ii 

 

OPTIMASI SUHU DAN VOLUME ETANOL DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii. M.) DENGAN

APLIKASI DESAIN FAKTORIAL

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Diana Erosita Pramesthi

NIM : 058114045

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2008

v 

HALAMAN PERSEMBAHAN

Kita tidak pernah diberi impian tanpa kemampuan untuk mewujudkannya.

Kupersembahkan Skripsi ini bagi :

Jesus Christ

Papa Mamaku

Adik-adikku

Teman-teman angkatan 2005

Almamaterku Tercinta

Janganlah takut, sebab Aku menyertai engkau,

janganlah bimbang, sebab Aku ini Allahmu; Aku akan meneguhkan, bahkan akan

menolong engkau; Aku akan memegang engkau dengan tangan

kananKu yang membawa kemenangan. Yesaya 41 : 10

vii 

PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan Yang Maha Pengasih dan Penyayang atas

semua berkat dan penyertaan-Nya kepada penulis, sehingga penulis dapat

menyelesaikan laporan akhir ini dengan baik. Laporan akhir ini disusun untuk

memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi (S.Farm).

Penulis banyak mengalami kesulitan dan hambatan dalam menyelesaikan

laporan akhir ini. Namun dengan bantuan dari banyak pihak, akhirnya penulis

dapat menyelesaikan laporan akhir tersebut. Dengan kerendahan hati penulis ingin

mengucapkan terimakasih atas bantuan yang telah diberikan kepada :

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

2. PHKA3 atas bantuan dan kesempatan yang diberikan.

3. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat

Tradisional atas batuannya dalam pengadaan bahan baku dalam penelitian

ini.

4. Yohanes Dwiatmaka M.Si., selaku dosen pembimbing yang telah

memberikan bimbingan dan arahan kepada penulis.

5. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah

memberikan bimbingan dan arahan kepada penulis.

6. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku dosen penguji atas kesediaannya

meluangkan waktu untuk menjadi dosen penguji, serta kritik dan saran yang

diberikan.

viii 

7. Ign. Yulius Kristio Budiasmoro M.Si., selaku dosen penguji yang telah

menguji sekaligus memberikan kritik, saran, dan arahan kepada penulis.

8. Yohanes Martono, S.Si. atas arahan dan masukan yang diberikan.

9. Papa, mama, dan adik-adik atas dukungan, kasih sayang, dan cintanya.

10. Teman-teman payung Steviosida sebagai teman satu tim atas bantuan,

kerjasama, dan dukungannya.

11. Teman-teman angkatan 2005 terutama kelompok E atas suka dan duka yang

kita lewati bersama.

12. Teman-teman Kost Wisma Surya atas bantuan doa dan dukungannya.

13. Pak Kasiran, Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Ottok, serta laboran-laboran

yang lain atas bantuannya selama penulis menyelesaikan laporan akhir.

14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan laporan akhir ini.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan laporan akhir ini banyak

kekurangan mengingat adanya keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis.

Untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua

pihak. Akhir kata semoga laporan ini dapat berguna bagi pembaca.

Penulis

x 

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL.........................................................................................i

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................ iii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI .............................................. vi

PRAKATA ........................................................................................................ vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................ ix

DAFTAR ISI ....................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiii

DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xv

INTISARI ......................................................................................................... xvi

ABSTRACT ...................................................................................................... xvii

BAB I. PENGANTAR.........................................................................................1

A. Latar Belakang...........................................................................................1

B. Perumusan Masalah...................................................................................3

C. Keaslian Penelitian....................................................................................3

D. Manfaat Penelitian.....................................................................................3

E. Tujuan Penelitian.......................................................................................4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.................................................................5

A. Stevia rebaudiana Bertoni. M...................................................................5

1. Keterangan botani.............................................................................5

2. Deskripsi tanaman............................................................................5

B. Glikosida Steviol.......................................................................................6

C. Maserasi....................................................................................................9

D. Etanol 96%................................................................................................10

E. Sokletasi....................................................................................................10

xi 

F. Ekstrak.........................................................................................................11

G. Kromatografi Lapis Tipis............................................................................11

H. KLT Densitometri.......................................................................................13

I. . Image J........................................................................................................14

J. Desain Faktorial............................................................................................15

K. Landasan Teori............................................................................................17

L. Hipotesis......................................................................................................18

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN.............................................................19

A. Jenis Rancangan Penelitian.........................................................................19

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.............................................19

1. Variabel Penelitian.........................................................................19

2. Definisi Operasional......................................................................20

C. Materi Penelitian.........................................................................................21

D. Instrumen Penelitian....................................................................................22

E. Tahap-tahap Penelitian................................................................................22

1. Determinasi Tanaman Stevia rebaudiana Bertonii.M...................22

2. Pembuatan Simplisia Daun Stevia rebaudiana Bertonii.M..........22

a. Pengumpulan bahan............................................................22

b. Sortasi Kering.....................................................................22

c. Pengeringan........................................................................23

d. Pembuatan Serbuk..............................................................23

e. Pembuatan Ekstrak.............................................................23

1. Defatisasi Serbuk Simplisia....................................23

2. Ekstraksi Serbuk Simplisia....................................23

3. Analisis Kualitatif Ekstrak Tanaman Stevia..................................24

4. Analisis Kuantitatif Ekstrak Tanaman Stevia ...............................25

a. Pembuatan Kurva Baku dan analisis sampel ...................25

b. Analisis Hasil....................................................................26

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN.............................................................28

A. Determinasi Tanaman Stevia.....................................................................28

B. Pemilihan Simplisia dan Pembuatan Serbuk.............................................28

xii 

C. Pembuatan Ekstrak Stevia Secara Maserasi...............................................32

D. Analisis Kualitatif Bercak Maserat Tanaman Stevia..................................35

E. Analisis Kuantitatif Bercak Maserat Tanaman Stevia................................39

1. Pembuatan Kurva Baku.................................................................39

2. Penetapan Kadar Sampel……………………………………………..42

3. Analisis Kadar Secara Desain Faktorial……………………...........44

4. Analisis Yate’s Treatment…………………………………………….46

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN...............................................................49

A. Kesimpulan.................................................................................................49

B. Saran...........................................................................................................49

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................... ...................50

LAMPIRAN ......................................................................................................... 56

BIOGRAFI PENULIS ......................................................................................... 80

xiii 

DAFTAR TABEL

Tabel I. Notasi Formula Desain Faktorial ......................................................... 16

Tabel II. Variasi Kondisi Suhu dan Volume Etanol 96% ................................. 24

Tabel III. Rf Sampel dan Baku Steviosida ........................................................ 37

Tabel IV. Hubungan Jumlah Steviosida (µg) dengan AUC pada seri Baku ..... 41

Tabel V. Kadar Steviosida dalam ekstrak yang dibuat dari masing-masing kondisi

dan replikasi ........................................................................................ 42

Tabel VI. Kondisi Desain Faktorial dan Respon yang dihasilkan ................... 44

Tabel VII. Nilai Efek dari faktor Suhu, Etanol 96%, dan Interaksinya ............ 44

Tabel VIII. Hasil Perhitungan Yate’s Treatment pada respon kadar Steviosida47

xiv 

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur komponen glikosida Steviol ................................................ 8

Gambar 2. Struktur komponen glikosida Steviol ................................................ 8

Gambar 3. Tampilan bercak sampel dan baku untuk perhitungan Rf ............... 38

Gambar 4. Tampilan bercak sampel dan baku untuk perhitungan Rf setelah di

Image J .............................................................................................. 40

Gambar 5. Grafik Kurva Baku .......................................................................... 41

Gambar 6. Grafik hubungan suhu maserasi (a) dan volume etanol (b) terhadap

kadar steviosida ................................................................................... 45

Gambar 7. Contour Plot Daerah Optimum ....................................................... 46

xv 

 

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Kurva Baku Steviosida ................................................................. 56

Lampiran 2. Data Sampel .................................................................................. 57

Lampiran 3. Perhitungan Data Sampel ............................................................. 58

Lampiran 4. Perhitungan Desain Faktorial ...................................................... 63

Lampiran 5. Grafik Contour Plot ...................................................................... 66

Lampiran 6. Perhitungan Yate’s Treatment ...................................................... 67

Lampiran 7. Gambar Tanaman dan simplisia kering ........................................ 71

Lampiran 8. Gambar pereaksi semprot ............................................................ 72

Lampiran 9. Tampilan Baku dan sampel pada lempeng KLT .......................... 73

Lampiran 10. Tampilan Baku dan Sampel dalam Tahapan Image J ................ 74

Lampiran 11. Tampilan Ekstrak.........................................................................75

Lampiran12. Lampiran Surat Determinasi ........................................................ 76

Lampiran 13. Langkah-langkah Analisis Image J..............................................78

xvi 

 

OPTIMASI SUHU DAN VOLUME ETANOL DALAM PROSES MASERASI DAUN STEVIA (Stevia rebaudiana Bertonii .M.) DENGAN

APLIKASI DESAIN FAKTORIAL

INTISARI

Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii. M.) merupakan tanaman yang banyak dimanfaatkan sebagai pemanis alami tidak berkalori berupa steviosida. Karena tidak berkalori maka pemanis ini sesuai untuk dikonsumsi bagi para penderita diabetes. Steviosida banyak terkandung pada daun tanaman stevia. Salah satu tahapan dalam proses isolasi steviosida adalah ekstraksi. Pada penelitian ini digunakan metode ekstraksi secara maserasi terhadap serbuk daun stevia dengan perbedaan suhu dan jumlah volume cairan penyari. Penelitian ini ditujukan untuk mengetahui faktor yang dominan mempengaruhi proses maserasi serbuk daun tanaman stevia agar dihasilkan kadar steviosida yang optimal. Cairan penyari yang digunakan adalah etanol 96%.

Penetapan kadar steviosida menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis dengan Fase diam silika gel dan fase Gerak kloroform : metanol : air (10 : 15: 2 v/v ) yang selanjutnya dihitung luas bercak yang muncul secara densitometri dengan menggunakan software Image J. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental menggunakan metode desain faktorial, dengan 2 faktor yaitu suhu-volume etanol dan 2 level, yaitu level tinggi-level rendah. Analisis data secara statistik menggunakan Yate’s Treatment dengan taraf kepercayaan 95%.

Diperoleh hasil bahwa suhu maserasi, volume etanol 96%, dan interaksinya mempengaruhi kadar steviosida yang dihasilkan. Volume etanol 96% berpengaruh dominan terhadap respon kadar steviosida yang dihasilkan, sedangkan suhu maserasi dan interaksi antara suhu maserasi dan volume etanol 96% tidak berpengaruh dalam menentukan kadar steviosida yang dihasilkan. Berdasarkan contour plot diperoleh area optimum untuk kadar steviosida yang dihasilkan yang diperkirakan sebagai proses maserasi optimum pada level yang diteliti. Kata kunci : Stevia rebaudiana Bertonii. M., steviosida, maserasi, suhu, volume pelarut etanol 96%, Kromatografi Lapis Tipis, Image J, Desain Faktorial.

xvii 

 

ABSTRACT

Stevia is a plant which used as a sweeterner that have zero calorie so it’s suitable for diabetic patient. Stevioside is much contains in leaves. One step in isolation process of stevioside is extraction. In this experiment used maceration method of extraction stevia leaves powder with different of temperature and ethanol 96% volume. In this experiment used to know the dominant factor influence in maceration process of stevia leaves powder which produced optimum concentration of stevioside. Solvent that use in this process is ethanol 96%.

Determination of concentration stevioside use the Thin Layer Chromatography with stationary phase is silica gel and mobile phase is cloroform : methanol : water (10 : 15: 2 v/v ) and than the wide of spot analysed with Image J software. This study was experimental research use factorial design method with two factor maceration temperature-volume of etanol 96% and two level high level-low level. The maceration process were optimized on their concentration of stevioside. The data were analyzed statistically using Yate’s treatment with 95% level of confidence.

The result show that the maceration temperature, volume of ethanol 96%, and its interaction influence with concentration of stevioside. Volume of ethanol 96% was dominant on determining concentration of stevioside, while maceration temperature and the interaction between maceration temperature and volume of ethanol 96% not influence on determining concentration of stevioside. The contour plot showed the optimum area of concentration of stevioside. The area was estimated as optimum maceration process of stevia extract on the level studied. Keyword : Stevia rebaudiana Bertonii. M., stevioside, maceration, Temperature, volume of ethanol 96%, Thin Layer Chromatography, Image J, Factorial Design.

 

1 

 

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Pada jaman sekarang ini jumlah penderita penyakit diabetes semakin

meningkat, hal ini membawa kesadaran akan pentingnya pencegahan penyakit

tersebut sehingga membawa dampak berupa peningkatan jumlah konsumsi gula

tidak berkalori sebagai pemanis (Anonim, 2004). Sebagai alternatif digunakan

bahan pemanis buatan dengan kalori yang lebih rendah yang terbuat dari senyawa-

senyawa kimia, sebagai contoh natrium sakarin, natrium siklamat, dan lain

sebagainya. Pemanis pengganti tersebut memiliki rasa yang mirip dengan sukrosa

(Moraes dan Machado, 2001), akan tetapi ternyata penggunaan dalam jumlah

yang besar akan menimbulkan rasa pahit (Achyar, 2005) dan penggunaan dalam

jangka waktu lama dapat bersifat karsinogen (Mudjajanto, 2005).

Oleh karena itu digunakan alternatif pemanis lainnya, yang berupa bahan

pemanis alami yang berasal dari ekstrak tanaman. Salah satu tanaman yang

potensial dapat dikembangkan sebagai pemanis adalah stevia. Pada tanaman

stevia terkandung steviosida yang berperan menimbulkan rasa manis yang

besarnya kurang lebih 200-300 kali kemanisan gula jika dilarutkan dalam air

(Wallin, 2007) dan tidak berkalori (Moraes dan Machado, 2001). Selain itu dari

beberapa penelitian telah menyebutkan bahwa steviosida tidak mempunyai

aktivitas toksik yang berarti bagi sistem biologi. Ekstrak yang mengandung

steviosida tidak mempunyai efek mutagenik dan genotoksik (Nabors, 1986). 

