Mikrobiologi Dasar

34
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI DASAR ACARA IV PENGHITUNGAN KOLONI BAKTERI

description

Penghitungan Koloni Bakteri

Transcript of Mikrobiologi Dasar

LAPORAN PRAKTIKUMMIKROBIOLOGI DASAR

ACARA IVPENGHITUNGAN KOLONI BAKTERI

KELOMPOK 5Penanggung jawab:Revashidqii Baroto A1M014058

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI DAN PENDIDIKAN TINGGIUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS PERTANIANPURWOKERTO2015

BAB IPENDAHULUANA. Latar BelakangKuantifikasi populasi mikroorganisme sering dilakukan untuk mendapatkan jumlah kuantitig mikroorganisme target. Kuantifikasi tersebut dapat berupa penentuan jumlah sel dan penentuan massa sel. Penentuan jumlah sel dapat dilakukan pada mikroorganisme bersel tunggal. Penentuan massa sel dilakukan bagi mikroorganisme bersel tunggal dan mikroorganisme berfilamen. Penghitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan beberapa cara, diantaranya metode hitungan cawan (Total Plate Count), hitungan mikroskopis langsung (Direct Count), dan penghitung Coulter. Cara lain penentuan jumlah sel adalah dengan menyaring sampel dengan saringan membran kemudian hasil saringan tersebut diinkubasi pada permukaan media yang sesuai. Koloni-koloni yang terbentuk berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup. Penentuan massa sel dapat dilakukan dengan beberapa metode. Cara yang paling umum adalah dengan menggunakan nilai kekeruhan suspensi sel. Cara lain dengan mengukur berat kering sel atau filamen sampel dalam suatu volume tertentu. Penentuan dengan cara ini dilakukan dengan lebih dahulu mengendapkan sampel diikuti dengan pencucian, pengeringan, dan penimbangan berat. Pada praktikum ini akan dilakukan penghitungan jumlah sel dengan penghitungan cawan. Kelemahan metode penghitungan mikroskopis langsung adalah tidak dapat membedakan sel yang hidup dan mati sehingga angka yang diperoleh merupakan total sel yang ada dalam populasi. Hal ini dapat diatasi dengan menggunakan penambahan zat warna tertentu (co: biru metilen 0,1%). Metode hitungan cawan menggunakan anggapan bahawa setiap sel akan hidup berkembang menjadi satu koloni. Jumlah koloni yang muncul menjadi indeks bagi jumlah organisme yang terkandung di dalam sampel. Teknik pengitungan ini membutuhkan kemampuan melakukan pengenceran dan mencawankan hasil pengenceran. Cawan-cawan tersebut kemudian diinkubasi dan kemudian dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni, sesuai dengan kaidah statistik adalah cawan yang berisi 30-300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat dalam sampel asal dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan bersangkutan.

B. TujuanMenghitung jumlah koloni bakteri dengan menggunakan metode hitungan cawan (Total Plate Count)

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun tidak langsung. Dalam perhitungan secara langsung, kita dapat mengetahuibeberapa jumlah mikroorganisme pada suatu bahan pada saat tertentu tanpa memberikan perlakuan terlebih dahulu, sedangkan jumlah organisme yang diketahui dari cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung, dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan dengan cara tidak langsung digunakan hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara, yaitu :perhitungan pada cawan petri (total plate count/TPC), perhitungan melaluipengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Dwidjoseputro, 1994).Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara, yaitu : perhitunganpada cawan petri (total plate count/ TPC), perhitungan melalui pengenceran,perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode MPN sendiri terdiri dari tiga tahap, yaitu ujipendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang perananpenting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah ammonium menjadi nitrat (Lim, 1998).Makna dari metode hitungan cawan itu sendiri adalah jika sel mikroba yang masih hidup di tumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan menggunakan mata telanjang tanpa harus dengan menggunakan mikroskop (Fardiaz,1992).Metode ini merupakan cara paling sensitif untuk menentukan jumlah jasad renik, dengan alasan:- Hanya sel mikroba yang hidup yang dapat dihitung- Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus- Dapat digunakan untuk isolasi, dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikroba yang mempunyai penampang spesifik

