Obat DBD-Unit Operasi Dan Pengemasan Penyimpanan

11
UNIT OPERASI PABRIK PEMBUATAN OBAT DEMAM BERDARAH DAN PENGEMASAN SERTA PENYIMPANANNYA Devi / Teknik Kimia / 1206243601 I. Pendahuluan Virus dengue (DENV) merupakan salah satu anggota dari keluarga virus Flaviviridae, yang ditransmisikan oleh nyamuk Aedes. Sebuah estimasi menyatakan bahwa 400 juta orang di seluruh dunia terinfeksi DENV setiap tahunnya, diikuti dengan 100 juta kasus demam berdarah dan 21000 kematian (Thomas’ Endy, 2011; Bhatt et al, 2013). Terdapat empat jenis virus dengue, yaitu DENV1-4. Perbedaan sequences asam amino antar stereotipe yang berbeda tersebut adalah sekitar 25-40%. Masing-masing stereotipe dapat menyebabkan demam berdarah, baik ringan (demam biasa) maupun fatal (Dengue Hemorrhagic Fever dan Dengue Shock Syndrome). DENV adalah virus yang terbungkus, dimana inti nukleokapsid dikelilingi oleh membran lipid bilayer. Pada pembungkus lipid, terdapat 180 eksemplar dari protein membran (M) dan protein envelope (E). Struktur kristal dari ektodomain protein E menunjukkan bahwa protein ini terdiri atas tiga domain yang berbeda, yaitu DI, DII, dan DIII. Molekul ini memiliki peranan penting bagi virus untuk masuk ke dalam sel, karena melakukan mediasi pengikatan ke reseptor seluler dan berdifusi di antara virus dan membran endosomal. Menurut Roehrig (2003), protein inilah yang menjadi target utama dalam proses netralisasi antibodi. Antibodi monoklonal manusia (HMAbs), seperti 1F4 mampu menetralisir DENV1 (Fabriansah et al, 2014). Antibodi ini tidak mengikat seluruh interface antar protein E yang terpisah, tetapi monomer protein E-lah yang mengadopsi konformasi ketika antibodi terdapat di dalam partikel virus. Proses netralisasi HMAb berkaitan dengan penghambatan yang kuat dari liposom virus dan fusi intraseluler dan bukan ikatan virus dengan sel. HMAb 1F4 mengikat DI dan daerah engsel DI-II dari monomer protein E dan ikatan antibodi cenderung sensitif terhadap daerah engsel ini. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa daerah ini merupakan epitop dasar di dalam protein E yang mendatangkan sejenis respon netralisasi antibodi yang spesifik. Hasil penelitian Fabriansah et al juga menyatakan bahwa induksi netralisasi antibodi dengan menggunakan vaksin yang mengandung monomer atau dimer protein E dapat ditingkatkan jika sudut engsel dari protein E sama dengan sudut permukaan virus. Berdasarkan hasil penelitian ini, maka HMAbs memiliki potensial untuk dijadikan sebagai bahan aktif obat untuk melawan virus dengue. Dengan alasan efisiensi, yaitu agar zat aktif berupa protein ini dapat bekerja efektif, maka sediaan yang dipilih untuk obat ini adalah sediaan parental atau injeksi. Proses isolasi HMAb dapat dilakukan dengan beberapa metode. Metode yang pertama adalah dengan Epstein-Bar virus (EBV) transformation. PMBC 1

description

DBD

Transcript of Obat DBD-Unit Operasi Dan Pengemasan Penyimpanan

UNIT OPERASI PABRIK PEMBUATAN OBAT DEMAM BERDARAH DAN PENGEMASAN SERTA PENYIMPANANNYA

Devi / Teknik Kimia / 1206243601

I. Pendahuluan

Virus dengue (DENV) merupakan salah satu anggota dari keluarga virus Flaviviridae, yang ditransmisikan oleh nyamuk Aedes. Sebuah estimasi menyatakan bahwa 400 juta orang di seluruh dunia terinfeksi DENV setiap tahunnya, diikuti dengan 100 juta kasus demam berdarah dan 21000 kematian (Thomas Endy, 2011; Bhatt et al, 2013). Terdapat empat jenis virus dengue, yaitu DENV1-4. Perbedaan sequences asam amino antar stereotipe yang berbeda tersebut adalah sekitar 25-40%. Masing-masing stereotipe dapat menyebabkan demam berdarah, baik ringan (demam biasa) maupun fatal (Dengue Hemorrhagic Fever dan Dengue Shock Syndrome).