2 

 

 

Oleh karena itu, untuk mendapatkan ekstrak yang mengandung kadar

steviosida yang optimum maka perlu dicari kondisi optimum dalam maserasi.

Pemilihan ekstraksi dengan metode maserasi memiliki kelebihan yaitu cara

pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah dilakukan

(Anonim, 1986). Dalam penelitian ini akan dioptimasi faktor suhu dan faktor

volume etanol 96% pada proses maserasi daun stevia, dimana suhu dan volume

penyari (etanol 96%) berpengaruh terhadap efektivitas penyarian. Selain itu

menurut Wallin (2007), steviosida mudah larut dalam etanol. Berdasarkan hasil

penelitian terungkap juga bahwa dengan peningkatan suhu dalam penyarian

steviosida menggunakan penyari etanol dihasilkan peningkatan kadar steviosida

(Alupului dan Lavric, 2008). Hal ini juga didukung dari data menurut Pasquel

A.(2008) yang menyebutkan bahwa dengan adanya peningkatan suhu dari 16°C

menjadi 45°C dihasilkan peningkatan massa glikosida yang dihasilkan dari 0,1 x

103 kg menjadi 0,15 x 103 kg. Penggunaan etanol sebagai cairan penyari akan

lebih baik kemampuannya dalam mengisolasi steviosida dibanding penyari

dengan air (Jaroslav Pol. dkk , 2007).

Dalam Penelitian ini akan dicari area optimum kondisi proses maserasi

dengan variasi suhu dan volume etanol 96% yang digunakan sehingga dapat

memberi solusi dalam pengadaan ekstrak yang memiliki kandungan steviosida

yang optimum.

3 

 

 

1. Perumusan masalah

Permasalahan dalam penelitian ini dapat dirumuskan dalam pertanyaan

sebagai berikut :

1. Apakah perbedaan suhu dan volume etanol 96% yang digunakan pada

proses maserasi daun stevia berpengaruh terhadap kadar steviosida yang

diperoleh ?

2. Berapakah kadar steviosida yang optimum yang dapat diperoleh pada

proses maserasi daun stevia dengan variasi suhu dan volume etanol

96%?

3. Manakah faktor antara suhu dan volume etanol 96% yang paling

dominan berpengaruh pada proses maserasi daun stevia sehingga

diperoleh kadar steviosida yang optimum?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh yang diketahui penulis, penelitian tentang optimasi proses maserasi

dengan melihat pengaruh suhu dan volume etanol 96% terhadap kadar

steviosida dengan aplikasi desain faktorial belum  pernah dilakukan oleh

peneliti lain.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat Teoritis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan

informasi bagi perkembangan ilmu pengetahuan di bidang farmasi

Sains Teknologi khususnya mengenai pengaruh perbedaan suhu dan

4 

 

 

volume etanol 96% terhadap kadar steviosida yang dihasilkan pada

proses maserasi serbuk daun tanaman stevia.

b. Manfaat Praktis

Dari penelitian ini akan diketahui kondisi suhu dan volume pelarut

etanol 96% dalam proses maserasi yang paling optimal untuk

menghasilkan ekstrak tanaman stevia dengan kadar steviosida yang

paling optimum.

4. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Secara umum penelitian ini bertujuan untuk menambah khasanah ilmu

pengetahuan mengenai kondisi proses maserasi yang optimal untuk

memperoleh kadar steviosida yang paling optimum dari tanaman

stevia.

2. Tujuan khusus

1. Membuktikan ada tidaknya pengaruh perbedaan suhu dan

volume etanol 96% terhadap kadar steviosida yang dihasilkan

pada proses maserasi serbuk daun stevia.

2. Mengetahui kadar steviosida yang optimum yang dihasilkan

dalam proses maserasi serbuk daun stevia dengan variasi suhu

dan volume etanol 96%.

3. Mengetahui faktor yang dominan antara suhu dan volume

etanol 96% yang berpengaruh dalam memperoleh maserat

dengan kadar steviosida yang optimal.

 

5 

 

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Stevia

a. Keterangan botani

Stevia (Stevia rebaudiana Bertonii. M.) merupakan anggota dari famili

Compositae. Stevia merupakan tanaman perenial bersemak kecil, yang dapat

tumbuh hingga ketinggian 65 cm. (Brandle dan Rosa, 1992). Tanaman Stevia

telah sukses ditanam di Jepang, Korea, Taiwan dan di negara-negara lain di dunia.

Ketika tanaman ini tumbuh maksimal maka tingginya mencapai 80 cm (Nabors,

1986).

Stevia ditemukan oleh orang Eropa Dr. M.S. Bertoni pada tahun 1898 di

daerah Paraguay, selanjutnya Dr. Rebaudi mendeskripsikan dan memberi nama

pada tanaman tersebut. Terdapat lebih dari 150 spesies yang telah dikenal tetapi

hanya satu yang secara signifikan mempunyai rasa manis (Midmore D.J., and

Rank A.H., 2002).

Stevia rebaudiana Bertonii.M. merupakan spesies yang paling manis

diantara 150 spesies lain yang ada. Stevia mengandung seluruh glikosida di

daunnya berupa steviosida yang merupakan komponen yang paling banyak

terkandung yaitu 3% - 10% dari berat serbuk kering daunnya (Gardana, Simonetti,

Canzi, Zanchi, Pietta, 2003).

b. Deskripsi tanaman

Habitus: semak, semusim, tinggi 30-90 cm. Batang: bulat, berbulu,

beruas, bercabang, hijau. Daun; tunggal, berhadapan, bulat telur, ujung tumpul,

6 

 

 

pangkal runcing, tepi rata, panjang 2-4 cm, lebar 1-3 cm, pertulangan meyirip,

berbulu, tangkai pendek, hijau. Bunga: majemuk, bentuk malai, di ujung dan di

ketiak daun, bentuk cawan, kelopak bentuk tabung, berbulu, berbagi lima, hijau,

tangkai benang sari dan tangkai putik pendek, kepala sari kuning, putik bentuk

silindris, putih. Buah: kotak, berambut, coklat. Biji; bentuk jarum, putih kotor.

Akar: tunggang, putih kotor (Backer dan bakhuizen van de Brink Jr., 1968).

B. Glikosida Steviol

Glikosida merupakan senyawa yang menyusun satu atau lebih gula.

Glikosida tersusun dari dua macam bagian yaitu gula yang disebut glikon dan non

gula yang disebut aglikon (Tyler, 1988). Terdapat dua kelas glikosida, yaitu C-

glikosida dimana gula yang terikat pada aglikon melalui ikatan karbon-karbon dan

O-glikosida dimana gula yang terikat pada aglikon melalui ikatan oksigen-karbon

(Trease and Evan’s, 2002).

Ekstrak stevia mengandung glikosida diterpen dalam jumlah tinggi yang

berupa glikosida steviol.  Komponen glikosida steviol yang terdapat dalam

tanaman stevia antara lain: steviol, steviolbiosida, steviosida, rebaudiosida A,

rebaudiosida B, rebaudiosida C, rebaudiosida D, rebaudiosida E, rebaudiosida F,

rubusodida, dan dulcoside A. Di antara kandungan-kandungan senyawa tersebut,

steviosida dan rebaudiosida A merupakan komponen pemanis utama pada stevia

(Wallin, 2007).

Wujud dari glikosida steviol ini berupa serbuk berwarna putih atau putih

kekuningan yang mudah larut dalam air dan etanol. Tingkat kemanisan dalam air

dari glikosida steviol ini 200 sampai 300 kali kemanisan sukrosa (Wallin, 2007).

7 

 

 

Menurut anonim (1995) untuk istilah mudah larut diartikan bahwa untuk

melarutkan 1 bagian zat diperlukan 1 sampai 10 bagian pelarut.

Rasa manis yang ditimbulkan karena terjadi ikatan molekul dengan

reseptor protein spesifik pada sel di lidah yaitu T1r3. T1r3 mempunyai “

kantong”, dimana molekul kecil dapat masuk dan mungkin berikatan. Ikatan yang

terjadi berhubungan dengan bentuk molekul yang sesuai dan adanya gugus fungsi

yang berinteraksi untuk menstabilkan ikatan. Rasa manis yang ditimbulkan tidak

ada hubungannya dengan metabolisme suatu molekul (Purves, 2006)

Larutan steviosida stabil dalam pH 3-9 dan pada pH tersebut serta pada

suhu 1000C stabil selama 1 jam. Selain itu apabila disimpan pada suhu 800C

selama 5 jam maka tidak akan ditemukan dekomposisi dari senyawa ini. Senyawa

ini akan terdekomposisi pada pH 10, sedangkan dalam larutan asam akan

memiliki kestabilan yang tinggi (Nabors, 1986). Berikut ini adalah rumus molekul

dari komponen glikosida steviol dalam stevia (Mantovaneli, 2004):

Glikosida Diterpen R1 R2 Tingkat Kemanisan (Sukrosa = 1)

Steviosida Glu Glu - Glu 150 – 300

Rebausida Glu Glu 100 – 120

Steviolbiosida H Glu – Glu 100 – 125

8 

 

 

Rebaudiosida A Glu Glu – Glu

Glu

250 – 450

Rebaudiosida B H Glu – Glu

Glu

300 – 350

Rebaudiosida C

(Dulkosida B)

Ram Glu – Ram

Glu

50 – 120

Rebaudiosida D Glu – Glu Glu – Glu

Glu

250 – 450

Rebaudiosida E Glu – Glu Glu – Glu 150 – 300

Dulkosida A Glu Glu – Ram 50 – 120

Glu = β-D-Glukopironasil Ram = α-L-Ramnopironasil

Gambar 1. Struktur komponen glikosida steviol (Mantovaneli, 2004)

Gambar 2. Struktur Steviosida

Kalorie merupakan pengukuran energi yang dihasilkan ketika makanan

dimetabolisme. Substansi yang tidak dimetabolisme, tidak menghasilkan energy

atau non kalori (Purves, 2006).

Steviosida tidak diserap usus dan tidak dimetabolisme oleh enzim

pada saluran pencernaan karena ikatan glukosa pada steviosida adalah ikatan b-

glukosidik. Steviosida didegradasi menjadi steviol dan glukosa oleh bakteri pada

kolon manusia. Sebanyak 400 mg steviosida hanya dihasilkan 240 mg glukosa

9 

 

 

pada kolon. Glukosa yang dihasilkan ini, sepertiga bagian dimetabolisme oleh

bakteri kolon, sepertiga bagian diekskresi, dan sepertiga bagian (± 80 mg) diserap

sehingga jumlah glukosa tersebut dapat diabaikan. Steviol yang dihasilkan dari

400 mg steviosida adalah sebanyak 160 mg. sekitar 90% dari bentuk steviol ini

diekskressi bersama dengan feses. Sejumlah kecil steviol diserap kolon dan

dikonjugasikan agar dapat dieksresi dalam urine (Perret, 2006).

C. Maserasi

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari

akan menembus dinding sel dan akan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan

konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang diluar sel, maka

larutan encer masuk ke dalam sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi

keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Anonim,

1986).

Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, air-etanol, atau

pelarut lain. Bila cairan penyari digunakan air maka untuk mencegah timbulnya

kapang, dapat ditambahkan bahan pengawet, yang diberikan pada awal penyarian

(Anonim, 1986).

Proses ekstraksi maserasi serbuk daun tanaman stevia dapat

menggunakan air panas atau alkohol. Serbuk daun stevia sebelum diekstraksi

dilakukan perlakuan dengan menggunakan pelarut non polar seperti kloroform

atau heksan yang bertujuan untuk mengurangi kandungan minyak atsiri, lipid,

10 

 

 

klorofil, dan senyawa non polar lainnya (Wallin, 2007). Berdasarkan hasil

penelitian terungkap bahwa dengan peningkatan suhu dalam penyarian steviosida

menggunakan penyari etanol akan dihasilkan peningkatan kadar steviosida

(Alupului and Lavric, 2008). Selain itu juga disebutkan bahwa peningkatan

volume pelarut akan meningkatkan jumlah steviosida yang terekstrak (Alupului

and Lavric, 2008).

D. Etanol 96%

Etanol mengandung tidak kurang dari 92,3% b/b dan tidak lebih dari

93,8%b/b, setara dengan tidak kurang dari 94,9%v/v dan tidak lebih dari 96%v/v

,C2H5OH, pada suhu 15,560C. Pemerian: Cairan mudah menguap, jernih, tidak

berwarna. Bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada lidah. Mudah menguap

walaupun pada suhu rendah dan mendidih pada suhu 780C. Bercampur dengan air

dan praktis larut dengan semua pelarut organik (Anonim, 1995).

Etanol dapat dipertimbangkan sebagai cairan penyari karena alasan-

alasan berikut, antara lain: lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam

etanol 20% ke atas, tidak beracun, netral, absorbsinya baik, etanol dapat

bercampur dengan air dalam segala perbandingan, panas yang diperlukan untuk

pemekatan lebih sedikit (Anonim, 1986). Penggunaan etanol sebagai cairan

penyari akan lebih baik kemampuannya dalam mengisolasi steviosida dibanding

penyari dengan air (Jaroslav Pol. dkk , 2007).

E. Sokletasi

Sokletasi merupakan salah satu metode ekstraksi. Dalam metode

sokletasi, cairan penyari diisikan pada labu, serbuk simplisia diisikan pada tabung

11 

 

 

dari kertas saring atau tabung yang berlubang-lubang dari gelas, baja tahan karat

atau bahan lain yang cocok. Cairan penyari akan dipanaskan hingga mendidih.

