PEMERIKSAAN LABORATORIUM DALAM DIAGNOSIS HEMOFILIA

I Nyoman Wande

Bagian Patologi Klinik

FK Unud/ RSUP Sanglah Denpasar

Pendahuluan

Hemofilia

• Kelainan herediter berupa gangguan pembekuandarah, ditandai dengan manifestasi perdarahan, disebabkan oleh kelainan atau defisiensi faktorkoagulasi.

• Macam-macam hemofilia :

- hemofilia A : def. FVIII

- hemofilia B : def. FIX

- hemofilia C : def. FXI

- acquired hemophilia : karena adanya antiboditerhadap FVIII (tanpa ada defisiensi FVIII) 2

Pola pewarisan hemofilia (A dan B)

Gambar . Skema transfer gen hemofilia dari ibu karier dan bapak menderitahemofilia (Mansouritorghabeh, 2015).

Gambar. Skema pewarisan gen hemofilia dari bapak hemofilia dengan ibu karier(Mansouritorghabeh, 2015).

Faktor koagulasi VIII (FVIII)

• Merupakan glikoprotein• Dikode oleh gen 186.000 bp• Protein faktor VIII dibagi menjadi:

• Rantai berat (A1-A2-B) • Rantai ringan (A3-C1-C2)

• Bentuk aktif FVIII mengandung glycosylated sites-free domain B as. Amino Arg740 untuk Glu1649.

• FVIII: C membentuk kompleks dengan von Willebrand (vWF).

• Waktu paruh F VIII: • Dengan vWF: 12 jam • Tanpa vWF: 2 jam

Perbandingan Faktor VIII dengan vWF

Von Willebrand Factor

Faktor VIII

Fungsi Adesi platelet, stabilitas factor VIII

Pembentukan fibrin clot

Tempat sintesis

Sel endotel, Megakariosit

Hepatosit

Kontrol genetik

Autosomal dominant

X-linked recessive

Hemofilia Normal Rendah

Von Willebrand Disease

Rendah rendah

Gambar skematik dua bentuk yang berbeda darifaktor VIII. (Pisarek et al., 2016)

186 kb

26 ekson

Terletak diregio Xq2.8

8

Gen FVIII

Rentang normal F VIII yaitu berkisar 50%-150% darinilai normal (bervariasi sesuai umur)

FVIII meningkat pada keadaan (Williamson et al., 2011): • Status inflamasi sebagai reaktan fase akut

• Penggunaan kontrasepsi oral

• Kehamilan trimester terakhir

FVIII menurun pada keadaan (Williamson et al., 2011): • Hemofilia A

• Disseminated intravascular coagulation (DIC)

• Acquired factor VIII inhibitor

• Von willebrand disease

• Beberpa wanita karier gen hemofilia (ringan)

Faktor Koagulasi IX (FIX)

• Protein yg tergantung Vit. K, dlm bentuk zymogen yg tdk aktif

• Aktivitasnya berlangsung pada membran fosfolipid, diawali dengan membentuk komplek dg faktorjaringan (TF/VIIa)

• Rentang normal: 70%-120% dari nilai normal

Peningkatan FIX terjadi pada:• Kehamilan• Penggunaan kontrasepsi oral

Penurunan FIX terjadi pada keadaan: • Hemofilia B• Penyakit hati• Penggunaan antagonis vitamin K (warfarin) atau

defisiensi vitamin K• Amyloidosis • Syndrome nefrotik• Alloantibodi pada hemofilia B yang diterapi dengan infus

faktor IX • Autoantibodi terhadap faktor IX pada individu yang

sebelumnya sehat (sangat jarang)

Kaskade koagulasi

Hemofilia A

• Defisiensi faktor VIII 80% dari kasus hemofilia

• Gangguang X-linked

Kadar FVIII sangat rendah

Inversi (± 50%)

Mutasi titik

insersi

delesi

Hemofilia B

• Defisiensi FIX

• Abnormalitas dari gen FIX pada kromosom X: • Delesi (besar atau kecil)

• Mutasi titik

• Mutasi missense

Gambaran klinis penderita hemofilia

Klinis

Hemarthrosis, hematoma

Perdarahan CNS, hematuria

Perdarahan post Op.

Perdarahan pd cabut gigi

Terbentukinhibitor

antibody thdFVIII atau FIX

Bagaimana terjadi perdarahanpada penderita hemofilia?

Haemarthrosis pada hemofilia

berat

Perdarahan pada otot paha

Differential diagnosis

• Hemofilia: • Hemofilia B• Kelainan koagulasi kongeninal lainnya: defisiensi FXI dan FXII• Von Willebrand disease • Aquired inhibitor FVIII• Kombinasi defisiensi kongenital FVIII dan FV

• Hemofilia B: • Hemofilia A• Defisiensi faktor koagulasi tergantung vit. K (didapat/

diturunkan)• Penyakit hati• Overdosis warfarin

Tabel. Klasifikasi klinis hemofilia A dan hemofilia B berdasarkan kadarfaktor koagulasi.Klasifikasi Hemofilia A

Kadar faktor

VIII

Hermofilia B

Kadar faktor

IX

Gambaran klinis

Severe

(berat)

≤ 1% dari

normal

(≤0.01 U/ml)

≤ 1% dari

normal

(≤0.01 U/ml)

1. Spontaneous hemorrhage

from early infancy

2. Frequent spontaneous

hemarthroses and other

hemorrhages requiring

clotting factor

replacement.