DENV adalah virus yang terbungkus, dimana inti nukleokapsid dikelilingi oleh membran lipid bilayer. Pada pembungkus lipid, terdapat 180 eksemplar dari protein membran (M) dan protein envelope (E). Struktur kristal dari ektodomain protein E menunjukkan bahwa protein ini terdiri atas tiga domain yang berbeda, yaitu DI, DII, dan DIII. Molekul ini memiliki peranan penting bagi virus untuk masuk ke dalam sel, karena melakukan mediasi pengikatan ke reseptor seluler dan berdifusi di antara virus dan membran endosomal. Menurut Roehrig (2003), protein inilah yang menjadi target utama dalam proses netralisasi antibodi.

Antibodi monoklonal manusia (HMAbs), seperti 1F4 mampu menetralisir DENV1 (Fabriansah et al, 2014). Antibodi ini tidak mengikat seluruh interface antar protein E yang terpisah, tetapi monomer protein E-lah yang mengadopsi konformasi ketika antibodi terdapat di dalam partikel virus. Proses netralisasi HMAb berkaitan dengan penghambatan yang kuat dari liposom virus dan fusi intraseluler dan bukan ikatan virus dengan sel. HMAb 1F4 mengikat DI dan daerah engsel DI-II dari monomer protein E dan ikatan antibodi cenderung sensitif terhadap daerah engsel ini. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa daerah ini merupakan epitop dasar di dalam protein E yang mendatangkan sejenis respon netralisasi antibodi yang spesifik. Hasil penelitian Fabriansah et al juga menyatakan bahwa induksi netralisasi antibodi dengan menggunakan vaksin yang mengandung monomer atau dimer protein E dapat ditingkatkan jika sudut engsel dari protein E sama dengan sudut permukaan virus. Berdasarkan hasil penelitian ini, maka HMAbs memiliki potensial untuk dijadikan sebagai bahan aktif obat untuk melawan virus dengue. Dengan alasan efisiensi, yaitu agar zat aktif berupa protein ini dapat bekerja efektif, maka sediaan yang dipilih untuk obat ini adalah sediaan parental atau injeksi.

Proses isolasi HMAb dapat dilakukan dengan beberapa metode. Metode yang pertama adalah dengan Epstein-Bar virus (EBV) transformation. PMBC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) yang telah di cyropreservasi dicairkan, kemudian ditempatkan di dalam suatu kultur, dan diinokulasi dengan EBV. Sel-sel kemudian diresuspensi di dalam RPMI yang mengandung 20% (vol/vol) fetal bovine serum (FBS), Primacin (InVivoGen, San Diego, CA), dan 2 mg/mL CpG 2006 (Midland Certified Reagent Co., Midland, TX) dan diletakkan pada 104 sel per well di dalam 96 well dari plate kultur jaringan. Plat-plat ini telah ditanami dengan sekitar 50,000 makrofag dewasa yang telah diiradiasi per well dari PMBC milik pendonor darah yang sehat, yang menjadi kultur feeder untuk mempromosikan pertumbuhan sel B yang telah ditransformasikan. Well antibodi-positif yang mengandung sel yang dapat hidup disubkultur pada beberapa pengenceran dan di-rescreen dengan ELISA. Cell line yang terus tumbuh dan menghasilkan antibodi selama low-cell-density passage pada akhirnya diklon pada pengenceran tertentu. Cell line yang secara pasti diklon diperluas pertumbuhannya sebagai kultur suspensi di dalam kultur roller bottle (Corning, Corning, NY) yang menjadi sumber fluida kultur sel dan dapat dipanen setiap minggu. HMAb dimurnikan dari 1 menjadi 2 liter dari kultur supernatan oleh kromatografi afinitas protein A. Subkelas IgG dan tipe cahaya-rantai dari setiap antibodi ditentukan dengan mMAb.

