Nur Hidayati

12
PENENTUAN TIAMIN, RIBOFLAVIN, DAN PIRIDOKSIN DALAM BERAS DENGAN HPLC SECARA SERENTAK Nur Hidayati* ABSTRAK PENENTUAN TIAMIN, RIBOFLAVIN, DAN PIRIDOKSIN DALAM BERAS DENGAN I1PLC SECARA SERENTAK. Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan metorle analisis tiamin, riboflavin, dan piridoksin secara serentak agar Icbih sederhana, mudah, dan cepal dengan HPLC. Kolom yang digunakan adalah p-Bondapak CI8, detektor ultra violet pada panjang gelombang 254 nm, dengan eluen campuran metanoi/larutan bufer asetat pad a pH 3,6 (15 + 85) dengan penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat. Kondisi HPLC yang digunakan adalah kecepatan aliran 1,5 ml/menit, kecepatan kertas 0,5 cm/menit, dan kepekaan 0,05, dapal memberikan hasil pemisahan puncak-puncak piridoksin, tiamin, dan riboflavin dengan baik. Analisis secara kuantitatif dari piridoksin, tiamin, dan riboflavin memerlukan waktu tidak lebih dari 20 men it. Hasil recovery dari piridoksin, tiamin, dan riboflavin masing-masing adalah 92%,82%, dan 56%. ABSTRACT SIMULTANEOUS DETERMINATION OF THIAMINE, RIBOFLAVIN ANI> I)YRI- I>OXINE IN RICE UY IIIGHI)ERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY. This study was done to develope a simple, easy and rapid method of analysis for simultaneous determination of thiamine, riboflavin and pyridoxine in rice using HPLC. The column used was p-Bondapak C 18 and detection was done using a ultra violet detedor at 254 nm. The mobile phase was a mixture of metha- nol-acetate buffer (15 + 85) pH 3,6 with the addition of 0,005 M I-heptane sulphonic acid sodium salt. The most satisfadory separation of pyridoxine, thiamine and riboflavin peaks was obtained at flow rate 1.5 ml/min, chart speed 0.5 cm/min, and sensitivity 0,05. Quantitative analysis of the three vitamins could be done in less than 20 minutes. Recoveries of pyridoxine, thiamine, and riboflavin were 92%, 82 %, and 56%, respectively. PENDAHULUAN Vitamin 8 merupakan suatu molekul organik yang tidak termasuk dalam golongan protein, karhohidrat atau lemak. Vitamin 8 terdapat dalam jumlah yang kedl dalam hahan makanan, namun sangat penting peranannya hagi heberapa fungsi tertentu dalam tubuh, yaitu untuk proses metabolisme dan pertumbuhan yang normal (I). Vitamin tersebut tidak dapat dibuat oleh tubuh dalam jumlah yang cukup. Oleh karena itu, harus diperoleh dari bahan pang an yang dikonsumsi misalnya beras. Kamlungan vitamin 81 atau tiamin dalam beras giling sekitar 0,12 mg/1 00 g sam pel dan dalam beras merah sekitar 0,21 mg/ 100 g sampel (2), at au antara 100 * Pusat Aplikasi IsotoI' Jan Radiasi, ~ATAN III

Transcript of Nur Hidayati

Page 1: Nur Hidayati

PENENTUAN TIAMIN, RIBOFLAVIN, DAN PIRIDOKSIN DALAM BERASDENGAN HPLC SECARA SERENTAK

Nur Hidayati*

ABSTRAK

PENENTUAN TIAMIN, RIBOFLAVIN, DAN PIRIDOKSIN DALAM BERASDENGAN I1PLC SECARA SERENTAK. Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan metorleanalisis tiamin, riboflavin, dan piridoksin secara serentak agar Icbih sederhana, mudah, dan cepaldengan HPLC. Kolom yang digunakan adalah p-Bondapak CI8, detektor ultra violet pada panjanggelombang 254 nm, dengan eluen campuran metanoi/larutan bufer asetat pad a pH 3,6 (15 + 85)dengan penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat. Kondisi HPLC yang digunakanadalah kecepatan aliran 1,5 ml/menit, kecepatan kertas 0,5 cm/menit, dan kepekaan 0,05, dapalmemberikan hasil pemisahan puncak-puncak piridoksin, tiamin, dan riboflavin dengan baik. Analisissecara kuantitatif dari piridoksin, tiamin, dan riboflavin memerlukan waktu tidak lebih dari 20 men it.Hasil recovery dari piridoksin, tiamin, dan riboflavin masing-masing adalah 92%,82%, dan 56%.

