naskah yudisium - Sanata Dharma UniversityTitle Microsoft Word - naskah yudisium.docx Created Date...

EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum indicum L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)

MELALUI REGULASI BCL-2

SKRIPSI Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

!

Diajukan oleh: Maria Nareswari NIM: 138114002

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

! i!

EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum inicum L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)

MELALUI REGULASI BCL-2

SKRIPSI Dijalankan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

!

Diajukan oleh: Maria Nareswari NIM: 138114002

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2017


! iv!

HALAMAN PERSEMBAHAN

And$when$you$want$something,$all$the$universe$conspires$in$helping$

you$to$achive$it$–$Paulo$Coelho$“The$Alchemist”$

$

Saat>saat$yang$luar$biasa$sulit$dalam$perjuangan$adalah$pertanda$

bahwa$kesuksesan$sudah$mendekat$–$Merry$Riana$

$ $


! vii!

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Kuasa penulis panjatkan atas segala berkat, rahmat,

dan limpahan kasih-Nya yang luar biasa sehingga penulis dapat menyelesaikan naskah

skripsi yang berjudul “Ekstrak etanolik bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) sebagai

agen kemopreventif terhadap sel kanker serviks HeLa melalui regulasi Bcl-2” sebagai syarat

memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulisan skripsi ini mendapat dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, sehingga penulis

mengucapkan terima kasih kepada :

1.! Ibu Dr. Riris Istighfari Jenie, M.Si., Apt, selaku dosen pembimbing skripsi yang telah

banyak membantu dalam berbagai ilmu, pengetahuan, dan wawasan, serta bersedia

meluangkan waktu, tenaga dan pikiran untuk berdiskusi dan mengarahkan serta

memberi semangat dan meyakinkan penulis dalam penyusunan skripsi ini.

2.! Ibu Dr. Erna Tri Wulandari., Apt., dan Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku

dosen penguji atas semua saran, dan dukungan yang membangun.

3.! Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma yang telah memberikan izin kepada peneliti.

4.! Komisi Etik Universitas Gadjah Mada, yang telah memberikan ijin untuk melakukan

penelitian.

5.! Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah memberikan

ilmu pengetahuan dan bimbingan kepada penulis selama proses perkuliahan.

6.! Bapak Wagiran selaku laboran di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia di Universitas

Sanata Dharma dan Ibu Atin selaku laboran di Laboratorium Parasitologi Universitas

Gadjah Mada yang telah membantu peneliti selama melakukan penelitian di

laboratorium.

7.! Bapak Angelo Karmayogi, Ibu Maudy Maria, Adikku Maria Sekartaji, dan seluruh

keluargaku sumber semangat, yang selalu berdoa, memberikan kasih sayang dan cinta,

dukungan, perhatian, kesabaran dalam membimbing penulis dari awal hingga

berakhirnya penulisan ini.

8.! Teman-teman seperjuangan skripsi Fira Elsa Septiana dan Lela Fransisca Adi Liana

yang selalu berjuang bersama dan saling memberikan semangat.

9.! Sahabat-sahabat yang selalu menemani dalam organisasi maupun proses perkuliahan

Enggar, Kenny, Liana, Atika, Axl, Santi, Agnes dan seluruh teman-teman FSMA dan

FKKA atas semua hiburan dan selalu mengingatkan penulis selama ini.


! viii!

10.! Sahabat dan teman bermain Nonik, Feli, Raviano yang selalu membantu dan selalu ada

bagi penulis serta memberikan semangat untuk menyelesaikan skripsi ini.

11.! Teman-teman FSM A 2013, FKK A 2013 dan semua angkatan 2013 yang telah

bersama-sama berproses dan berbagi suka duka di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

12.! Semua pihak yang telah membantu penulis, yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan serta masih

jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran

yang membangun dari semua pihak. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat

bermanfaat bagi semua pihak terutama di bidang ilmu farmasi.

Yogyakarta, 31 Januari 2017

Penulis


! ix!

EKSTRAK ETANOLIK BUNGA KRISAN (Chrysanthemum indicum L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa)

MELALUI REGULASI BCL-2 Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Kampus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman, Yogyakarta, Indonesia 55282

Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529 [email protected]

ABSTRAK

Kanker serviks memiliki karakter ekspresi berlebih pada protein Bcl-2 sehingga

dapat menghambat proses apoptosis. Cisplatin merupakan obat lini pertama pada kemoterapi kanker serviks, namun dewasa ini terjadi meningkatnya resistensi cisplatin yang dapat menyebabkan kegagalan pada kemoterapi. Bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) merupakan salah satu tanaman yang memiliki kandungan myricetin, salah satu flavonoid yang memiliki aktivitas kemoprevensi. Penelitian ini bertujuan untuk untuk melihat penghambatan ekstrak etanol bunga krisan terhadap viabilitas sel HeLa melalui uji sitotoksik menggunakan metode MTT, uji flowcytometry Annexin V Flous untuk melihat potensi ekstrak etanol bunga krisan dalam menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan penghambatan terhadap protein Bcl-2 dianalisis secara semi kuantitatif menggunakan metode imunositokimia. Hasil uji sitotoksik terhadap sel HeLa dengan metode MTT pada ekstrak etanol bunga krisan menunjukkan efek sitotoksik lemah pada nilai IC50 700 µg/mL, dan mampu menginduksi apoptosis sebesar 59% pada konsentrasi ½ IC50 (350 µg/mL) pada uji flowcytometry. Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan mampu menekan ekspresi protein Bcl-2 dengan kuat pada konsentrasi 125 µg/mL. Hasil ini menunjukkan ekstrak etanol bunga krisan memiliki efek sitotoksik lemah dan menyebabkan kematian secara apoptosis salah satunya dengan menekan ekspresi protein Bcl-2.

Kata kunci: Kanker serviks, Bcl-2, Chrysanthemum indicum L, sel HeLa


! x!

Chrysanthemum indicum L. ETANOLIC EXTRACT AS CHEMOPREVENTION AGENT TOWARDS HeLa CANCER CELLS THROUGH BCL-2 REGULATION

Faculty of Pharmacy Sanata Dharma University, Campus III Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman,

Yogyakarta, Indonesia 55282 Telp. (0274) 883037, Fax. (0274) 886529

[email protected]

ABSTRACT

Cervical caner has a character of over expression of Bcl-2 protein that could be inhibit apoptosis. Cisplatin is the first line medication for cervical cancer chemotherapy, eventually nowadays cisplatin resistance leads to the failure of chemotherapy. Chrysanthemum indicum L. flowers is one of many plants that contain myricetin one of flavonoids that has chemoprevention activity. The aim of this study is to determine the chemoprevention activity of Chrysanthemum indicum L etanolic extract towards HeLa cervical cancer cells with MTT to see HeLa viability, followed by flowcytometry with Annexin V Flous to analyze the activity of Chrysanthemum indicum L etanolic extract that undergo apoptotic cell and the expression of Bcl-2 is being analyzed using immunocytochemistry. Chrysanthemum indicum L etanolic extract shows weak cytotoxic activity on HeLa with IC50 of 700 µg/mL and induced 59% apoptosis at 350 µg/mL, as determined by flowcytometry. Imunocytochemistry shows that Chrysanthemum indicum L etanolic extract at 125 µg/mL reduce the expression of Bcl-2 firmly. Result shows that Chrysanthemum indicum L etanolic extract shows weak cytotoxic activity and cause death with an apoptotic pathway by reduce the expression of Bcl-2.