Proses kedua adalah melalui proses kloning HMAb dari manusia. Untuk menghasilkan HMAb, stimulasi transien dari sel memori B digunakan sebagai sebuah pendekatan alternatif untuk transformasi EBV. HMAb 1,6D diisolasi menggunakan metode berikut. PMBC yang telah di-cyropreservasi diencerkan dan dicuci seperti yang dijelaskan di atas dan kemudian disuspensi di dalam RPMI yang mengandung 20% (vol/vol) FBS, Primacin, 2,5 g/ml R848, reseptor yang mirip toll (TLR7) dan TLR8 agonis (InvivoGen, San Diego, CA), dan 50 U/ml rekombinan dari interleukin-2 manusia (Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, IN). Setalh diinkubasi selama 3 hari pada suhu 37C dan 5% (vol/vol) CO2, sel-sel dihitung kembali dan ditempatkan di plat dengan jumlah 500 hingga 104 sel per well di dalam 96 kultur jaringan well yang mengandung sel feeder.

Untuk menghasilkan klon molekular dari HMAb, diperlukan konstruksi linear full-length Ig kaset ekspresi gen rantai berat dan ringan. Klon molekular dimulai dari PMBC yang distimulasi, dan D11C, dari garis sel B yang telah ditransformasi. Singkatnya, RNA diekstraksi dari HMAb sel B positif ditranskripsi terbalik dan diklon ke dalam kaset ekspresi gen. Produk PCR yang telah dipurifikasi dari pasangan Ig kaset ekspresi gen rantai berat dan ringan di cotransfeksikan ke dalam 80 hingga 90% konfluen sel HEK-293T yang tumbuh di dalam plat jaringan kultur dengan 48 well dengan menggunakan Reagen Transfeksi Fugene dengan mengikuti instruksi produsen bahan tersebut. Supernatan transfeksi diuji untuk produksi HMAb terhadap 4 stereotipe DENV dengan concanavalin A (Con A) ELISA. Kultur positif ditanam ke dalam plat dengan 96 well di DMEM dengan 10% (vol/vol) FBS dan 20 g/ml Blasticidin S (InvivoGen) untuk menghasilkan formasi dari garis produksi sel HMAb yang stabil. Kultur diklon dengan subkultur serial pada densitas sel yang semakin menurun di dalam plat dengan 96 well, diikuti dengan screening antibodi pada setiap tahap.

Dari mekanisme isolasi di atas, dapat disimpulkan bahwa untuk membuat pabrik vaksin virus dengue, dibutuhkan beberapa unit operasi sebagai berikut.

II. Unit Operasi

Gambar 2.1. Proses upstream Mab. Proses dimulai dengan ekspansi vial thaw dan ekspansi sel melalui serangkaian tahap inoculum. Sel-sel ini kemudian dikembangkan lebih lanjut dalam seed bioreactor seri sebelum ditransfer ke bioreaktor produksi dimana mAb dimasukkan ke dalam media. Sentrifugasi dan serangkaian langkah filtrasi kemudian dilakukan untuk panen broth kultur sel dari sel dan cell debris.

(Sumber : Shukla, Abhinav dan Jorg Thommes, 2010)

Gambar 2.2. Downstream process monoklonal antibodi. Proses dimulai dengan kromatografi Protein A untuk menghilangkan pengotor. Proses ini juga mencakup dua langkah ortogonal khusus untuk penghilangan virus : pH rendah menginaktivasi virus setelah kromatografi Protein A dan filtrasi virus. Langkah terakhir proses adalah ultrafiltrasi / diafiltration (UF / DF) untuk memformulasikan dan mengkonsentrasikan produk

(Sumber : Shukla, Abhinav dan Jorg Thommes, 2010)

Beberapa unit operasi penting yang digunakan di dalam proses produksi ini, antara lain :

1. Bioreactor

Gambar 2.3. Contoh bioreaktor

(Sumber : Kastanek, n.d.)