Selain keuntungan-keuntungan tersebut diatas, metode hitungan cawan jugamempunyai kelemahan sebagai berikut:- Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk koloni.- Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan jumlah yang berbeda pula.- Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas dan tidak menyebar.- Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung

Metode hitungan cawan dibedakan atas dua cara, yakni metode tuang (pour plate), dan metode permukaan (surface / spread plate). Pada metode tuang , sejumlah sampel (1ml atau 0,1ml) dari pengenceran yang dikehendaki dimasukkan kecawan petri, kemudian ditambah agar-agar cair steril yang didinginkan (47-50oC) sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya menyebar. Pada pemupukan dengan metode permukaan, terlebih dahulu dibuat agar cawan kemudian sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan dipipet pada permukaanagar-agar tersebur. Kemudian diratakan dengan batang gelas melengkung yang steril. (Dwidjoseputro, 2005).

BAB IIIMETODE PRAKTIKUMA. Alat dan BahanAlat:- Cawan petri steril- Tabung Reaksi- Pipet ukur 1 mlBahan:- Kultur bakteri dalam medium cair- Medium NA- Larutan 0,85% NaCl

B. ProsedurLarutan pengencer disiapkan dan diberi label sesuai dengan pengenceran yang ditetapkan yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, masing-masing ditandai dengan A, B, C, D, dan E

Kultur bakteri yang akan dihitung, diambil 1 ml dengan pipet dan dimasukkan ke dalam tabung A, dikocok perlahan supaya tercampur rata

Kultur bakteri pada tabung A diambil 1 ml dengan pipet dan dimasukkan ke dalam tabung B, dikocok perlahan. Hal yang sama dilakukan sampai ke tabung E dan setiap kultur dalam pengenceran ini dipindahkan, digunakan pipet yang berbeda

Disiapkan cawam petri steril dan medium NA yang siap dituang (suhu sekitar 45-50oC

Dilakukan penanaman kultur bakteri yang sudah diencerkan pada medium agar dari tabung dengan pengenceran tinggi

Kultur dalam tabung C, D, dan E diambil masing-masing 1 ml dan diteteskan ke dalam cawan petri steril yang masih kosong. Kedalam cawan-cawan tersebut dituang medium NA, digoyang-goyangkan/diputar cawan agar bakteri tersebar merata

Cawan diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 hari. Pada akhir inkubasi dihitung jumlah koloni bakteri dalam cawan, pilih cawan petri yang memenuhi syarat perhitungan koloni. Jumlah bakteri dalam sampel dapat dihitung menggunakan rumus

BAB IVHASIL DAN PEMBAHASANA. Hasil Cawan petri C (10-3)Jumlah mikroba = 1673Jumlah koloni = 1673 x = 1673 x 103 = 1,673 x 106 Cawan petri D (10-4)Jumlah mikroba = 1190Jumlah koloni = 1190 x = 1190 x 10-4 = 1,19 x 107 Cawan petri E (10-5)Jumlah mikroba = 270Jumlah koloni = 270 x = 270 x 105 = 2,7 x 107

