot.

Pewarisan bersama thalassemia .

Peningkatan kemampuan untuk membuat hemoglobin fetus

(produksi rantai - ).

- Thalassemia heterozigot

Pewarisan bersama gen globin- tambahan ( atau

).

Sifat thalassemia dominan.

- Thalassemia – dan hemoglobin fetus persisten herediter

Thalassemia – homozigot.

Thalassemia – thalassemia heterozigot.

Hb lepore homozigot (beberapa kasus).

10

- Penyakit hemoglobin H

4. Thalassemia minor

Sifat thalassemia -o.

Sifat thalassemia – +.

5. Hemoglobin fetus persisten herediter

Sifat thalassemia – .

Sifat thalassemia - o.

Sifat thalassemia - +.

Tabel 2.1 Jenis Thalassemia Berdasarkan Sifat Homozigot dan Heterozigot

Jenis Haplotipe Sifat thalassemia

heterozigot (minor)

Homozigot

Thalassemia

+

-

o - -/ MCV, MCH rendah Hidrops fetalis

+ - MCV, MCH berkurang

minimal Seperti thalassemia -

o

heterozigot

Thalassemia -

o MCV, MCH rendah (HbA2 >

3,5%) Thalassemia mayor (HbF

98% HbA2 2%)

+ MCV, MCH rendah (HbA2 >

3,5%) Thalassemia mayor atau

intermedia ( HbF 70-80%,

HbA 10-20%, HbA2

variabel)

Thalassemia

dan hemoglobin

fetus persisten

herediter

MCV. MCH rendah (HbF 5-

20%, HbA2 normal) Thalassemia intermedia

(HbF 100%)

Hb Lepor

Thalassemia

Thalassemia

dan hemoglobin

fetus persisten

MCV, MCH rendah (HbA

80-90%, Hb Lepore 10%,

HbA2 berkurang)

Thalassemia mayor atau

Intermedia (HbF 80%,

Hb Lepore 10-20%, HbA,

HbA2 tidak ada)

Sumber: Thompson MW, Mc Innes RR, Willard HF. The Hemoglobinopathies: Models of Molecular

Disease. in Thompson & Thompson, eda. Genetic in Medicine. USA: WB Saunders Company. 1991.

11

2.1.3 Patogenesis Thalassemia

Thalassemia ß merupakan kelainan sel darah pada rantai ß.

Thalassemia ß adalah kelainan autosomal resesif yang diturunkan oleh

individu yang kedua alelnya mengalami mutasi pada thalassemia ß, baik

herediter

Sel tersebut bersifat lebih kaku dan

sukar menembus celah-celah endotel

sumsum tulang

Badan inklusi menurunkan

kelenturan membran eritrosit

Pada eritrosit ditemukan badan

inklusi yang masih berinti di

sumsum tulang yang dapat dilihat

dengan pewarnaan supravital

Jaringan Hipoksia

Pembentukan HbF dan HbA2

Daya ikat yang kuat terhadap

oksigen

Sebagian akan berikatan dengan

rantai dan

Rantai berlebihan dalam

eritrosit

Thalassemia

Kelainan genetik -globin

Berkurang atau tidak diproduksinya rantai

-globin

Tabel 2.1 Jenis Thalassemia Berdasarkan Sifat Homozigot dan Heterozigot

(Lanjutan)

Akibatnya eritrosit berinti tersebut

akan hancur atau rusak dan terjadi

kebocoran isi sel

Umur eritrosit menjadi pendek

Eritropoiesis berlangsung tidak efektif

Masuk ke dalam peredaran

darah

Masuk melalui limpa

Badan inklusi difagosit oleh

makrofag

Kerusakan sel dan terbentuk tear

drop cell

Anemia mikrositik hipokrom

Gambar 2.3 Patofisiologi Gejala Klinis Anemia pada Thalassemia17

12

homozigot ataupun heterozigot. Thalassemia ß tersebut merupakan

kelainan herediter yang berupa berkurangnya polipeptida globin pada

rantai ß.18

Kondisi tersebut mengakibatkan sintesis hemoglobin berkurang

dan ketidakseimbangan antara rantai globin dan rantai globin ß yaitu

berlebihnya jumlah rantai globin . Rantai globin yang berlebih tersebut

akan membentuk suatu rantai yang abnormal yaitu 4 rantai globin .

Rantai globin yang abnormal ini merupakan rantai globin yang tidak stabil

dan mudah berpresipitasi pada prekursor sel darah merah di sumsum

tulang sehingga mengganggu pembentukan eritrosit atau eritropoiesis,19

juga mengakibatkan sel darah merah mudah rusak (hemolisis) di sirkulasi

perifer.20

Dasar kelainan genetik penyakit thalassemia beta disebabkan

adanya mutasi gen beta, yang dapat berupa:

1. Delesi gen

Delesi gen ini jarang terjadi pada thalassemia beta, tersering pada

thalassemia beta yang kompleks seperti thalassemia gamma beta.

Delesi gen ini dapat terjadi mulai dari bagian intron sampai akhir dari

bagian exon. Kelainan ini banyak ditemukan pada suku Indian dan

penyebarannya hampir 30% suku bangsa tersebut. Umumnya keadaan

penyakit berat.18,19

2. Mutasi transkripsi

Merupakan penyebab yang paling sering terjadi pada thalassemia beta.

Mutasi ini terjadi pada proses pembentukan m-RNA. Pada kelainan ini

terjadi mutasi basa nukleotida promoter region. Berat ringannya

13

kelainan ditentukan oleh banyaknya basa nukleotida yang terganti,

sehingga mempengaruhi aktivitas DNA dan dapat menyebabkan

berkurangnya m-RNA yang terbentuk. Mutasi ini didapat pada

thalassemia ß+

Mediteranian, terjadi mutasi satu basa sitosin ke

guanine yang menyebabkan penurunan 10% produksi m-RNA. Pada

thalassemia ß+

China terjadi mutasi adenin ke guanin dan

menyebabkan penurunan produksi m-RNA sebanyak 20-30%. Pada

kedua tipe ini fenotip penyakit tampak ringan.18,19,20

3. Mutasi prosesing RNA

Pada kelainan ini tidak terjadi splicing yang normal pada basa

nukleotida tertentu yaitu AG dan GT, Karena adanya mutasi pada

salah satu basa nukleotida tersebut.

Mutasi pada thalassemia beta terjadi terutama karena perubahan G

(guanin) ke A (adenin) pada GT dan G (guanin) ke C (sitosin) pada

AG. Perubahan ini akan mengakibatkan bagian intron akan lebih

memanjang ke bagian ekson, sehingga bagian ekson yang berisi kodon

untuk membentuk m-RNA berkurang. Selain itu processing mutation

ini juga menjadi dasar terjadinya kejadian Hb varian. Mutasi tersebut

mengakibatkan terjadinya kesalahan pelepasan bagian intron yang

menyebabkan terjadinya kelainan susunan basa nukleotida kodon di

bagian ekson sehingga terjadi pembentukan asam amino yang lain.

Sebagai contoh pada HbE rantai ßE

merupakan mutasi yang

menghasilkan perubahan satu asam amino, yaitu perubahan dari

glutamat (Glu) ke lisin (Lys). Jenis mutasi ini sering terjadi pada

14

bangsa-bangsa di Asia, khususnya Asia Tenggara, China, dan Negro.

18,19,20,21

4. Mutasi nonsense

Pada keadaan ini terbentuk m-RNA yang tidak dapat berfungsi secara

baik karena terhentinya proses translasi sebelum terbentuk rangkaian

asam amino yang lengkap. Hal ini disebabkan adanya mutasi

penggantian nukleotida tertentu dan dikenal sebagai akhir pembacaan

kodon. Kelainan dengan terbentuknya kodon UAA sering terjadi pada

thalassemia ß Mediteranian dan kelainan terbentuknya kodon UAG

pada thalassemia ß Sardinia. Keduanya merupakan kelainan yang berat

karena hampir seluruh globin rantai ß tidak terbentuk. Mutasi ini

sering terjadi pada bangsa – bangsa Mediteranean, Indian, dan

Asia.19,20,21,22

2.2.1 Struktur Molekul dan Kontrol Gen Globin-ß

Sintesis rantai globin pada manusia disandi oleh 2 kelompok gen,

yaitu gen globin -like dan gen globin ß-like. Kedua gen ini membentuk

suatu gugus gen yang terletak pada kromosom yang berbeda.22,23

Rantai

globin- mengandung 141 asam amino, sedangkan rantai globin- ß

tersusun atas 146 asam amino.24,25

Gen globin- ß terdiri dari 3 ekson yang dipisahkan oleh 2 intron

(IVS, intervening sequence). Ukuran masing-masing ekson dan intron ini

tidak sama, ada yang panjang dan pendek. Ekson 1 merupakan yang

terpendek, tersusun atas 30 kodon, sedangkan ekson 2 membentang dari

kodon 31-104 merupakan ekson terpanjang, dan ekson 3 tersusun dari

15

kodon 105-146. Intron pertama (IVS1) terletak di antara kodon 30-31

dengan panjang 130 pb, sedangkan intron kedua (IVS2) terletak diantara

kodon 104 dan 105 dengan ukuran 850 pb.24

Secara umum setiap gen globin terdiri atas tiga ekson dan diantara

ketiga ekson terdapat intron (intervening sequence=IVS). Bagian hulu

atau upstream atau 5’ dan sebelah hilir atau downstream atau 3’ terdapat

segmen DNA yang masing-masing dinamakan DNA sisi 5’ (5’ flanking

DNA) dan DNA sisi 3’. Setelah transkripsi, ujung hulu 5’ dari mRNA akan

ditempati oleh rangkai (sequence) yang terdiri atas 2 atau 3 nukleotid yang

mempunyai struktur khusus, yang disebut cap, sehingga tempat tersebut

dinamakan cap site. Ujung hilir dari DNA sisi 3’ merupakan tempat

penambahan poliadenil.26

Heksanukleotid yang terdapat pada batas ekson-intron penting

sekali untuk berlangsungnya proses splicing.27

Rangkai tersebut

dinamakan consensus splice sequence. Insiasi translasi dari mRNA

bermula dari kodon AUG dan berakhir pada kodon UAA, UAG, atau

UGA.28

16

Gambar 2.4 Situs Splicing pada Gen ß Globin. 10

17

Gambar 2.5 Lokasi Mutasi Penyebab Thalassemia- ß.28

18

2.2.2 Thalassemia ß Mayor

Thalassemia mayor akibat diturunkannya dua mutasi yang berbeda,

masing-masing mengenai sintesis globin-ß (heterozigot campuran). Pada

beberapa kasus, terjadi delesi gen ß, gen dan ß, atau bahkan gen , ß,

dan .17

Gambaran klinis:

1. Anemia berat menjadi nyata pada usia 3-6 bulan setelah kelahiran

ketika seharusnya terjadi pergantian dari produksi rantai ke rantai ß.