Bioreaktor adalah sebuah alat tempat terjadinya proses kimia yang terjadi pada organisme atau substansi aktif biokimia lainnya. Proses yang terjadi di dalam bioreaktor dapat bersifat aerobik maupun anaerobik. Bioreaktor juga dapat berupa sebuah aparatus, yang merupakan wadah terjadinya fermentasi, tempat bertumbuhnya organisme yang digunakan di dalam produksi bioteknologi dari suatu susbtansi, seperti pharmaceutical, antibodi, atau vaksin, atau biokonversi dari limbah organik. Sebuah bioreaktor juga dapat berupa alat atau sistem tempat tumbuhnya sel atau jaringan di dalam konteks kultur sel. Sel kultur adalah proses peryumbuhan sel pada kondisi tertentu.

Berdasarkan modus dasar operasi, bioreaktor dapat diklasifikasikan sebagai bioreaktor batch dan continuous. Berdasarkan jenis aliran fluida di dalam bioreaktor, bioreaktor dapat diklasifikasikan menjadi reaktor CSTR, bioreaktor dengan piston flow, dan bioreaktor dengan aliran fluida yang non-ideal. Sedangkan, berdasarkan jumlah fase yang diolah di dalam bioreaktor, bioreaktor dapat dibedakan menjadi bioreaktor homogen dan heterogen.

Ukuran ferementer biasanya mencapai 1,2 juta liter. Pada umumnya, 20-25% dari volume fermenter tidak diisi dengan medium untuk mengizinkan terjadinya percikan, foaming, dan aerasi. Desain fementer berbeda tergantung pada tipe fermentasi yang akan terjadi di dalam bioreaktor tersebut. Desain reaktor yang digunakan dalam pembuatan obat ini digambarkan oleh gambar di bawah ini, sebuah bioreaktor dengan pengaduk.

Gambar 2.4. Mixed tank bioreactor

(Sumber : Kastanek, n.d.)

Fungsi dari impeller di dalam bioreaktor adalah untuk homogenisasi dispersi di dalam bioreaktor, desperasi dan menghancurkan gelembung udara untuk meningkatkan luas permukaan perpindahan massa dan untuk meningkatkan turbulensi cairan.

2. Centifugator

Sentrifugator merupakan alat yang menggunakan prinsip gaya sentrifugal sebagai prinsip kerjanya. Partikel-partikel disuspensikan di dalam gerakan fluida, di bawah pengaruh gravitas, ke arah bagian bawah alat dengan kecepatan tertentu, yang tergantung pada ukuran dan densitas partikelnya. Pada alat ini, gaya sentrifugasi lebih besar dibandingkan dengan gaya gravitasi. Hal ini terjadi akibat adanya proses spinning, pada axis rotasi sehingga partikel yang terdapat di dalamnya dipaksa untuk menjauhi aksis tersebut.

Gambar 2.5. Centifugator

(Sumber : The Biomedical Scientist, 2013)

Terdapat beberapa komponen utama di dalam sentifugator, antara lain :

a. Rotor

Terdapat tiga desain dasar dari rotor, yaitu desain horizontal, fixed angle, dan vertikal. Pada desain horizontal, zat yang akan disentrifugasi akan dilempar keluar dari posisi horizontal dan dapat beroperasi pada kecepatan sekitar 300 rpm. Pada desain kedua, tabung sampel diletakkan pada sudut tertentu terhadap posisi vertikal sehingga dapat bekerja dengan kecepatan lebih tinggi, yaitu sekitar 7000 rpm. Pada umumnya sentifugator menggunakan desain horizontal karena dapat mengendapkan partikel dengan ukuran besar dan efiseinsi pada gaya yang rendah karena sedimen datar akan terbentuk.

b. Motor

Pada umumnya, motor sentrifugator memiliki torsi yang tinggi, series wound DC motor, sehingga rotasi akan meningkay ketika voltage meningkat.

c. Imbalance detector

Beberapa sentrifugator memiliki detektor ketidakseimbangan di bagian dalam yang memonitor kerja rotor. Apabila terjadi ketidakseimbangan, detektor ini akan menyebabkan alat shutdown secara otomatis.