Keywords: Cervical cancer, Bcl-2, Chrysanthemum indicum L, HeLa cells.


! xi!

DAFTAR ISI

!

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. ii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................ . iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................. v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................................. vi

PRAKATA .......................................................................................................... vii

ABSTRAK .......................................................................................................... ix

ABSTRACT .......................................................................................................... x

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv

PENDAHULUAN .............................................................................................. 1

METODOLOGI PENELITIAN .......................................................................... 2

Bahan penelitian ............................................................................................. . 2

Alat penelitian ................................................................................................ . 2

Determinasi dan ekstraksi .............................................................................. . 3

Pembuatan Larutan Uji .................................................................................. . 3

Panen Sel ........................................................................................................ . 3

Uji Sitotoksik dengan MTT ........................................................................... . 4

Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ........................................................... . 4

Uji Imunositokimia ........................................................................................ . 4

Analisis Hasil ................................................................................................. . 5

Analisis Nilai IC50 ..................................................................................... . 5

Analisis Uji Apoptosis ............................................................................... . 5

Analisis Uji Imunositokimia ..................................................................... . 6

HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 6

Determinasi dan Ekstraksi Bunga Krisan ...................................................... . 6

Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa dengan MTT ......... . 7

Uji apoptosis dengan Flowcytometry ............................................................. . 9


! xii!

Uji Imunositokimia ........................................................................................ . 11

KESIMPULAN ................................................................................................... 13

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 14

LAMPIRAN ........................................................................................................ 17

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................ 26

!! !


! xiii!

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil Uji Apoptosis Menggunakan Flowcytometry dengan

Pewarnaan Annexin V Flous ........................................................... 9

Tabel II. Distribusi Ekpresi Bcl-2 pada Sel HeLa dengan Berbagai

perlakuan .......................................................................................... 11


! xiv!

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Morfologi sel HeLa ......................................................................... 7

Gambar 2. Efek sitotoksik cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap

sel HeLa ........................................................................................... 7

Gambar 3. Hasil induksi apoptosis cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan

terhadap sel HeLa ............................................................................. 9

Gambar 4. Efek perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap

ekspresi Bcl-2 terhadap sel HeLa ..................................................... 10


! xv!

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar bunga krisan yang digunakan dan proses ekstraksi .......... 18

Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay ...................................................... 19

Lampiran 3. Dokumentasi Uji Apoptosis ........................................................... 20

Lampiran 4. Dokumentasi Uji Imunositokimia .................................................. 23

Lampiran 5. Surat keterangan hasil determinasi tanaman krisan ........................ 24

Lampiran 6. Surat Ethical Clearance .................................................................. 25


! 1!

PENDAHULUAN

Kanker serviks berkembang menjadi masalah kesehatan bagi wanita di Indonesia

yaitu dengan prevalensi kedua tertinggi setelah kanker payudara. (Nuranna et al., 2015).

WHO (2015) juga menyebutkan bahwa kanker serviks menduduki urutan keempat pada

kanker yang sering terjadi pada wanita di belahan benua Australia, Eropa, Asia dan Afrika.

Kanker serviks disebabkan oleh infeksi HPV (Human Papiloma Virus) 18 dan 16 sehingga

terjadi gangguan pada regulasi sel. HPV 16 dan 18 mengekspresikan protein E6 dan E7 yang

memiliki kemampuan untuk menekan aktivitas p53 sebagai tumor suppressor gen. Hal itu

menyebabkan protein pro-apoptosis (Bax dan Bad) yang di aktivasi oleh sinyal dari p53

menjadi tidak aktif, sehingga muncul ekspresi berlebih dari protein anti-apoptosis (Bcl-xL

dan Bcl-2) yang menyebabkan terjadinya kanker (Kho et al., 2013)

Pengobatan kanker serviks yang dilakukan selama ini adalah dengan terapi radiasi,

kemoterapi, dan terapi dengan antibodi monoklonal. (National Cancer Institute, 2015).

Cisplatin merupakan salah satu agen kemoterapi untuk kanker serviks, namun dewasa ini

dengan meningkatnya resistensi cisplatin sering menyebabkan kegagalan pada kemoterapi.

Peningkatan dosis cisplatin untuk mengatasi resistensi terbukti tidak efektif karena pasien

akan mengalami dose-dependent toxicity dan kerusakan jangka panjang pada ginjal serta

menyebabkan terjadinya ototoksisitas yang akan menyebabkan penurunan kualitas hidup

pada pasien (Leisching et al., 2015). Maka dibutuhkan agen kemopreventif untuk mencegah

berkembangnya kanker serviks sedini mungkin.

Kemopreventif merupakan senyawa alami atau sintesis yang dapat menghambat dan

mencegah perkembangan kanker. Tujuan utama dari penggunaan agen ini adalah

menurunkan angka kejadian kanker dan mencegah terjadinya kanker. Agen kemopreventif

juga memliki target molekuler, yaitu protein anti apoptosis, jalur aktivasi angiogenesis, dan

protein inflamasi seperti COX-2. (Sharma et al., 2012). Bunga krisan (Chrysanthemum

indicum L.) berpotensi untuk dikembangkan menjadi agen kemopreventif pada kanker

serviks karena mengandung myricetin, salah satu flavonoid yang dapat menurunkan regulasi

dari protein anti-apoptosis yaitu Bcl-2, dan meningkatkan regulasi dari protein pro-apoptosis

yaitu Bax (Kim et al., 2014). Bcl-2 merupakan protein membran intraseluler yang mencegah

terjadinya apoptosis sehingga dapat memperpanjang masa hidup sel dan mengakibatkan

terjadinya kanker (Chipuk et al, 2008). Li et al (2009) berhasil mengekstrak bunga krisan

dengan etanol 95% dan ekstrak tersebut mampu menghambat proliferasi pada sel kanker

hepar manusia (MHCC97H) dengan selektif, yaitu tidak bersifat toksik terhadap sel


! 2!

hepatosit tikus dan sel endothelial manusia (ECV304).

Penelitian ini dirancang untuk mengetahui potensi kemoprevensi bunga krisan yang

diekstrak dengan etanol 95% pada sel kanker serviks HeLa, yaitu sel serviks yang memiliki

gen p53 dengan tipe wild type. Infeksi HPV 18 pada sel HeLa meyebabkan penurunan pada

fungsi p53 pada HeLa sehingga aktivitas induksi apoptosis pada sel HeLa menjadi terganggu

(Kho et al., 2013). Mekanisme aksi ekstrak bunga krisan diamati melalui uji sitotoksik,

induksi apoptosis dan imunositokimia pada protein regulator apoptosis Bcl-2. Hasil dari

penelitian ini diharapkan peneliti mendapatkan bukti ilmiah untuk mengembangkan ekstrak

etanol bunga krisan sebagai agen kemopreventif terhadap kanker serviks.

