Mutasi gen Mutasi gen katGkatG dalam Isolat dalam Isolat Klinis Klinis Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis

yang Resisten Isoniazidyang Resisten Isoniazid

Oleh:Oleh:Elfira Rosa PaneElfira Rosa Pane

2050500820505008

Dosen PembimbingDosen PembimbingAchmad Saifuddin Noer, Ph.DAchmad Saifuddin Noer, Ph.D

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 22

AgendaAgenda

1. Pendahuluan1. Pendahuluan

- Latar Belakang- Latar Belakang

- Tujuan Penelitian- Tujuan Penelitian

2. Tinjauan Pustaka2. Tinjauan Pustaka

3. Metode Penelitian3. Metode Penelitian

4. Hasil Penelitian dan Pembahasan4. Hasil Penelitian dan Pembahasan

5. Kesimpulan 5. Kesimpulan

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 pendahuluanpendahuluan 33

Latar BelakangLatar Belakang

Ada Isolat Klinis yang Multi Drug Resisten Ada Isolat Klinis yang Multi Drug Resisten terhadap Isoniazid dan Rifampinterhadap Isoniazid dan Rifampin

Peneliti sebelumnya telah menemukan Peneliti sebelumnya telah menemukan bahwa isolat klinis tersebut bahwa isolat klinis tersebut adaada mutasi mutasi pada gen pada gen rpoBrpoB namun namun tidak adatidak ada mutasi mutasi S315T pada gen S315T pada gen katGkatG. .

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 44

Tujuan penelitianTujuan penelitian

Mencari mutasi pada posisi selain asam Mencari mutasi pada posisi selain asam amino S315, yang berkontribusi dalam amino S315, yang berkontribusi dalam resistensi terhadap isoniazid.resistensi terhadap isoniazid.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 55

Tinjauan PustakaTinjauan PustakaPenyakit Tuberculosis (TB) : penyakit kronis; Penyakit Tuberculosis (TB) : penyakit kronis;

gejala: demam, batuk, sesak napas, nyeri gejala: demam, batuk, sesak napas, nyeri dada, dan malaise (tidak nafsu makan) dada, dan malaise (tidak nafsu makan) yang terjadi secara perlahan. yang terjadi secara perlahan.

Penyebab: infeksi oleh Penyebab: infeksi oleh Mycobacterium Mycobacterium tuberculosistuberculosis (Mtb), bakteri berbentuk (Mtb), bakteri berbentuk batang, lurus atau sedikit bengkok seperti batang, lurus atau sedikit bengkok seperti kurva dengan panjang 2-4 mikro dan lebar kurva dengan panjang 2-4 mikro dan lebar 0,2-0,5 mikro 0,2-0,5 mikro

Penularan: melalui udaraPenularan: melalui udara

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 tinjauan pustakatinjauan pustaka 66

Mycobacterium tuberculosisMycobacterium tuberculosis bakteri gram positif , sulit bakteri gram positif , sulit

diwarnai, menahan zat diwarnai, menahan zat warna dengan kuat dan warna dengan kuat dan tidak dapat dilunturkan tidak dapat dilunturkan walaupun dengan asam, walaupun dengan asam, sehingga disebut bakteri sehingga disebut bakteri tahan asamtahan asam

asam lemak (asam lemak (lipidlipid), 20-), 20-40% dari keseluruhan 40% dari keseluruhan berat kering, membuat berat kering, membuat bakteri ini resisten bakteri ini resisten terhadap asam dan terhadap asam dan tahan terhadap antibiotik tahan terhadap antibiotik

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 tinjauan pustakatinjauan pustaka 77

Pengobatan TBCPengobatan TBC

Terapi TB : 6-9 bulanTerapi TB : 6-9 bulan

Resistensi terhadap Resistensi terhadap obat TB karena obat TB karena meminum obat tidak meminum obat tidak sesuai dengan dosis sesuai dengan dosis yang dianjurkan.yang dianjurkan.

Resistensi bisa terjadi Resistensi bisa terjadi pada satu atau lebih pada satu atau lebih obat anti TB (MDR-obat anti TB (MDR-TB)TB)

isoniazid, rifampin, pyrazinamide, dan ethambutol

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 tinjauan pustakatinjauan pustaka 88

Isoniazid Isoniazid

INH menginhibisi INH menginhibisi biosintesis asam biosintesis asam mikolat pada dinding mikolat pada dinding sel, sehingga sel, sehingga mikobakteria menjadi mikobakteria menjadi lebih rentan terhadap lebih rentan terhadap reaksi dengan reaksi dengan oksigen dan faktor oksigen dan faktor lingkungan lainnya.lingkungan lainnya.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 tinjauan pustakatinjauan pustaka 99