d. Tachometer

Alat ini digunakan untuk mengindikasi kecepatan di dalam satuan rpm.

e. Safety ltd

Beberapa alat sentrifugator modern memiliki mekanisme door-locking untuk mencegah penutup dari gaya yang menyebabkan terbukanya penutup selama proses sentrifugasi sedang berlangsung.

f. Refrigerator

Proses sentrifugasi dapat menghasilkan panas ketika rotasi terjadi. Ketika melakukan sentrigasi pada bahan yang peka terhadap suhu, sentrifugator harus dilengkapi dengan alat ini.

g. Braking system

Alat ini berinkorporasi untuk menghasilkan deklarasi rotor yang tinggi.

3. Membrane filter

Membran filter adalah membran yang berupa lapisan plastik dengan ukuran pori dengan satuan mikro. Membran ini meloloskan partikel yang lebih kecil dari ukuran porinya dan menahan partikel dengan ukuran yang lebih besar.

4. Cromatography skid

Gambar 2.6. Cromatography skid

(Sumber : Bio-Rad, n.d.)

Gambar 2.7. Detail cromatography skid

(Sumber : Bio-Rad, n.d.)

Alat ini digunakan untuk meningkatkan konsentrasi dan kemurnian dari zat, dalam pengolahan obat ini adalah protein A di dalam HMAbs.

III. Pengemasan dan Penyimpanan

Obat virus dengue dengan zat aktif berupa HMAb ini dapat dikemas ke dalam bentuk sediaan injeksi. Tentu saja sebelum dimasukkan ke dalam jarum suntik, obat dikemas di dalam suatu kemasan terpisah yang dapat menjaga obat dari kerusakan atau penurunan efisiensi. Sediaan ini sendiri kemudian dapat dilapisi atau dibungkus dengan bahan pengemas sekunder, misalnya karton atau plastik.

Obat virus dengue ini dapat dikemas di dalam kemasan yang dikenal dengan sebutan ampul. Ampul adalah wadah berbentuk silindris yang terbuat dari gelas/kaca, yang memiliki ujung runcing (leher) dan bidang dasar datar dengan ukuran normal 1, 2, 5, 10, 20, dan kadang-kadang 25, atau 30 ml (Amilina et al, 2012). Ampul adalah wadah takaran tunggal, oleh karena total jumlah cairanya ditentukan pemakaiannya untuk satu kali injeksi (Voight, 1995).

Gambar 3.1. Contoh ampul

(Sumber : Amilina et al, 2012)

Bahan yang digunakan sebagai wadah dari obat ini (termasuk tutupnya) harus tidak berinteraksi dengan sediaan , baik secara fisik maupun kimia karena akan mengubah kekuatan dan efektifitasnya. Gelas atau kaca dipilih karena bersifat inert. Bahan kaca yang digunakan harus jernih atau tidak berwarna jernihuntuk memungkinkan pemeriksaaan isinya. Pada umumnya kemasan dirancang sedemikian rupa sehingga setelah dibuka tidak dapat ditutup rapat kembali. Ampul biasanaya di dalam kondisi aseptis. Wadah gelas dibuat mempunyai leher agar dapat dengan mudah dipisahkan dari bagian badan wadah tanpa terjadi serpihan-serpihan gelas. Sesudah dibuka, obat dapat dihisap ke dalam alat sungtik dengan menggunakan jarum hipodermik. Gelas yang digunakan dalam pengemasan sediaan farmasi digolongkan ke dalam 4 golongan.

Tabel 3.1. Tipe gelas yang digunakan sebagai bahan pengemasan obat dan aplikasinya

Gelas

Komposisi

Sifat-sifat

Aplikasi

Tipe I

Borosilikat

Resistensi terhadap hidrolisis tinggi,eksporasi termal rendah

Sediaan parenteral asidik dan netral, bisa juga untuk sediaan alkali yang sama

Tipe II

Kaca soda kapur (diperlukan dealkalisasi)

Resistensi hidrolitik relatif tinggi

Sediaan parenteral asidik dan netral, bisa juga untuk sediaan alkalin yang sesuai