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah bunga krisan yang diperoleh

dari Asta Bunda, Kaliurang, Yogyakarta, ekstrak etanol bunga krisan, sel kanker serviks

HeLa yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah

Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 95% (teknis), Media Kultur Medium

DMEM 10% (Gibco), Tripsin EDTA 0,25%, PBS (Phosphat Buffer Saline), SDS (Sodium

Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0,01 N, DMSO (Merck) 0,5%, akuades, Cisplatin

(10mg/10mL) sebagai kontrol positif yang didapat dari Kalbe Farma, metanol 70%, reagen

Annexin V Fluos staining kit (Roche) (100 mL, binding buffer 2 mL Annexin V : 2 mL

propium iodide (PI)), reagen MTT (Sigma) 5 mg/mL, primary monoclonal antibody mouse

anti human Bcl-2 Oncoproteini (Dako), biotinylated universal secondary antibody

(Biocare), Mayer Hematoxylin (Dako), xylol, substrat DAB.

Alat Penelitian

Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas steril

(Pyrex), blender, neraca digital, rotary evaporator (buchi Labortechnik AG CH-99230),

waterbath (Memmert), alumunium foil, conical tube, autoklaf (Hirayama), 96 well-plate

(Iwaki), 24 well-plate (Iwaki), cover slip, object-glass, inkubator CO2 (Thermo Heraeus

HeraCell 150), Laminar air flow cabinet (Labconco), pinset (Gilson), mikropipet,

hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad), kamera digital (Canon 550D),

mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus), flowcytometry (FACS

Calibur)


! 3!

Determinasi dan Ekstraksi

Determinasi dilakukan di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi

Universitas Gadjah Mada. Bagian yang di determinasi adalah tanaman utuh mulai dari akar

hingga bunga. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah

bunga krisan (Chrysanthemum indicum L.) (Lampiran 1). Bunga krisan yang dipilih

berwarna kuning dengan usia 13 minggu kemudian dipisahkan dari tangkainya dicuci

dengan air mengalir, lalu dikeringkan dengan oven dalam suhu 400C selama 2 minggu.

Bunga yang sudah kering dihancurkan dengan blender hingga berbentuk serbuk. Serbuk

bunga krisan sebanyak 80 gram diekstraksi dengan metode refluks menggunakan 150 mL

etanol 95% selama 3 jam. Proses ini diulang dua kali, ektrak etanol bunga krisan krisan

dipekatkan menggunakan rotary evaporator, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan

waterbath pada suhu 80OC sampai etanol menguap dan mencapai bobot tetap (Li et al.,

2009).

Pembuatan larutan uji

Ekstrak etanol kental ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam 100

µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000 µg/ mL.

Selanjutnya dibuat lima seri kadar yaitu 1000, 500, 250, 125, 62 µg/ mL.

Cisplatin dengan konsentrasi 10 mg/10mL diambil sebanyak 1 mL sehingga

diperoleh Cisplatin dengan konsentrasi 1000 µg/mL. Kemudian diencerkan dengan media

kultur DMEM dan dibuat seri kadar pengenceran 5, 10, 20, 39, 78 µg/mL (CCRCa, 2009 ;

Li et al., 2009).

Panen sel

Sel HeLa ditanam dan diinkubasi dalam tissue culture dish hingga konfluen,

kemudian media kultur dibuang terlebih dahulu menggunakan mikropipet. PBS

ditambahkan ke dalam cawan petri untuk mencuci, kemudian dibuang dan ditambahkan

tripsin 0,5 mL secara merata dalam cawan petri. Cawan petri ditutup dan didiamkan di dalam

inkubator selama 3 menit hingga sel terlepas. Sel ditampung pada conical tube, disentrifugasi

10 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang diberi media DMEM 2 mL,

dicuplik sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung

jumlah sel yang diperlukan selama pengujian.

Perhitungan+jumlah+sel =Jumlah+sel+kuadran+1 + 2 + 3 + 4

4+9+10;+/=>


! 4!

Setelah diketahui jumlah sel, sel diambil sesuai dengan jumlah sel yang diperlukan untuk

masing-masing uji (CCRCb, 2009 ; Ham et al., 2014).

Uji Sitotoksik ekstrak bunga krisan pada sel HeLa

Sel dengan populasi 1.104 sel/well ditanam pada sumuran 96 well plate (Iwaki),

masing-masing 100 µL. Sisakan 3 sumuran kosong untuk kontrol sel, kontrol pelarut dan

kontrol media. Kemudian inkubasi sel pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C selama 24

jam. Setelah 24 jam, media dibuang dan sel diberi ekstrak etanol bunga krisan 100 µL

(konsentrasi 1000, 500, 250, 125, 62 µg/mL) dan cisplatin 100 µL (konsentrasi 78, 39, 20,

10, 5, 2,5 µg/mL) lalu diinkubasi selama 24 jam. Setelah inkubasi, media kultur dibuang lalu

diberi MTT 100 µL dengan konsentrasi 5 mg/mL dan diinkubasi selama 4 jam pada

inkubator CO2 5% dengan suhu 370C, setelah itu diberi reagen stopper SDS 10% dalam 0,1

N HCl kemudian plate dibungkus dengan alumunium foil dan diinkubasi pada suhu ruangan

selama 24 jam setelah itu dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm

(CCRCc, 2009 ; Huang et al., 2015).

Uji Apoptosis

Sel dengan populasi 1.106 sel/well ditanam pada sumuran 6 well plate (Iwaki),

masing-masing 2 mL, diinkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel

diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan 2 mL dengan konsentrasi 125 µg/mL, lalu

diinkubasi 24 jam. Well-plate dicuci dengan 10% PBS 1 mL dan ditampung pada conical

tube, lalu diberi 200 µL tripsin, inkubasi selama 3 menit dan amati dibawah mikroskop

apakah sel sudah terlepas. Apabila sudah terlepas, tambahkan media kultur 1 mL pada well

plate lalu ditampung kembali ke dalam conical tube kemudian disentrifugasi selama 10

menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan dibuang, sisa endapan diberi PBS dingin 1

mL kemudian resuspensi campuran dan dipindahkan ke dalam microtube 1 mL kemudian

diberi reagen Annexin V Fluos staining kit (Roche) (100 mL binding buffer, 2 mL Annexin

V : 2 mL propium iodide (PI)), kemudian sampel dianalisis mengunakan flowcytometry

(FACS Calibur) (CCRCd, 2009 ; Huang et al., 2015).