ABSTRACT

SIMULTANEOUS DETERMINATION OF THIAMINE, RIBOFLAVIN ANI> I)YRI­I>OXINE IN RICE UY IIIGHI)ERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY. This study wasdone to develope a simple, easy and rapid method of analysis for simultaneous determination ofthiamine, riboflavin and pyridoxine in rice using HPLC. The column used was p-Bondapak C 18 anddetection was done using a ultra violet detedor at 254 nm. The mobile phase was a mixture of metha­nol-acetate buffer (15 + 85) pH 3,6 with the addition of 0,005 M I-heptane sulphonic acid sodium salt.The most satisfadory separation of pyridoxine, thiamine and riboflavin peaks was obtained at flow rate1.5 ml/min, chart speed 0.5 cm/min, and sensitivity 0,05. Quantitative analysis of the three vitaminscould be done in less than 20 minutes. Recoveries of pyridoxine, thiamine, and riboflavin were 92%,82 %, and 56%, respectively.

PENDAHULUAN

Vitamin 8 merupakan suatu molekul organik yang tidak termasuk dalam

golongan protein, karhohidrat atau lemak. Vitamin 8 terdapat dalam jumlah yang

kedl dalam hahan makanan, namun sangat penting peranannya hagi heberapa fungsi

tertentu dalam tubuh, yaitu untuk proses metabolisme dan pertumbuhan yang normal

(I). Vitamin tersebut tidak dapat dibuat oleh tubuh dalam jumlah yang cukup. Oleh

karena itu, harus diperoleh dari bahan pang an yang dikonsumsi misalnya beras.

Kamlungan vitamin 81 atau tiamin dalam beras giling sekitar 0,12 mg/1 00 g

sam pel dan dalam beras merah sekitar 0,21 mg/ 100 g sampel (2), at au antara 100

* Pusat Aplikasi IsotoI' Jan Radiasi, ~ATAN

III

Page 2: Nur Hidayati

dan 1000 JLg/IOO g sampel, riboflavin antara 10 dan 100 JLg/lOO g sampel, dan

pirido~~in untrrrrr 1000 dnn 10.000 ~2f100 2 ~JmD~10).Peneliti terdahulu telah mempelajari pengawetan beras dengan iradiasi

gamma (4). Dalam rangka pengawetan beras dengan iradiasi gamma perlu diketahui

pengaruh iradiasi terhadap vitamin .B yang dikandungnya di antaranya vitamin B Iatau tiamin, vitamin B2 atau ribotlavin dan vitamin B6 atau piridoksin. Untukmenentukan kandungan tiamin, riboflavin, dan piridoksin dalam beras perlu dikem­bangkan metode yang sederhana, mudah dan cepat, serta dapat ditentukan secaraserentak.

SOEYONO (5) telah mengembangkan metode pengukuran riboflavindengan cara spektrofluorometri pada panjang gelombang eksitasi 440 nm danpanjang gelombang emisi 565 nm, SOEYONO dan PAMUNTJAK (6) telahmengembangkan pula pengukuran tiamin dengan cara spektrofluorometri padapanjang gelombang eksitasi 365 nm dan panjang gelombang emisi 435 nm. Peng­ukuran secara spektrofluorometri tidak dapat dilakukan secara serentak bila dalam

larutan terdapat campuran tiamin, riboflavin dan piridoksin. Salah satu metode yangdapat digunakan ialah dengan cara kromatograti cair atau High Performance LiquidChromatography (HPLC).

AUGUSTIN (7) telah mengembangkan metode pengukuran dengan caraHPLC untuk tiamin dan ribotlavin. Detektor yang digunakan adalah tluoresensidengan panjang gelombang eksitasi 360 nm dan panjang gelombang emisi 415 nm,sedangkan WEHLING dan DAVID (8) melakukan pengukuran tiamin, riboflavindan piridoksin secara HPLC dengan detektor fluoresensi dengan panjang gelombangeksitasi 288 nm dan panjang gelombang emisi 444 nm.