Tipe III

Kaca soda lapur (tidak mengalami perlakuan

Sama dengan tipe II, tapi dengan pelepasan oksida

Cairan anhidrat dan produk kurang, sediaan parenteral jika sesuai

Tipe NP

Kaca soda kapur (penggunaan umum)

Resistensi hidrolitik sangat rendah

Hanya digunakan untuksediaaan non parenteral (oral, tipikal, dsb)

(Sumber : Amilina et al, 2012)

Tipe I umumnya merupakan gelas yang paling tahan dari keempat kategori yang ada (Ansel, 1989). Sediaan yang akan diberikan secara parental harus jernih, berkilauan, bebas dari semua zat-zat khusus dan pengotor, seperti debu, serat baju, serpihan gelas, dan sebagainya. Untuk mencegah masuknya partikel yang tidak diinginkan ke dalam produk, sejumlah tindakan pencegahan harus dilakukan selama proses pembuatan dan penyimpanan. Misalnya, larutan sediaan disaring terlebih dahulu sebelum dimasukkan ke dalam wadah kemasan.

Proses pengemasan diawali dengan pembersihan, pencucian, dan sterilisasi. Pada umumnya, ampul kosong dipasarkan dalam keadaan terbuka yang memiliki leher yang lebar untuk memudahkan pembersihan dan pengisian. Di dalam industri, biasanya terdapat mesin pembersih ampul yang bersifat semiotomatis dan otomatis. Pencucian otomatis dilakukan dengan cairan pencuci yang memiliki suhu 8C dan bertekanan tinggi (0,4 MPa). Setelah dilakukan penyemprotan dengan cairan pencuci, pada umumnya proses pembersihan diikuti dengan dua kali pencucian dengan air pada tekanan yang sama dan diakhiri dengan pencucian dengan air suling (Voight, 1995).

Gambar 3.2. Diagram alir pengemasan dan penyimpanan obat

Sesudah itu, dilakukan proses pengisian dan penyegelan ampul. Proses pengisian dilakukan dengan alat torak pengisi yang bekerja secara manual atau elektris. Melalui gerakan lengannya, larutan yang akan diisikan dihisap oleh sebuah torak ke dalam penyemprot penakar, kemudian pengisian dilakukan dengan gerakan lengan yang sebaliknya (Voight, 1995). Proses penyegelan dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu peleburan dan tarikan. Cara pertama, penyegelan dilakukan dengan diberikannya semburan nyala api pada leher ampul yang terbuka dan ampul ditutup dengan mambakar salah satu bagian leher sambil dilakukan pemutaran ampul secara kontinu. Cara kedua, tarikan dilakukan oleh alat penutup ampul otomatis.

Selanjutnya, dilakukan pelabelan pada ampul. Label pada umumnya berisi nama obat, spesifikasi, serta cara penggunaan dan penyimpanannya. Kemasan dapat dimasukkan ke dalam kemasan sekunder, misalnya kardus karton dan dapat disimpan di dalam final warehouse sebelum didistribusikan ke konsumen. Pemilihan kardus karton dilakukan dengan alasan bahan yang digunakan untuk pengemasan primer bersifat rentan. Dengan dimasukkan ke dalam kardus, resiko adanya ampul yang pecah dapat dikurangi. Selain itu, pengemasan sekunder dilakukan untuk mempermudah distribusi.

REFERENSI

A, Shulda Abhinav dan Jorg Thommes. 2010. Recent advences in large-scale production of monoclonal antibodies and related proteins. Trends in Biotechnology, Cell Press, Vol 28, (25), p. 253-261, Maret 2010.

A, Shulda Abhinav dan Uwe Gottschalk. 2013. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology, Cell Press, Vol 31, (3), p. 147-154, Maret 2013

Fibriansah, Guntur, et al. 2013. A potent anti-dengue human antibody preferentially recognizes the conformation of E protein monomers assembled on the virus surface. EMBO Molecular Medicine, Vol 6, (3), p. 358-371, Agustus 2013.

Warehouse

Pengisian dan penyegelan (Filling and Sealing)

Labelling

Pengemasan sekunder

(Packaging)

Pencucian dan Sterilisasi

Final Warehouse

8