Moderat

(sedang)

1-5% dari

normal

(0.01-0.05

U/ml)

1-5% dari

normal

(0.01-0.05

U/ml)

1. Hemorrhage secondary to

trauma or surgery

2. Occasional spontaneous

hemarthroses

Mild

(ringan)

6-30% dari

normal

(0.06-0.30

U/ml)

6-30% dari

normal

(0.06-0.40

U/ml)

1. Hemorrhage secondary to

trauma or surgery

2. Rare spontaneous

hemorrhage

Dikutip dari: Williams Manual of Hematology, sixth edition. 2003 (Lichtman et al., 2003).

Diagnosis dan pemeriksaanlaboratorium pada hemofilia

Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaanhemofilia dilakukan pada (Kitchen and McCraw, 2000):

• Bayi laki-laki, riwayat keluarga (+), dengan atau tanpa gejala• Remaja atau dewasa asimtomatik perdarahan yang

berlebihan pada saat trauma atau tindakan.• Individu asimtomatik pemanjangan APTT.

Diagnosis pasti hemofilia: • Assay kadar FVIII atau IX • Assay cytogenetic

Algoritme diagnosis laboratorik hemofilia

Pemeriksaan penyaring

hemostasis

APTT memanjang PPT normal

APTT dari campuran plasma pasien dan plasma normal

Tes substitusi

Tidak terkoreksiTerkoreksi

Asai faktor

Inhibitor

Pemeriksaan yang mendukung diagnosis hemofilia:

Pemeriksaan penyaring: CT, PT, APTT

Mixing test

Differential APTT

Pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX

Pemeriksaan inhibitor FVIII atau FIX

1. Pemeriksaan penyaring hemostasis:

1. Masa pembekuan (clotting time): melihatdefisiensi FVIII dan FIX

2. Masa prothrombin plasma (prothrombin time/ PT): Jalur ekstrinsik dan jalur bersama (Faktor II, V, VII, X) memanjang jika 10% dibawah normal

3. Masa tromboplastin partial teraktivasi (activated partial thromboplastin time/ APTT): defisiensijalur intrinsik, terutama FVIIImemanjang jikaFVIII < 25%

2. Mixing test

• Membedakan defisiensi faktor koagulasidengan adanya inhibitor.

Tujuan

• Dilakukan dengan mencampur plasma pasien dengan plasma normal denganperbandingan 1:1, kemudian diinkubasi.

Metode

• APTT memanjang inhibitor faktor VIII

• Koreksi APTT defisiensi atau tidakmenyingkirkan inhibitor apabila klinis sesuai

Interpretasi

3. Differential APTT

Tujuan: untuk menentukan jenis defisiensi faktorsebelum assay faktor

200 µL adsorbed

plasma200 µL plasma

pasien

Masing-masingdilakukan

pemeriksaan APTT

200 µL aged plasma

Skema pemeriksaan differential APTT

Tabel Interpretasi pemeriksaan differential APTT

Plasma normal Adsorbed plasma

(F I,V,VIII,XI,XII)

Aged plasma

(F II,VII,IX,X,XI,XII)

Kelainan

Terkoreksi Terkoreksi Tidak terkoreksi < FVIII

Terkoreksi Tidak terkoreksi Terkoreksi < FIX

Terkoreksi Terkoreksi Terkoreksi < FXI,XII

Tidak

terkoreksi

Tidak terkoreksi Tidak terkoreksi Inhibitor

4. Pemeriksaan FVIII atau FIX

• Tujuan pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX: 1. Menegakkan diagnosis defisiensi faktor

2. Menilai beratnya gangguan/defisiensi

3. Monitor terapi pengganti

4. Mendeteksi karier

Metode pemeriksaan: 1. one-stage assay

2. two-stage assay

3. chromogenic substrate assay

One-stage

-Berdasarkankemampuan plasma pasien dalammengoreksiperpanjangan APTT dari plasma def.FVIII

Chromogenicsubstrate

-Prinsip mirip fase I two-stage method. Setelah terbentukFxa, Fxa diukurmenggunakansubstratkromogenikspesifik.

Two-stage

-Fase Ireagen (FV, CaCl₂, fosfolipid, serum) + plasma standar/plasma penderita (FVIII) Fxa

- Fase IIditambahkan plasma substrat (FII & fibrinogen) terbentukbekuanKecepatan terbentuknyabekuan tergantungjumlah Fxa, Fxatergantung FVIII.