Uap penyari akan naik ke atas melalui serbuk simplisia. Uap penyari mengembun

karena didinginkan oleh pendingin balik. Embun turun melalui serbuk simplisia

sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu. Cairan akan menguap

kembali berulang proses sebelumnya, uap penyari akan naik ke atas melalui

serbuk simplisia, kemudian uap penyari mengembun dan embun turun melalui

serbuk simplisia sambil melarutkan zat aktifnya dan kembali ke labu. (Anonim,

1986). Kelebihan dari sokletasi adalah jumlah pelarut yang dibutuhkan sedikit,

dan penyarian terjadi dengan pelarut yang selalu baru secara terus-menerus.

Kekurangan dari sokletasi adalah membutuhkan waktu ekstraksi yang lama

(beberapa jam) sehingga dibutuhkan energi listrik yang tinggi (Voigt, 1994).

F. Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kering, kental, atau cair dibuat dengan menyari

tanaman atau hewani menurut cara yang cocok di luar pengaruh cahaya matahari

langsung. Cairan penyari yang biasa digunakan adalah air, eter, atau campuran air

dan etanol. Penyarian simplisia dengan air dapat dilakukan dengan cara maserasi,

perkolasi, atau peyeduhan dengan air mendidih.(Anonim, 1979).

G. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis merupakan metode pemisahan komponen-

komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi atas fase diam di bawah

gerakan pelarut atau pelarut pengembang yang berupa campuran. Pemilihan

pelarut pengembangan atau pelarut pengembangan yang berupa campuran sangat

12 

 

 

dipengaruhi oleh macam dan polaritas zat-zat kimia yang dipisahkan. Fase diam

yang umum dan banyak dipakai adalah silika gel, sedangkan jenis yang lain dapat

dipakai alumina, kieselguhr, celite, serbuk sellulosa, serbuk poliamida, kanji, dan

sephadex. Penyangga untuk fase diam dapat berupa plastik, logam, ataupun kaca.

(Mulja, 1995).

Lempeng KLT biasanya dilapisi adsorbent dengan indikator fluorescens

(F254) sehingga senyawa alam yang mengabsorbsi sinar UV dekat (254 nm) akan

menampakkan spot hitam dengan background lempeng hijau. Untuk senyawa

alam yang tidak nampak dengan deteksi UV membutuhkan reagent semprot,

seperti vanillin-asam sulfat, reagent Dragendorff, asam fosfomolibdat atau

antimony triklorida (Heinrich dkk, 2004).

Fase diam yang berupa silika gel dapat digunakan untuk memisahkan

senyawa-senyawa yang termasuk golongan asam amino, alkaloid, gula, asam

lemak, anion dan kation anorganik, dan terpenoid melalui mekanisme pemisahan

secara partisi (Stock, 1974). Baik silika gel, kieselguhr maupun alumina,

semuanya bersifat polar, dengan adanya atom O dan gugus hidroksi pada

permukaan (Gritter, 1985).

Untuk identifikasi senyawa yang dipisahkan menggunakan perbandingan

rambatan senyawa dibandingkan dengan rambatan zat pelarutnya dikenal dengan

harga Rf.

Rf = Jarak titik pusat bercak dari penotolan Jarak rambat fase gerak   

13 

 

 

Angka Rf berjarak antara 0,00 sampai 1,00 dan hanya dapat ditentukan

dua desimal, sedangkan hRf ialah angka Rf dikalikan faktor 100 dan

menghasilkan nilai berjarak antara 0-100 (Stahl, 1985).

H. KLT Densitometri

KLT Densitometri merupakan salah satu dari metode analisis KLT

Kuantitatif. Penetapan kadar suatu senyawa dengan metode ini dilakukan dengan

mengukur kerapatan bercak senyawa yang dipisahkan dengan cara KLT. Pada

umumnya pengukuran kerapatan bercak tersebut dibandingkan dengan kerapatan

bercak standar yang dielusi bersama-sama. Syarat-syarat untuk senyawa standar

adalah murni, inert, dan stabil (Sastrohamidjojo, 1985). Instrument modern

memungkinkan pengukuran cepat dalam berbagai keadaan serapan atau pendaran,

baik dengan cara penerusan atau pemantulan. Teknik ini memungkinkan

pengukuran panjang gelombang serapan maksimum untuk mencapai kepekaan

yang lebih besar (Munson, 1991)

Ada dua cara penetapan kadar dengan alat densitometer, pertama, setiap

kali penetapan ditotolkan sediaan baku dari senyawa yang bersangkutan dan

dielusi bersama dalam suatu lempeng, kemudian AUC (luas daerah di bawah

kurva) sampel dibandingkan dengan harga AUC zat baku. Yang kedua, dengan

membuat kurva baku hubungan antara jumlah zat baku dengan AUC. Kurva baku

diperoleh dengan membuat totolan zat baku pada pelat KLT dengan bermcam-

macam konsentrasi (minimal tiga macam konsentrasi). Bercak yang diperoleh

dicari AUCnya dengan alat densitometer. Dari kurva baku diperoleh persamaan

14 

 

 

garis lurus Y=Bx+A, dimana x adalah kadar zat yang ditotolkan dan Y adalah

AUC (Supardjan, 1987).

I. Image J

Image J merupakan suatu program berbasis Java yang berguna untuk

memproses gambar. Program ini dikembangkan pada Institusi Kesehatan

Nasional. Program ini memungkinkan pengguna untuk dapat menganalisis dan

memproses banyak gambar mulai dari bentuk 3 dimensi sel hidup hingga

memproses gambar radiologis, berbagai perbandingan data gambar sampai sistem

hematologi (Anonim, 2008). Program ini dapat diaplikasikan pada Microsoft

Windows, Mac OS, Mac OS X, Linux, dan Sharp Zaurus PDA (Jahnen, 2008).

Kromatogram pada lempeng KLT dapat dihitung intensitas bercaknya

dengan menggunakan software Image J (Zeligs and Bradlow, 2006). Menurut

Patnark (2004), dijelaskan mengenai langkah – langkah penggunaan Image J

untuk Densitometri antara lain:

1. Buat gambar dalam format JPEG, TIFF, GIF, atau BMP.

2. Bercak harus dibuat berwarna putih atau hitam (Warna gambar

dapat diatur dalam photoshop)

3. Gambar harus vertikal ( putar gambar jika diperlukan dapat

menggunakan photoshop atau Image J)

4. Buka software Image J

5. Buka file gambar yang akan diukur

6. Pilih menu analyze-calibrate-function-lalu pilih uncalibrate OD

15 

 

 

7. Gunakan rectangular marquee tool untuk memilih gambar yang

pertama akan diukur, pengukuran sebaiknya tinggi kotak untuk

gambar yang dipilih lebih besar dari lebarnya.

8. Pilih menu analyze-gels-pilih first lane

9. Klik dan pindahkan pada gambar selanjutnya yang dipilih,

kemudian analyze-gels-pilih next lane

10. Kemudian pilih analyze-gels-plot lane

11. Akan dihasilkan plot lane

12. Daerah dari plot lane kemudian diukur dengan magic wand tool,

akan terukur luas daerah kurva tertutup.

J. Desain Faktorial

Desain faktorial merupakan metode rasional untuk menyimpulkan dan

mengevaluasi secara obyektif efek dari besaran yang berpengaruh terhadap

kualitas produk (Voigt, 1984).

Penelitian desain faktorial dimulai dengan menentukan faktor dan level

yang diteliti. Penelitian desain faktorial yang paling sederhana adalah penelitian

dengan dua faktor dan dua level (Amstrong, 1996).

Jumlah percobaan untuk penelitian desain faktorial dihitung dari jumlah

level yang digunakan dalam penelitian, dipangkatkan dengan jumlah faktor yang

digunakan. Jumlah percobaan untuk penelitian dengan 2 level dan 2 faktor adalah

22 = 4. Penamaan formula untuk jumlah percobaan = 4 adalah formula (1)untuk

percobaan I, formula a untuk percobaan II , formula b untuk percobaan III, dan

formula ab untuk percobaan IV (Bolton, 1990).

16 

 

 

Pada desain faktorial dua level dan dua faktor diperlukan empat

percobaan (2n = 4, dengan 2 menunjukkan level dan n menunjukkan jumlah

faktor), yaitu (1) A dan B masing-masing pada level rendah, (a) A pada level

tinggi dan B pada level rendah, (b) A pada level rendah dan B pada level tinggi,

(ab) A dan B masing-masing pada level tinggi (Tabel I.) :

Tabel I. Notasi Formula Desain Faktorial Formula Faktor A Faktor B Interaksi

1 - - + A + - - B - + -

Ab + + +

Persamaan umum desain faktorial adalah sebagai berikut :

Y = b0 + b1 (A) + b2 (B) +b12 (A) (B).......................................................(1)

Berdasarkan persamaan di atas, dengan substitusi secara matematis dapat

dihitung besarnya efek masing-masing faktor, maupun efek interaksinya.

Besarnya efek dapat dicari dengan menghitung selisih antara rata-rata respon pada

level tinggi dan rata-rata respon pada level rendah. Konsep perhitungan efek

menurut Bolton (1990) sebagai berikut :

Efek faktor A = ((a-(1)+(ab-b))/2

Efek faktor B = ((b-(1)+(ab-a))/2

Efek interaksi = ((ab-b)+(a-1))/2

Menurut hasil eksperimen yang telah tersedia, efek dan antaraksi

dihitung menurut skema semu menggunakan Yate’s treatment.

17 

 

 

Desain faktorial memiliki beberapa keuntungan. Metode ini memiliki

efisiensi yang maksimum untuk memperkirakan efek yang dominan dalam

menentukan respon. Keuntungan utama desain faktorial adalah bahwa metode ini

memungkinkan untuk mengidentifikasi efek masing-masing faktor, maupun efek

interaksi antar faktor. Metode ini ekonomis dapat mengurangi jumlah penelitian

jika dibandingkan dengan meneliti metode secara terpisah (Muth, 1999).

K. Landasan Teori

Tanaman stevia memiliki kandungan kimia utama yang berupa gula

steviosida atau yang disebut glikosida steviol yang berguna sebagai pemanis

alami. Steviosida sangat mudah larut dalam etanol (Wallin, 2007). Oleh karena itu

gula steviosida dapat diperoleh dengan penyarian secara maserasi menggunakan

etanol. Serbuk steviosida tidak/sedikit berbau dan memiliki tingkat kemanisan

sekitar 200-300 kali dari kemanisan sukrosa (Wallin, 2007).

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Cairan penyari

akan menembus dinding sel dan akan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan

konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang diluar sel, maka

larutan encer masuk ke dalam sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi

keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel .

Optimasi dalam penelitian ini pada faktor suhu maserasi dan faktor

volume etanol 96% yang digunakan sebagai cairan penyari, hal ini karena kedua

faktor tersebut merupakan faktor yang berpengaruh dan dapat dikendalikan dalam

18 

 

 

proses maserasi untuk mendapatkan maserat dengan kadar steviosida yang

optimum. Hal ini juga didukung dari data menurut Pasquel A. (2008) yang

menyebutkan bahwa dengan adanya peningkatan suhu dari 16°C menjadi 45°C

akan dihasilkan peningkatan massa glikosida yang dihasilkan dari 0,1 x 103 kg

menjadi 0,15 x 103 kg. Menurut Jaroslav Pol. dkk (2007), penggunaan etanol

sebagai cairan penyari lebih baik kemampuannya dalam mengisolasi steviosida

dibandingkan dengan air. Selain itu juga disebutkan bahwa peningkatan volume

pelarut akan meningkatkan jumlah steviosida yang terekstrak (Alupului and

Lavric, 2008).

L. Hipotesis

Hipotesis yang dapat diajukan dalam penelitian ini antara lain:

1. Dengan semakin meningkatnya suhu akan semakin meningkatkan kadar

steviosida dalam ekstrak.

2. Dengan semakin meningkatnya volume etanol 96% yang digunakan

sebagai cairan penyari maka akan semakin meningkatkan kadar steviosida

dalam ekstrak.

 

19 

 

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena ada

intervensi atau perlakuan terhadap fenomena yang diamati.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Klasifikasi Variabel

a. Variabel Bebas

suhu (300C dan 500C) dan volume etanol 96% (20 ml dan 50 ml)

b. Variabel Tergantung

Kadar Steviosida yang diperoleh dari pembuatan ekstrak tanaman

Stevia secara maserasi dengan adanya perbedaan suhu dan volume

etanol.

c. Variabel Pengacau Terkendali

Yang termasuk variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini

antara lain: spesies tanaman, asal tanaman, umur tanaman, dan

suhu saat defatisasi (sokhlet).

20 

 

 

d. Variabel Pengacau Tak Terkendali

Yang termasuk variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini

adalah cara pemanenan.

e. Definisi Operasional

a. Maserasi adalah suatu metode penyarian dengan cara

merendam serbuk daun tanaman stevia dalam cairan penyari

selama 6 jam dengan menggunakan variasi suhu dan volume

etanol 96% dan menggunakan penyari air sebanyak 20 ml pada

setiap kondisi variasi serta dengan penggojogan setiap 15

menit.

b. Ekstrak steviosida merupakan ekstrak cair yang diperoleh dari

penyarian serbuk simplisia secara maserasi dengan adanya

variasi suhu dan volume etanol yang digunakan yang berasal

dari tanaman Stevia.

c. Sampel steviosida yang dimaksud dalam penelitian ini adalah

steviosida sebagai senyawa yang dinyatakan setara dengan

stevosida baku dari Wako Jepang 196-08131 (99,2%).

d. Faktor besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian

ini digunakan 2 faktor, yaitu suhu dan volume etanol 96%.

e. Kromatografi Lapis Tipis merupakan suatu metode Pemisahan

secara cepat dengan menggunakan penjerap (silica gel 60 F254)

yang dilapiskan secara merata pada lempeng penyangga dan

21 

 

 

dielusi menggunakan fase gerak yang sesuai yaitu kloroform:

metanol: air (10:15:2 v/v).

f. Penetapan kadar steviosida dilakukan terhadap ekstrak stevia

dengan menggunakan software image J secara densitometri,

kemudian dilanjutkan dengan perhitungan desain faktorial dan

analisis Yate’s Treatment.

g. Respon adalah besaran yang akan diamati perubahan efeknya.