2. Pembesaran hati dan limpa terjadi akibat destruksi eritrosit yang

berlebihan, hemopoiesis ekstramedular, dan lebih lanjut akibat

penimbunan besi. Limpa yang mengalami pembesaran tersebut,

meningkatkan kebutuhan darah dengan meningkatkan volume plasma,

dan meningkatkan destruksi eritrosit dan cadangan (pooling) eritrosit.

3. Pelebaran tulang yang disebabkanoleh hiperplasia sumsum tulang yang

hebat menyebabkan terjadinya facies thalassemia dan penipisan

korteks di banyak tulang, dengan ciri khas terjadinya fraktur dan

penonjolan tengkorak dengan gambaran ‘rambut berdiri (hair on end)’

pada foto ronsen.

4. Penimbunan besi pasca transfusi darah.

5. Mudah terkena infeksi.

6. Osteoporosis.17

2.2.3 Thalassemia ß Minor

Keadaan pada thalassemia ini biasanya tanpa gejala yang berat.

Gambaran darah sangat jelas, mikrositik hipokrom (MCV dan MCH

19

sangat rendah) namun jumlah eritrosit tinggi (>5,5 x 102/mm

3) dan anemia

ringan (hemoglobin 10-15 g/dl).17

Untuk memastikan diagnosis karena

hampir sama sifatnya dengan thalassemia , maka dilihat kadar HbA2

yang tinggi (>3,5%). Indikasi terpenting untuk memastikan diagnosis

yakni konseling prenatal pada pasien dengan seorang pasangan yang juga

mempunyai kelainan hemoglobin yang nyata.17

2.2.4 Thalassemia Intermedia.

Thalassemia intermedia merupakan thalassemia dengan derajat

tingkat keparahan sedang pada (Hb 7,00-10,0 g/dl) yang tidak memerlukan

transfusi teratur. Dapat disebabkan oleh pengaruh genetik. Thalassemia ß

homozigot dengan produksi Hb F yang lebih dari biasanya atau dengan

defek genetik pada sintesis rantai ß atau oleh sifat thalassemia ß sendiri

tetapi dengan derajat kelainan globin ringan seperti Hb Lepore.17

Gejala

klinis yang biasa ditemukan yaitu, deformitas tulang, pembesaran hati dan

limpa, eritropoiesis ekstramedular, dan gambaran kelebihan besi yang

disebabkan oleh absorpsi yang meningkat.17

2.2.5 Thalassemia .

Penyakit ini merupakan kegagalan pada produksi rantai dan .

Pada keadaan homozigot hanya ditemukan HbF, dan secara hematologik

gambarannya seperti thalassemia intermedia.17

2.2.6 Hemoglobin Lepore.

Merupakan suatu hemoglobin yang abnormal yang disebabkan

oleh crossing over yang tidak seimbang pada gen dan yang

20

memproduksi rantai polipeptida yang terdiri dari rantai di ujung

aminonya dan rantai di ujung karboksil.17

2.2.7 Thalassemia ß– Hb E

Thalassemia ß dapat dijumpai sebagai penyakit yang berdiri sendiri

ataupun dalam bentuk heterozigot ganda dalam hemoglobin varian.

Bentuk heterozigot ganda antara thalassemia dengan hemoglobin varian

yang sering dijumpai adalah thalassemia ß – HbS, thalassemia ß – HbE,

thalassemia ß – HbC, dan thalassemia – HbS.11,29

Bentuk Thalassemia ß–

Hb E, yaitu genotip ßEß

O atau ß

Eß

+. Thalassemia ß– Hb E pertama kali

dijumpai di Thailand.11

Thalassemia ß– Hb E sering ditemukan di Asia

Tenggara, kedua gen terdapat dalam frekuensi tinggi.30

Hal ini disebabkan

karena adanya pernikahan pasien thalassemia dan Hb E yang tidak

terdeteksi.30

2.2.8 HbE (Cd26, GAG>AAG)

HbE ( 2 ß2 26Glu lys

) terjadi akibat adanya mutasi titik pada kodon

26 (GAG AAG), menyebabkan perubahan asam amino posisi 26 dari

glutamat menjadi lisin. Mutasi ini mengaktivasi cryptic donor site pada

kodon 25 selama process splicing m-RNA ßE

sehingga terjadi splicing

abnormalsebesar 5 – 8 %, meskipun situs splicing normal masih tetap

aktif.31

Pada umumnya manifestasi klinis HbE ringan, baik dalam bentuk

heterozigot (HbE trait) maupun homozigot (HbE/HbE).32

Heterozigot

ganda HbE dengan thalassemia ß memberikan gambaran klinis yang

bervariasi, mulai dari bentuk yang ringan sampai dengan ketergantungan

21

terhadap transfusi darah; dengan kadar Hb antara 3-13 g/dl.32

Kelainan

Hemoglobin E ini banyak ditemukan di Asia Tenggara termasuk

Indonesia.32

Gambar 2.6 Apusan darah tepi pasien thalassemia ß–HbE

heterozigot.26

Mikrositik

hipokrom

Sel target

Sel target

Poikilosit

Gambar 2.7 Apusan darah tepi pasien Hb E homozigot dengan gambaran

mikrositik hipokrom, sel target dan poikilosit lain.26

22

2.2.9 Parameter Hematologi Thalassemia ß

Tabel 2.2 Parameter Hematologi Thalassemia ß.

Parameter Normal Heterozigot Homozigot

Hb (g/dl)

Pria 15 2 9-11 2-3

Wanita 13,5 1,5

MCV (fL) 92 9 <76 50-60

HbA2 (%) 2,2-3,5 3,8-8 2-7

HbF (%) <1 1-5 <10->90

HbA(%) >95% - 0-80

Tabel 2.3 Diagnosis Banding Thalassemia dan Anemia Defisiensi Besi.

Thalassemia Anemia defisiensi besi

Splenomegali + -

Ikterus + =

Perubahan morfologik eritrosit Tak sebanding dengan derajat

anemi

Sebanding dengan derajat

anemi

Sel target ++ +/-

Resistensi osmotik Meningkat Normal

Besi serum Meningkat Menurun

TIBC Menrun Meningkat

Cadangan besi Meningkat Kosong

Feritin serum Meningkat Menurun

HbA2/HbF Meningkat Normal

Sumber: Bunn, H. Franklin. Hemoglobin Molecular, Genetic, and Clinical Aspects. Philadelphia:

W.B Saunders Company. 1986.

Sumber: Bunn, H. Franklin. Hemoglobin Molecular, Genetic, and Clinical Aspects. Philadelphia:

W.B Saunders Company. 1986.

23

2.3 Hemoglobin

Fungsi dari hemoglobin yaitu sebagai pengikat oksigen yang

sangat dibutuhkan untuk diedarkan ke seluruh tubuh. Sintesis hemoglobin

dimulai dalam proeritroblas dan berlanjut bahkan dalam stadium

retikulosit pada pembentukan sel darah merah.32

Oleh karena itu, ketika

retikulosit meninggalkan sumsum tulang dan masuk ke dalam aliran darah,

retikulosit tetap membentuk sejumlah kecil hemoglobin satu hari sesudah

dan seterusnya sampai sel tersebut menjadi eritrosit yang matang.32

Ada banyak informasi tentang berbagai sifat fisik dan kimia pada

hemoglobin. Banyak perbedaan sifat kimia pada oksihemoglobin dan

deoksihemoglobin dapat diartikan dan diprediksikan dalam bentuk struktur

tiga dimensi ditetapkan oleh Perutz dan rekan.11

Dioksihemoglobin

terdisosiasi menjadi dimer jauh lebih mudah daripada oksihemoglobin.

24

Tabel 2.4 Perbedaan Fisik dan Kimia Antara Oksihemoglobindan

Dioksihemoglobin.

Oksihemoglobin Deoksihemoglobin

Properti fisik

Spektrum yang terlihat:

puncak absorbansi

576,540 nm 555 nm

Spektrum soret 415 nm 430 nm

Kerentanan magnetic Rendah (diamagnetik) Tinggi (paramagnetik)

Properti kimia

Kelarutan Tinggi Rendah

Disosiasi kedalam

dimer

Cepat Lambat

Mengikat haptoglobin Cepat Lambat

Pencernaan oleh

karboksipeptidase

Cepat Lambat

Sumber: Orkin, S. H. Kazazian, H. H., Jr., Antonarakis, S. Linkage of –thalassemia mutations and

globin gene polymorphisms with DNA polymorphisms in human globin gene cluster. Nature.

1982

25

Oksihemoglobin Deoksihemoglobin

Properti kimia

Reaktivitas 93-sistein

SH

Cepat

Lambat

Reaktivitas terhadap

bromotimol

Lambat Cepat

Reaktivitas terhadap

sianat

Lambat Lebih lambat

Sifat fungsional

Afinitas terhadap ligan

heme

Tinggi Rendah

Afinitas terhadap proton Rendah Tinggi

Relatif afinitas untuk CO2 Rendah Tinggi

Afinitas untuk fosfat

organik

Rendah Tinggi

Tabel 2.4 Perbedaan Fisik dan Kimia Antara Oksihemoglobindan

Dioksihemoglobin.11

(Lanjutan)

4

Sumber: Orkin, S. H. Kazazian, H. H., Jr., Antonarakis, S. Linkage of –thalassemia mutations and

globin gene polymorphisms with DNA polymorphisms in human globin gene cluster. Nature.