Imunositokimia

Sel dengan populasi 2.105sel/well dengan volume 200 µL ditanam pada sumuran 24

well plate (Iwaki) yang telah diberi cover slip lalu diinkubasi selama 30 menit, setelah itu

tambahkan 800 µL media kultur kedalam sumuran secara perlahan dan diinkubasi 24 jam

pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diberi perlakukan dengan menambahkan 1

mL sampel konsentrasi 125 µg/mL dan diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 5%


! 5!

dengan suhu 370C. Cover slip diberi PBS lalu dibuang, dilakukan dua kali kemudian

difiksasi menggunakan metanol 300 µL selama 10 menit lalu dibuang dan diberi PBS 1 mL,

diamkan 5 menit kemudian dibuang. Cover slip, diberi hidrogen peroksida 1 mL selama 10

menit lalu dibuang dan cuci dengan aquadest kemudian diberi PBS. Cover slip diberi larutan

blocking 20 µL selama 10 menit lalu dibuang, diberi antibodi primer 50 µL selama 1 jam

setelah itu dibuang dan diberi PBS, diulang dua kali. Kemudian cover slip diberi antibodi

sekunder 30 µL selama 20 menit lalu dibuang dan diberi PBS. Setelah itu diberi streptavidin

30 µL selama 10 menit lalu tambahkan PBS lalu inkubasi 2 menit dan diulang dua kali.

Cover slip diberi larutan DAB (diaminobenzidin) 50 µL diinkubasi 7 menit dan diberi

aquadest lalu dibuang setelah itu ditambahkan dengan MayeHematoxylin selama 3 menit dan

diberi aquadest lalu dibuang. Cover slip diangkat dengan pinset, dicelupkan kedalam xylol

dan alkohol kemudian dikeringkan dan diletakkan di atas object glass lalu di tetesi dengan

lem dan ditutup dengan cover slip kotak dan diamati dengan mikroskop cahaya (CCRCe,

2009 ; Guimarães et al., 2005)

Analisis hasil

Analisis IC50

Data absorbansi pada tiap sumuran dari hasil uji MTT diperlukan untuk dikonversi

menjadi presentase sel yang hidup. Presentase sel yang hidup (% viabilitas) dihitung

menggunakan rumus:

%+Viabilitas =Absorbansi+perlakuan − Absorbansi+kontrol+mediaAbsorbansi+kontrol+sel − Absorbansi+kontrol+media

+x+100%

Data yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai IC50 dengan membuat regresi

linear konsentrasi versus persen viabilitas sel dengan menggunakan program Microsoft

Excel (CCRCc, 2009, Nobakht et al., 2014).

Analisis Apoptosis Sel

Pengamatan kuantitatif dilakukan menggunakan alat FACS Calibur yang terhubung

dengan software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan, kemudian

dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna

hijau (Annexin-/PI-), warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis

(Annexin+/PI-), dan merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+),

dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis (Annexin-/PI+) (Hingorani et al.,

2011).


! 6!

Analisis Imunositokimia

Pengamatan kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2. Warna

coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl-2 dan warna biru menunjukkan tidak terdapat

ekspresi protein Bcl-2.

Pengamatan seacara semikuantitatif dilakukan dengan level scoring. Pembacaan data

dilakukan dengan bantuan tiga responden blind reader untuk menghitung jumlah sel yang

mengekspresikan Bcl-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap preparatnya.

%+Ekspresi+Bcl2 =jumlah+sel+berwarna+coklat

jumlah+total+sel+satu+lapang+pandangx100%

Level scoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan : 0 : kurang dari 5% (Sangat Kuat),

1+ : 6% - 25% (Kuat), 2+: 26% - 50% (Sedang), 3+ : 51% - 75% (Lemah), 4+ : 76% - 100%

(Sangat Lemah) (Jing et al., 2015).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi dan Ekstraksi Bunga Krisan

Determinasi tanaman dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran dari

tanaman yang digunakan sebagai sampel. Determinasi dilakukan untuk memastikan bahwa

bunga yang digunakan dalam penelitian ini benar berasal dari tanaman krisan

(Chrysanthemum indicum L.). Bunga dipetik dan dipisahkan dari tangkainya lalu dicuci dan

dikeringkan pada oven dengan suhu 40-500C. Pengeringan bertujuan untuk menghilangkan

kadar air dalam bunga karena air dapat menimbulkan tumbuhnya jamur pada bunga.

Serbuk bunga krisan sebanyak 80 gram diekstraksi dengan metode refluks

menggunakan 150 mL etanol 95% selama 3 jam, proses ini dilakukan selama dua kali. Hasil

refluks yang sudah ditampung dan disaring kemudian dipekatkan dengan rotary evaporator

kemudian diuapkan diatas waterbath pada suhu 80OC sampai etanol menguap dan mencapai

bobot tetap dengan berat 12,4 gram, setelah itu ekstrak disimpan pada suhu 40C (Li et al.,

2009).

Pada penelitian ini tidak dilakukan uji kandungan kimia pada bunga krisan, namun

diharapkan ekstrak bunga krisan dapat menghambat proliferasi pada sel HeLa karena

menurut penelitian Li et al (2009), bunga krisan yang diekstrak dengan etanol 95% dapat

menghambat proliferasi pada sel kanker hati dengan nilai IC50 1200 µg/mL, dengan hasil

selektif yaitu tanpa menunjukkan toksisitas pada sel normal. Selain itu Wu et al (2008)

menunjukkan bahwa bunga krisan yang diekstraksi dengan etanol 70% mengandung dua


! 7!

flavonoid utama yaitu quercitrin dan myericetin, dimana myericetin mampu menginduksi

apoptosis pada sel kanker ovarium A2780/CP70 dan OVCAR-3 dengan nilai IC50 yaitu 30

µM dan 20 µM , namun tidak memiliki aktivitas terhadap sel ovarium normal IOSE-364

(Huang et al., 2015). Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk

mengidentifikasi kandungan kimia pada bunga krisan yang diekstraksi dengan etanol 95%

karena perbedaan usia tanaman, tempat tumbuh, waktu panen dan kondisi lingkungan serta

perbedaan metode dan pelarut ekstraksi menyebabkan kandungan yang tersari dari bunga

krisan menjadi berbeda-beda.

Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker serviks HeLa dengan MTT

MTT merupakan uji reduksi warna kuning dari 3-(4,5-dimethythiazol- 2-yl)-2,5-

diphenyl tetrazolium bromide dengan enzim suksinat dehydrogenase pada mitokondria.

MTT akan masuk kedalam sel dan melewati mitokondria dan direduksi oleh enzim suksinat

dehydrogenase menjadi senyawa yang tidak larut dan membentuk formazan berwarna ungu.

Reduksi pada MTT hanya terjadi pada sel yang masih hidup (mengalami metabolisme secara

aktif) sehingga metode ini dapat digunakan untuk mengukur viabilitas sel. Formazan yang

terbentuk sebanding dengan jumlah sel yang hidup kemudian diukur dengan menggunakan

ELISA reader dengan panjang gelombang 595nm (Riss, et al., 2013).