Dalam penelitian ini respon yang diamati adalah kadar

steviosida yang diperoleh dari proses maserasi.

h. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan variasi level

dan faktor.

C. Materi Penelitian

Bahan atau materi yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:

Simplisia berupa tanaman Stevia rebaudiana (Bert.) diambil dari B2P2TOOT

(Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional)

Tawangmangu, Baku Steviosida Wako Jepang 196-08131 (99,2%), Kloroform p.a

(Merck), Metanol p.a (Merck), Etanol 96% teknis (Brataco Chemika), n-hexan

teknis (Brataco Chemika), Aquabidest (aqua bidestilata steril) pro injection 500ml

(PT. Ikapharmindo Putramas), Kalium Iodida (MKRChemical’s), Iodium Crystal

(MKRChemical’s), Vanilin asam sulfat, Kieselgel 60 F254 (Merck), Aquadest

Produksi USD, Kertas saring.

22 

 

 

D. Instrumen Penelitian

Alat atau Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini antara lain:

Oven (Memmert), Labu Ukur (10 ml,25 ml,50 ml, 100 ml,500 ml,1 lt) (Pyrex-

Fortuna), Mikropipet IntraEND, Oven untuk suhu penyimpanan serbuk hasil

soklet Termak’s, Manttell Heater (Toshniwal), Hotplate Magnetic Stirer (Cenco

Instrumen.b.v), Alat Soxhlet (Quickfit) (1 set), Waterbath (Emerson), Waterbath

(Boom.B.V. Meppel), Pipa kapiler 1 µl (Einmal- Mikropipetten), Ayakan dengan

no mesh 50, Timbangan Analitik (Metler Toledo), Alat Scanner (Canon MP 160),

Software Image J.

E. Tahap-tahap Penelitian

1. Determinasi Tanaman Stevia rebaudiana Bertonii. M.

Determinasi tanaman Stevia rebaudiana (Bert.) dilakukan dengan

mencocokan ciri-ciri tanaman Stevia dengan kunci determinasi menurut buku

Flora of Java oleh B2P2TOOT.

2. Pembuatan Ekstrak Tanaman Stevia rebaudiana Bertonii. M.

a. Pengumpulan bahan

Bahan diperoleh dari B2P2TOOT Tawangmangu.

b. Sortasi Kering

Sortasi kering dilakukan dengan cara di pisahkan dari benda-benda asing seperti

bagian tanaman yang tidak diinginkan dan juga dari pengotor lain yang masih

tertinggal.

23 

 

 

c. Pengeringan

Pengeringan dilakukan dengan dengan menggunakan oven dengan suhu 40°C

selama 1 hari.

d. Pembuatan serbuk

Pembuatan serbuk dilakukan dengan menggunakan mesin penyerbuk (grinder),

serbuk yang telah jadi diayak dengan ayakan nomer mesh 50.

e. Pembuatan Ekstrak Tanaman Stevia

a. Defatisasi serbuk simplisia

Sebanyak 50 g serbuk yang telah halus yang terbungkus dalam

kertas saring, dipisahkan dari senyawa – senyawa non polar

menggunakan pelarut heksan dengan sokhlet selama 2 x 8 jam

(Martono. dkk, 2007), dengan jumlah sirkulasi sebanyak 4 sirkulasi

setiap 10 menit dengan range suhu pelarut heksan pada Labu Alas

Bulat saat perkolasi antara 550C-660C. Residu sampel kemudian

dioven pada suhu 500C untuk menguapkan heksan, kemudian

residu sampel yang telah kering siap untuk diekstraksi.

b. Ekstraksi serbuk simplisia secara maserasi dengan adanya variasi

suhu dan volume Etanol 96% yang digunakan.

Residu sampel sebanyak 4 gram yang telah dipisahkan dari

senyawa non polar diekstraksi dengan menggunakan campuran air-

etanol, dengan perbandingan volume air tetap sebanyak 20 ml dan

variasi suhu dan volume etanol 96% (Tabel II.):

24 

 

 

Tabel II. Variasi kondisi suhu dan volume etanol 96%. Suhu (0C) Etanol 96% (mL)

30 20 50 20 30 50 50 50

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi selama

6 jam menggunakan waterbath, dengan penggojogan setiap 15

menit, setiap penggojogan dilakukan 1 menit. Masing-masing

ekstraksi dengan variasi suhu dan jumlah volume pelarut etanol

tersebut dilakukan replikasi sebanyak 2 kali. Maserat yang didapat

kemudian diperas dengan kain. Kemudian ditambah dengan cairan

penyari yang sesuai hingga volume labu ukur yang mendekati.

Kemudian maserat didiamkan selama 30 menit untuk tujuan

pengendapan.

4. Analisis Kualitatif Ekstrak Tanaman Stevia

Maserat yang diperoleh kemudian ditotolkan pada lempeng KLT

(Kieselgel 60 F254 atau silika gel 60 F254) begitu juga dengan baku

Steviosida dan dielusi menggunakan fase gerak kloroform:metanol:air (10

: 15 : 2) (Martono. dkk, 2007). Setelah elusi selesai, lempeng disemprot

dengan larutan Iodium kemudian setelah kering dilanjutkan dengan

disemprot larutan vanilin-asam sulfat pekat. Lempeng lalu dipanaskan

pada plat panas untuk menampakkan bercak dan dihitung harga Rf untuk

masing-masing bercak. Harga Rf sampel yang diperoleh kemudian

dibandingkan dengan harga Rf baku steviosida. Lempeng KLT sebelum

digunakan dioven terlebih dahulu pada suhu 1000C selama 1-3 jam.

25 

 

 

5. Analisis Kuantitatif Ekstrak Tanaman Stevia

a. Pembuatan kurva baku dan Analisis Sampel

Larutan induk standar steviosida (2 mg/ml) ditotolkan pada lempeng Silika

gel 60 F254 dengan Mikrokapiler dengan deret jumlah totolan masing-

masing 2µl, 3µL, 4µL, 5µL, 6µL, dan 7µL dimana masing-masing totolan

tersebut mengandung seri jumlah baku Steviosida sebanyak 4µg, 6µg,

8µg, 10µg, 12µg, dan 14µg. Pada lempeng yang sama ditotolkan pula

maserat sampel dari masing-masing kondisi dan replikasi. Kemudian

lempeng dielusi dengan fase gerak kloroform:metanol: air (10:15:2).

Setelah elusi selesai, lempeng disemprot dengan larutan Iodium kemudian

setelah kering dilanjutkan dengan disemprot larutan vanilin-asam sulfat

pekat. Lempeng lalu dipanaskan pada plat panas untuk menampakkan

bercak. Bercak yang diperoleh dianalisis secara densitometri dengan

menggunakan software Image J dengan menghitung luas bercak yang

muncul. Dari luas bercak yang diperoleh (sebagai nilai Y) dan jumlah seri

baku steviosida (sebagai nilai x) kemudian dibuat persamaan kurva baku.

Dan nilai AUC dari bercak sampel dimasukan sebagai nilai Y dalam

persamaan kurva baku yang diperoleh sebelumnya untuk mendapatkan

jumlah steviosida (µg) dalam maserat. Dari jumlah steviosida (µg) yang

diperoleh kemudian dapat dicari kadar steviosida (%b/b) yang terdapat

dalam sampel.

26 

 

 

b. Analisis Hasil

Kadar steviosida (%b/b) dalam sampel dari setiap kondisi dan setiap

replikasi yang didapat kemudian dianalisis dengan menggunakan aplikasi

Desain faktorial untuk melihat pengaruh suhu dan volume etanol 96%

manakah yang paling dominan dalam menghasilkan ekstrak dengan kadar

steviosida (%b/b) yang optimum. Pendekatan Factorial Design yang

digunakan untuk menghitung koefisien a, b, ab sehingga didapatkan

persamaan Y = b0 + b1(XA) + b2(XB) + b12(XA)(XB). Dari persamaan ini

kemudian dapat dibuat suatu profil yang menggambarkan profil kadar

steviosida (%b/b) dari maserat tanaman stevia dengan adanya perbedaan

kondisi perlakuan antara suhu dan volume etanol 96% yang digunakan.

Hasil profil yang diperoleh berdasarkan rumus digunakan untuk

menentukan kombinasi antara suhu dan volume etanol 96% manakah yang

optimal akan menghasilkan kadar Steviosida (%b/b) yang paling optimum.

Setelah dianalisis dengan metode desain faktorial, dilakukan analisis

menggunakan metode Yate’s Treatment untuk mengetahui perbedaan dari

setiap faktor dan interaksi dalam mempengaruhi respon. Berdasarkan

analisis statistik ini maka dapat ditentukan ada tidaknya hubungan dari

setiap faktor dan interaksi terhadap respon . Hal ini dapat dilihat dari harga

F hitung dan F tabel. Sebelumnya ditentukan hipotesis terlebih dahulu,

hipotesis alternatif (Hi) menyatakan adanya regresi atau hubungan antara

faktor dengan respon, sedangkan Ho merupakan negasi dari Hi yang

menyatakan tidak adanya regresi (hubungan antara faktor dan respon). Hi

27 

 

 

diterima dan Ho ditolak apabila harga F hitung lebih besar dari F tabel,

yang berarti faktor berpengaruh terhadap respon. F tabel diperoleh dari Fa

(numerator, denominator) dengan taraf kepercayaan 95%.

28 

 

 

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman Stevia

Determinasi tanaman dilakukan untuk mendapatkan kepastian kebenaran

tanaman yang diselidiki sesuai dengan yang dimaksud dalam penelitian.

Determinasi dilakukan oleh B2P2TOOT (Balai Besar Penelitian dan

Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional Tawangmangu) dengan

mencocokkan ciri-ciri yang ada pada tanaman dengan kunci determinasi yang ada

dalam buku acuan menurut Backer (1968). Hasil determinasi menunjukkan bahwa

tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah Stevia rebaudiana

Bertonii.M. (Lampiran 12.).

B. Pemilihan Simplisia dan Pembuatan Serbuk

Stevia yang digunakan sebagai bahan penelitian ini diambil pada bulan

juli dari hasil panen para petani di daerah Tawangmangu yang telah diserahkan

pada Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat

Tradisional Tawangmangu yang berperan sebagai pengumpul hasil panen. Alasan

pemilihan sampel di daerah tersebut adalah karena stevia yang dihasilkan

merupakan tanaman hasil budidaya sehingga faktor-faktor seperti umur, asal, dan

tingkat kematangan stevia dapat dikendalikan. Stevia yang digunakan adalah

stevia hasil panen setelah berumur ± 2 bulan. Sampel stevia yang diperoleh

berupa simplisia kering, yang kemudian dilakukan sortasi kering terhadap sampel

tersebut, adapun tujuan dari sortasi kering ini adalah untuk memisahkan benda-

29 

 

 

benda asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotor-

pengotor lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering.

Selanjutnya dilakukan pengeringan kembali menggunakan oven dengan

suhu 400C selama 1 hari yang bertujuan untuk mendapatkan simplisia yang tidak

mudah rusak sehingga dapat disimpan dalam jangka waktu yang lebih lama

(Anonim, 1985).

Simplisia yang telah dioven kemudian diserbuk dengan menggunakan

grinder. Penyerbukan akan memperbesar luas permukaan spesifik sehingga

kontak antara cairan penyari dengan serbuk juga akan bertambah. Pada umumnya,

penyarian akan semakin baik jika permukaan serbuk simplisia yang kontak

dengan cairan penyari semakin luas (Anonim, 1986), sehingga semakin halus

serbuk simplisia maka penyarian akan semakin baik.  Serbuk yang diperoleh

kemudian diayak dengan menggunakan ayakan dengan nomer mesh 50. Menurut

Matsushita (1979), range ukuran mesh penyerbukan daun Stevia rebaudiana

Bertonii. M. antara 50-400.

Tujuan pengayakan adalah agar diperoleh partikel-partikel serbuk

dengan distribusi ukuran yang kurang lebih mendekati seragam. Menurut

penelitian Alupului dan Lavric (2008), diketahui bahwa dengan diameter ukuran

serbuk sebesar 0,315 mm dapat menghasilkan kadar steviosida yang lebih tinggi

dibandingkan dengan diameter ukuran serbuk sebesar 2 mm dan 6,3 mm. Dari

hasil perhitungan, diameter ukuran serbuk sebesar 0,315 mm dapat dicapai dengan

pengayak mesh 50.

30 

 

 

Serbuk yang telah diayak kemudian dilakukan proses defatisasi dengan

metode sokletasi. Proses defatisasi ini bertujuan untuk mengurangi senyawa-

senyawa yang bersifat non polar yang dapat mengganggu proses ekstraksi, karena

secara teori etanol dapat melarutkan senyawa non polar (Anonim, 1986). Adapun

senyawa non polar yang terkandung dalam tanaman stevia dapat berupa: minyak

atsiri, asam dekanoat, pentacosane, octacosane, stigmasterol, lupeol, dan

pentacyclic triterpene (Wallin, 2007). Serbuk setelah didefatisasi jumlah senyawa

non polarnya akan berkurang dan serbuk inilah yang kemudian akan diekstraksi

untuk mendapatkan maserat steviosida.

Proses defatisasi serbuk stevia menggunakan pelarut heksan karena

heksan merupakan pelarut organik yang bersifat sangat non polar (Cannel, 1998),

sehingga proses penarikan senyawa non polar pada serbuk stevia dapat optimal.

Alat yang digunakan dalam defatisasi ini adalah sokhlet yang dapat menyari

secara berkesinambungan. Metode sokhletasi merupakan proses ekstraksi

menggunakan pelarut yang selalu baru sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan

jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

Sebanyak 50 gram serbuk dibungkus didalam kertas saring berbentuk

kantung, kemudian di soklet menggunakan cairan penyari heksan selama 2x8 jam

(Martono dkk., 2007), dimana setiap 8 jam, dilakukan pergantian penyari yang

digunakan. Pergantian penyari bertujuan untuk mencegah terjadinya kejenuhan

dalam cairan penyari dalam mengekstrak senyawa-senyawa yang bersifat non

polar. Sedangkan waktu 2x8 jam diperoleh berdasarkan hasil orientasi yang

dilakukan pada penelitian sebelumnya (Martono dkk., 2007), dimana dengan

31 

 

 

waktu tersebut sudah cukup untuk mengurangi sebagian besar senyawa non polar

yang terkandung dalam tanaman.