IsoniazidIsoniazid

Isoniazid (INH) adalah Isoniazid (INH) adalah prodrug,prodrug, akan diubah akan diubah menjadi bentuk aktifnya yaitu asam menjadi bentuk aktifnya yaitu asam nikotinatnikotinat oleh oleh enzim katalase peroksidase yang dikode oleh enzim katalase peroksidase yang dikode oleh gen gen katGkatG pada MTb pada MTb

katGkatG mengaktifkan INH, mutasi pada mengaktifkan INH, mutasi pada katGkatG menyebabkan MTb resisten terhadap INH menyebabkan MTb resisten terhadap INH

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 tinjauan pustakatinjauan pustaka 1010

Katalase peroksidaseKatalase peroksidase CPs: enzym yang CPs: enzym yang

tergantung hemetergantung heme Melindungi bakteri dari Melindungi bakteri dari

molekul toksik molekul toksik (hidroperoksida) dan (hidroperoksida) dan hidroksil radikalhidroksil radikal

Homotetramer, 80kDaHomotetramer, 80kDa N-terminal: heme binding N-terminal: heme binding

motif.motif.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 tinjauan pustakatinjauan pustaka 1111

Mutasi S315TMutasi S315T

Mutasi titik yang paling Mutasi titik yang paling banyak ditemukan adalah banyak ditemukan adalah satu substitusi pada gen satu substitusi pada gen katGkatG asam amino asam amino S315T(AS315T(AGGCC→→AACCC)C)

memberikan memberikan keseimbangan yang keseimbangan yang optimal antara penurunan optimal antara penurunan katalase dan aktifitas katalase dan aktifitas peroksidase yang cukup peroksidase yang cukup tinggi dalam tinggi dalam katGkatG

S315T mengganti sisi S315T mengganti sisi pengikatan INH dan/atau pengikatan INH dan/atau mempengaruhi transfer e- mempengaruhi transfer e- ke hemeke heme

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 1212

Metodologi PenelitianMetodologi Penelitian

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 1313

Hasil penelitianHasil penelitian

hasil PCR menggunakan MAS hasil PCR menggunakan MAS PCR sepanjang 435pb dan PCR sepanjang 435pb dan 292pb: 292pb:

Lajur 1 kontrol(-)Lajur 1 kontrol(-) Lajur 2 kontrol +Lajur 2 kontrol + Lajur 3 L10Lajur 3 L10 Lajur 4 L13Lajur 4 L13 Lajur 5 Marker pUCLajur 5 Marker pUC Lajur 6 L14Lajur 6 L14 Lajur 7 L18Lajur 7 L18 Lajur 8 L4. Lajur 8 L4.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 hasil penelitianhasil penelitian 1414

Hasil PCR gen katG Hasil PCR gen katG sepanjang 435 pb:sepanjang 435 pb:

Lajur 1 H37RVLajur 1 H37RV Lajur 2 L18Lajur 2 L18 Lajur 3 Marker pUCLajur 3 Marker pUC Lajur 4 L4Lajur 4 L4 Lajur 5 L10.Lajur 5 L10.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 hasil penelitianhasil penelitian 1515

Hasil Sequensing Isolat L10Hasil Sequensing Isolat L10

mutasi pada isolat klinis L10. (kiri→kanan) mutasi pada: mutasi pada isolat klinis L10. (kiri→kanan) mutasi pada: kodon 316(kodon 316(GGGC→GC→TTGC; Gly→Cys); GC; Gly→Cys); kodon 317 (ATkodon 317 (ATCC→AT→ATAA; Ile→Ile); mutasi silence; Ile→Ile); mutasi silence

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 hasil penelitianhasil penelitian 1616

Hasil Sequensing Isolat L18Hasil Sequensing Isolat L18

mutasi pada isolat klinis L18, mutasi pada: mutasi pada isolat klinis L18, mutasi pada: kodon 316(kodon 316(GGGC→GC→TTGC; Gly→Cys); GC; Gly→Cys); kodon 317 (ATkodon 317 (ATCC→AT→ATAA; Ile→Ile): mutasi silence; Ile→Ile): mutasi silence

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 1717

PembahasanPembahasan

Isolat L10 dan L18, mutasi yang sama pada:Isolat L10 dan L18, mutasi yang sama pada:

kodon 316(kodon 316(GGGC→GC→TTGC; Gly→Cys)GC; Gly→Cys)

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 pembahasanpembahasan 1818

Gly 316Gly 316

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 pembahasanpembahasan 1919

Akibat mutasi:Akibat mutasi: meningkatkan kerapatan (bulky) pada sisi meningkatkan kerapatan (bulky) pada sisi

yang termutasi, mengurangi akses masuk yang termutasi, mengurangi akses masuk INH INH

perubahan konformasi enzim perubahan konformasi enzim mengurangi afinitas mengurangi afinitas mengganti/mengubah orientasi terikatnya mengganti/mengubah orientasi terikatnya