KAMMAN dkk. (9) telah mengembangkan metode pengukuran tiamin danriboflavin dengan metode yang sederhana, mudah, dan cepat, yaitu dengan HPLC,dengan detektor ultra violet yang bekerja pada panjang gelombang 254 nm. FUK­LUEN LAM dkk. (10) telah dapat menentukan asam askorbat, niasinamide, tiamin,riboflavin, dan piridoksin dengan HPLC, dan detektor ultra violet (uv). Untukanalisis asam askorbat ditentukan pada panjang gelombang 254 nm, sedangkan untukanalisis vitamin yang lainnya ditentukan pada panjang gelombang 280 nm. Penen­tuan vitamin B6 atau piridoksin telah pula dikembangkan oleh VANDERSLICE dkk.(II) dengan cara HPLC dengan detek-tor tluoresensi.

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode pengukuran tiamin,riboflavin dan piridoksin dalam beras dengan cara HPLC dengan menggunakandetektor uv pada panjang gelombang 254 nm dan dengan kolomn jL-Bondapak C 18.

BAlIAN DAN METODE

Bahan. Vitamin yang digunakan sebagai standar adalah tiaminhidroklorida(BDH), ribotlavin dan piridoksin (E. MERCK). Bahan kimia lain yang digunakan

112

Page 3: Nur Hidayati

ialah trietilamin (Ajax Chemical), garam natrium I-heptan asam sulfonat (BOH),metanol untuk HPLC, asam asetat, natrium asetat, dan asam trikloroasetat (E.MERCK). Sampel beras yang digunakan ialah beras giling cianjur rojolele dan berasmerah .

Peralatan. Pada penelitian ini digunakan alat HPLC buatan Waters Associ­ates model 441 Absorbance detektor. Kolom yang digunakan adalah wBondapakC18 (4mm x 30 em).

Eluen. Pada penelitian ini digunakan eluen dengan berbagai perbandinganeampuran antara metanol dan larutan bufer asetat pH 3,6 yaitu 20%, 15%, dan 10%dengan dan tanpa penambahan garam natrium I-heptan asam sulfonat.

Pembuatan Larutan Rufer Asetat. Ke dalam labu takar 1 titer yang telahberisi aquabidest dimasukkan berturut-turut sebanyak 24 ml asam asetat p.a. dan 5,0ml trietilamin, lalu ditepatkan menjadi 1 liter dengan aquabidest. Penepatan pH 3,6diatur dengan menambahkan asam asetat atau trietilamin.

Penyiapan Standar dan Kurva Kalibrasi Vitamin. Standar tiamin, ribofla­vin, dan piridoksin dengan konsentrasi yang paling tinggi masing-masing 10 ppm,10 ppm, dan 25 ppm dan konsentrasi yang terendah ialah 1 ppm, 1 ppm dan, 2,5ppm dilarutkan dalam HCI 0, I N. Oari data yang diperoleh dibuat kurva kalibrasistandar seperti tertera dalam Gambar 4. Sumbu X ialah konsentrasi standar vitamindalam ppm, dan sumbu Y ialah tinggi puneak dalam em.

Penentuan Recovery Standar Vitamin. Ke dalam larutan sampel berasditambahkan standar vitamin dengan konsentrasi tertentu, dan dibandingkan denganlarutan sampel beras tanpa penambahan standar vitamin. Berdasarkan perbedaankonsentrasi yang diperoleh dari hasil analisis HPLC standar vitamin tersebut, dapatditentukan harga recovery masing-masing standar vitamin.

Penyiapan Sampel. Beras giling eianjur rojolele dan beras merah masing­masing ditumbuk dengan mortar porselen hingga halus. Kemudian ditimbangmasing-masing 10 gram, ditambah 10 ml HCI 0,1 N dan dibiarkan semalam padasuhu 35°C. Bubur tepung beras tersebut ditambah natrium asetat 2,5 M sebanyak 5ml, selanjutnya diinkubasi pada suhu 42°C, selama 2 jam. Kemudian ditambah 2 mlTCA 50% dan diinkubasi pada 42°C selama 2 jam. Bubur tepung beras tersebutdisentrifus dan diambil filtratnya, lalu disaring dan diinjeksikan pada HPLC.