Dalam proses sokletasi ini digunakan volume pelarut heksan sebanyak 2

kali sirkulasi, hal ini bertujuan untuk mencegah habisnya pelarut dalam Labu Alas

Bulat sehingga LAB tersebut ketika terus dipanaskan tidak pecah dan juga agar

proses ekstraksi dapat berjalan terus tanpa adanya penambahan pelarut lagi.

Sokletasi merupakan salah satu metode penyarian dengan menggunakan

panas, maka faktor suhu hendaknya perlu diperhatikan. Hal ini karena steviosida

yang terkandung dalam serbuk dapat dengan mudah terdekomposisi pada suhu

yang tinggi (±1000C, hanya stabil selama 1 jam, dan pada suhu 80°C stabil selama

5 jam) (Nabors, 1986). Dalam penelitian suhu pelarut heksan yang dipanaskan

pada Labu Alas Bulat saat soklet diatur pada rentang suhu antara 550C-660C

sehingga steviosida yang terkandung dalam serbuk simplisia tidak

terdekomposisi. Hal ini karena ketika suhu pelarut heksan yang dipanaskan pada

LAB berkisar pada range 550C-660C, maka suhu pada tabung soklet dimana

terdapat serbuk daun stevia akan berada dibawah range suhu tersebut.

Setelah proses defatisasi selesai, kemudian dikeringkan dengan oven

pada suhu 500C untuk menguapkan semua sisa pelarut heksan agar diperoleh

serbuk kering. Heksan yang masih tersisa dalam serbuk dapat mengganggu proses

penyarian selanjutnya sehingga perlu dilakukan penguapan heksan terlebih

dahulu.

32 

 

 

C. Pembuatan Ekstrak Stevia Secara Maserasi

Metode maserasi yang digunakan adalah metode maserasi sederhana

selama 6 jam terhadap 4 gram serbuk dengan cairan penyari menggunakan

campuran air dan etanol. Air yang digunakan dengan volume sama untuk setiap

kondisi yaitu sebanyak 20 ml. Tujuan penggunaan volume air dalam jumlah kecil

karena air dapat berperan sebagai media untuk pertumbuhan mikroorganisme

(Anonim, 1986), sehingga untuk meminimalisir hal tersebut maka digunakan air

dalam jumlah sedikit. Penggunaan cairan penyari dalam penelitian ini berupa

campuran air dan etanol, karena campuran tersebut bersifat polar yang sesuai

dengan zat aktif steviosida yang juga bersifat polar, campuran tersebut juga umum

digunakan dalam ekstraksi.

Adapun penggunaan waktu maserasi selama 6 jam karena pada waktu

tersebut sudah cukup optimal untuk mengekstraksi steviosida yang terkandung

dalam tanaman Stevia rebaudiana Bertonii. M., hal ini karena dalam penyarian

secara maserasi dalam penelitian ini dilakukan dengan modifikasi pemanasan

yaitu pada suhu 300C dan 500C serta adanya penggojogan, itu semua akan

membantu mempercepat proses penyarian steviosida. Menurut Masushita (1979)

disebutkan bahwa penyarian dengan menggunakan pemanasan dapat dilakukan 1

sampai 2 jam atau lebih.

Adanya pemanasan saat ekstraksi maka akan menurunkan kekentalan

dari pelarut sehingga mengakibatkan berkurangnya lapisan-lapisan batas.

Pemanasan juga akan meningkatkan daya melarutkan cairan penyari sehingga

33 

 

 

pemanasan tersebut mempunyai pengaruh yang sama dengan pengadukan.

Koefisien difusi juga berbanding lurus dengan suhu absolut dan berbanding

terbalik dengan kekentalan, hingga kenaikan suhu akan berpengaruh pada

kecepatan difusi. Umumnya kelarutan zat aktif akan meningkat bila suhu dinaikan

(Anonim, 1986).

Proses maserasi dilakukan terhadap 4 gram serbuk dengan 4 macam

variasi kondisi yaitu suhu dan volume etanol 96% yang digunakan. Setiap kondisi

dilakukan replikasi sebanyak 2 kali. Variasi kondisi suhu dan volume etanol yang

digunakan seperti yang tertera dalam cara kerja.

Pemilihan variasi suhu saat ekstraksi yaitu 300C dan 500C bertujuan

untuk melihat pengaruhnya dalam level tinggi dan level rendah pada proses

ekstraksi steviosida yang diperlukan untuk analisis desain faktorial untuk

mendapatkan daerah optimun kondisi maserasi agar dapat menghasilkan ekstrak

dengan kadar steviosida yang optimum. Pemilihan suhu 500C dikarenakan pada

maserasi dalam penelitian ini dilakukan modifikasi maserasi yaitu secara digesti

yang merupakan metode maserasi dengan pemanasan pada range suhu 400C-500C,

dari situ maka dipilih suhu 500C sebagai level tinggi. Sedangkan pemilihan suhu

yaitu 300C adalah karena suhu tersebut dapat diasumsikan sebagai suhu kamar

dimana untuk proses maserasi secara konvensional umumnya menggunakan suhu

kamar, dan dengan pemilihan suhu 300C maka akan memudahkan dalam

pengontrolannya.

34 

 

 

Sedangkan pemilihan variasi jumlah volume etanol yaitu 20 ml dan 50

ml begitu juga dengan variasi suhu, bertujuan untuk melihat pengaruhnya dalam

level tinggi dan level rendah pada proses ekstraksi steviosida yang diperlukan

untuk analisis desain faktorial untuk mendapatkan daerah optimun kadar

steviosida pada proses maserasi dengan variasi suhu dan volume etanol 96%.

Selain itu dengan 20 ml etanol 96% dan adanya air 20 ml sudah cukup membuat

serbuk terendam, hal ini sesuai dengan prinsip maserasi yang berupa perendaman

serbuk dalam cairan penyari (Anonim, 1986). Sedangkan pemilihan level tinggi

sebesar 50 ml diharapkan bahwa dengan peningkatan volume etanol 96%

sebanyak 2,5 kali dari volume etanol yang ditentukan sebelumnya dapat menyari

semua steviosida yang terkandung dalam tanaman stevia.

Metode maserasi dilakukan dengan bantuan alat waterbath dengan

pengaturan suhu, dan dilakukan penggojogan setiap 15 menit, dimana setiap

penggojogan dilakukan selama 1 menit. Pada metode maserasi ini serbuk

simplisia terendam dalam cairan penyari. Perendaman ini akan memudahkan

cairan penyari untuk menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan

konsentrasi antara zat aktif di dalam sel dan di luar sel maka larutan yang terpekat

terdesak keluar. Peristiwa ini berulang hingga terjadi keseimbangan konsentrasi

antara larutan didalam dan diluar sel. Selain perendaman dilakukan juga proses

penggojogan, tujuannya adalah untuk meratakan distribusi larutan diluar butir

serbuk simplisia, sehingga konsentrasinya akan tetap terjaga karena adanya

derajat perbedaan konsentrasi sebesar-besarnya antara larutan didalam sel dan

35 

 

 

larutan diluar sel (Anonim, 1986). Setelah 6 jam maserasi dilakukan proses

pemerasan untuk memperoleh maserat cair. Kemudian ditambahkan dengan

cairan penyari yang sesuai sampai batas labu ukur yang mendekati. Maserat cair

tersebut kemudian dibiarkan selama beberapa waktu tertentu (±30 menit). Waktu

tersebut diperlukan untuk mengendapkan zat-zat yang tidak diperlukan tetapi ikut

terdispersi dalam cairan penyari.

D. Analisis Kualitatif Bercak Maserat Tanaman Stevia

Maserat cair tanpa endapan yang diperoleh kemudian dianalisis secara

kualitatif bercak dengan menggunakan metode KLT melalui perbandingan nilai

Rf yang dihasilkan antara bercak sampel dan baku. Tujuan dilakukan KLT adalah

untuk mengetahui dan memastikan bahwa ekstrak yang diperoleh mengandung

steviosida. Cara penghitungan Rf adalah dengan membandingkan jarak titik pusat

bercak dari titik awal penotolan bercak dengan jarak rambat/elusi fase gerak,

Penelitian dilakukan dengan menotolkan ekstrak hasil maserasi dan baku

steviosida pada lempeng Silika gel 60 F254 dengan penyangga logam.

Penggunaan lempeng tersebut karena lempeng tersebut dapat memisahkan

senyawa yang termasuk golongan terpen, gula (Stock, 1974). Pada penelitian

digunakan penyangga logam dengan tujuan agar lempeng KLT tersebut tahan

terhadap pemanasan pada plat panas untuk langkah pendeteksian bercak.

Sebelum digunakan lempeng KLT tersebut harus di oven terlebih

dahulu selama ± 1-3 jam pada suhu 1000C, hal ini bertujuan untuk mengaktifkan

penjerap pada lempeng KLT. Dilakukan pengaktifan menggunakan oven hal ini

36 

 

 

karena dalam penjerap normal yang tidak diaktifkan, maka pada permukaan

lempeng penjerap diduduki oleh molekul air yang sangat polar dan membentuk

ikatan hidrogen. Molekul air tersebut harus dihilangkan dengan pemanasan agar

tidak mengganggu dalam pengelusian bercak, biasanya pengaktifan dilakukan

pada suhu 100-1100C paling sedikit 1 jam (Gritter, 1985).

Lempeng KLT kemudian dimasukkan dalam bejana yang telah jenuh

dengan fase gerak yaitu kloroform : metanol : Air (10 :15: 2 v/v) kemudian

dikembangkan hingga mencapai batas jarak elusi yang telah ditentukan yaitu

sebesar 15cm. Dengan jarak elusi tersebut maka zat steviosida yang terkandung

dalam sampel sudah dapat terpisah dan dapat dielusi. Penggunaan perbandingan

fase gerak tersebut karena sifat fase gerak yang polar yang sesuai dengan sifat

steviosida yang diteliti, sehingga dengan sistem tersebut sampel dapat terelusi.

Fase gerak yang digunakan harus mempunyai kepolaran yang relatif sama dengan

senyawa yang akan dipisahkan, tetapi memiliki sifat yang tidak saling campur

dengan fase diam (Sastrohamidjojo, 1991).

Kemudian untuk pendeteksian bercak sampel maupun baku pada

lempeng dilakukan terhadap (a) disemprot dengan larutan Iodium yang

mengasilkan bercak berwarna kuning kecokelatan (b) disemprot dengan vanilin

asam sulfat (c) dan dilakukan pemanasan pada lempeng hingga bercak muncul.

Bercak yang dihasilkan akhirnya berwarna hitam, hal ini karena steviosida yang

terkandung dalam bercak mengalami pengarangan dengan adanya pereaksi

semprot dan juga dengan adanya pemanasan. Dengan pereaksi semprot iodium,

maka akan dihasilkan bercak berwarna cokelat yang menunjukan bahwa pada

37 

 

 

senyawa organik mengandung atom O (Gritter, 1985). Warna bercak cokelat lama

kelamaan akan menghilang karena iodium menyublim (Gritter, 1985). Sedangkan

untuk pereaksi semprot vanilin asam sulfat yang dilanjutkan dengan pemanasan

akan menghasilkan bercak berwarna hitam, yang menandakan terjadinya

pengarangan menjadi karbon pada senyawa organik yang diuji (Gritter, 1985).

Selain itu penggunaan pereaksi semprot vanilin asam sulfat juga dapat digunakan

untuk mendeteksi senyawa spesifik berupa golongan diterpen (Wagner, 1984).

Bercak yang dihasilkan antara sampel dan baku kemudian dibandingkan

harga Rf nya. Dalam penelitian dihasilkan rata-rata harga Rf antara sampel dan

baku yang mendekati (Tabel III), maka dapat dipastikan bahwa dalam sampel

terkandung steviosida.

Tabel III. Rf Sampel dan Baku Steviosida Sampel Baku

Nomor Suhu (°C) Etanol (ml) Rf Nomor Rf

A 30 20 0,76 I 0,80 B 30 20 0,76 J 0,76 C 50 20 0,79 K 0,78 D 50 20 0,79 L 0,78 E 30 50 0,78 M 0,78 F 30 50 0,80 N 0,77 G 50 50 0,79 O 0,76 H 50 50 0,80

Rata-rata 0,78 Rata-rata± SD 0,77±0,01

38 

 

 

 

Gambar 3. Kromatogram KLT sampel dan baku untuk perhitungan Rf Keterangan Gambar:

A = sampel (30°C-20ml), replikasi 1

B = sampel (30°C-20ml), replikasi 2

C = sampel (50°C-20ml), replikasi 1

D = sampel (50°C-20ml), replikasi 2

E = sampel (30°C-50ml), replikasi 1

F = sampel (30°C-50ml), replikasi 2

G = sampel (50°C-50ml), replikasi 1

H = sampel (50°C-50ml), replikasi 2

I = Baku Steviosida (14µg)

J = Baku Steviosida (12µg)

K = Baku Steviosida (10µg)

L = Baku Steviosida (8µg)

M = Baku Steviosida (6µg)

N = Baku Steviosida (4µg)

O = Baku Steviosida (2µg)

Keterangan KLT:

Fase diam : Silika Gel 60 F254

Fase Gerak : Kloroform : methanol : air

(10:15:2)

Jarak elusi : 15 cm

Deteksi :

a. Reagen semprot Iodium

b. Reagen semprot Vanilin-asam sulfat

c. Pemanasan pada plat panas

A B C D E F G H I J K L M N O

39 

 

 

E. Analisis Kuantitatif Steviosida dalam Ekstrak Tanaman Stevia

1. Pembuatan Kurva Baku

Kurva baku steviosida dibuat dengan cara menotolkan suatu deret kadar

steviosida baku (dalam µg) melalui deret jumlah totolan pada plat Silika gel 60

F254 dan dikembangkan dalam fase gerak kloroform : metanol : air (10:15:2v/v).