Hasil menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga krisan mampu memberikan efek

sitotoksik terhadap sel HeLa secara dose-dependent, dimana seiring dengan meningkatnya

Gambar 1. Morfologi sel HeLa secara mikroskopis dengan perbesaran 100x setelah diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dan cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. (A) Morfologi kontrol sel HeLa. (B) Morfologi sel pada perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 39 µg/mL. (C) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi 250 µg/mL. (D) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi 500 µg/mL. Panah warna biru menunjukkan morfologi sel yang masih utuh, menunjukkan sel yang sudah tidak utuh.

A B

C D


! 8!

konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan, maka jumlah sel HeLa yang hidup juga semakin

berkurang (Gambar 1), begitu juga dengan cisplatin. Pada uji ini terlihat perbedaan

morfologi sel yang diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan, dimana bentuk sel menjadi

tidak utuh, terlihat bahwa ada beberapa sel yang hanya berbentuk bulat dan setelah diberi

perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan (gambar 2B, 2C dan 2D).

Uji sitotoksik dilakukan sebanyak tiga kali secara independent eksperimen, dimana

pada masing-masing eksperimen terdapat tiga replikasi. Nilai IC50 ekstrak etanol bunga

krisan adalah 700 µg/mL (Gambar 2A), sehingga potensi ekstrak etanol bunga krisan

digolongkan sebagai agen sitotoksik lemah dimana nilai IC50 > 50 µg/mL (Ellithey et al.,

2014). Nilai IC50 dari cisplatin sebagai kontrol positif adalah 36 µg/mL. (Gambar 2B).

Berdasarkan grafik yang diperoleh dari regresi linier menunjukkan bahwa baik perlakuan

cisplatin (Gambar 2A) dan ekstrak etanol bunga krisan (Gambar 2B) mampu menurunkan

viabilitas sel. Sebagai agen sitotoksik lemah, ekstrak etanol bunga krisan dapat ditingkatkan

efikasinya dengan dikombinasikan dengan cisplatin. Diharapkan dengan diturunkannya

dosis cisplatin yang dikombinasikan dengan ekstrak etanol bunga krisan, mampu

menghasilkan efek yang sama dengan dosis awal cisplatin. Namun sebelum melakukan

kombinasi ini diperlukan preformulasi untuk melihat kompatibilitas antara cisplatin dengan

ekstrak etanol bunga krisan

Gambar 2. Efek sitotoksik cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa. Sel HeLa (1.104 sel/well) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi cisplatin. (B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak etanol bunga krisan.

020406080100120

0 20 40 60 80 100Via

blita

s sel

(%)

Cisplatin (µg/mL)

020406080100120140

0 200 400 600 800 1000 1200Viab

ilitas(sel((%

)

Ekstrak(etanol(bunga(krisan((µg/mL)((

A

B


! 9!

Uji apoptosis dengan Flowcytometry

Annexin V merupakan protein yang dapat berikatan secara spesifik dengan fosfolipid

seperti fosfatidilserine yang biasanya tidak ada di luar permukaan membrane. Pada tahap

early apoptosis, fosfatidilserin akan berpindah ke permukaan membran sehingga Annexin

dapat berikatan dengan fosfatidilserin dan mendeteksi jumlah sel yang mengalami early

apoptosis. Pada tahap late apoptosis, terjadi disintegrasi pada membran sel, sehingga reagen

PI dapat masuk kedalam sel dan berikatan dengan DNA sel, sehingga pada keadaan late

apoptosis, baik Annexin maupun PI akan berikatan dengan membrane dan DNA sel. Pada

tahap nekrosis akan terjadi kebocoran plasma pada sel, kondisi ini menyebabkan reagen PI

yang akan berikatan langsung dengan DNA sel (Hingorani et al., 2011). Flowcytometry

digunakan untuk mendeteksi sel yang sudah diberi label dengan annexin maupun PI. Pada

flowcytomery sel akan ditembakkan dengan sumber cahaya dan menghasilkan fluoresensi

yang berbeda-beda berdasarkan label yang ada pada sel tersebut, sehingga sel dapat

dikelompokkan dan dihitung sesuai populasinya lalu dikonversikan menjadi sebuah grafik

dengan suatu program yang ada pada flowcytometry (Macey, 2007).

Hasil flowcytometry dengan Annexin menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga

krisan mampu meningkatkan peristiwa apoptosis dibandingkan dengan kontrol sel HeLa.

Ekstrak etanol bunga krisan dengan nilai ½ IC50 (350 µg/mL) mampu menginduksi apoptosis

sebesar 58,62%, dimana 14,64% mengalami nekrosis dan jumlah sel yang hidup sebesar

27,01% (Gambar 3C ; Tabel 1) Sel yang mengalami nekrosis diasumsikan mengalami

nekrosis sekunder karena ketika percobaan tidak dilakukan secara in vitro, tidak ada

peristiwa fagositosis dari badan golgi yang merupakan tahap kelanjutan dari peristiwa

apoptosis, sehingga sel yang apoptosis menjadi terdeteksi sebagai nekrosis sekunder

(Demoy et al., 2000).

Hal ini dapat diteliti lebih lanjut dengan menguji apoptosis menggunakan

flowcytometry dengan pewarnaan FLICA, dimana FLICA akan berikatan dengan caspase

sehingga jika terjadi lisisnya dinding sel tanpa adanya aktivitas caspase, maka dipastikan

bahwa jalur induksi pada sel yang diuji adalah melalui jalur nekrosis (Immunochemistry

Technologist, 2015). Selain itu menurut penelitian Li et al (2009) ekstrak etanol bunga krisan

memiliki mekanisme penghambatan secara time dependent, dimana pada dosis yang sama

kematian sel akan meningkat seiring dengan lamanya waktu inkubasi, sehingga pada

penelitian selanjutnya diapat dilakukan optimasi terhadap waktu inkubasi sel HeLa yang


! 10!

diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan, yaitu beberapa titik waktu sebelum 24 jam

untuk memastikan apakah sel mengalami kematian melalui jalur apoptosis.

Pada cisplatin, sel yang mengalami early apoptosis adalah 25,44%, late apoptosis

10,62%, nekrosis 2,68% dan sel yang masih hidup adalah 2,69% (tabel 1 ; gambar 3B). Hal

ini menunjukkan bahwa cisplatin menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis, dimana

cisplatin meningkatkan aktivitas dari caspase-3 dan-7 (Leisching et al., 2015) Caspase-3

menyebabkan fragmentasi pada sitoskeleton sehingga terjadi kematian sel secara apoptosis

(Elmore, 2008).