1982

26

Perbedaan terutama karena ikatan garam intersubunit, termasuk

2,3-DPG, yang menstabilkan struktur deoksi. Disosiasi hemoglobin

menjadi dimer tampaknya diperlukan untuk mengikat haptoglobin dan

untuk infiltrasi hemoglobin melalui glomeruli ginjal.32

Gambar 2.8 Proses pembentukan hemoglobin.32

Setiap rantai hemoglobin memiliki gugus prostetik heme yang

mengandung satu atom besi, karena adanya empat rantai hemoglobin di

setiap molekul hemoglobin, dapat ditemukannya empat atom besi di setiap

molekul hemoglobin. Empat atom besi pada setiap molekul hemoglobin

dapat berikatan dengan molekul oksigen pada setiap molekulnya, sehingga

empat molekul oksigen dapat diangkut oleh setiap molekul hemoglobin.32

Suksinil KoA yang

dibentuk dalam siklus

krebs

Membentuk molekul

pirol

4 pirol bergabung

untuk membentuk

protofirin IX

Bergabung dengan

besi membentuk

molekul heme

Setiap molekul heme

bergabung dengan rantai

polipeptida panjang, yaitu

globin yang disintesis

oleh ribosom

Membentuk subunit

hemoglobin yang disebut

rantai hemoglobin

27

Apabila adanya abnormalitas pada molekul hemoglobin

menentukan afinitas ikatan hemoglobin terhadap oksigen. Abnormalitas

tersebut dapat mengubah ciri-ciri fisik dari molekul hemoglobin.

Contohnya pada anemia sel sabit, asam amino valin digantikan oleh asam

glutamat pada satu titik, masing-masing di kedua rantai beta.32

Jika

terpapar dengan oksigen berkadar rendah, akan terbentuk kristal panjang

di dalam sel-sel darah merah yang panjangnya kadang-kadang mencapai

15 . Hal ini membuat sel-sel tersebut tidak dapat melewati kapiler-

kapiler kecil, dan ujung kristal tersebut yang tajam cenderung merobek

membran sel, sehingga terjadi anemia sel sabit.34

2.4 Diagnosis Molekular

Diagnosis molekular pada pemeriksaan thalassemia menggunakan

DNA dari darah. Pemeriksaan ini dipakai untuk mencari gen thalassemia.

Gen tersebut tersusun atas asam nukleat yang disebut asam

deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid, DNA).33

Molekul tersebut

berperan sebagai pembawa informasi genetik. 34

Gambar 2.9 Aliran informasi genetik.34

Replikasi DNA

Transkripsi

Transkripsi balik

RNA Protein

Translasi

28

Diagnosis molekular menggunakan DNA bertujuan untuk mencari adanya

mutasi. Mutasi adalah perubahan pada sekuens DNA tersebut.35

2.4.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan sebuah

penggandaan DNA yang dilakukan secara in vitro. Cara ini banyak sekali

dipakai, karena sifatnya yang cenderung lebih mudah, spesifik, dan

sensitif. Prinsip PCR adalah apabila DNA dicampur dengan

oligonukleotida yang komplementer dan diberi kondisi yang sesuai, maka

oligonukleotida tadi akan berperan sebagai titik awal (primer) sintesis

copy dari DNA target. Dengan menggunakan dua primer, satu di sebelah

hulu (5’) dan satu di sebelah hilir (3’) (reverse primer), segmen DNA yang

terletak di antara kedua primer tadi akan tergandakan. Dalam satu siklus

reaksi, satu untai DNA tunggal akan tergandakan menjadi 2 untai. Dengan

n siklus, dari satu DNA untai tunggal teoretis akan dihasilkan 2n

copy.

Dengan 25 siklus dari satu DNA untai tunggal akan dihasilkan lebih dari

30 juta copy.36

Dengan digunakan enzim Taq yang tahan panas sampai 1000

C

maka dapat dicapai otomatisasi pengerjaan dan segmen DNA berukuran

sampai beberapa kilo base pair (kb) dapat digandakan dalam waktu kurang

dari 3 jam.37

Metode ini sangat sensitif, DNA sejumlah 1 telah cukup

untuk satu sample. Dari single copy genes dapat diperoleh sejumlah copy

DNA cukup untuk dianalisis.38

Pembentukan dimer pada prosedur PCR dimanfaatkan untuk

diagnostik (cara Ligase Chain Reaction/LCR). Prinsip LCR ini yakni, dua

29

oligonukleotid yang menghibridasi segmen yang berdekatan dengan DNA

target dapat mengalami penyambungan (ligase) bila ujung-ujungnya yang

berdekatan dengan komplementer dengan DNA target. Bila ujung 3’ dari

oligonukleotid yang berdekatan mismatch, maka ligasi tidak akan terjadi.39

Maasalah yang muncul pada prosedur diagnostik ini adalah;40

1. Kita harus tahu lebih dahulu spektrum mutasi dalam populasi

untuk menyesuaikan oligonukleotid yang dipakai.

2. Kondisi reaksi menuntut persyaratan yang lebih tinggi dibanding

PCR biasa, kenaikan 5 unit enzim pada tiap reaksi atau dua kali

lipat konsentrasi oligonukleotid, demikian pula jumlah siklus lebih

dari 25 atau 30 akan menyebabkan terjadinya reaksi bebas cetakan

(template free reaction); oligonukleotid dengan panjang tidak tepat

atau tidak mengandung fosfat 5’ akan menurunkan efisiensi reaksi

yang berarti menurunnya sensitivitas.

Kelebihan metode ini adalah bahan radioaktif tidak diperlukan dan

otomatisasi dapat diterapkan sehingga dapat dipakai untuk sejumlah besar

sampel.41

30

2.4.2 Analisis Sequencing

Analisis sequencing digunakan untuk mengetahui suatu mutasi

pada salah satu alel. Analisis tersebut dilakukan pada DNA untai tunggal.

Secara garis besar proses ini meliputi: Reaksi PCR untuk mengamplifikasi

fragmen DNA yang akan disekuens, mendapatkan DNA untai tunggal

dengan teknik kloning dan sequencing template DNA tersebut.21

Hasil

sequencing tersebut kemudian dibandingkan dengan sekuens DNA

referens (Genebank). 21

31

2.5 Kerangka Teori Faktor genetik

Thalassemia ß:

- CD2

- IVSI-5

- IVSII-16

- IVSII-74

- IVSII-81

- IVSII-81

Mutasi pada kompleks

gen ß globin

Rantai ß berhenti atau

berkurang

Presipitasi rantai yang berlebihan yang

tidak mendapat pasangan rantai ß

Presipitasi rantai

pada eritrosit

Deposit Fe dalam

jaringan

Absorpsi Fe

Eritropoiesis inefektif

Presipitasi rantai

intramedular

Pada eritrosit ditemukan badan

inklusi yang masih berinti di

sumsum tulang yang dapat dilihat

dengan pewarnaan supravital

Thalassemia

Thromboembolism

dan disfungsi

vaskular

Hemolisis

Hypercoagulability dan

disfungsi platetlet

ANEMIA mikrositik

hipokrom

Perubahan bentuk

eritrosit

Kelenjar

paratiroid

dan tiroid

Kelenjar

pituitari

Pankreas Testis dan

ovarium

Hati Jantung Sistem

imun

HbE:

Mutasi Codon 26glulys

Gambar 2.10 Kerangka Teori42

32

2.6 Kerangka Konsep

Gambar 2.11 Kerangka Konsep

Siswi 15-18 tahun SMAN

1 Sukaraja Sukabumi

Gen ß globin

Identifikasi mutasi pada

kompleks gen ß globin

Thalassemia ß:

- CD2

- IVSI-5

- IVSII-16

- IVSII-74

- IVSII-81

HbE:

Mutasi Codon 26glulys

33

2.7 Definisi operasional

Dalam penelitian ini peneliti menggunakan istilah – istilah yang

didefinisikan sebagai berikut

Tabel 2.5 Tabel Definisi Operasional

No Variabel Definisi Alat Ukur Skala Skor

1 Gen

globin

Variasi

sequencing

DNA pada

gen globin

Light

cycler 480

Roche 04

909 631

001

Nominal Homozigot

Heterozigot

35

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan studi deskriptif dengan desain cross sectional.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari sampai Mei 2017.

Pengambilan sampel darah dilakukan di SMA Negeri 1 Sukaraja, Sukabumi.

Proses perlakuan spesimen darah dilaksanakan di Laboratorium Riset,

Biokimia dan Biologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.3 Populasi dan Sampel

3.3.1 Populasi Target

Populasi target adalah remaja perempuan di wilayah Sukabumi.

3.3.2 Populasi Terjangkau

Populasi terjangkau adalah responden perempuan masyarakat

Sukabumi berusia 15-18 tahun.

36

3.3.3 Perkiraan Besar Sampel

Dalam penelitian ini penentuan jumlah sampel peneliti

menggunakan rumus besar sampel deskriptif:43

adalah deviasi baku alfa

adalah proporsi kategori variabel yang diteliti

adalah 1-

adalah presisi

untuk penelitian deskriptif, proporsi (P) yang dimaksud adalah

proporsi dari kategori variabel yang diteliti.43

Untuk mentukan

besar sampel yang akan diteliti maka nilai P yang digunakan

adalah jumlah prevalensi thalassemia berdasarkan hasil survey

riskesdas sejumlah 21,7 %.4

Pada penelitian deskriptif kategorik, presisi ( ) penelitian

berarti kesalahan peneliti yang masih bisa diterima untuk

memprediksi proporsi yang akan diperoleh. Peneliti menetapkan

37

bahwa selisih nilai yang akan diperoleh dengan nilai sebenarnya

yang masih bisa diterima adalah 10%, maka presisi penelitian

adalah sebesar 10%. Semakin kecil nilai presisi ( ), maka semakin

kecil kesalahan penelitian, semakin baik presisi penelitian, akan

tetapi semakin banyak subjek penelitiannya.

3.3.4 Kriteria Pemilihan Sampel

Kriteria pemilihan sampel dalam penelitian ini terdiri dari kriteria

inklusi, eksklusi, dan kriteria drop out.

3.3.4.1 Kriteria inklusi

a. Siswi perempuan SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi

b. Berusia 15-18 tahun

c. Menyetujui informed consent

3.3.4.2 Kriteria eksklusi

Mengalami gangguan pembekuan darah.

Mengalami menstruasi

3.3.4.3 Kriteria drop out

Sampel yang digunakan rusak selama proses penelitian

berlangsung.

3.3.5 Tehnik Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel menggunakan metode Simple Random

Sampling. Sampel dipilih secara acak dari jumlah yang telah

ditentukan. Subjek yang terlibat terlebih dahulu menyatakan

kesediannya untuk menjadi subjek penelitian dengan

menandatangani lembar informed consent. Selanjutnya subjek yang

38

bersedia mengisi dan menandatangani informed consent secara

sukarela memberikan 3-5 mL darahnya untuk dilakukan

pemeriksaan screening genetik. Sampel darah dimasukkan ke

dalam tabung EDTA dan diberi nomor, selanjutnya disimpan

dalam cold room untuk dilakukan isolasi DNA, kemudian

dilakukan PCR, dan sequencing DNA. Pengambilan sampel ini

telah mendapat persetujuan etik dari Komisi Etik Penelitian

Kesehatan, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

39

3.4 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian tertera dalam tabel di bawah

ini.