Analisis dengan HPLC. Kondisi HPLC yang digunakan adalah laju aliran1,5 ml/menit, kecepatan kertas 5 cm/l0 menit dan kepekaan 0,05. Untuk analisissecara kuantitatif dibuat kurva kalibrasi larutan standar dengan plot tinggi puncak(em) terhadap konsentrasi (ppm).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pellgaruh Eluen Terhadap Hasil Pemisahan. Pada penelitian ini digllnakan

herhagai perbandingan campllran eluen antara metanol/asetonitril dengan larlltan

113

Page 4: Nur Hidayati

bufer asetat pH 3,6 tanpa penambahan garam natrium I-heptan asam sulfonat. Dari

hasil kromatogram yang diperoleh ternyata puncak-puncak tiamin, riboflavin danpiridoksin tidak terpisah. Hal ini mungkin disebabkan ketiga vitamin tersebutmempunyai sifat kimia seperti kestabilan, kepolaran, dan keasaman yang karakteris­tik. Untuk mendapatkan pemisahan puncak tiamin, riboflavin, dan piridoksin yangbaik, perlu diperhatikan pemilihan eluen dengan pH yang sesuai. Banyak sekalipelarut yang dapat digunakan sebagai fase mobil, dengan syarat utama yang harusdiperhatikan, yaitu komponen-komponen dalam sampel harus dapat larut denganbaik dalam fase mobil tersebut. Pada waktu pemilihan pelarut yang akan dipakaisebagai fase mobil perlu diperhatikan kepolarannya. Pada perbandingan elueneampuran metanol dan larutan bufer asetat (pH 3,6) 20% dengan penambahan 0,005M garam natrium I-heptan asam sulfonat, terjadi pemisahan puncak-puncak tiamin,riboflavin, dan piridoksin, namun kurang baik karena puneak-puncak ketiga vitamintersebut jaraknya berdekatan, atau waktu yang dilalui sejak sampel diinjeksikansampai tereatatnya respons maksimum (tR) ketiga vitamin tersebut berdekatan(Gambar I). Pada perbandingan eluen 10%, terjadi pemisahan yang eukup baik,namun tR ketiga vitamin tersebut eukup jauh, sehingga memerlukan waktu yanglama dan kurang efisien (Gambar 2). Pada perbandingan eluen 15%, terjadi pemi­sahan yang cukup baik dengan waktu retensi (tR) tiamin, riboflavin dan piridoksinmasing-masing 4,8; 9,6; dan 19,0 menit (Gambar 3).

Kurva Kalibrasi Standar Vitamin. Pada penelitian ini diperoleh persamaanlinier untuk piridoksin, tiamin, dan riboflavin berturut-turut sebagai berikut Y =0,1294 X, Y = 0,5608 X, dan Y = 0,3700 X (Y ialah tinggi puneak standarvitamin dalam em, dan X ialah konsentrasi standar vitamin dalam ppm). Kurvakalibrasi piridoksin, tiamin, dan riboflavin dapat dilihat pada Gambar 4.

Kandungan Tiamin, Riboflavin, dan Piridoksin dalam Beras. Hasil kro­matogram dari sam pel beras dapat dilihat pada Gambar 5 & 6. Kandungan ketigavitamin dalam sampel beras yang diperoleh pada pereobaan ini dapat dilihat padaTabel I. Nilai yang diperoleh masuk dalam kisaran nilai yang tertera dalam Hand­book of Vitamins and Hormones (3) dan hampir sam a dengan hasil analisis yangdiperoleh oleh SOEYONO dkk (5,6). Hasil recovery yang diperoleh pada analisisini ialah tiamin dan piridoksin masuk dalam kisaran nilai 80 dan 100 %, sedangkanriboflavin hanya 56%. Kandungan riboflavin dalam sampel beras giling cianjurrojolele tidak terdeteksi (Gambar 6). Kelebihan analisis dengan cara ini ialah ketigavitamin tersebut dapat diukur seeara serentak, sehingga lebih mudah dan eepat.

KESIMPULAN

Penentuan piridoksin, tiamin, dan riboflavin dalam beras dapat dilakukansecara serentak dengan eara HPLC menggunakan kolom I1-Bondapak C 18, detektorultra violet pada panjang gelombang 254 nm, dan eluen yang digunakan adalah

114

Page 5: Nur Hidayati

campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (15 + 85) dengan menambahkan0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat. Pada kondisi tersebut piridoksin,tiamin, dan ribotlavin terpisah baik dengan waktu retensi (tR) berturut-turut 4,8menit, 9,5 menit, dan 19,0 menit.

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terima kasih disampaikan kepada Ibu Surtipanti yang telah memban­tu penulisan ini, dan kepada semua pihak yang telah membantu, sehingga percobaanini terlaksana dengan baik.