File: KS HeLa.001Gate: No GateTotal Events: 20000

Region % Gated % TotalR1 88.28 88.28R2 3.55 3.55R3 2.58 2.58R4 5.67 5.67


Quad % Gated % TotalUL 5.05 5.05UR 2.50 2.50LL 88.72 88.72LR 3.74 3.74

R2

R3R4

R1

File: cisplatin HeLa.006Gate: No GateTotal Events: 20000




R2

R4

R1

File: krisan I HeLa.005Gate: No GateTotal Events: 20000


File: krisan I HeLa.005Gate: No GateTotal Events: 20000


R2

R4

R1

A B

Gambar 3. Hasil induksi apoptosis cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan. Sel HeLa (1.106 sel/well) yang ditanam pada 6 well-plate dan diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan dengan inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Sel diwarnai dengan reagen annexin V dan PI. Sel yang hidup ditunjukkan dengan warna hijau, early apoptosis ditunjukkan dengan warna kuning, late apoptosis dengan warna merah muda dan nekrosis ditunjukkan dengan warna merah. Hasil dibaca dengan flowcytometer. (A) Kontrol sel. (B) Sel HeLa dengan perlakuan cisplatin konsentrasi ½ IC50 (18 µg/mL). Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ½ IC50 (350 µg/mL)

C

Tabel I. Hasil Uji Apoptosis Menggunakan Flowcytometry dengan Pewarnaan Annexin V Flous Total Sel (%)

Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4

Hidup Awal Apoptosis Akhir Apoptosis Nekrosis

Kontrol Sel 88,28 3,55 2,58 5,67

Cisplatin 61,80 25,55 10,62 2,69

Ekstrak Etanol Bunga

Krisan

27,01 17,82 41,34 14,64

!


! 11!

Uji imunositokimia

Imunositokimia merupakan teknik untuk memvisualisasikan keberadaan protein di

dalam sel dengan menggunakan biomolekul berupa antibodi yaitu berdasarkan pada

kemampuan antibodi tersebut untuk mengikat protein dalam sel yang dikenali sebagai

antigen. Ada dua jenis imunostitokimia yaitu imunositokimia langsung dan imunositokimia

tidak langsung. Imunositokimia langsung hanya menggunakan satu antibodi, metode ini

cepat namun tidak cukup sensitif untuk mendetiksi protein karena jumlah protein yang

dideteksi biasanya terlalu kecil untuk menghasilkan sinyal yang kuat. Sensitivitas akan

meningkat dengan menggunakan metode tidak langsung yaitu dengan adanya ikatan pada

antibodi sekunder terhadap komples antibodi primer dan antigen. Peristiwa ini akan

memperkuat sinyal yang ada (Uhlen et al., 2016)

Uji imunositokimia bertujuan untuk melihat ekspresi dari protein anti-apoptosis Bcl-

2, yaitu salah satu mekanisme sitotoksik dari ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel HeLa.

Warna coklat pada sitoplasma menunjukan adanya ekspresi protein Bcl-2 pada sel,

sedangkan warna biru menunjukkan tidak adanya ekspresi Bcl-2 pada sel. Intensitas warna

coklat digunakan sebagai parameter semi-kuantitatif untuk menilai ekspresi Bcl-2 dan

menghitung jumlah sel yang mengekspresikan protein Bcl-2. Ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa

dapat dilihat pada gambar 4. Ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi ¼ IC50 (125

Gambar 4. Efek perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan terhadap ekspresi Bcl-2 terhadap sel HeLa dengan perbesaran 400x. Sel HeLa (2.105 sel/well) ditanam pada 6 well plate yang diberi cover slip, kemudian diberi perlakuan cisplatin dan ekstrak etanol bunga krisan dengan inkubasi 24 jam pada inkubator CO2 5% dengan suhu 370C. Antibodi primer yang digunakan adalah mouse anti human Bcl-2 Oncoproteini (Dako), ekspresi Bcl-2 diamati dibawah mikroskop cahaya. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan antibodoi Bcl-2. (C) Sel HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan ¼ IC50 (175 µg/mL). (D) Sel HeLa dengan perlakuan cisplatin ½ IC50 (18 µg/mL). Panah warna hitam menunjukkan adanya ekspresi Bcl-2, sedangkan panah warna biru menunjukkan tidak adanya ekspesi Bcl-2 pada sel HeLa.


! 12!

µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan kuat (level ekspresi 1+) dan cisplatin

dengan konsentrasi ½ IC50 (18 µg/mL) mampu menekan ekspresi Bcl-2 dengan sangat kuat

(level ekspresi 0).

Menurunnya fungsi p53 pada sel HeLa menyebabkan sel tersebut kehilangan fungsi

supresifnya, akibatnya terjadi ekspresi berlebih pada protein anti-apoptosis, yaitu Bcl-2.

Strategi untuk mengatasi hal ini adalah meningkatkan protein-protein yang bersifat pro-

apoptosis yaitu p21, Hdm2, PUMA, NOXA dan Bax. Bax adalah salah satu protein pro-

apoptosis, dimana meningkatnya Bax akan menurunkan ekspresi dari Bcl-2 sebagai protein

anti-apoptosis (Kroemer et al., 2007). Ekstrak etanol bunga krisan yang pada penelitian

sebelumnya dilaporakan memiliki efek sitotoksik diharapkan mampu menurunkan ekspresi

Bcl-2 sehingga dapat meningkatkan peristiwa apoptosis dan menyebabkan terjadinya

penurunan viabilitas sel akibat dari pemberian ekstrak etanol bunga krisan pada sel HeLa.

Ekstrak etanol bunga krisan dengan konsentrasi ¼ IC50 (125 µg/mL) mampu

menekan ekspresi Bcl-2 dengan kuat. Hal ini disebabkan karena kemungkinan dari

mekanisme induksi apoptosis bunga krisan adalah melalui jalur caspase-3, dimana aktivasi

dari caspase-3 melalui jalur ekstriksik apoptosis akan menyebabkan terjadinya aktivasi

protein yang menyebabkan transduksi sinyal cascade, sehingga menyebabkan aktivasi

apoptosis secara intrinsik yaitu induksi keluarnya sitorom-c dari mitokondria. Keluarnya

sitokrom-c dari sitoplasma diperantarai dengan aktivitas Bax/Bax sebagai protein pro-

apoptosis. Meningkatnya Bax akan menekan ekspresi Bcl-2 sebagai protein anti-apoptosis.

Lapang

Pandang

Ekspresi Bcl-2 pada

Kontrol Sel tanpa

Antibodi

Level

1 (n = 128) 1 (0,78%) 0

2 (n = 125) 3 (2,4%) 0

3 (n = 107) 0 (0%) 0

!

Lapang

Pandang

Ekspresi Bcl-2 pada

Kontrol Sel dengan

Antibodi

Level

1 (n = 105) 105 (100%) 4+

2 (n = 97) 97 (100%) 4+

3 (n = 106) 106 (100%) 4+

!

Lapang

Pandang

Ekspresi Bcl-2 pada

Perlakuan Ekstrak

Etanol Bunga

Krisan

Level

1 (n = 350) 21 (6%) 1+

2 (n = 345) 23 (6.6%) 1+

3 (n = 300) 20 (6.6%) 1+

!