Tabel 3.1 Alat dan Bahan Penelitian

Pengukuran konsentrasi hasil isolasi DNA

Maestro Nano Drops

Alat Bahan

Pengambilan sampel (darah)

Spuit 3 cc EDTA dalam tabung

Tourniquet

Tabung berisi EDTA

Sarung tangan

Kapas alkohol

Isolasi genom DNA dari darah

Tabung mikro sentrifugasi 1,5 ml steril,

Penangas air (Water bath) AS ONE TRW 42TP 80

high temperature version, pipet mikro BIOHIT

berbagai ukuran, vortex DADD, 2 mL collection

tube, Alat sentrifugasi, Eppendorf, mikrotip

Biologi ukuran 10 , 200 , dan 1000 ,

incubator EYELA NDO-400, biomedical freezer

SANYO

RBC Lysis Buffer

GB Buffer

Elution Buffer

Ethanol Absolut

W1 Buffer

Wash Buffer

40

Alat

Bahan

Polymerase Chain Reaction (PCR)

DNA sequencer ABI PRISM 3730x1 Genetic

Analyzer develop by Applied Biosystems, US

primer spesifik gen -globin

Elektroforesis genom DNA

Elektroforesis ATTO My Power II 300 AE8135,

Timbangan analitik AdventureTM,

gel doc system,

penggaris sumur

Agarosa

Ethidium bromide

Loading dye

Plastic wrap

3.5 Cara Kerja Penelitian

3.5.1 Pengumpulan Data

Pengambilan darah dilakukan oleh tim dokter PSKPD–FKIK UIN pada

bulan Februari 2017. Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah

data primer dengan cara punksi darah vena untuk penapisan mutasi gen

-globin.

Responden sebanyak 85 orang yang telah mengisi lembar informed

consent (lampiran 1) dilakukan pengambilan darah sebanyak 3 cc.

Sampel darah diberi nomor dan disimpan dalam freezer/cold room

untuk dilakukan isolasi genom DNA, kemudian dilakukan teknik PCR

serta sequencing DNA dan selanjutnya dilakukan analisis hasil

sequencing.

Tabel 3.1 Alat dan Bahan Penelitian (Lanjutan)

41

3.5.2 Isolasi DNA

Tabel 3.2 Langkah Isolasi DNA

Persiapan

Sampel

Fresh Blood

1. Darah sebanyak300 dimasukkan kedalam tabung

mikrosentrifugasi berukuran 1,5 mL.

2. 900 RBC Lysis Buffer kemudian ditambahkan

dan dikocok.

3. Tabung diinkubasi 10 menit dalam suhu ruangan.

4. Tabung disentrifugasi selama 5 menit pada

kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, supernatant

dibuang.

5. 100 RBC Lysis Buffer ditambahkan untuk

meresuspensi endapan leukosit, kocok, kemudian

diproses dengan cell lysis.

Langkah 1 Cell

Lysis

6. 200 GB Buffer ditambahkan kedalam tabung

tadi.

7. Tabung diinkubasi pada suhu 60oC selama 10 menit

untuk memastikan sampel terlisis dengan baik.

8. Pada saat yang sama, tabung lain berisi50 Elution

Buffer untuk tiap satu sampel disiapkan, kemudian

diinkubasi pada suhu 60oC.

9. Setelah tabung sampel tadi diinkubasi, tabung

didinginkan di suhu ruangan.

Langkah 2

DNA binding

10. 200 ethanol absolute ditambahkan kedalam

tabung tadi, kemudian secara cepat dikocok

selama10 detik.

11. GD Column pada 2 mL Collection Tube disiapkan.

12. Campuran ethanol tadi dipindahkan kedalam GD

Column.

13. Tabung disentrifugasi pada 14.000–16.000 x g

42

selama 5 menit.

14. Cairan pada 2 mL Collection Tube dibuang.

15. GD Collumn ditempatkan kembali pada 2mL

Collection Tube.

Langkah 3

Wash

16. 400 w1 Buffer ditambahkan kedalam GD

column kemudian disentrifugasi pada 14.000–16.000

x g selama 1 menit.


18. GD Collumn ditempatkan kembali pada 2 mL

Collection Tube.

19. 600 Wash Bufer ditambahkan kedalam GD

Collumn.

20. Tabung disentrifugasi pada 14.000–16.000 x g

selama1 menit.


22. GD Collumn ditempatkan kembali pada 2 mL

Collection Tube.

23. Tabung disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk

mengeringkan matriks kolom.

Langkah 4

DNA Elution

Standar elution buffer untuk 1 sampel adalah 100 . Jika

sampel yang digunakan dalam volum yang sedikit, volume elusi

sekitar 30-50 dapat meningkatkan konsentrasi DNA.

24. GD Collumn yang sudah kering dipindahkan

kedalam tabung mikrosentrifugasi yang steril.

25. 50 elution buffer yang sudah diinkubasi

ditambahkan kedalam matriks kolom, dibiarkan

selama 3 menit.

26. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 xg.

Table 3.2 Langkah Isolasi DNA (Lanjutan)

43

3.5.3 Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA

DNA genom hasil isolasi dianalisis secara kuantitatif dengan

menggunakan Denovix Spectrophotometer sehingga diketahui

konsentrasi dan kemurnian DNA.

1. Sebanyak 1 μl ddH2O dimasukkan ke dalam apparatus sebagai

blanko.

2. Apparatus dibersihkan dengan kertas tisu.

3. Sebanyak 1 μl elusi buffer dimasukkan ke dalam apparatus sebagai

blanko.

4. Apparatus dibersihkan dengan tisu dan dapat dimulai pengukuran

DNA.

5. Sebanyak 1 μl DNA hasil isolasi dimasukkan ke dalam apparatus

kemudian dilakukan pengukuran.

6. Konsentrasi DNA dapat diketahui dari nanogram/μl dan

kemurnianDNA dapat diketahui dari nilai 260/280.

3.5.4 PCR

Berikut prosedur dalam PCR yang akan digunakan :

a. DNA didenaturasi oleh panas dengan suhu 90-95oC selama 20

detik.

Dua untai terpisah karena rusaknya hidrogen yang mengikat

mereka.

b. Campuran reaksi mengandung 4 deoxynucleotide triphosphates (

dATP, dCTP, dGTP, dTTP), dan thermostable DNA polymerase.

DNA polymerase tidak mengalami denaturasi pada suhu yang

tinggi. Campuran tersebut kemudian mengalami pendinginan, suhu

diturunkan menjadi 50-65O C.

44

c. Setiap helai molekul DNA mengalami proses annealing dengan

primer oligonukleotida melengkapi kedua ujung urutan target yang

membutuhkan waktu 20 detik.

d. Suhu dinaikan ke 60-75oC dan primer diperluas oleh aksi

polymerase DNA selama 30 detik. Polymerase yang mensintesis

urutan komplementer 5’ ke 3’ arah dari masing-masing primer. Jika

template mengandung nukleotida A, enzim menambahkan pada

nukleotida T untuk primer. Jika template berisi G, ia menambahkan

C untuk rantai baru. Pada titik ini akan ada persis dua salinan dari

urutan DNA target.

e. Campuran dipanaskan lagi di 90-95oC untuk denaturasi molekul

dan memisahkan helai dan siklus diulang. Setiap helai baru

kemudian bertindak sebagai template untuk siklus sintesis

berikutnya. Jadi amplifikasi hasil pada eksponensial (logaritmik)

tingkat, yaitu jumlah DNA yang dihasilkan ganda pada setiap

siklus. Produk diperkuat pada akhir PCR yang disebut amplikon.

45

Standar PCR Protocol KAPA HiFi Hot Start Ready Mix PCR Kit

Step 1: persiapkan PCR mater mix.

Tabel 3.3 Komposisi mix PCR

Step2:Mengatur reaksi individual

- Transfer volume yang sesuaiuntuk PCR Master mix,

template dan primer ke individu PCR tubes, atau sumur dari

PCR plate.

- Ditutup atau disegel setiap reaksi individu, mix dan

kemudian di sentrifuge.

Step 3: Melakukan PCR dengan cycling protocol berikut

Tabel 3.4 Tehnik PCR

Step Temperature Duration Cycle

Initial

denaturation

950C 3 min 1

Denaturation 980C 20 sec 15-35

Annealing 60-750C 15 sec 15-35

Extension 720C 15-60 sec/kb 15-35

Final

Extension

720C 1 min/kb 1

Komponendan konsentrasi bahan Volume akhir dalam larutan

Kappa HifiHotStartReadyMix

PCR kit

12,5 μl

Primer forward (10 pmol) 1 μl

Primer reverse (10 pmol) 1 μl

DNA Template (100 ng/μl) 4 μl

ddH2o 6,5 μl

Total voume reaksi 25 Μl

46

3.5.5 Analisis Fragmen DNA Menggunakan Elektroforesis

Hasil isolasi dan amplifikasi DNA dianalisis menggunakan

elektroforesis. Tahap elektroforesis adalah sebagai berikut:

1. Pada elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5% dengan cara

mencampurkan 1,5 gram bubuk agarose dengan 100 mL buffer

TAE 1x.

2. Larutan Ethidium bromide ditambahkan pada gel sebanyak 1 μl

untuk visualisasi DNA.

3. Sebanyak 3 μl DNA hasil PCR dicampurkan dengan 1 μl

loadingdye dan dimasukkan ke dalam sumur.

4. Sebanyak 5 μlladder 100 bp dicampur dengan 1 μl loadingdye

sebagai marker dimasukkan ke dalam sumur.

5. Elektroforesis berlangsung selama 60 menit dengan beda potensial

90 V dalam buffer TAE. Setelah elektroforesis selesai, gel

ditempatkan pada UV transiluminator padaGel Doc System.

3.5.6 AnalisisHasil Sequencing

Analisishasil sequencing dilakukan setelah didapatkan produk PCR

sekeuensing dilakukan dengan mengirimkan sampel ke lab

sequencing First Base. Gen yang akan dilakukan sequencing yaitu

β-globin. Setelah dilakukan sequencing, maka akan dibaca hasil

sequencing tersebut dari urutan awal hingga yang terakhir. Hasil

analisis sequencing kemudian dibandingkan dengan sequencing

normal manusia yang didapatkan dari data Genebank. Apabila ada

tumpang tindih atau overlapping dan susunan basanya berubah

maka akan dihitung mutasi homozigot dan heterozigot. Setelah

mutasi tersebut dibaca, maka ditentukan letak mutasi yang

ditemukan,pada posisi kodon, intron, maupun eksonnya.

