Pembahasan cara kerja

Pada praktikum kali ini dilakukan penetapan kadar SGPT pada tikus yang terinduksi

paracetamol. Sala satu cara untuk mendeteksi adanya kerusakan hati adalah dengan

memeriksa aktivitas dari SGPT. Enzim ini terdapat dalam sitoplasma dan mitokondria sel

hati. Bila terjadi kerusakan hati maka akan terjadi peningkatan permeabilitas membran

intraseluler seperti mitokondria rusak dan enzim-enzim yang terdapat di dalamnya akan

mengalami peningkatan aktivitas dalam serum. Pemeriksaan kadar serum glutamik piruvit

transaminase atau alanin aminotransferase (SGPT atau ALT) dan kadar serum glutamik

oksaloasetik transaminase atau aspartat aminotransferase (SGOT atau AST) adalah salah satu

dari banyaknya tes fungsi hati lain. Kedua tes ini mengukur kadar enzim yang terdapat dalam

hati, jantung dan otot (Hasan, 2008).

Tahap pertama dari praktikum ini ialah dengan memberikan parasetamol secara per

oral pada tikus (dosis toksik parasetamol pada manusia adalah 8 gram) dalam pelarut CMC-

Na 1% satu hari sebelum pelaksanaan praktikum. Fungsi CMC-Na 1% sebagai suspending

agent dalam sediaan cair (pelarut air) yang ditujukan untuk pemakaian eksternal, oral atau

parenteral (Reynold, 1982). Lalu sebanyak ±100 μl sampel darah yang diambil melalui sinus

orbitalis mata tikus ditampung dalam vacuutiner dan didiamkan 15 menit. Namun dalam

praktikum ini tidak menggunakan vacuutiner untuk menampung sampel darah, tetapi

menggunakan tabung sentrifuse yang telah diberi EDTA sebagai antikoagulan yang

mencegah penggumpalan darah dengan cara mengikat kalsium atau dengan menghambat

pembentukan trombin yang diperlukan untuk mengkonversi fibrinogen menjadi fibrin dalam

proses pembekuan (Riswanto, 2009). Sampel darah disentrifugasi dengan kecepatan 6000

rpm selama 5 menit untuk diambil supernatannya (serum). Setelah itu, dilakukan analisis

kadar SGPT dengan mengambil serum darah yang diperoleh sebanyak ±100 μl menggunakan

mikropipet dengan skala yang sudah diatur sebelumnya dan direaksikan dengan piridoksal

fosfat. Pemipetan menggunakan mikropipet bertujuan supaya diperoleh volume yang lebih

akurat karena akurasi mikropipet ini sangat tinggi. Kemudian dicampur dengan 1000 μl

reagen 1 yang berisi buffer Tris pH 7,5 100 mmol/L, L-alanine 500 mmol/L, LDH ≥ 1800

U/L dan diinkubasi selama 5 menit. Buffer Tris pH 7,5 dalam reagen 1 berfungsi sebagai

dapar yang menjaga pH serum selama reaksi ini dan supaya menjaga kestabilan aktivitas

SGPT karena enzim ini sangat sensitif terhadap perubahan pH. L-alanine berfungsi sebagai

asam amino yang akan diubah menjadi L-Glutamat dengan katalis enzim SGPT. LDH (Laktat

Dehidrogenase) juga merupakan enzim yang akan mengkatalis reaksi dari produk perubahan

L-alanine yang dikatalis oleh SGPT yaitu piruvat, yang akan diubah menjadi laktat. Tujuan

dari inkubasi sendiri agar serum dan reagen dapat bereaksi sempurna. Selanjutnya campuran

tersebut ditambah 250 μl reagen 2 yang berisi 2-oxoglutarat 15 mmol/L dan NADH 0,18

mmol/L. 2-oxoglutarat akan beraksi dengan L-alanine membentuk L-glutamat dan piruvat

dengan katalis oleh enzim SGPT. Enzim ini akan mengkatalis pemindahan gugus amino pada