INH pada sisi aktif enzimINH pada sisi aktif enzim mengurangi kemampuan enzim untuk mengurangi kemampuan enzim untuk

secepatnya berinteraksi dengan obat.secepatnya berinteraksi dengan obat.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 2020

KesimpulanKesimpulan

Mutasi pada isolat klinis L10 dan L18, yaitu Mutasi pada isolat klinis L10 dan L18, yaitu kodon 316(kodon 316(GGGC→GC→TTGC; Gly→Cys) diperkirakan GC; Gly→Cys) diperkirakan bertanggung jawab dalam mengurangi afinitas bertanggung jawab dalam mengurangi afinitas katalase peroksidase terhadap isoniazid katalase peroksidase terhadap isoniazid sehingga hasil penelitian ini diharapkan dapat sehingga hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi baru mengenai penyebab memberi informasi baru mengenai penyebab resistensi.resistensi.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 2121

SekianSekianTerima KasihTerima Kasih

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 2222

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 metode penelitianmetode penelitian 2323

DNA Strain M.tb resisten isoniazidDNA Strain M.tb resisten isoniazid: DNA : DNA M.Tb strain L4, L10, L13, L14, dan L18 M.Tb strain L4, L10, L13, L14, dan L18 yang digunakan untuk analisis yang digunakan untuk analisis menggunakan PCR, diperoleh atas menggunakan PCR, diperoleh atas kebaikan Ibu Hera Noviana (Mahasiswi kebaikan Ibu Hera Noviana (Mahasiswi S3, Kimia S3, Kimia FMIPAFMIPA ITB). ITB).

kontrol negative air bi-destilasi; kontrol negative air bi-destilasi; kontrol positif strain H37Rv.kontrol positif strain H37Rv.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 metode penelitianmetode penelitian 2424

PCRPCR

Sekuen primer yang Sekuen primer yang digunakan adalah: digunakan adalah:

primer luar KF 5’-gCA primer luar KF 5’-gCA gAT gAT ggg gCT gAT gAT gAT ggg gCT gAT CTA Cg-3’, CTA Cg-3’,

primer luar KR 5’-AAC primer luar KR 5’-AAC ggg TCC ggg ATg gTg-3’, ggg TCC ggg ATg gTg-3’,

primer dalam terbalik primer dalam terbalik katG315 5’-ATA CgA katG315 5’-ATA CgA CCT CgA TgC CgC-3’CCT CgA TgC CgC-3’

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 metode penelitianmetode penelitian 2525

Reaksi PCR dilakukan dengan mesin PCR Reaksi PCR dilakukan dengan mesin PCR Perkin-Elmer GeneAmp PCR System Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 2700 pada kondisi:2700 pada kondisi:

Denaturasi awal 96 ˚C selama 3 menit, Denaturasi awal 96 ˚C selama 3 menit, lima siklus 95 ˚C 1 menit, 62 ˚C 1 menit, lima siklus 95 ˚C 1 menit, 62 ˚C 1 menit, dan 72˚C 30 detik, dan 72˚C 30 detik,

lima siklus 95 ˚C 1 menit, 60 ˚C 40 detik, lima siklus 95 ˚C 1 menit, 60 ˚C 40 detik, dan 72˚C 30 detik, dan 72˚C 30 detik,

dua puluh dua siklus 94 ˚C 1 menit, 58 ˚C dua puluh dua siklus 94 ˚C 1 menit, 58 ˚C 40 detik, dan 72˚C 30 detik, 40 detik, dan 72˚C 30 detik,

elongasi akhir 72 ˚C selama elongasi akhir 72 ˚C selama 3 3 menitmenit..

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 2626

Elektroforesis gel agaroseElektroforesis gel agarose

Sebanyak 5μL Sebanyak 5μL fragmen hasil fragmen hasil amplifikasi amplifikasi dielektroforesis pada dielektroforesis pada Gel agarose dengan Gel agarose dengan konsentrasi 1,5% konsentrasi 1,5% dalam 40 mL TAE dalam 40 mL TAE dan visualisasi di dan visualisasi di bawah lampu bawah lampu UVUV..

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 2727

Sequensing: DNA sepanjang 435 pb yang Sequensing: DNA sepanjang 435 pb yang telah di perbanyak, dikirim ke Macrogen telah di perbanyak, dikirim ke Macrogen Korea untuk sequensing.Korea untuk sequensing.

Rabu, 2 Mei 2007Rabu, 2 Mei 2007 2828