Kadar larutan induk dari baku steviosida yang digunakan sebesar 2,028 mg/ml.

Dari larutan induk tersebut dibuat seri kurva baku dengan menggunakan deret

jumlah totolan (Gritter, 1985), sehingga didapatkan seri baku sebesar 4,056 µg;

6,084 µg; 8,112 µg; 10,14 µg; 12,168 µg; dan 14,196 µg. Selanjutnya, dilakukan

langkah-langkah pendeteksian bercak seperti pada analisis kualitatif sebelumnya.

Kemudian plat yang telah terdapat bercak baik dari sampel maupun baku discan,

kemudian dianalisis secara densitometri dengan menggunakan Software Image J

melalui perhitungan luas bercak yang tergambar dalam luas bercak dibawah kurva

(AUC). Adapun langkah-langkah Image J secara umum dimulai dengan membuat

tampilan kromatogram baik sampel dan baku sebagai bercak yang jelas dan

memisah sehingga akan didapatkan tepi bercak yang lebih tegas (lampiran 10a).

Latar belakang dari kromatogram dibersihkan sehingga yang didapat hanyalah

kromatogram baik dari sampel maupun baku (lampiran 10b). Kemudian masing-

masing kromatogram yang diperoleh disamakan intensitas warnanya dengan

fasilitas binary (hasil pada lampiran 10b), kemudian dihitung luasnya dengan

membuat plot kurva dari setiap kromatogram. Plot kurva yang dihasilkan

kemudian diukur luasnya (sebagai nilai AUC atau sebagai nilai luas area dibawah

kurva). Pengukuran luas hanya dapat dilakukan pada plot kurva tertutup.

40 

 

 

Gambar 4. Tampilan bercak baku dan sampel setelah di Image J

Keterangan Gambar:

A = sampel (30°C-20ml), replikasi 1

B = sampel (30°C-20ml), replikasi 2

C = sampel (50°C-20ml), replikasi 1

D = sampel (50°C-20ml), replikasi 2

E = sampel (30°C-50ml), replikasi 1

F = sampel (30°C-20ml), replikasi 2

G = sampel (50°C-50ml), replikasi 1

H = sampel (50°C-50ml), replikasi 2

I = Baku Steviosida (14µg)

J = Baku Steviosida (12µg)

K = Baku Steviosida (10µg)

L = Baku Steviosida (8µg

M = Baku Steviosida (6µg)

N = Baku Steviosida (4µg)

O = Baku Steviosida (2µg)

Keterangan KLT:

Fase diam : Silika Gel 60 F254

Fase Gerak : Kloroform : methanol : air

(10:15:2)

Jarak elusi : 15 cm

Deteksi :

d. Reagen semprot Iodium

e. Reagen semprot Vanilin-asam sulfat

f. Pemanasan pada plat panas

A B C D E F G H I J K L M N O

41 

 

 

Tabel IV. Hubungan Jumlah Steviosida (µg) dengan AUC pada Seri Baku

Persamaan Kurva Baku A= -5,7459 B= 3,6796 r = 0,9911

Y= 3,6796 x-5,7459

                  

Gambar 5. Grafik Kurva Baku Steviosida

Dari persamaan tersebut diperoleh nilai koefisien korelasi (rhitung) yang

lebih besar dari harga rtabel. Harga rtabel dengan taraf kepercayaan 95%, df=4

adalah 0,811. Karena nilai r hitung > nilai r tabel, maka menunjukan bahwa ada

hubungan yang linear antara jumlah steviosida (µg) dan AUC yang dihasilkan.

Jumlah Totolan

AUC Jumlah (µg)

2 11,188 4,056 3 15,927 6,084 4 23,61 8,112 5 28,539 10,14 6 39,371 12,168 7 48,372 14,196

42 

 

 

2. Penetapan Kadar sampel

Pada sampel ekstrak cair dilakukan analisis kuantitatif dengan metode

yang sama dengan baku Steviosida yaitu dengan menggunakan metode

Kromatografi Lapis Tipis dengan sistem KLT yang sama, sehingga antara totolan

sampel dari masing-masing kondisi dan setiap replikasi dan juga totolan seri baku

dibuat pada 1 lempeng KLT yang sama. Hal ini bertujuan agar saat dianalisis

dengan software Image J antara sampel dan seri baku mendapat perlakuan yang

sama, sehingga akan mengurangi variabilitas dalam pengukuran. Setelah

didapatkan AUC sampel, maka untuk menentukan kadar sampel dilakukan dengan

memasukan nilai AUC sampel sebagai nilai Y ke dalam persamaan kurva baku

yang telah diperoleh sebelumnya, yaitu Y= 3,6796x-5,7459. Sehingga akan

didapatkan kadar steviosida dalam sampel.

Tabel V. Kadar Steviosida dalam ekstrak yang dibuat dari masing-masing kondisi dan replikasi

Kondisi Replikasi

Kadar steviosida dalam sampel(mg/4gram serbuk)

Kadar steviosida dalam sampel (gram/4gram serbuk)

Kadar steviosida dalam sampel (gram/100 gram serbuk) (%b/b)

Rata-rata (%b/b)    

30°C-20ml 1 106,5917491 0,1066 2,6648

2,7575 ± 0,1311

30°C-20ml 2 114,0110338 0,1140 2,8503

50°C-20ml 1 120,4338334 0,1204 3,0108

2,8198 ± 0,2701

50°C-20ml 2 105,1468457 0,1051 2,6287

30°C-50ml 1 257,0379027 0,2570 6,4259

6,2469 ± 0,2531

30°C-50ml 2 242,7156937 0,2427 6,0679

50°C-50ml 1 344,9369497 0,3449 8,6234

7,9355 ± 0,9728

50°C-50ml 2 289,9037939 0,2899 7,2476

43 

 

 

Pada kondisi volume etanol 96% 50 ml (level tinggi) dan suhu 500C (level

tinggi) dihasilkan rata-rata kadar steviosida yang paling besar, yaitu sebesar

7,9355 %b/b (Tabel V). Sedangkan pada kondisi lainnya dihasilkan kadar

steviosida yang lebih rendah. Hal ini dikarenakan sifat steviosida yang mudah

larut dalam etanol (Wallin, 2007). Etanol 96% yang menghasilkan kadar

steviosida paling besar adalah dengan volume paling tinggi (50 ml),hal ini dapat

disebabkan karena pada jumlah pelarut yang besar membuat proses penyarian

menjadi lebih efektif. Proses penyarian terkait dengan penembusan cairan penyari

melewati dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel (Anonim, 1986). Peristiwa

ini akan berlangsung terus-menerus sepanjang proses penyarian sehingga jumlah

cairan penyari yang digunakan akan mempengaruhi keberlangsungan proses

penyarian. Jumlah cairan penyari yang besar dapat mencegah terjadinya

kejenuhan sehingga senyawa yang dapat terekstrak akan menjadi semakin besar,

hal ini karena dengan jumlah penyari yang besar dapat menyediakan perbedaan

konsentrasi yang sebesar-besarnya antara larutan zat aktif di dalam sel dengan

yang diluar sel sehingga proses penyarian akan tetap berlangsung sampai terjadi

keseimbangan konsentrasi.

Selain itu juga dengan adanya suhu yang tinggi (500C) maka akan

meningkatkan energi kinetik selama penyarian, sehingga akan meningkatkan

efektivitas penyarian sehingga membuat kadar steviosida yang tersari meningkat.

44 

 

 

3. Analisis Kuantitatif Sampel Dengan Aplikasi Desain faktorial

Data kuantitatif yang diperoleh berupa kadar rata-rata sampel dari setiap

kondisi kemudian dianalisis menggunakan metode Desain faktorial.

Tabel VI. Kondisi desain faktorial dan respon yang dihasilkan Kondisi Suhu (0C) Volume Etanol Rata-rata

kadar sampel (%b/b)

(1) 30 20ml 2,7575 ± 0,1311 a 50 20ml 2,8198 ± 0,2701 b 30 50ml 6,2469 ± 0,2531 ab 50 50ml 7,9355 ± 0,9728

Dari analisis tersebut akan diperoleh suatu persamaan desain faktorial

yaitu  y =  1,9662 -0,0511A + 0,0349 B +0,00271AB. Dari analisis dengan

menggunakan desain faktorial dapat dilihat bahwa faktor B yaitu etanol 96%

memberikan pengaruh yang paling besar. Hal ini ditunjukkan pada nilai efek

faktor B bernilai positif dan nilainya paling besar bila dibandingkan nilai efek

faktor A (suhu) dan faktor AB (interaksi). Hal tersebut dapat dilihat dari tabel

dibawah ini (Tabel IX)yang menunjukan nilai efek dari masing-masing faktor.

Tabel VII. Nilai efek dari faktor suhu, etanol 96%, dan interaksinya Efek Respon

Suhu 1,7509

Volume etanol 96% 8,6051

Interaksinya 1,6263

Hal ini berarti etanol 96% yang berperan sebagai cairan penyari

memberikan efek paling besar dalam melarutkan steviosida yang terkandung

dalam sampel, hal ini dikarenakan sifat steviosida yang mudah larut dalam etanol

45 

 

 

(Wallin, 2007). Dan dengan penggunaan etanol maka lebih baik kemampuannya

dalam mengisolasi steviosida dibanding dengan air (Jaroslav Pol. dkk, 2007).

Gambar 6a Gambar 6b

Gambar 6. Grafik hubungan suhu maserasi (a) dan volume Etanol 96%(b) terhadap kadar Steviosida

Dari grafik hubungan antara suhu maserasi dan kadar steviosida diatas

(Gambar 6), maka didapatkan bahwa dengan semakin meningkatnya suhu pada

volume etanol 96% level rendah akan terjadi peningkatan kadar steviosida. Begitu

pula dengan semakin meningkatnya suhu pada volume etanol 96% level tinggi

akan terjadi peningkatan kadar steviosida. Sedangkan dari grafik hubungan antara

volume etanol dan kadar steviosida maka didapatkan bahwa dengan semakin

meningkatnya jumlah volume etanol 96% pada suhu maserasi level rendah akan

terjadi peningkatan kadar steviosida. Begitu pula dengan semakin meningkatnya

jumlah volume etanol 96% pada suhu maserasi level tinggi akan terjadi

peningkatan kadar steviosida. Pada grafik suhu maserasi dan kadar Steviosida

(Gambar. 6a) dan grafik volume Etanol 96% dan Kadar Steviosida (Gambar. 6b)

garis yang terbentuk tidak sejajar yang berarti terjadi interaksi antara suhu

46 

 

 

maserasi dan volume etanol 96%, namun hal ini masih harus dibuktikan dengan

perhitungan Yate’s treatment. Dari persamaan desain faktorial yang diperoleh

kemudian dibuat grafik Contour Plot. Dari grafik Contour plot yang didapat

kemudian dibuat daerah optimumnya. Daerah optimum tersebut mencerminkan

kondisi optimum baik dari faktor suhu maupun faktor jumlah volume etanol 96%

untuk mendapatkan ekstrak yang mengandung kadar steviosida yang optimal.

Gambar 7. Grafik Contour Plot Daerah Optimum hubungan antara suhu dan volume etanol 96%

Dari gambar tersebut (Gambar. 7) dapat dilihat bahwa rentang kadar

steviosida optimum yang dapat diperoleh yaitu 3%b/b –7,935%b/b. Rentang

kadar ini masuk dalam rentang kadar yang steviosida yang secara teoritis terdapat

dalam tanaman Stevia rebaudiana Bertoni. M. yaitu sebesar 3%-10% dari berat

kering daunnya (Gardana, Simonetti, Canzi, Zanchi, Pietta, 2003).

47 

 

 

4. Analisis Yate’s Treatment

Perhitungan harga F yang diperoleh dari Yate’s treatment (Tabel VIII)

untuk respon kadar steviosida dalam sampel memperlihatkan bahwa volume

etanol 96% memberikan pengaruh yang bermakna secara statistik dalam hal

meningkatkan kadar steviosida. Hi (Hipotesis alternatif) diterima jika harga F

hitung lebih besar dari F tabel. Harga F hitung volume etanol 96% lebih besar dari

F tabel (1,3) yaitu 10,128, oleh karena itu Hi2 statistik (lampiran 6) diterima

sehingga terbukti bahwa faktor volume etanol 96% memberikan perbedaan respon

kadar steviosida yang dihasilkan (tabel VIII). Artinya, perbedaan volume etanol

96% yang digunakan pada level rendah (20 ml) dan level tinggi (50 ml)

memberikan respon kadar steviosida yang berbeda. Volume etanol 96% yang

digunakan dalam proses maserasi meningkatkan kadar steviosida yang

terekstraksi (gambar 6b). Harga F hitung dari faktor volume etanol 96% adalah

paling besar, hal ini menegaskan bahwa etanol 96% merupakan faktor yang

dominan dalam menentukan respon kadar steviosida dalam sampel.

Tabel VIII. Hasil perhitungan Yate’s Treatment pada respon kadar steviosida

Source of variation Degrees of

freedom Sum of Squares

Mean Squares

F hitung F tabel (1,3)

Replicates 1 0,465806 0,465806

Treatment 3 39,87911 13,29304

a (suhu) 1 1,53265 1,53265 7,242069 10,128

b (vol etanol 96%) 1 37,02387 37,02387 174,945 10,128

ab Interaksi 1 1,322588 1,322588 6,249487 10,128

Experimental error 3 0,634895 0,211632

Total 7 40,97981

48 

 

 

Sedangkan harga F hitung suhu dan interaksi lebih kecil dari F tabel (1,3)

yaitu 10,128, oleh karena itu H01 dan H03 statistik (lampiran 6) diterima sehingga

terbukti bahwa faktor suhu dan interaksi tidak memberikan perbedaan respon

kadar steviosida yang dihasilkan (tabel VIII).