B. PembahasanPraktikum pengamatan mikroorganisme kali ini adalah untuk mengetahui bagaimana cara menghitung jumlah koloni bakteri berdasarkan syarat-syarat tentang perhitungan koloni bakteri yang berlaku, yaitu 30-300 sel per ml atau per gram. Dan pada praktikum ini, kita menggunakan kultur bakteri yang sudah disiapkan sebelumnya.Untuk memudahkan dalam menghitung jumlah koloni bakteri, sebaiknya dilakukan pengenceran terlebih dahulu agar lebih mudah menghitungnya, suspensi yang belum diencerkan mengandung banyak sekali mikroba, sehingga apabila tidak diencerkan akan lebih sulit menghitungnya karena lebih banyak jumlah mikrobanya. Pengenceran bertujuan agar konsentrasi dari suspense tersebut menurun.Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady,1999).Karena ukuran bakteri sangat kecil, menghitung jumlah bakteri dalam sampel bisa sulit. Meskipun dapat menghitung jumlah mikroba langsungdengan mikroskop, mereka memerlukan banyak waktu dan keahlian. Sebuah metode yang lebih mudah adalah untuk menyebarkan bakteri di wilayah yang luas (plate agar yaitu nutrisi) dan menghitung jumlah koloni yang tumbuh. Jika bakteri ini menyebar cukup, setiap sel bakteri dalam sampel asli harus menghasilkan koloni tunggal. Biasanya, sampel bakteri harus diencerkan jauh untuk mendapatkan jumlah yang wajar(Eema, 2011).Pada perhitungan dengan metode hitungan cawan dilakukan pengenceran bertingkat yang mana ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspensi bakteri. Sampel yang telah diencerkan ini dihitung ke dalam cawan baru kemudian dituang ke mediumnya (metode tuang). Kemudian setelah diinkubasi selama 24-48 jam, amati koloni yang tumbuh dan koloni yang diamati hanyalah koloni yang berjumlah 30-300 koloni (Gobel, 2008)Untuk melakukan perhitungan seperti hasil pengamatan diatas maka menggunakan langkah-langkan, yang pertama cawan yang dihitung dan dipilih adalah cawan yang mengandung jumlah koloni antara 30 sampai 300 koloni. Kedua, beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni. Ketiga, suatu rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni (Fardiaz, 1993)Metode viable count atau disebut dengan metode TPC (Total Plate Count) merupakan kultur yang diencerkan sampai batas yang diinginkan. Kultur encer ditumbuhkan kembali pada media, sehingga diharapkan setiap sel tumbuh menjadi satu koloni, biasanya 4-12 jam. Namun, cara ini memiliki keterbatasan yaitu biasanya jumlah sel yang terhitung lebih kecil dari sebenarnya dan tidak dapat diaplikasikan pada bakteri yang tumbuh lambat. Faktor yang mempengaruhi perhitungan bakteri dengan metode ini adalah jumlah sel bakteri harus mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencerannya. Jika tidak, maka perhitungan dianggap gagal (Purwoko, 2007)Pentingnya melakukan pengenceran adalah untuk mengantisipasi munculnya TNTC / TBUD dan TFTC. Karena apabila pengenceran yang di lakukan terlalu tinggi, maka koloni yang terbentuk hanya sedikit. Sedangkan apabila pengenceran kita di lakukan terlalu rendah, maka kecenderungan menghasilkan TNTC / TBUD akan lebih besar. Koloni yang terbentuk cenderung tumbuh bertumpuk-tumpuk juga sampai tak bisa dihitung (Hadiutomo, 1990).TNTC adalah singkatan dari Too Numerous To Count, sedangkan TBUD adalah singkatan dari Tidak Bisa Untuk Dihitung. Ini adalah kondisi dimana koloni yang terbentuk pada media terlalu banyak sampai tidak memungkinkan untuk dihitung, jumlah koloni telah melewati batas penghitungan 30-300. Hal ini dapat terjadi karena faktor pengencerannya masih rendah sehingga konsentrasi bakteri di dalam suspensi masih banyak. Bisa juga karena penyebaran yang kurang merata sehingga membuat bakteri tumbuh secara bertumpuk dan susah dihitung. Hal ini dapat diatasi dengan membuat pengenceran yang lebih tinggi lagi dan lebih memperhatikan homogenisasi di setiap penginokulasian. Namun hal ini bisa juga terjadi karena adanya kontaminan yang masuk ke dalam media dan ikut berproses (Barazandeh, 2008).Kelemahan metode pengenceran adalah keselektifan hasil perhitungan yang kadang menjadi bias. Kondisi pertumbuhan kontaminan, termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu dan pH sangat menentukan bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada (Harmita, 2008).Pada saat pemindahan sampel, dilakukan di dekat api supaya steril dari kontaminan. Sterilisasi yaitu proses mematikan semua mikroorganisme dengan pemanasan, dengan tujuan untuk membebaskan bahan dari semua mikroba perusak. Kemudian sampel yang sudah diencerkan dimasukan kedalam cawan petri sesuai dengan pengencerannya yaitu 10-1, 10-2, dan 10-3 sebanyak 1 ml. Setelah larutan sampel berada pada cawan petri, kemudian sampel di campur dengan media agar, lalu di homogenkan supaya bakteri tersebar pada cawan petri secara merata. Setelah itu di inkubasi selama 24 jam dengan suhu kamar sekitar 35 37oC (Anton, 2003)Suhu yang di gunakan pada saat inkubasi adalah suhu kamar sekitar 35-37oC karena suhu inkubasi tersebut sudah sangat sesuai dan dapat mendukung pertumbuhan mikroba dengan sangat baik. Suhu tersebut sangat disukai mikroba, oleh karena itu mereka jadi lebih cepat tumbuh dan berkembang biak. Apabila suhu tersebut dinaikkan, maka mikroba tersebut bisa mati atau terdenaturasi kecuali mikroba yang memang bersifat thermophilik. Dan apabila suhu tersebut diturunkan, mikroba tersebut juga akan mati karena tak tahan suhu dingin dan akan rusak karena enzimnya telah inaktif (Pelczar, 2006).Dari hasil inkubasi, didapatkan bakteri pada setiap cawan petri. Pada cawan petri C dengan pengenceran 10-3 didapati 1673 koloni, pada cawan D dengan pengenceran 10-4 didapati 1190 koloni, dan pada cawan E dengan pengenceran 10-5 didapati 270 koloni. Hal ini sesuai dengan literatur yaitu semakin tinggi pengenceran maka jumlah koloni semakin sedikit. Pada hitungan cawan kita hanya menghitung sel bakteri yang hidup saja yang membentuk koloni pada media karena apabila menggunakan satuan jumlah sel/ml, itu berarti harus menghitung seluruh sel yang ada dalam cawan. Tidak hanya yang hidup saja, yang matipun juga ikut terhitung. Selain itu, dalam hitungan cawan, tujuannya adalah menghitung koloni. Sedangkan apabila menggunakan satuan sel/ml, maka tidak akan mengetahui secara pasti berapa jumlah sel dalam setiap koloni yang terbentuk. Dengan demikian tidak bisa menggunakan satuan sel/mL. Itulah tujuannya menggunakan CFU/mL, karena untuk menghitung sel yang membentuk koloni yang tampak saja (Irianto, 2006).