47

3.5.7Alur Kerja Penelitian

Desain Primer

Optimasi produk PCR

meliputi formulasi dan

program PCR

Sequencing DNA

Interpretasi Hasil

Sequencing DNA

menggunakan

Chromas software

Sampel Darah

Isolasi DNA dengan

metode Geneaid

Analisis DNA genom

dengan teknik

elektroforesis dan

Nano drop

Pita DNA diamati

menggunakan gel

docsystem, dan dinilai

purity DNA

menggunakan Nano

drop

Presentasi frekuensi

mutasi gen -globin

pada populasi

Sukabumi usia 15-18

tahun

49

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

4.1.1 Hasil Isolasi Genom dari Darah Responden

Sampel yang digunakan pada penelitian ini berupa sampel DNA yang

diisolasi dari sel darah putih (white blood), terdiri dari 81 sampel DNA siswi

SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. Isolasi dan purifikasi DNA dari sampel darah

(whole blood) dilakukan berdasarkan protokol Genomic DNA Mini Kit

(Blood/Cultur Cell) Geneaid GB100. Kemudian untuk memeriksa apakah DNA

telah terisolasi dan terpurifikasi dengan baik dilakukan elektroforesis yang dapat

dilihat pada gambar (lampiran 4).

Setelah dilakukan isolasi genom, dilakukan uji spektrofotometri menggunakan

Nano Drop Spektrofotometer. Kemurnian DNA berkisar 0,82-1,94 yang dapat

dilihat pada tabel 6.1 (lampiran 5). Adapun nilai konsentrasi DNA dapat dilihat

pada table 6.1 (lampiran 5). Uji spektrofotometri bertujuan untuk mengetahui nilai

kemurnian, konsentrasi DNA, dan konsentrasi non DNA dari hasil isolasi genom.

Kemudian beberapa sampel dipilih secara acak untuk dilakukan konfirmasi

keberadaan pita genom menggunakan elektroforesis gel agarosa (lampiran 4).

Beberapa sampel dilakukan isolasi genom lebih dari satu kali. Hal tersebut

disebabkan karena adanya darah yang menggumpal dalam proses isolasi sehingga

kemurniannya kurang pada saat dilakukan Nano drop dan setelah elektroforesis

tidak menunjukkan gambaran pita (lampiran 5).

50

Pada gambar 4.1 didapatkan gen β-globin yang terpendar pada pita

seribu dua ratus pasang basa. Gen β-globin didapatkan dari sampel DNA

setelah dilakukan PCR. Marker yang berada di bagian kiri berjajar merupakan

segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi

sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.

Pada hasil amplifikasi DNA gen β-globin marker atau penanda terbaca

pada 1200 pasang basa. Sampel satu hingga sepuluh merupakan hasil

amplifikasi DNA gen β-globin. Teknik yang digunakan adalah teknik

amplifikasi fragmen DNA secara in vitro dengan menggunakan sepasang

primer oligonukleotida melalui serangkaian reaksi denaturasi, anealing dan

ekstensi. Primer yang digunakan akan berhibridasi terhadap untai DNA yang

sekuensnya komplementer, sehingga fragmen DNA yang teramplifikasi

adalah fragmen DNA yang terletak antara kedua primer tersebut.8

Alat yang

digunakan untuk mengamati hasil dari elektroforesis tersebut adalah gel doc.

Marker

Pita pada

1200 bp

Gambar 4.1 Hasil PCR Gen β-globin

Keterangan gambar: Sampel 1-10 merupakan hasil PCR gen β-globin, marker

sebagai penanda posisi pasang basa DNA.

Sampel

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

51

4.1.2 Amplifikasi Gen β-globin Menggunakan PCR dan Sequencing

Sebanyak 77 nomor identitas dilakukan amplifikasi gen β-globin.

Namun, hanya 72 nomor identitas yang memiliki hasil sequence DNA yang

baik dan dapat diinterpretasikan. Lima sampel memiliki sequence yang buruk

dan terlalu banyak noise sehingga tidak dapat diinterpretasikan.

Berdasarkan hasil sequencing ditemukan terdapat lima jenis mutasi (CD2

T>C, IVS I-5 G>C, IVS II-16 G>C, IVS II-74 T>G, IVS II-81 C>T) dari gen

β-globin yang ditemukan dari 72 siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. Dari

seluruhnya, paling banyak mutasi pada CD2 T>C homozigot varian dan

heterozigot (tiga puluh sembilan koma delapan puluh persen). Kedua yang

paling banyak mutasi yaitu IVS-II-16 G>C homozigot varian dan heterozigot

(24.18%) dan ketiga yang paling banyak mutasi yaitu IVS II-74 T>G

homozigot varian dan heterozigot (16.38%).

52

Berikut adalah contoh hasil sequencing sampel DNA yang menyebabkan

munculnya trait β-globin.

Pada gambar 4.2.2 didapatkan mutasi pada basa sitosin dan guanin

tumpang tindih dalam IVS I-5 yang ditunjukkan dengan tanda biru.

Heterozigot 2

peak G dan C

Hasil normal

Gambar 4.2.1 Interpretasi Hasil

Sequencing Normal

Gambar 4.2.2 Interpretasi Hasil

Sequencing Mutasi Heterozigot IVS I-5

Grafik 4.1 Persentase Mutasi Gen β-Globin.

53

Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi heterozigot

pada intron 1 nukleotida 5.

Pada gambar 4.3.2 heterozigot didapatkan mutasi pada basa timin dan

sitosin tumpang tindih dalam kodon 2 yang ditunjukkan dengan tanda biru.

Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi heterozigot

pada kodon 2 ekson 1. Pada gambar 4.3.3 homozigot didapatkan mutasi basa

timin menjadi basa sitosin dalam kodon 2 yang ditunjukkan dengan tanda

biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi

homozigot varian pada kodon 2 ekson 1.

Pada gambar 4.4.2 homozigot didapatkan mutasi pada basa guanin

menjadi basa sitosin dalam IVS-II-16 yang ditandai tanda biru.

Heterozigot 2

peak T dan C

Homozigot CGC

menjadi CCC Heterozigot 2

peak G dan C

Hasil normal

Homozigot CAT

menjadi CAC

Hasil normal

Gambar 4.3.1 Interpretasi

Hasil Sequencing Normal


Hasil Sequencing Mutasi

Heterozigot CD-2



Homozigot CD-2



Heterozigot IVS-II-16



Homozigot IVS-II-16


Hasil Sequencing Normal

54

Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi homozigot

varian pada intron 2 nukleotida 16. Pada gambar 4.4.3 heterozigot didapatkan

mutasi pada basa guanin dan sitosin tumpang tindih dalam IVS-II-16 yang

ditandai tanda biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut

memiliki mutasi heterozigot pada intron 2 nukleotida 16.

Pada gambar 4.5.2 homozigot didapatkan mutasi basa timin menjadi

basa guanin dalam IVS-II-74 yang ditandai tanda biru. Hal tersebut

menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi homozigot varian pada

intron 2 nukleotida 74. Pada gambar 4.5.3 heterozigot didapatkan mutasi pada

basa timin dan guanin tumpang tindih dalam IVS-II-74 yang ditandai tanda

biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi

heterozigot pada intron 2 nukleotida 74.

Heterozigot 2

peak T dan G

Homozigot T

menjadi G

Hasil normal


Hasil Sekuensing Mutasi




Homozigot IVS-II-74


Hasil Sekuensing Normal

55

Pada gambar 4.6.2 didapatkan mutasi basa sitosin dan timin tumpang

tindih atau dalam IVS-II-81 yang ditandai tanda biru. Hal tersebut

menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi heterozigot pada intron

2 nukleotida 81.

Heterozigot 2

peak C dan T Hasil normal


Hasil Sekuensing Normal




56

4.2 Pembahasan

4.2.1 Analisa Mutasi Gen β-Globin

Hasil penelitian ini menunjukkan terdapat lima jenis mutasi dalam 20

tipe genotipik pada siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. Mutasi yang paling

banyak ditemukan ialah CD2: T>C baik homozigot (Gambar 4.3.3)maupun

heterozigot (Gambar 4.3.2). Mutasi ini ditemukan paling sering pada kontrol

sehat baik tipe heterozigot ataupun homozigot. Polimorfisme bentuk tunggal

ini tidak memiliki efek patogenik saat terbentuk pola genotipik dengan

IVS2-16: G>C Homozigot (Gambar 4.4.2) dan IVS2-74; T>G Homozigot

(Gambar 4.5.2) Mutasi lain yang paling umum ialah IVS2-16: G>C, mutasi

ini ditemukan pada kontrol sehat baik bentuk heterozigot (Gambar 4.4.3) atau

homozigot (Gambar 4.4.2). Oleh sebab itu, dapat disimpulkan CD2: T>C dan

IVS2-16: G>C merupakan satu-satunya polimorfisme yang tidak memiliki

efek patogenik. Pada penelitian yang dilakukan di Bangladesh, CD2: T>C dan

IVS2-16 G>C adalah mutasi ketiga yang paling umum ditemukan, dengan

frekuensi 57.1%. Pada penelitian ini, CD2: T>C dan IVS2-16 G>C adalah

mutasi pertama yang paling banyak frekuensinya. Codon 2 T>C mengubah

CAT ke CAC tetapi keduanya mengkode asam amino yang sama, yaitu

histidin.11

Pada penelitian yang dilakukan di Bangladesh, mutasi IVS1-5: G>C

saja bisa menimbulkan kondisi patogen pada genotipik homozigot.

Sedangkan, pada sampel nomor tiga, kami menemukan mutasi IVS1-5: G>C

57

saja tipe heterozigot (Gambar 4.2.2), akan tetapi tidak menunjukkan gejala

ataupun penyakit thalassemia, dan Hb pada sampel nomor tiga ini dalam batas

normal yaitu 14.3 g/dL. Pada penelitian ini, kami menemukan sampel yang

menimbulkan kondisi patogen yakni Hb dibawah 11 g/dL, dengan mutasi

IVS1-5: G>C frekuensi 5% pada genotip heterozigot bersama dengan mutasi

lain. Hal ini disebabkan karena, thalassemia IVS1-5 dinilai berdasarkan

kuantitas mRNA yang dimiliki gen globin.11

Untuk IVS1-5 yang memiliki

kadar Hb normal, maka mRNA abnormal yang dimiliki masih lebih sedikit

dari mRNA yang normal. Oleh sebab itu, masih dapat membentuk Hb.