           

49 

 

 

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Perbedaan suhu dan jumlah volume pelarut etanol 96% yang digunakan

dalam proses maserasi daun tanaman stevia berpengaruh terhadap kadar

steviosida yang dihasilkan.

2. Kadar steviosida optimum yang dapat diperoleh pada proses maserasi

daun stevia dengan variasi suhu dan volume etanol 96% adalah berkisar

pada rentang 3%b/b hingga 7,935%b/b.

3. Volume etanol 96% berpengaruh paling dominan terhadap proses maserasi

daun tanaman stevia.

B. Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai optimasi lama maserasi

serbuk daun tanaman stevia.

.

50 

 

 

DAFTAR PUSTAKA

Achyar, 2005, Zat Aditif Pada Makanan, http://www.pppgtertulis.or.id/index.php?id=16, diakses pada tanggal 23 oktober 2008

Alupului. A., Vasile Lavric, 2008, Ultrasound Extraction of Active Principles

with Hypoglycaemic Activity from Medical Plants, 1-8, University Politehnica of Bucharest, Chemical Engineering Department, Romania

Amstrong, N.A., James, K.C., 1996, Pharmaceutical Experimental Design and

Interpretation, Taylor and Francis, USA: , 131 – 165 Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Ed III, 4, Departemen Kesehatan RI,

Jakarta Anonim,1985, Cara Pembuatan Simplisia, 7-15,105-123, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, Jakarta Anonim,1986. Sediaan Galenik, 25-26, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta Anonim,1995, Farmakope Indonesia, Ed IV, 63, Departemen Kesehatan RI,

Jakarta Anonim, 2004, Stevia; 0% Calorie, 100% Sweet, 100% Nature, 1-7, Source

Science Tech, Entrepreneur, Vol. 12/ No. 10 Anonim, 2008, Image J, http://en.wikipedia.org/wiki/ImageJ, diakses tanggal 6

November 2008

Ansel, H.C., 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, 605-612, Edisi III, Universitas Indonesia Press, Jakarta

Backer, C.A, and Van de Brink, 1968, Flora of Java, Volume I&II, Wolters

Noordhff, N.N, Groningen, the Nedherlands

Brandle, J.E., dan Rosa, N. 1992. Heritability for yield, leaf:stem ratio and stevioside concentration estimated from a landrace cultivar of Stevia rebaudiana. Can. J. Plant Sci. 72: 1263-1266

Bolton, 1997, Pharmaceutical Statistic Practical and Clinical Aplications, 3rd Ed, Marcel Dekker Inc., New York, p.611-614

51 

 

 

Cannel, Richard J.P, 1998, Methods in Biotecnology Natural Products Isolation, 54-66, Humana Press, Totowa New Jersey

Gardana, C., Simonetti, P., Canzi, E., Zanchi, R., Pietta, P., 2003, Metabolism of

Stevioside and Rebaudioside A from Stevia rebaudiana Extracts by Human Microflora, http:/www.steviainfo.com/research_articles/Gardana , diakses tanggal 6 Desember 2008.

Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., and Schwarting, A.E., 1985, Introduction to

Chromatography, 2rd ed, 84-85, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Holden-day inc, USA

Heinrich, M., Barnes, J., Gibbons, S., Williamson, E.M., 2004, Fundamentals of

Pharmacognosy and Phytotherapy, 91-92, 107, 111-112, Churchill

Livingstone, United Kingdom

Jahnen, and Andreas, 2008, Image J software in ophthalmic research of retina

with optical coherence tomography,

http://imagejconf.tudor.lu/programme/posters/imageJ-software-in-

ophthalmic-research%20of%20retina%20with-optical-coherence-

tomography, diakses tanggal 6 November 2008

Kumar J.K, N.W Megeji, Virendra Singh, V.K Kaul, P.S Ahuja, 2005,

Introducing Stevia rebaudiana; a Natural Zero-Calorie Sweeterner, Current

Science Vol. 88 No. 10, Institute of Himalayan Bioresource Technology, 1-

4, Palumpiur, India

Mantovaneli, I.C.C., Ferretti, E.C., M. R. Simões, M.R., dan C. Ferreira da Silva.

2004. The effect of temperature and flow rate on the clarification of the

aqueous stevia-extract in a fixed-bed column with zeolites. Braz. J. Chem.

Eng. São Paulo . vol.21 no.3: 449-458

Martono, Y., Kristopo, H., dan Sihasale, L.R., 2007, Recovery Produk Ekstrak

Steviosida sebagai Bahan Alternatif, Pengganti Gula dari Stevia rebaudiana

(Bert.), Laporan Penelitian, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas

Satya Wacana, Salatiga

52 

 

 

Matshushita, 1979, 1-5, Separation of Sweet Component from Natural Sweet Extracts

Midmore, D.J., and Rank, A.H.,2002, A New Rural Industry- Stevia to Replace

Imported Chemical Sweeterners, RIRDC Rural Industries Research &

Development Corporation

Moraes, Ĕlida de Paula., Machado, and Nádia Regina Camargo Fernandes, 2001,

Clarification of Stevia rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in

modified zeolites. Maringá, v. 23, n. 6, p. 1375-1380

Mudjajanto, E.S., 2005, Keamanan Jajanan Tradisional.

http://www.kompas.com/kompas-cetak/0502/17/ilpeng/1563189.htm,

diakses pada tanggal 3 November 2008

Mulja, H. Muhammad, dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 223-224,

Universitas Airlangga Press, Surabaya.

Munson, J.W., 1991, Analisis Farmasi Metode Modern, 36-38, Airlangga University Press, Yogyakarta.

Muth, J.E, 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Statistical Application, 265-

294, Marcel Dekker. Inc, All Right Revised, Madnison Avenue, New York

Nabors, Lyn’O Brien, and Robert C.Gelardi, 1986, Alternative Sweeteners, edited

by Abraham I. Bakal, 296-297, 302, Marcel Dekker. Inc, New York, USA

Pasquel, A., 2008, Extraction of Stevia Glycosides with CO2 + Water, CO2 + Etanol, and CO2 + Water +Etanol, 1-15, Brazilian Journal of Chemical Engineering, Brazil

 

Patnark, Santosh, 2004, Using Image J for Densitometry, http://stanxterm.aecom.yu.edu/wiki/index.php?page=Using_ImageJ , diakses pada tanggal 5 Mei 2008

53 

 

 

Perret, .J, Berthon, .J, Moreno, .C, Tenin, .M, 2006, Frequently Asked Questions and Answers (FAQs), http://www.greensweet/stevia.com/publication/index.php?page=page&pere=5 , diakses tanggal 28 Januari 2009

Pol,. Jaroslav, Elena Varadova Ostra, Pavel Karasek, Michal Roth, Karolinka

Benesova, Pavla Kotlarikova, and Josef Caslavsky, 2007, Comparison of

Two Different Solvents Employed for Pressurised Fluid Extraction of

Stevioside from Stevia rebaudiana : methanol versus water, Anal Bioanal

Chem, Czech Republic, 388: 1847-1857

Purves, W.K., 2006, How Can an Artificial Sweeterner Contain No Calorie?,

http://www.sciam.com/artikel.csm?id=how-can-an-artificial-swe, diakses

tanggal 28 Januari 2009

Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, Ed I, 26 – 30, Liberty, Yogyakarta

Silva, Flavia Ficira. dkk., 2007, Purification Process of Stevioside Using Zeolites

and Membranes, 1-7, International Journal of Chemical Reactor

Engineering, Vol 5 Article A40

Stahl, Egon, 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microssopy,

diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 3-18, Penerbit ITB, Bandung

Stock, R., and C.B.F. Rice, 1974, Chromatographic Methods, Third Edition, 283,

Chapman and Hall and Science Paper Backs, Great, Britain

Supardjan, A.M., 1987, Pemisahan Tetrasiklin dan Hasil Uraiannya dalam

Sediaan Tetrasiklin secara KLT Densitometri, 57, Lembaga Penelitian

UGM, Yogyakarta.

Trease, William, and Charles Evan’s, 2002, Pharmacognosy 15th edition, 92,

W.B. Saunders, Nottingham, UK

Tyler, Varro E., Lynn R. Brady, and James E. Robbers, 1988, Pharmacognosy 9th

edition, Lea & Febiger, Philadelphia

54 

 

 

Voigt, 1984, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, 165-169, Gadjah Mada

University Press, Yogyakarta.

Wagner H., S. Bladt, and E.M. Zgainski, 1984, Plant Drug Analysis; Thin Layer

Cromatography Atlas, diterjemahkan oleh Th. A. Scott, 125,304, Springer-

Verlag, New York.

Wallin. Harriet, 2007, Steviol Glycosides Chemical and Technical Assesment, 1,

revised by Paul M. Kuznesof Ph.D, 68th, JECFA

Zeligs, Michael A., and H. Leon Bradlow, Diindolylmethane (DIM), formed

spontaneously from Indole-3-carbinol (I3C), is the dominant anti-

proliferative indole in cell culture media after adding I3C,

http://www.aidic.it/IBIC2008/webpapers/86Alupului.pdf, diakses pada

tanggal 22 Desember 2008.

 

 

 

55 

 

 

 

 

 

LAMPIRAN DATA

56 

 

 

Lampiran 1. Kurva Baku Steviosida

Data Penimbangan Baku Steviosida

Berat Cawan = 13,3605 g

Berat Cawan + Zat = 13,37079 g

Berat Zat = 0,01014 g

= 10,14 mg add 5 ml

Konsentrasi Baku Steviosida = 2,028 mg/ml

Kadar Steviosida dalam 1µl (1 totolan ) = 2,028 µg

Kurva Baku Steviosida Jumlah Totolan AUC Kadar (µg)

2 11,188 4,056

3 15,927 6,084

4 23,61 8,112

5 28,539 10,14

6 39,371 12,168

7 48,372 14,196

Persamaan Kurva Baku

A= -5,7459

B= 3,6796

r = 0,9911

Y= 3,6796 X-5,7459

57 

 

 

Lampiran 2. Data Sampel

1. Data Sampel Replikasi Air Suhu Etanol AUC

Sampel Kadar (µg/3µl) Kadar Sampel

(mg/vol ekstrak)

Rata-rata kadar sampel(mg/4gram serbuk)

1 20ml 300C 20ml 17,787 6,395504946 106,5917491

2 20ml 300C 20ml 19,425 6,840662028 114,0110338

110,3014 ± 5,2462

1 20ml 500C 20ml 20,843 7,226030003 120,4338334

2 20ml 500C 20ml

17,468 6,30881074 105,1468457

112,7903 ± 10,8095

1 20ml 300C 50ml 22,628 7,71113708 257,0379027

2 20ml 300C 50ml 21,047 7,281470812 242,7156937

249,8768 ± 10,1273

1 20ml 500C 50ml 32,331 10,34810849 344,9369497

2 20ml 500C 50ml 26,256 8,697113817 289,9037939

317,4204 ± 38,9143

Rata-rata Kadar Sampel dalam (%b/b)

Kondisi Rata-rata kadar

sampel (mg/4 gram

serbuk)

Rata-rata kadar

sampel (gram/4

gram serbuk)

Rata-rata kadar

sampel (gram/100

gram serbuk)

(%b/b)

(1) 110,3014 0,1103 2,7575 ± 0,1311

a 112,7903 0,1128 2,8198 ± 0,2701

b 249,8768 0,2499 6,2469 ± 0,2531

ab 317,4204 0, 3174 7,9355 ± 0,9728

58 

 

 

Lampiran 3. Perhitungan Data Sampel

Perhitungan Data Sampel

Persamaan kurva baku = Y= 3,6796 x-5,7459

1. Sampel (300C dan etanol 20 ml)

a. Replikasi 1 (AUC = 17,787)

- Jumlah steviosida dalam sampel

Y = 3,6796 x-5,7459

17,787 = 3,6796 x-5,7459

23,5329 = 3,6796 x

x = 6,395504946 µg/3µl

x = 106,5917491mg/50 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk

- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)

Jumlah Steviosida = 106,5917491mg/4gram serbuk

= 0,1066 gram/4 gram serbuk

= 2,6648 gram/100 gram serbuk (%b/b)

b. Replikasi 2 (AUC= 19,425)

- Jumlah steviosida dalam sampel

Y = 3,6796 x-5,7459

19,425 = 3,6796 x-5,7459

25,1709 = 3,6796 x

x = 6,840662028 µg/3µl

x = 114,0110338 mg/50 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk

- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)

Jumlah Steviosida = 114,0110338 mg/4gram serbuk

59 

 

 

= 0,1140 gram/4 gram serbuk

= 2,8503 gram/100 gram serbuk (%b/b)

2. Sampel (500C dan etanol 20 ml)

a. Replikasi 1 (AUC= 20,843)

- Jumlah steviosida dalam sampel

Y = 3,6796 x-5,7459

20,843 = 3,6796 x-5,7459

26,5889 = 3,6796 x

x = 7,226030003 µg/3µl

x = 120,4338334 mg/50 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk

- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)

Jumlah Steviosida = 120,4338334 mg/4gram serbuk

= 0,1204 gram/4 gram serbuk

= 3,0108 gram/100 gram serbuk (%b/b)

b. Replikasi 2 (AUC=17,468)

- Jumlah steviosida dalam sampel

Y = 3,6796 x-5,7459

17,468 = 3,6796 x-5,7459

23,2139 = 3,6796 x

x = 6,30881074 µg/3µl

x = 105,1468457 mg/50 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk

- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)

Jumlah Steviosida = 85,27339928 mg/4gram serbuk

60 

 

 

= 0,0853 gram/4 gram serbuk

= 2,1318 gram/100 gram serbuk (%b/b)

3. Sampel (300C dan etanol 20 ml)

a. Replikasi 1(AUC=22,628)

- Jumlah steviosida dalam sampel

Y = 3,6796 x-5,7459

22,628 = 3,6796 x-5,7459

28,3739 = 3,6796 x

x = 7,71113708µg/3µl

x = 257,0379027mg/100 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk

- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)