PUSTAKA

1. WINARNO, EG., Kimia Pang an dan Gizi, Gramedia, Jakarta (1984).

2. SOEDARMO, P., dan SEDlAOETOMO, A.D., Masalah Gizi dan Perbaikan­nya, Dian Rakyat, Jakarta (1974).

3. ROMAN J. KUTSKY, Handbook of Vitamins and HORMONES, Van Nostrand.Reinhold Company, New York, Cincinnati, Toronto, London, Melbourne(1973).

4. ANONIM, "Penelitian Pengawetan Beras dengan Radiasi Sinar Gamma",(Laporan Akhir Kerjasama BULOG-BATAN), P2PsD/39/1970.

5. SOEYONO, "Pengaruh Radiasi Sinar Gamma Co-60 terhadap Riboflavin dalamBeras", P2PsD/54/1971.

6. SOEYONO dan PAMUNTJAK, M., "Pengaruh Radiasi (Co-60) pada thiaminBeras" P2PsD/33/1970.

7. AUGUSTIN, 1., Simultaneous determination of thiamine and ribotlavin in foodsby liquid chromatography, J. AOAC, 67 (1984) 1012.

8. WEHLING RANDY, L. and WETZEL DAVID, L., Simultaneous determina­

tion of pyridoxine,riboflavin and thiamine in fortitied cereal products by high­performance liquid chromatography, J. Agric. Food Chern., J1 (1984) 1326.

9. KAMMAN, J.E, LABUZA, T.P. and WARTHESEN, Thiamine and riboflavinanalysis by high performance liquid chromatography, J. Food Science, 45(1980) 1497.

10. FUK-LUEN LAM, IRA J. HOLCOMB, and FUSARI A. SALVATORE,Liquid chromatographic assay of ascorbic acid, niacinamide, pyridoxine,thiamine, and ribotlavin in multivitamin-mineral preparation, J. AOAC, 67(1984) 1007.

115

Page 6: Nur Hidayati

II. VANDERSLICE, J.T., BROWNLEE R. STELLA, and CORTISSOZ E.

MARIANN, Liquid chromatographic determination of vitamin B6 in foods, J.AOAC, 67 (I 984) 9997.

Tabel 1. Kandungan vitamin B1, B2, dan B6 dalam sampel berasgiling cianjur rojolele dan beras merah

Kandungan vitamin, ug/100 9 sampelSampel

Beras gilingcianjur rojolele

Beras merah

Bl

221,83

406,65

B2

tt

164,09

B6

2284,79

7568,38

Basil rata-rata dari 3 ulangan percobaan.tt = tidak terdeteksi.

1]6

Page 7: Nur Hidayati

~cOUc::='0..

050I'n 2 I ':1

0.0 c::F=

Waktu retensi

Gambar 10 Hasil kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluencampuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (20 + 80) denganpenambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat

(1) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribotlavin

117

Page 8: Nur Hidayati

I ~

::::

/.

"

I/:3

Ii

I

,

'I

I

I

i

,00

..>C'"~==c.~~=

E=

,f

: .~4r

I

! Ii I

~ J ' _

Waktu retensi

~ --------

Gambar 2. HasH kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluencampuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (10 + 90) denganpenambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat

(I) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribot1avin

Page 9: Nur Hidayati

2

A~--------- ----------

Waktu retensi

Gambar 3. Hasil kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluencampuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (15 + 85) denganpenambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat

(1) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribotlavin

Page 10: Nur Hidayati

No

7,0

,.......

E 6,0u '---'..10::

5,0:'<:S

Uc:::::s 4,0a..~OJ)c:: 3,0E=,

2,01,00

5,0 10,0 15,0

Konsentrasi (ppm)

20,0 25,0

Gambar 4. Kurva kalibrasi standar tiamin, ribotlavin, piridoksin

(A) piridoksin, (D) tiamin, dan (A:) ribotlavin

Page 11: Nur Hidayati

Waktu retensi

Gambar 5. HasH kromatogram sampel beras merah

(1) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribotlavin

121

Page 12: Nur Hidayati

-- \,~ j (J,'- \.'--- "------------ __0' __

Waktu retensi

122

Gamhar 6. Hasil kromatogram sampel beras giling Cianjur Rojolele

(I) piridoksin, (2) tiamin, dan (3) ribotlavin