Sedangkan untuk IVS1-5 dengan kondisi patogenik yaitu denganHb yang

rendah, disebabkan karena mRNA normal lebih sedikit dari mRNA abnormal.

Hal tersebut diperberat dengan mutasi IVS1-5 yang ditemukan bersama

dengan mutasi lain, sehingga mRNA yang abnormal lebih banyak. Maka kami

menyarankan untuk melakukan pemeriksaan dengan Real Time PCR agar

dapat memeriksa nilai mRNA yang dimiliki.11

Mutasi di IVS-1 dan di ekson 1 diidentifikasi menyebabkan

kekurangan globin mRNA.44

Disebabkan karena alternatif splicing dari

prekursor molekul mRNA pada satu atau lebih sisi dekat 5’ situs terakhir

IVS-1. Semua mutasi ini meninggalkan secara utuh dinukleotid GT sequence

pada splice 5’ situs IVS-1, dengan demikian memungkinkan beberapa proses

normal prekursor molekul mRNA terjadi di situs tersebut.44,45

58

Subsitusi dasar semua yang terjadi di sekitar situs splice 5’ IVS-1,

tampak menyebabkan kerusakan situs splice yangnormal dan penggunaan

yang abnormal dari alternatif donor splice (atau ‘cryptic’) yang sudah ada

sebelumnya: dua terletak di ujung bawah ekson 1 dan satu terletak di atas

IVS-1.46,47

Mutasi di IVS-1 yang menyebabkan alternatif splicing yang

berlokasi pada posisi ke-5 IVS-1. Mutasi pada posisi ke-lima banyak

ditemukan di populasi Asian Indian dan menyebabkan sindrom

thalassemia yang cukup parah, dengan turunnya kadar dari mRNA yang

normal.11

Mutasi lain yang ditemukan yaitu IVS2-81 C>T heterozigot

(Gambar 4.6.2) dan IVS2-74 T>G homozigot (Gambar 4.5.2) heterozigot

(Gambar 4.5.3). Mutasi ini memiliki dua fenotip yaitu non patogenik dan

patogenik. Pada non patogenik ditemukan Hb normal dan pada patogenik

yang ditemukan dengan mutasi lain, didapatkan nilai Hb yang rendah.

Sedangkan pada penelitian yang dilakukan di Bangladesh, IVS2-81 C>T

hanya ditemukan pada pasien thalassemia, dan IVS2-74 T>G ditemukan pada

kontrol yang sehat saja.

Mutasi di IVS-2 disebabkan alternatif splicing pada prekursor

molekul mRNA. Mutasi pada IVS-2 dapat menyebabkan trait thalassemia

dengan membuat alternatif situs splicing ketika meninggalkan situs splicing

yang normal tetapi hipofungsi atau fungsinya jadi berkurang.11

Mutasi ini

meyebabkan aktivasi situs second pre-existing splice pada IVS-2. Nukleotida

59

sebanyak 850 terjadi kerusakan pada nukleotida ke-745 pada IVS-2.12,13

Mutasi mengubah C(T) ke G(T) dan membuat rangkaian GT dinukleotid yang

dapat berpotensial menerima sebagai 5’ atau donor situs splice. Sebagian kecil

dari prekursor molekul mRNA dapat berproses dengan normal, tetapi

sebagian besar berproses secara abnormal.12,13

Proses prekursor molekul

mRNAyang terjadi dengan cara internal, segmen IVS-2 disimpan dalam

proses mRNA. Pada akhir 3’, prekursor menyambung dari situs splice 5’ yang

dibentuk oleh nukleotida 745 ke normal situs splice 3’ pada akhir IVS-2.11

Beberapa mutasi thalassemia tersebut, memberikan gambaran klinis

anemia pada trait thalassemia. Dinyatakan bahwa keparahan anemia yang

terjadi pada thalassemia- tergantung dari tingkat ketidakseimbangan rantai

globin. Pasien dengan kombinasi HbE biasanya membutuhkan transfusi darah

karena tingkat keparahan anemia yang sangat tinggi. Namun pada penelitian

ini, kami tidak menemukan adanya mutasi pada HbE.

Thalassemia- tidak hanya ditemukan di daerah Mediterania,

melainkan di berbagai daerah lain terutama daerah Timur Tengah, daratan

India dan Asia Tenggara dengan spektrum mutasi yang berbeda pada tiap

populasi.48

Diketahui bahwa tiap populasi umumnya mempunyai tipe alel

thalassemia- yang spesifik. Oleh karena itu walaupun ada lebih dari 15 jenis

mutasi pada penyakit ini, hanya beberapa jenis saja yang ditemukan pada

suatu etnik tertentu, dan seringkali merupakan ciri khas etnik tersebut

terutama untuk daerah Sukaraja, Sukabumi. Ciri khas dari etnik Sukabumi

60

yakni, mutasi CD2 T>C dan IVSII-16 G>C ditemukan pada sampel

patogenikdan non patogenik, sama dengan penelitian yang dilakukan di

Bangladesh. Beberapa sampel patogenik ditemukan dengan kadar Hb yang

rendah. Kadar Hb yang rendah itu tergantung dari kadar mRNA yang dimiliki.

Selain itu, penelitian ini menunjukkan bahwa mutasi IVSI-5 G>C saja

didapatkan pada individu yang memiliki Hb normal dan tidak memiliki gejala

thalassemia. Sementara itu bentuk heterozigot bersama dengan mutasi lain

ditemukan pada pasien thalassemia. Sedangkan pada penelitian di

Bangladesh, mutasi IVSI-5 G>C hanya ditemukan pada pasien thalassemia

dalam bentuk homozigot.49

Perbedaan tersebut disebabkan karena pada penelitian di Bangladesh

bentuk mutasi IVS1-5 G>C homozigot menghasilkan fenotip thalassemia,

sedangkan pada penelitian di Sukabumi bentuk mutasi IVS1-5 G>C

heterozigot.11

Pada homozigot Thalassemia- , sintesis rantai globin yang

tidak seimbang terjadi pada semua tahap pematangan sel eritroid.11

Sehingga

pembentukan eritrosit terganggu, dan fenotip thalassemia dapat terlihat dari

nilai Hb yang rendah. Pada heterozigot, penurunan sintesis rantai hanya

terjadi pada tahap retikulosit, sehingga Thalassemia- heterozigot tidak

menunjukkan anemia dan gambaran sel darah merahnya tidak menunjukkan

hipokrom dan mikrositik.11

Oleh sebab itu tidak menunjukkan fenotip dari

Thalassemia- yang signifikan.11

61

Beberapa hasil sequence pada penelitian ini tidak terbaca sehingga

tidak dapat diinterpretasikan. Hal ini disebabkan karena banyaknya kotoran

atau debu pada DNA tersebut, serta faktor kualitas DNA. Kemungkinan

kesalahan terjadi saat proses isolasi, sehingga konsentrasi DNA terlalu kecil

dan tipis, serta kemurnian DNA yang rendah akibat banyaknya kotoran yang

mengkontaminasi sampel. Pada saat PCR, konsentrasi primer yang tidak

sesuai dapat memberikan hasil pita (band) yang tidak jelas serta kontaminasi

kotoran pada sampel juga dapat memberikan hasil sequence dengan noise.

4.2.2 Keterbatasan Penelitian

Beberapa keterbatasan pada penelitian ini adalah :

1. Tidak mencari data mengenai apusan darah tepi.

2. Tidak mencari data mengenai besi serum.

3. Tidak melakukan Real Time PCR.

61

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Berdasarkan hasil sequencing ditemukan lima jenis mutasi (CD2 T>C, IVS I-

5 G>C, IVS II-16 G>C, IVS II-74 T>G, IVS II-81 C>T) dari gen β-globin

yang ditemukan pada 72 siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi.

2. Mutasi terbanyak yaitu IVSI-5 G>C heterozigot, dengan frekuensi 5% dan

mungkin bersifat patogenik.

3. Mutasi non patogenik, didapatkan terbanyak padamutasi kombinasi CD 2 T>C

dan IVSII-16 G>C yaitu 32%.

5.2 Saran

1. Diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk diagnosis thalassemia seperti

hapusan darah tepi dan pemeriksaan lainnya.

2. Diperlukan pemeriksaan Real Time PCR untuk memeriksa jumlah mRNA

yang normal dan abnormal.

62

PERNYATAAN PENELITIAN

Penelitian ini adalah bagian dari kerja sama penelitian antara Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan

Seameo Fakultas Kedokteran (FK) UI dan Kementerian Agama dengan tema

penelitian Hemoglobinopati dan Genetik.

63

DAFTAR PUSTAKA

1. Datar S, Poflee S, Shrikhande A. Premarital Screening of College Students for

Carrier Detection in Thalassemia and Sickle Cell Disease. International

Journal of Medical Science and Public Health. 2015;3(15):420-3.

2. Rumah Sakit Hasan Sadikin. 6-10% Masyarakat Indonesia Memiliki

Keturunan Thalassemia. Bandung; RSHS. [dikutip tanggal 15 Febuari 2017].

Tersedia pada: http:// web rshs.or.id/who-6-10-masyarakat-indonesia-

memiliki-keturunan-thalassemia. 2011.

3. Putri Alyumnah, Mohammad Ghozali, Nadjwa Z. Skrining Thalassemia Beta

Minor pada Siswa SMA di Jatinangor. Bandung: Fakultas Kedokteran

Universitas Padjadjaran. 2016.

4. RI BPDPKDK. Laporan Hasil Riset Kesehatan Dasar (RIKESDAS) Provinsi

Jawa Barat Tahun 2007. DepartemenKesehatan RI: Jakarta. 2009.

5. Langlois S, Ford JC, Chitayat D. Carrier Screening for Thalassemia and

Hemoglobinopathies in Canada. Canada: Joint Clinical Practice Guideline

SOGC-CCMG. 2008.

6. Kementerian Kesehatan RI. Profil Kesehatan Indonesia. Jakarta:

KementerianKesehatan Republik Indonesia; 2014. [dikutip tanggal 15 Febuari

2017]. Tersedia Pada: http;//www.depkes.go.id/ resources/download.pusdatin/

profil-kesehatan-indonesia/profil-kesehatan-indonesia- 2013.pdf.2013.