Jumlah Steviosida = 257,0379027 mg/4gram serbuk

= 0,2570 gram/4 gram serbuk

= 6,4259 gram/100 gram serbuk (%b/b)

b. Replikasi 2(AUC= 21,047)

- Jumlah steviosida dalam sampel

Y = 3,6796 x-5,7459

21,047 = 3,6796 x-5,7459

26,7929 = 3,6796 x

x = 7,281470812 µg/3µl

x = 242,7156937 mg/40 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk

- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)

Jumlah Steviosida = 242,7156937mg/4gram serbuk

61 

 

 

= 0,2427 gram/4 gram serbuk

= 6,0679 gram/100 gram serbuk (%b/b)

4. Sampel (300C dan etanol 20 ml)

a. Replikasi 1 (AUC = 32,331)

- Jumlah steviosida dalam sampel

Y = 3,6796 x-5,7459

32,331 = 3,6796 x-5,7459

38,0769 = 3,6796 x

x = 10,34810849 µg/3µl

x = 344,9369497 mg/40 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk

- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)

Jumlah Steviosida = 344,9369497 mg/4gram serbuk

= 0,3449 gram/4 gram serbuk

= 8,6234 gram/100 gram serbuk (%b/b)

b. Replikasi 2 (AUC = 26,256)

- Jumlah steviosida dalam sampel

Y = 3,6796 x-5,7459

26,256 = 3,6796 x-5,7459

32,0019 = 3,6796 x

x = 8,697113817µg/3µl

x = 289,9037939 mg/40 ml ekstrak – dari 4 gram serbuk

- Kadar steviosida dalam 100 gram serbuk (%b/b)

Jumlah Steviosida = 289,9037939 mg/4gram serbuk

62 

 

 

= 0,2899 gram/4 gram serbuk

= 7,2476 gram/100 gram serbuk (%b/b)

Kondisi Replikasi Kadar steviosida dalam sampel(mg/4gram serbuk)

Kadar steviosida dalam sampel (gram/4gram serbuk)

Kadar steviosida dalam sampel (gram/100 gram serbuk) (%b/b)

Rata-rata (%b/b)

(1) 1 106,5917491 0,1066 2,6648 2,7575 ± 0,1311 (1) 2 114,0110338 0,1140 2,8503

a 1 120,4338334 0,1204 3,0108 2,8198 ± 0,2701 a 2 105,1468457 0,1051 2,6287

b 1 257,0379027 0,2570 6,4259 6,2469 ± 0,2531 b 2 242,7156937 0,2427 6,0679

ab 1 344,9369497 0,3449 8,6234 7,9355 ± 0,9728 ab 2 289,9037939 0,2899 7,2476

63 

 

 

Lampiran 4. Perhitungan Desain Faktorial

Perhitungan Desain Faktorial Kondisi Suhu (0C) Volume Etanol Interaksi Rata-rata

kadar sampel (%b/b)

(1) - - + 2,7575

a + - - 2,8198

b - + - 6,2469

ab + + + 7,9355

Perhitungan nilai efek masing-masing faktor

Efek Etanol =

Efek Suhu =

Efek Interaksi =

Perhitungan mencari persamaan Faktorial Design

Persamaan Umum = Y = b0 + b1.X1 + b2.X2 + b12.X1X2

X1= faktor suhu X2 = faktor volume etanol

(1) 2,7575 = b0 + 30 b1 + 20 b2 + (30x20) b12

2,7575 = b0 + 30 b1 +20 b2 + 600 b12

(a) 2,8198 = b0 +50 b1+20 b2+ (50x20)b12

2,8198 = b0 +50 b1+20b2+1000 b12

(b) 6,2469 = b0 + 30 b1 + 50 b2 +(30x50)b12

6,2469 = b0 + 30 b1 + 50 b2 + 1500 b12

64 

 

 

(ab) 7,9355 = b0 + 50 b1+ 50 b2 + (50x50) b12

7,9355 = b0 + 50 b1 +50 b2 + 2500 b12

Eliminasi (1) dan (a)

(1) 2,7575 = b0 + 30 b1 +20 b2 + 600 b12

(a) 2,8198 = b0 +50 b1+20b2+1000 b12 _

-0,0623= -20 b1 – 400 b12……………(I)

Eliminasi (b) dan (ab)

(b) 6,2469 = b0 + 30 b1 + 50 b2 + 1500 b12

(ab) 7,9355 = b0 + 50 b1 +50 b2 + 2500 b12

-1,6886 = -20 b1 – 1000 b12………………(II)

Eliminasi (I) dan (II)

(I) -0,0623 = -20 b1 – 400 b12

(II) -1,6886 = -20 b1 – 1000 b12

1,6263 = 600 b12

b12 = 2,7105x10-3

substitusi b12 ke (I)

(I) -0,0623 = -20 b1 – 400 b12

-0,0623 = -20 b1 – 400 (2,7105x10-3)

-0,0623 = -20 b1 – 1,0842

1,0219 = -20 b1

b1 = -0,0511

65 

 

 

eliminasi (1) dan (b)

(1) 2,7575 = b0 + 30 b1 +20 b2 + 600 b12

(b) 6,2469 = b0 + 30 b1 + 50 b2 + 1500 b12

-3,4894= -30 b2 – 900 b12………………,(III)

Substitusi b12 ke (III)

(III) -3,4894 = -30 b2 – 900 b12

-3,4894 = -30 b2 – 900 (2,7105x10-3)

-3,4894 = -30 b2 – 2,4395

-1,0499 = -30 b2

b2 = 0,0349

substitusi b1,b2,b12 ke (1)

(1) 2,7575 = b0 + 30 b1 +20 b2 + 600 b12

2,7575 = b0 + 30 (-0,0511) +20 (0,0349) + 600 (2,7105x10-3)

2,7575 = b0 – 1,533 + 0,6980 + 1,6263

2,7575 = b0 + 0,7913

b0 = 1,9662

Persamaan Desain Faktorial

y = 1,9662 -0,0511A + 0,0349 B +0,0027105AB

66 

 

 

Lampiran 5. Grafik Contour Plot

67 

 

 

Lampiran 6. Perhitungan Yate’s Treatment

Perhitungan Yate’s Treatment

Kondisi Replikasi Kadar steviosida dalam sampel(mg/4gram serbuk)

Kadar steviosida dalam sampel (gram/4gram serbuk)

Kadar steviosida dalam sampel (gram/100 gram serbuk) (%b/b)

(1) 1 106,5917491 0,1066 2,6648

(1) 2 114,0110338 0,1140 2,8503

a 1 120,4338334 0,1204 3,0108

a 2 105,1468457 0,1051 2,6287

b 1 257,0379027 0,2570 6,4259

b 2 242,7156937 0,2427 6,0679

ab 1 344,9369497 0,3449 8,6234

ab 2 289,9037939 0,2899 7,2476

Faktor Suhu

A1(rendah) A1(rendah) A2(tinggi) A2(tinggi)

Replikasi B1(rendah) B2(tinggi) B1(rendah) B2(tinggi)

1 2,6648 6,4259 3,0108 8,6234

2 2,8503 6,0679 2,6287 7,2476

68 

 

 

Kadar Steviosida (Perhitungan Yates Treatment)

2yΣ = total sum of squares

2yΣ = (2,6648)2 + (2,8503)2 +(6,4259)2 + (6,0679)2 +( 3,0108)2 + (2,6287)2 +

(8,6234)2 + (7,2476)2 – 8

2)5194,39(

= 40,97981

Ryy = replicate sum of square

Ryy = ( ) ( ) ( )

85194,39

418,794520,7249 222

−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +

= 0,465806

Tyy = treatment sum of squares

Tyy = ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

85194,39

215,8715,639512,49385,5151 22222

−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +++

= 39,87911

Eyy = experiment al error sum of squares

= 40,97981– 0,465806– 39,87911

= 0,634895

Ayy = sum of squares associated with teh different level of a

= ( ) ( ) ( )

85194,39

421,510518,0089 222

−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +

= 1,53265

69 

 

 

Byy = sum of squares associated with teh different level of b

= ( ) ( ) ( )

85194,39

428,364811,1546 222

−⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ +

= 37,02387

Source of variation

Degrees of freedom Sum of Squares Mean Squares

F

Replicates 1 0,465806 0,465806

Treatment 3 39,87911 13,29304

a 1 1,53265 1,53265 7,242069

b 1 37,02387 37,02387 174,945

ab 1 1,322588 1,322588 6,249487

Experimental error 3 0,634895 0,211632

Total 7 40,97981

F tabel (1,3) dengan tingkat kepercayaan 95% adalah 10,128

Hipotesis Statistik:

H01 = kadar steviosida pada suhu level tinggi tidak berbeda dengan suhu level

rendah.

Hi1= kadar steviosida pada suhu level tinggi berbeda dengan suhu level rendah.

H02 = kadar steviosida pada volume etanol 96% level tinggi tidak berbeda dengan

volume etanol 96% level rendah.

Hi2= kadar steviosida pada volume etanol 96% level tinggi berbeda dengan

volume etanol 96% level rendah.

.

70 

 

 

H03 = kadar steviosida pada suhu level tinggi dan volume etanol 96% level tinggi

dan rendah tidak berbeda dengan respon kadar steviosida pada suhu level rendah

dan volume etanol 96% level tinggi dan rendah .

Hi3 = kadar steviosida pada suhu level tinggi dan volume etanol 96% level tinggi

dan rendah berbeda dengan respon kadar steviosida pada suhu level rendah dan

volume etanol 96% level tinggi dan rendah .

71 

 

 

Lampiran 7. Gambar Tanaman dan Simplisia Kering

72 

 

 

Lampiran 8. Gambar Pereaksi Semprot

Pereaksi Semprot

a. Larutan Iodium

b. Larutan Vanilin-asam sulfat

73 

 

 

Lampiran 9. Tampilan Baku dan Sampel pada Lempeng KLT

74 

 

 

Lampiran 10. Tampilan Baku dan Sampel dalam Tahapan Image

a. Saat di Auto 3 kali

b. Saat setelah di Image J

75 

 

 

Lampiran 11. Tampilan Ekstrak

a. Suhu 300C dan Etanol 20 ml

b. Suhu 500C dan Etanol 20 ml

c. Suhu 300C dan Etanol 50 ml

d. Suhu 500C dan Etanol 50 ml

78 

 

 

Lampiran 13. Langkah-langkah Analisis Image J

a. Hasil scan gambar kromatogram dari sampel maupun baku di atur dalam

hal contrast/brightness gambar menggunakan fasilitas Image > Adjust >

Brightness/Contrast > Auto pada software Image J, sehingga bercak akan

tampak lebih jelas dan memisah. Lalu file disimpan.

b. Membuka program Adobe Photoshop, lalu buka file yang telah disimpan

pada (a) (Open > File). Gambar kromatogram tersebut dihitamkan dengan

menggunakan fasilitas Magic Wand Tool dan Paint Bucket Tool. Dengan

fasilitas yang sama, maka sisi luar dari kromatogram diputihkan.

Kemudian file disimpan kembali.

c. File yang telah disimpan pada (4) dibuka pada Image j (Open > File)

d. Gambar diperbesar (Image > Zoom Out)

e. Hapus background gambar dan titik-titik pengotor dengan menggunakan

fasilitas Eraser Tool dan fasilitas perbesaran Magnifying Glass, sehingga

yang tampak hanya bercak baik dari baku maupun sampel.

f. Kromatogram yang diperoleh tersebut kemudian disamakan intensitas

warna bercak dengan menggunakan fasilitas Binary (Process > Binary).

g. Setelah itu dibuat kurva kalibrasi dengan unit Gray value (Analyze >

Calibrate > Uncalibrate OD).

h. Selanjutnya, masing-masing kromatogram dihitung luasnya dengan

membuat Plot Kurva dengan menggunakan fasilitas Rectangular

79 

 

 

Selections untuk memberi kotak dengan ukuran sama pada setiap

kromatogram dan pemberian nomer (Analyze > Gels > Select First Lane),

penomeran selanjutnya (Analyze > Gels > Select Next Lane). Lalu pilih

fasilitas Plot Lanes.

i. Setelah plot kurva dari masing-masing kromatogram muncul, kemudian

dicari luas daerah dibawah kurva (AUC) yang menggambarkan luas

bercak dengan menggunakan fasilitas Wand (tracing) Tool. Nilai AUC

dari setiap kromatogram akan muncul.

j. Setelah kurva dari masing-masing bercak muncul, kemudian dicari luas

daerah dibawah kurva (AUC) yang menggambarkan luas bercak dengan

menggunakan fasilitas Wand (tracing) Tool.

80  

BIOGRAFI PENULIS

Diana Erosita Pramesthi, lahir di Cirebon pada hari Selasa pon tanggal 22 Maret 1987,

merupakan anak sulung dari pasangan Anton Budiono dan Helena Usiati, memiliki 2 orang Adik

laki-laki bernama Daniel Ugik Permana dan David Irwan Prabowo. Pernah menempuh

pendidikan di TK Santa Maria Cirebon tahun ajaran 1990/1991 hingga 1992/1993, SD Santa

Maria Cirebon tahun ajaran 1993/1994 hingga 1998/1999, kemudian melanjutkan pendidikan di

SLTP Santa Maria Cirebon tahun ajaran 1999/2000 hingga 2001/2002, selanjutnya melanjutkan

pendidikan di SMA Santa Maria I pada tahun ajaran 2002/2003 hingga 2004/2005. Setamat dari

SMA, penulis memilih untuk melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta. Selama jadi mahasiswa, penulis aktif mengikuti berbagai kegiatan

kemahasiswaan, diantaranya menjadi panitia Donor Darah JMKI (2006), panitia Sumpahan

Apoteker (2007), panitia Dies Natalis (2007). Selain itu penulis juga pernah menjadi asisten

Praktikum Botani Dasar (2007) dan asisten Praktikum Farmakologi (2007).