L-alanine ke gugus keto dari alfa-ketoglutarat membentuk glutamat dan piruvat. Selanjutnya

piruvat direduksi menjadi laktat. Rekasi tersebut dikatalisis oleh LDH yang membutuhkan

NADH dan H+. NADH akan mengalami oksidasi menjadi NAD+. Campuran diinkubasi lagi

agar seluruh reagen bereaksi sempurna dengan sampel. Absorbansi sampel diukur

menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm karena pada panjang

gelombang tersebut sampel akan memberikan serapan maksimum. Dilakukan pengukuran

dengan menggunakan spektrofotometer UV/Vis karena mempunyai sensitivitas yang relatif

tinggi, pengerjaanya mudah sehingga pengukuran yang dilakukan cepat, dan mempunyai

spesifitas yang baik. Selain itu, pada pembacaan aktivitas SGPT didasarkan pada NAD+

dimana absorbansi NAD+ sebanding jumlah piruvat yang dihaslikan dari reaksi antara L-

alanine dan 2-oxoglutarat yang dikalatis oleh SGPT. Jumlah piruvat sebanding dengan SGPT

dan aktivitas SGPT dinyatakan dalam U/L (unit/liter) (Yuliani dkk, 2011).

Kuvet berisi sampel dimasukkan ke dalam spektrofotometer UV/Vis untuk diukur

absorbansinya. Namun sebelumnya dilakukan pengukuran blanko terlebih dahulu. Pembuatan

larutan blanko sama dengan pembuatan larutan sampel yang akan diuji, tetapi hanya reagen I

dan II tanpa adanya sampel. Blanko ini berfungsi supaya alat spektrofotometer yang

mengenal matriks selain sampel sebagai pengotor. Kemudian setting blank sehingga ketika

pengukuran hanya sampel yang akan diukur absorbansinya pada layar readout. Selama proses

pemeriksaan ini bagian bening kuvet tidak boleh disentuh oleh tangan karena sumber sinar

akan diteruskan melalui bagian bening kuvet. Jika bagian bening kuvet terkontaminasi oleh

tangan, maka akan mempengaruhi nilai absorbansi karena protein-protein yang terdapat pada

tangan akan ikut menempel pada permukaan kuvet. Hal ini akan memungkinkan kesalahan

dalam menginterpretasikan data yang diperoleh. Hasil absorbansi yang diperoleh kemudian

dihitung menggunakan rumus berikut untuk memperoleh nilai x, dimana x adalah kadar

Y = 0,971x + 0,047

Dipakainya rumus tersebut karena perolehan nilai absorbansi yang didapat lebih besar kontrol

daripada sampel. Hal ini dapat terjadi salah satunya karena pembacaan pada panjang

gelombang yang kurang tepat, menurut Yuliani dkk (2011) bahwa pembacaan NAD+ spesifik

pada panjang gelombang 365 nm, sedangkan pada praktikum ini dibaca pada panjang

gelombang 340 nm. Setelah nilai x didapat selanjutnya dimasukkan dalam rumus berikut :

Untuk kontrol : x 20

Untuk perlakukan :

Kadar SGPT yang diperoleh untuk sampel kontrol sebesar 16,347 U/L dan untuk sampel

perlakuan 27,2338 U/L.

Daftar pustaka

Hasan, I., 2008, Peran Albumin Dalam Penatalaksanaan Sirosis Hati, Medicinus, Vol.21 No 2

Reynold, James EF., 1982, Martindale the extra pharmacopeia, Twenty-eight edition, The

pharmaceutical press, London

Riswanto, 2009, Antikoagulan, http://labkesehatan.blogspot.com/2009/11/antikoagulan.html

diakses tanggal 18 April 2014

Yuliani, Sapto dkk., 2011, Effects Of Lycopene on SD (Sprague Dawley) Rat Paracetamol-

Induced By Determination Of Aminotransferase (SGPT) Activity in Blood, Jurnal

Ilmiah Kefarmasian, Vol.1 No.2 : 23-33