7. Ghee D, Payne M. Hemoglobinopathies and Hemoglobin Defects. In: Rodak

BF, editor. Diagnostic Hematology. 1sted Philadelphia: WB Saunders,

1995:251-86.

8. Ratna Agung. Kendala Deteksi Mutasi: Thalassemia-β Sebagai Model. Tesis

Magister Program Studi Ilmu Biomedik. Jakarta: Fakultas Kedokteran

Universitas Indonesia. 2003:23.

9. I Made Bakta. Hematologi Klinik Ringkas. Jakarta: Penerbit Buku

Keodokteran EGC. 2013:92.

64

10. Bunn, H. Franklin. Hemoglobin Molecular, Genetic, and Clinical Aspects.

Philadelphia: W.B Saunders Company. 1986.

11. Orkin, S. H. Kazazian, H. H. Jr. Antonarakis, S. Linkage of –Thalassemia

Mutations and Globin Gene Polymorphisms with DNA Polymorphisms in

Human Globin Gene Cluster. Nature. 1982:296;627.

12. Humphries, R. K. Differences in Human - Globin Gene Expression in

Monkey Kidney Cells. Cell 1982:30;173.

13. Santoso, Wintono. Gambaran Hematologis Talasemia B Heterozigot dan

Talasemia B-Hb-E. In: Makalah Akhir Program Studi Patologi Klinik

Program Pendidikan Dokter Spesialis I Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia. Jakarta: Bidang Studi Ilmu Kedokteran Fakultas Pasca Sarjana

Universitas Indonesia, 1991.

14. Thompson MW, Mc Innes RR, Willard HF. The Hemoglobinopathies:

Models of Molecular Disease. in TheGenetic in Medicine. USA: WB

Saunders Company. 1991:250.

15. Davies KE, Read AP. Molecular Basis of Inherited Disease. 2nd

ed. London:

William Heinemann Medical Books. 1981:213-28.

16. Hoffbrand A.V, Pettit J. E, Moss P.A.H. Kapita Selekta Hematologi. 4th

ed.

Jakarta; Penerbit Buku Kedokteran EGC. 2005:66-75.

17. Achwartz E, Surrey S. Molecular Biology Application in Hematology.

Sandorama.1989: IV: 11-7.

18. Steinberg M, Adams JG. Thalassemic Hemoglobinopathies. Am J

ClinPathol, 1983: 396-409.

19. Cao A, Furbetta M, Xiemenes A, et al. ß-Thalassemia Types in Southern

Sadinia. J Med Genet.198:196-9.

20. Weatherall DJ. The thalassemies. In : Williams WJ, Butler E, Erslev AJ,

Litchman MA, eds. Hematology. 4th

ed. New York : McGraw – Hill. 1990:

39-510.

21. Maniatis T, Fritsch EF, Lauer j, Lawn RM. The Molecular Genetics of

Human Hemoglobins. Ann Rev Genet. 1980:145-78.

65

22. Stamatayannopoulos G, Nienhuis AW. Hemoglobin Switching. In:

Stamatayannopoulos G, Nienhuis AW, Majerus PJ, Varmus H, et all. The

Molecular Basis of Blood Disease. USA: W.B. Saunders Company.

1994:356.

23. Fucharoen S, Winichagoon P. The Molecular Basis of Thalassemias. Indian J

Pediatr. 1989:693-706.

24. Sunarto. Patogenesis Molekular Talasemia. Berkala Ilmu Kedokteran. Jilid

XXV; Nomor 2. Yogyakarta: Laboratorium Ilmu Kesehatan Anak, Fakultas

Kedokteran Universitas Gadjah Mada. 1993.

25. Mueller RF, Young ID. Emery’s Elements of Medical Genetics. 11th

edition.

Toronto: Churchill Livingstone. 2001:139-42.

26. L. E. Lie-Injo et al. ß-Thalassemia Mutations in Indonesia and Thei Linkage

to ß Haplotypes. Am. J. Hum. Genet. 1989:971-5.

27. Suton M, Bouhassira EE, Nagel RL. Polymerase Chain Reaction

Amplification Applied to the Determination of ß-like Globin Gene Cluster

Haplotypes. Am J Hematol. 1989:66-9.

28. McKenzie SB. Anemia Caby Abnormalities in Globin Biosynthesis. In:

McKenzie SB, editor. Textbook of Hematology. 2nd

ed. Philadelphia:

Williams & Wilkins. 1996used:147-78.

29. Orkin SH, Kazazian Jr HH, Antonarkis SE, Ostrer H, Golf SC, Sexton JP.

Abnormal RNAProcessing due to The Exon Mutation of ßE– Globin Gene.

Nature. 1982:768-9.

30. Gonzalez-Redondo JM, Brickner HE, Atweh GF. Abnormal Processing of ß–

Malay Globin RNA. Biochemical and Biophysical Research

Communications. 1989:8-13.

31. Weatherall DJ, Clegg JB. The Thalassemia Syndromes. 4th

edition. Oxford:

Blackwell Science.2001:704-12.

32. Guyton, Hall. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran Fisiologi Kedokteran. 12th

ed.

In: Anton Tanzil, editor. Sel-Sel Darah Merah, Anemia, dan Polistemia.

Singapore; Saunders, 2014:450.

66

33. Arnheim N & Levensin CH. Polymerase chain reaction. CAEN Special

Report. Oktober. 1990.

34. Susan Elrod, Ph.D, William Stansfield Ph.D. Schaum’s Outlines Genetika

Edisi Keempat. Jakarta; Penerbit Erlangga. 2007:54-9.

35. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, et al.

Primer Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable

DNA Polymerase. Science. 1988:239;487-91.

36. Wong C, Dowling CE, Saiki RK Higuchi RG, Ehrlish HA and Kazazian Jr

HH. 1987 Characterization of ß-Thalassemia and Hemoglobin E Gene in

Thai by DNA Amplification Technique Hum Genet. 1989:389.

37. Sunarto. Diagnostik Molekular Thalassemia. BerkalaIlmuKedokteran. Vol.

28; No. 1. Yogyakarta: BagianIlmuKesehatan Anak FKUGM/SMF

Kesehatan Anak RSUP DR. Sardjito. 1996.

38. Twyman RM. Advanced Molecular Biology. Oxford: Bioscientif Publisher

Limited. 1998:216-7.

39. Smooker PM, Cotton RGH. The Use of Chemical Reagents in the Detection

of DNA Mutations. USA: Mutation Research. 1993:65-77

40. Qazi RA. Screening for Beta Thalassemia Trait. Journal of Rawalpindi

Medical college. 2014:15-60.

41. I Made Bakta. Hematologi Klinik Ringkas. Jakarta: Penerbit Buku

Kedokteran EGC. 2013:92.

42. Brethnach, R and Chambon. Ovalbumin Gene: Evidence for a Leader

Sequence in mRNA and DNA Sequences at the Exon-Intron Boundaries.

USA: Proc. Natl. Acad. Sci.1978:75;4853.

43. Dahlan MS. Penelitian Deskriptif. In: Besar Sampel dan Cara Pengambilan

Sampel dalam Penelitian Kedokteran dan Kesehatan. Edisi ke-3. Jakarta:

Salemba Medika. 2013:56-60.

44. Mears, J. G. Ramirez, F. Changes in Restricted Human Cellular DNA

Fragments Containing Globin Gene Sequences in Thalassemias and Related

Disorders. USA: Proc. Natl. Acad. Sci. 1978:75;1222.

67

45. Mount, S. M. Catalogue of Splice Junction Sequences. Nucleic acids Res.

1982:10;459.

46. Weatherall DJ. The Thalassemias. In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BISA,

Kipps TJ, eds. Williams Hematology. USA: McGraw-Hill,Inc. 1995.

47. Huisman T, Carver M, Baysaal E. A Syllabus of Thallassemia Mutations.

USA: The Sickle Cell Anemia Foundation, Augsta, GA. 1997:270-90.

48. Kazazian Jr HH, Boehm CD. Molecular Basis and Prenatal Diagnosis of -

Thalassemia. Blood. 1988:1107-16.

49. Sultana GNN. The Complete Spectrum of Beta Thalassemia Mutations in

Bangladeshi Population. Bangladesh: Austin Publishing Group. 2016:3-5.

68

LAMPIRAN

Lampiran 1. Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian

Lampiran 1

69

LampirLembar Persetujuan Responden

Surat Persetujuan Pengambilan Sampel

Kepada Yth,

Siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi

Di tempat

Dengan hormat,

Dalam rangka memenuhi tugas skripsi saya pada Program Studi Kejuruan

dan Profesi Dokter Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, maka dengan

segala kerendahan hati saya sangat menghargai kesediaan Saudari terhadap

pengambilan darah yang dilakukan sebagai subjek penelitian “screening

thalassemia”

Screening thalassemia ini, dilakukan dengan pengecekan DNA

Thalassemia menggunakan PCR, serta pengambilan darah dilakukan oleh tenaga

kesehatan professional. Pengecekan ini memerlukan kurang lebih sebanyak 1 cc

untuk mengetahui apakah Saudari tergolong thalassemia atau tidak. Metode ini

aman karena menggunakan syringe atau suntikan yang steril dan baru. Rangkaian

pengecekan ini sama sekali tidak dipungut biaya (gratis)

Peneliti mengucapkan terimakasih atas ketersediaan Saudari untuk

membaca penjelasan dan penelitian ini. Peneliti sangat berharap keikutsertaan

Saudari dalam penelitian ini.

Hormat saya,

Peneliti

Raissya Armilla

Lampiran 2

70

LEMBAR PERSETUJUAN/PENOLAKAN SAMPEL

Identitas

Jenis Kelamin : a. Laki-laki b. Perempuan

Usia : …………………………….

Pekerjaan : …………………………….

Status : a. Menikah b. Belum menikah

Jumlah saudara kandung : a. …saudara laki – laki

b. … saudara perempuan

Dengan ini menyatakan BERSEDIA / TIDAK BERSEDIA* untuk dilakukan

pengambilan dan pemeriksaan darah sebagai data penelitian.

Yang tujuan, sifat dan perlunya tindakan medis tersebut telah cukup dijelaskan

oleh peneliti/perawat dan telah saya mengerti sepenuhnya. Demikian pernyataan

ini saya buat dengan penuh kesadaran dan tanpa paksaan.