BAB VPENUTUP

A. KesimpulanKesimpulan yang dapat diambil dari praktikum ini adalah:1. Hasil perhitungan jumlah bakteri pada masing-masing cawan petri adalah C (10-3)1673, D (10-4)1190, dan E (10-5)270 2. Semakin tinggi tingkat pengenceran yang dilakukan maka jumlah koloni bakteri yang adavsemakin rendah, begitupun sebaliknya.3. Faktor yang mempengaruhi TPC adalah jumlah sel bakteri yang mendekati kelipatan 10 pada setiap pengencerannya.4. Dalam memindahkan bakteri dari satu tabung reaksi ke tabung lainnya harus menggunakan pipet yang berbeda dan dalam memindahkannya harus dekat dengan nyala api karena agar tidak terjadi kontaminasi yang menyebabkan kegagaln nantinya.

B. SaranDalam pelaksanaan praktikum, sebaiknya lebih memperhatikan dan lebih teliti lagi dalam setiap metode yang dilakukan, supaya hasilnya bisa sesuai dengan yang diharapkan. Pada setiap metode yang digunakan juga harus selalu memperhatikan kesterilan lingkungan, media, dan alat agar tidak terjadi kontaminasi dari luar (udara).

DAFTAR PUSTAKA

Anton, W. 2008. Mikrobiologi Umum. Malang : Universitas BrawijayaBarazandeh, N. 2008. Microbiology Titles . Jerman : Springer-Verlag BerlinHeidelberg MediaBrady, J. E. 1999. Kimia Universitas Asas dan Struktur. Jakarta: Binarupa AksaraDwdijoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: DjambatanDwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: DjambatanEema. 2011. Pemeriksaan angka kuman serial dilution. http://eema-kharisma.blogspot.com/. Diakses pada tanggal 24 Desember 2011Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: GramediaFardiaz, Srikandi. 1993. Analisi Mikrobiologi Pangan. Jakarta: Raja Grafinda PersadaGobel, Risco, B., dkk. 2008. Mikrobiologi Umum Dalam Praktek. Makassar: Universitas HasanuddinIrianto, Koes. 2006. Mikrobiologi. Bandung: Yrama WidyaLim, D. 1998.Microbiology. Missiouri: WCB McGraw-HillPleczar, M.J. 2006. Dasar Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI-PressPurwoko, Tjahjadi. 2007. Fisiologi Mikroba. Jakarta: Bumi Aksara

LAMPIRAN FOTO