Tabel II. Distribusi Ekspresi Bcl-2 pada Sel HeLa dengan Berbagai Perlakuan

Lapang

Pandang

Ekspresi Bcl-2 pada

Perlakuan Cisplatin Level

1 (n = 128) 1 (0,78%) 0

2 (n = 125) 3 (2,4%) 0

3 (n = 107) 0 (0%) 0

!


! 13!

Sitokrom-c akan berikatan dengan Apaf-1, hal ini akan mengaktivasi caspase-9. Caspase-9

menjadi pemicu terjadinya aktivasi caspase-3 dan-7 sehingga akan terjadi fragmentasi dan

menyebabkan kematian sel secara apoptosis (Weyhenmeyer et al., 2012). Namun perlu diuji

lebih lanjut untuk mengetahui hal tersebut, yaitu untuk menghitung jumlah ekspresi Bcl-2

secara kuantitatif pada sel HeLa yang diberi perlakuan ekstrak etanol bunga krisan terhadap

sel HeLa.

Pada gambar 4A yaitu kontrol sel tanpa antibodi, morfologi sel terlihat berbeda-beda.

Hal ini disebabkan karena tanpa adanya ikatan antibodi dengan sel menyebabkan pewarna

streptavidin tidak optimal dalam mewarnai sel tersebut. Pewarnaan streptavidin yang tidak

optimal menyebabkan DAB tidak dapat memunculkan reaksi warna coklat dengan jelas,

sehingga bentuk morfologi sel menjadi terlihat berbeda-beda antara satu dengan yang lain

(Colby, 2014).

Kesimpulan

Ekstrak etanol bunga krisan mempunyai efek sitotoksik lemah pada sel kanker

serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 700 µg/mL serta mampu menginduksi apoptosis

dengan konsentrasi 350 µg/mL dan menekan ekspresi protein Bcl-2 secara kuat pada

konsentrasi 175 µg/mL.

Saran untuk penelitian berikutnya adalah dilakukan uji kandungan senyawa dalam

ekstrak etanol bunga krisan, melihat efek sitotoksik ekstrak etanol bunga krisan terhadap sel

normal serta efek sinergis dari kandungan ekstrak etanol bunga krisan dan agen kemoterapi.

Selain itu mekanisme induksi apoptosis perlu dikonfirmasi dengan melakukan time course

assay dengan waktu inkubasi kurang dari 24 jam dan perlu dilakukan uji untuk mendeteksi

adanya ekspresi Bcl-2 secara kuantitatif serta penelitian lebih lanjut untuk mengetahui

regulasi mediator lainnya setelah terjadi penekanan ekspresi Bcl-2.


! 14!

Daftar Pustaka

ATCC, 2014, HeLa (ATCC® CCL-2™), American Type Culture Collection, USA,

https://www.atcc.org/products/all/CCL-2.1.aspx, diakses tanggal 20 April 2016 Bo, L., Gao, Y., Rankin, G. O., Rojanasakul, Y., Cutler, S. J., Tu, Y., Chen, Y. C., 2015.

Chaetoglobosin K Induces Apoptosis and G2 Cell Cycle Arrest through p53-Dependent Pathway in Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer Cells. HHS Public Access, 33(4), 395–401.

Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel,

Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.009.-Preparasi-sampel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur TetapPanen Sel, Unversitas

Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Uji sitotoksik MTT,

Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Flowcytometry,

Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Reasearch Centere, 2009. Prosedur tetap pengamatan ekspresi

protein dengan metode imunositokimia, Universitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf, diakses tanggal 14 April 2016.

Colby, D., 2014. A Guide to Successful Immunohistochemistry, Cell Signalling Technology,

http://kromat.hu/UserFiles/files/patologia/Dako_IHC_metodikai_kézikönyv_I.pdf, diakses tanggal 22 Februari 2017

Chipuk, J. E., Green, D. R., 2008. How do BCL-2 proteins induce mitochondrial outer

membrane permeabilization. Trends Cell Biology, 18(4), 157–164. Comalada, M., Camuesco, D., Sierra, S., Ballester, I., Xaus, J., Gálvez, J., & Zarzuelo, A.,

2005. In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which inhibits inflammation through down-regulation of the NF-κB pathway. European Journal of Immunology, 35(2), 584–592.

Demoy, M., Minko, T., Kopenckova, P., Kopecek, J., 2000. Time and concentration

dependent apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymerbound doxorubicin in human ovarian carcinoma cells. J Control Release, 69(1): 185-96


! 15!

Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., Meyer, D. 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme

inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14 (77).

Elmore, S., 2008. Apoptosis%: A Review of Programmed Cell Death. NIH Public Access,

381(1) 143–154. Guimarães, M. C. M., Gonçalves, M. A. G., Soares, C. P., Bettini, J. S. R., Duarte, R. A.,

Soares, E. G., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4A and bcl-2 According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4): 509–516.

Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., Mittar, D., 2011. Detection of Apotosis using

the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM System, BD Biosciences, 1-12.

Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C., 2015.

Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a p53-dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–1502.

Immunochemistry Technologist, 2015. FAM-FLICA® Caspase Assay Kits,

Immunochemistry Technologist LCC, USA, https://www.bio-rad-antibodies.com/caspases-flica.html, diakses tanggal 22 Februari 2017.

Jing, Z., Heng, W., Xia, L., Ning, W., Yafei, Q., Yao, Z., Shulan, Z., 2015. Downregulation

of phosphoglycerate dehydrogenase inhibits proliferation and enhances cisplatin sensitivity in cervical adenocarcinoma cells by regulating Bcl-2 and caspase-3. Cancer Biology and Therapy, 16(4)

Kho, E. Y., Wang, H. K., Banerjee, N. S., Broker, T. R., Chow, L. T., 2013. HPV-18 E6

mutants reveal p53 modulation of viral DNA amplification in organotypic cultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(19), 7542–9.

Kim, M. E., Ha, T. K., Yoon, J. H., & Lee, J. S., 2014. Myricetin induces cell death of human

colon cancer cells. Anticancer Research, 34(2), 701 – 706. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C., 2007. Mitochondrial Membrane Permeabilization

in Cell Death. Physiology Reveiw, 99–163 Leisching, G., Loos, B., Botha, M., Engelbrecht, A.-M., Benedetti-Panici, P., Bermudez, A.,

Albertyn, G., 2015. Bcl-2 confers survival in cisplatin treated cervical cancer cells: circumventing cisplatin dose-dependent toxicity and resistance. Journal of Translational Medicine 2015 13:1, 13(1), 2470–2486.

Li, Z. F., Wang, Z. D., Ji, Y. Y., Zhang, S., Huang, C., Li, J., & Xia, X. M., 2009. Induction

of apoptosis and cell cycle arrest in human HCC MHCC97H cells with Chrysanthemum indicum extract. World Journal of Gastroenterology, 15(36), 4538–4546.


! 16!