Sampel Penelitian Peneliti

(…………………) (……………………)

Raissya Armilla

(NIM 11141030000012)

71

Lampiran 3. Alat dan Bahan Penelitian

Gambar 6.3.1 Pembatas

sumur agar

Gambar 6.3.2 Tempat

agar

Gambar 6.3.3 Agar cair

Gambar 6.3.4 Agarose Gambar 6.3.5 Spatula

pengaduk agar

Gambar 6.3.6

Timbangan digital

Lampiran 3

72

Gambar 6.3.7 Gelas ukur Gambar 6.3.8 Ethidium

bromide

Gambar 6.3.9 Tube

isolasi DNA

Gambar 6.4.0 RBC lysis

buffer

Gambar 6.4.1 Wash

buffer

Gambar 6.4.3 Elution

buffer Gambar 6.4.4 Alat

sentrifugasi Gambar 6.4.5

Mikropipet PCR

Gambar 6.4.5

Mikropipet darah

73

Lampiran

Gambar 6.4.2 GB buffer Gambar 6.4.6 Ethanol

absolut

Gambar 6.4.7 Loading

dye

Gambar 6.4.8 Alat nano

drop

Gambar 6.4.9 Multiwall

plate

Gambar 6.5.1 TAE

buffer

Gambar 6.5.0

Elektroforesis

74

4. Gel Documentation Hasil Elektroforesis Agarose dari Produk PCR Genom

DNA Sampel.

Lampiran 4

75

Lampiran 5. Hasil Sequence DNA yang Tidak Terbaca

Lampiran 5

Hasil yang tidak terbaca

76

Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel.

Tabel Hasil Pengukuran Kemurnian dan Konsentrasi DNA genom Responden

No Nomor

Sampel

Kemurnian

(A260/A280)

A260/A230 Konsentrasi

(ng/ )

1 28 1.86 1.71 42.328

2 30 1.58 0.83 76.091

3 31 1.01 0.27 78.864

4 32 1.07 0.19 66.909

5 33 1.19 0.22 47.221

6 34 0.82 0.13 79.023

7 35 1.82 1.70 81.552

8 39 1.90 2.01 42.635

9 21 1.51 0.49 6.755

10 23 1.89 0.66 73.328

11 24 1.72 0.57 15.833

12 25 1.60 0.55 50.980

13 38 1.87 1.69 61.001

14 36 1.74 0.95 98.739

15 47 1.82 1.67 90.888

16 45 1.73 1.69 78.900

17 41 1.80 0.78 67.899

18 46 1.71 0.86 98.100

19 48 1.58 0.98 87.653

20 43 1.02 1.23 80.453

21 49 1.82 1.24 63.874

22 42 1.88 1.45 78.902

23 44 1.26 1.98 98.032

24 50 1.83 1.78 87.654

25 20 1.49 1.65 93.456

26 21 2.02 1.24 67.750

27 22 1.72 1.14 56.450

28 59 1.66 0.89 42.355

29 55 1.63 0.67 37.063

30 60 1.42 0.64 22.377

31 62 1.78 1.04 33.807

32 51 1.77 0.76 29.505

33 54 1.66 0.54 29.594

34 52 1.94 0.76 19.386

Lampiran 6

77


(Lanjutan)

35 57 1.92 0.85 22.782

36 61 1.84 0.65 23.906

37 53 1.81 0.88 38.066

38 75 1.64 0.83 45.16

39 76 1.13 0.71 54.58

40 77 1.82 0.76 30.59

41 78 1.86 1.83 37.51

42 79 1.64 1.14 20.44

43 82 1.66 1.86 49.67

44 83 1.42 1.01 40.32

45 84 1.82 1.41 27.93

46 85 1.45 1.80 36.39

47 86 1.66 2.01 51.08

48 63 1.68 2.02 34.94

49 40 1.85 1.77 20.65

50 64 1.85 1.97 101.086

51 65 1.82 0.95 36.785

52 66 1.81 0.87 56.199

53 67 1.83 1.11 83.561

54 68 1.67 0.33 34.275

55 69 1.71 0.42 41.852

56 70 1.68 0.42 52.207

57 72 1.60 0.51 61.600

58 73 1.78 0.74 47.687

59 74 1.85 1.77 57.109

60 21 1.81 2.07 161.942

No Nomor

Sampel

Kemurnian

(A260/A280)


(ng/ )

78


(Lanjutan)

61 9 1.85 2.27 142.219

62 14 1.78 1.69 113.646

63 2 1.85 2.13 126.585

64 3 1.88 2.20 99.917

65 18 1.81 1.85 80.992

66 81 1.85 1.00 74.072

67 15 1.81 2.19 81.774

68 31 1.77 1.90 94.458

69 34 1.82 2.14 105.785

70 44 1.82 1.96 102.408

71 43 1.79 1.51 102.369

72 26 1.80 1.56 90.571

73 6 1.98 0.50 120.304

74 1 1.82 2.09 106.134

75 7 1.86 2.13 75.853

76 10 1.82 1.96 104.128

77 5 1.79 1.51 102.999

78 16 1.80 1.56 103.564

79 11 1.98 0.50 80.143

80 12 1.82 2.09 79.899

81 9 1.85 2.27 142.219

No Nomor

Sampel

Kemurnian

(A260/A280)


(ng/ )

79

Lampiran 7. Hasil Sequencing DNA dan Pemeriksaan Hb

Tabel Hasil Sequencing DNA dan Pemeriksaan Hb

No Nama

Sampel

Nama

umum HGVS kode Lokasi gen

Tipe

genotip

1 Sampel

21

CD2(T-

C) HBB:c.9T>C Ekson 1

Homozigot

varian

IVS-I-

5(G-C) HBB:c.92+5G>c

Intravenous

Sequence 1 Heterozigot

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

2 Sampel

26

CD2 (T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

3 Sampel

43

IVS-I-


Intravenous


4 Sampel

47 N N N N

5 Sampel

52 N N N N

6 Sampel

54 N N N N

7 Sampel

59

CD2(T-

C) HBB:c.9T>C Ekson 1 Heterozigot

8 Sampel

67

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

81(C-T) HBB:c.315+81C>T

Intravenous


Lampiran 7

80

Tabel Hasil Sequencing DNA dan Pemeriksaan DNA (Lanjutan)

No Nama

Sampel

Nama

umum HGVS kode Lokasi gen

Tipe

genotip

9 Sampel

79

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


10 Sampel

1

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

11 Sampel

10, 57

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


12 Sampel

48 N N N N

13 Sampel

57

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


14 Sampel

64 N N N N

15 Sampel

65

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


16 Sampel

4

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


81


No Nama

Sampel

Nama

umum HGVS kode Lokasi gen Tipe genotip

17 Sampel

6

CD2(T-C) HBB:c.9T>C Ekson 1 Heterozigot

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


18 Sampel 8 N N N N

19 Sampel 15 N N N N

20 Sampel 18


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


21 Sampel 22 N N N N

22 Sampel 27


IVS-I-


Intravenous


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


23 Sampel 28

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

81(C-T) HBB:c.315+81C>T

Intravenous


24 Sampel 53


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


82


No Nama

Sampel

Nama


25 Sampel

19

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


26 Sampel

78 N N N N

27 Sampel

51 N N N N

28 Sampel

46 N N N N

29 Sampel

36

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

30 Sampel

35 N N N N

31 Sampel

15

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) BB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

32 Sampel 9

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


34 Sampel 5

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


83


No Nama

Sampel

Nama


35 Sampel 3

CD2(T-C) HBB:c.9T>C Ekson 1 Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


36 Sampel 44


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


37 Sampel 50


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


38 Sampel 86


varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

39 Sampel 83


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


40 Sampel 34 IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


41 Sampel 75


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


84


No Nama

Sampel

Nama


42 Sampel 49


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


43 Sampel 14


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


44 Sampel 72


varian

IVS-I-


Intravenous


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

45 Sampel 12


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


46 Sampel 31


varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

47 Sampel 69 CD2(T-C) HBB:c.9T>C Ekson 1 Heterozigot

48

Sampel 7


IVS-I-


Intravenous


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

85


No Nama

Sampel

Nama


49 Sampel

82 N N N N

50 Sampel

81

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


51 Sampel

32

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


52 Sampel

45

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


53 Sampel

60

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


54 Sampel

62

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


55 Sampel

66

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


86


No Nama

Sampel

Nama


56 Sampel

70

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


57 Sampel

74

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


58 Sampel

85

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

59 Sampel

20

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

60 Sampel

23

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

61 Sampel

39

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


87


No Nama

Sampel

Nama


62 Sampel

61

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


63 Sampel

63

CD2(T-


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous


64 Sampel

73

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

65 Sampel

76 N N N N

66 Sampel

77 N N N N

67 Sampel

17

CD2(T-


68 Sampel

24

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-I-


Intravenous


IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

69 Sampel

40

CD2(T-


70 Sampel

84

CD2(T-


88


No Nama

Sampel

Nama


71 Sampel

16 N N N N

72 Sampel

11

CD2(T-


Homozigot

varian

IVS-II-

16(G-C) HBB:c.315+16G>C

Intravenous

Sequence 2

Homozigot

varian

IVS-II-

74(T-G) HBB:c.315+74T>G

Intravenous


89

CURICULUM VITAE

Nama : Raissya Armilla

Panggilan : Raissya

Jenis Kelamin : Perempuan

Tempat, Tanggal, Lahir : Jakarta, 9 Januari 1997

Usia : 20 Tahun

Golongan Darah : B

Mobile : 081280390992

Agama : Islam

E-Mail : [email protected]

Alamat : Jalan Batam No. 8 Benda Baru – Pamulang,

Tanggerang Selatan

Pendidikan:

a. Elementary School : Ibtidaiyah Madrasah Pembangunan UIN Jakarta

b. Junior High School : SMP Negri 19 Jakrta

c. Senior High School : SMA Negri 34 Jakarta

d. University : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pengalaman Organisasi:

Anggota paskibra Ibtidaiyah Madrasah Pembangunan UIN Jakarta

Anggota paduan suara SMA Negri 34 Jakarta

Anggota photography SMA Negri 34 Jakarta

Anggota CIMSA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Penghargaan:

Juara 2 Lomba Puisi Ibtidaiyah Madrasah Pembangunan UIN Jakarta

Juara 3 Spelling Bee English First

Juara 3 English Debate EF

Juara 1 Painting Intermediate Class ITC BSD

mailto:[email protected]

PENAPISAN MUTASI GEN BETA GLOBIN...

Documents

Transcript of PENAPISAN MUTASI GEN BETA GLOBIN...