Metode Pemeriksaan FVIII

21

Metode One-Stage Assay

Memerlukan plasma defisien FVIII, reagen APTT, plasma standar, plasma normal.

Alat yang dipakai koagulometer

Interpretasi hasil menggunakan kurva standardengan kertas grafik semilogaritmic atau double logaritmic.

22

Pemeriksaan FVIII

1. Plasma kontrol dan plasma pasien dibuatpengenceran 1:10, 1:20, 1:40 dengan lar.dapar

2. Ambil 100 µL plasma yg telah diencerkan + 100 µL plasma defisien FVIII + 100 µL reagen APTT inkubasi pada 37⁰C selama 5’

3. Tambahkan 100 µL CaCl₂ yang telah diinkubasipada 37⁰C

4. Catat lama waktu terbentuk bekuan

5. Hasil dari plasma pasien maupun kontrol diplotpada kurva standar.

23

24Interpretasi pengukuran kadar FVIII²⁰

5. Pengukuran kadar inhibitor FVIII atau FIX

Inhibitor FVIII diperiksa dengan mencampur plasma pasien dengan plasma normal dengan perbandinganyang sama + FVIII inkubasi. Bila plasma sampelmengandung inhibitor, FVIII akan cepat dinetralkan.

Satuan: BU inhibitor FVIII yang menginaktifkansetengah dari jumlah awal kadar FVIII dalam normal pooled plasma

Metode yang sering dipakai: metode Bethesda modifikasi Nijmegen.

• Metode pemeriksan inhibitor FIX sama dengan inhibitor FVIII

Bethesda vs Nijmegen Assays

Test

mixtureControl

mixture

FVIII

Deficient

Plasma

Patient

Plasma

Buffered

Normal

Plasma

pH 7.4

50/50 Mix

Incubate

2hr 37o C

Factor VIII activity assay

Calculate inhibitor activity (NBU/ml)

Test

Mixture

Control

Mixture

Imidazole

Buffer

pH 7,4

Patient

Plasma

Normal

PooledPlasma

50/50 Mix

Incubate

2hr 37o C

Factor VIII activity assay

Calculate inhibitor activity (BU/ml)

Nijmegen-Bethesda AssayClassical Bethesda Assay

Slide concept courtesy of Drs HW Verbruggen and Piet Meijer, ECAT Foundation

26

10

100

0 0.50 1.00 1.50 2.00

Bethesda Units (BU)

Re

sid

ua

l A

cti

vit

y (

%)

2.50

100

7570

61

50

40

3228

251 BU =

amount of

inhibitor that

inactivates

50% of FVIII

in NPP

2 BU = amount of

inhibitor that

inactivates 75%

of FVIII in NPP

10

100

0 0.50 1.00 1.50 2.00

Bethesda Units (BU)

Re

sid

ua

l A

cti

vit

y (

%)

2.50

100

7570

61

50

40

3228

25

10

100

0 0.50 1.00 1.50 2.00

Bethesda Units (BU)

Re

sid

ua

l A

cti

vit

y (

%)

2.50

100

7570

61

50

40

3228

25

10

100

0 0.50 1.00 1.50 2.00

Bethesda Units (BU)

Re

sid

ua

l A

cti

vit

y (

%)

2.50

100

7570

61

50

40

3228

25

10

100

0 0.50 1.00 1.50 2.00

Bethesda Units (BU)

Re

sid

ua

l A

cti

vit

y (

%)

2.50

100

7570

61

50

40

3228

25

10

100

0 0.50 1.00 1.50 2.00

Bethesda Units (BU)

Re

sid

ua

l A

cti

vit

y (

%)

2.50

100

7570

61

50

40

3228

25

10

100

0 0.50 1.00 1.50 2.00

Bethesda Units (BU)

Re

sid

ua

l A

cti

vit

y (

%)

2.50

100

7570

61

50

40

3228

25

100

7570

61

50

40

3228

251 BU =

amount of

inhibitor that

inactivates

50% of FVIII

in NPP

1 BU =

amount of

inhibitor that

inactivates

50% of FVIII

in NPP

2 BU = amount of

inhibitor that

inactivates 75%

of FVIII in NPP

2 BU = amount of

inhibitor that

inactivates 75%

of FVIII in NPP

Grafik semilogaritmik untuk menghitung Bethesda Unit

Ringkasan

• Hemofilia: kelainan perdarahan kongenital yang terjadi olehkarena adanya penurunan atau tidak adanya faktor VIII ataufaktor IX secara fungsional.

• Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaan hemofiliapada:

• Bayi laki-laki riwayat hemofilia (+) gejala (-) atau gejala (+) • Remaja atau dewasa asimtomatik yang mengalami perdarahan

yang berlebihan pada saat trauma • Individu asimtomatik yang mengalami pemanjangan APTT.

• Diagnosis lab penderita hemofilia: • pemeriksaan penyaring: (clotting time (CT), PT, APTT)• Mixing test• Differential APTT • Pemeriksaan FVIII, FIX, • Pemeriksaan inhibitor FVIII dan inhibitor FIX.