Macey, M., 2007. Flow cytometry: Principles and Applications, Springer Science & Business

Media, Totowa, pp. 1-2 National Cancer Institute, 2015. Cervical Cancer Treatment-Patient Version (PDQ) General

Information About Cervical Cancer, U.S Departement of Health and Human Services, USA, https://www.cancer.gov/types/cervical/patient/cervical-treatment-pdq, diakses tanggal 4 April 2016

Nuranna, L., Aziz, M.F., Cornain, S., Purwoto, G., Purbadi, S., Budiningsih, S., Budiningsih,

S., Peters, A. A. W., 2012. Cervical Cancer Prevention Program in Jakarta, Indonesia: See and Treat Model in developing country, J Gynecol Oncol, 23 (3): 147-152.

Nobakht, G. M., Kadir, M., Stanslas, J., Charng, C. W. 2014. Cytotoxic effect of Typhonium

flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31), 1021–1024. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L., 2015.

Cell viability assays, 1–31. Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Journal of

Cancer Science & Therapy, 01(S3), 5956 Uhlen, M., Ponten, F., Tegel, H., Nilson, P., Feilitzen, K., Lundberg, E., 2016,

Immunocytochemistry, Uppsala University, Sweden, www.proteinatlas.org/learn/method/immunocytochemistry, diakses tanggal 24 April 2016.

Weyhenmeyer, B., Murphy, A. C., Prehn, J. H. M., Murphy, B. M., 2012. Invited Review

Targeting the Anti-Apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer, Exp Oncol 2012, 192–199.

Wu, L., Gao, H., Wang, X., Ye, J., Lu, J., Liang, Y. 2010. Analysis of chemical composition

of Chrysanthemum indicum flowers by GC/MS and HPLC. J Med Plants Res, 4(5), 421–426.

WHO, 2015. Cervical Cancer Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in

2012, http://globocan.iarc.fr/old/FactSheets/cancers/cervix-new.asp, diakses 20 April 2016.


! 17!

LAMPIRAN


! 18!

Lampiran 1. Gambar bunga krisan yang digunakan dan proses ekstraksi

Gambar A. Bunga krisan yang sudah dikeringkan

Gambar B. Ekstraksi dengan metode refluks dan pemekatan dengan vaccum rotary evaporator

Gambar C. Ekstrak etanol bunga krisan


! 19!

Lampiran 2. Pengolahan data uji MTT assay

Data Konsentrasi Ekstrak Etanol Bunga Krisan vs Viablitias Sel

Konsentrasi

ekstrak (µg/mL)

Viabilitas sel (%) SD

1 2 3 Rata-rata

0 102,168 106,378 91,454 100,000 7,694

15,63 117,092 110,587 81,314 102,997 19,058

31,25 118,048 104,847 87,054 103,316 15,554

62,5 106,569 92,028 81,505 93,367 12,585

125 55,293 57,589 73,469 62,117 9,898

250 36,543 30,038 19,898 28,827 8,389

500 117,092 110,587 81,314 102,997 19,058

Data Konsentrasi Cisplatin vs Viablitias Sel Konsentrasi

Cisplatin

(µg/mL)

Viabilitas sel (%)

SD 1 2 3 Rata-rata

0 100 100 100 100 0

5 73,003 90,551 105,062 89,539 16,053

10 56,468 78,909 101,181 78,853 22,357

20 39,258 49,888 64,398 51,181 12,62

39 31,159 31,834 37,402 33,465 3,426

78 25,253 9,393 15,804 16,817 7,979


! 20!

Lampiran 3. Dokumentasi uji apoptosis





R2

R3R4

R1


! 21!





R2

R4

R1


! 22!





R2

R3R4

R1


! 23!

Lampiran 4. Dokumentasi uji Imunositokimia

A.! Kontrol sel tanpa antibodi

B.! Kontrol sel dengan antibodi

C.! Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin

D.! Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak etanol bunga krisan


! 24!

Lampiran 5. Surat keterangan hasil determinasi sampel tanaman krisan

UNIVERSITAS GADJAH MADAFAKULTAS BIOLOGI

LABORATORIUM SISTEMATIKA TUM BUHANJalan Teknika Sefatan Sekip Utara Yogyakarta 55281Telpon(O27416/,922621il92272; Fax: (0274580839

SURAT KETERANGANNomer: O924lS.rb. / tX / 2076

Yang bertanda tangan dibawah ini, Kepala Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas BiologiUGM, menerangkan dengan sesungguhnya bahwa,

NamaNIMAsal instansi

: Maria Nareswari: 138114002: Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

telah melakukan identifikasitumbuhan dengan hasil sebagai berikut,

identifikasitersebut dibantu oleh Dr. Purnomo, M.S.Demikian surat keterangan ini diberikan untuk dapat dipergunakan seperlunya.

Yogyakarta, 26 September 2016Kepala LaboratoriumSistematika TumbuhanFakultas Biologi UGM

Dr. Purnomo,N rP. 19s5042 1 L98203 1005

SAMPEL FAMILIA GENUS SPESIES NAMA DERAHI Asteraceae Chrysonthemum Chryso nthe m um i ndicu m L. Bunga krisan

rno naif,usanto,


! 25!

Lampiran 6. Surat ethical clearance


! 26!

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Ekstrak Etanolik Bunga Krisan

(Chrysanthemum indicum L.) sebagai Agen Kemopreventif

terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) melalui Regulasi Bcl-2”

memiliki nama lengkap Maria Nareswari. Anak pertama dari

pasangan Bapak Angelo dan Ibu Maudy Maria. Penulis lahir di

Jakarta, 17 April 1995. Pendidikan formal yang ditempuh penulis

dimulai di TK Teruna Bangsa Yogyakarta (2000-2001).

Pendidikan dilanjutkan ke SD Teruna Bangsa Yogyakarta (2001-

2007). Pendidikan dilanjutkan ke SMP Stella Duce 1 Yogyakarta (2007-2010), pendidikan

menengah atas di SMA Stella Duce 1 Yogyakarta (2010-2013). Kemudian pendidikan

dilanjutkan hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulis terlibat dalam organisasi dan kepanitiaan di dalam kampus, antara lain menjadi

Bendahara acara Donor Darah JMKI (2014), anggota Media Farmasi (2014), anggota seksi

acara Seminar Nasional JMKI (2014), koordinator divisi acara Inisiasi Sanata Dharma

(2015), Ketua Seminar Nasional JMKI (2015). Selain itu, penulis juga pernah menjadi

delegasi fakultas dalam kegiatan seminar internasional 14th IPSF Asia Pasific

Pharmaceutical Symposium in Pattaya, Bangkok (2015) dan mengikuti menjadi asisten

praktikum Biologi Sel dan Molekuler (2015/2016).


naskah yudisium - Sanata Dharma UniversityTitle Microsoft Word - naskah yudisium.docx Created Date...

Documents

Transcript of naskah yudisium - Sanata Dharma UniversityTitle Microsoft Word - naskah yudisium.docx Created Date...