Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl-, SO4-, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (Sutedjo, 1991).Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987).Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan pada noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang berwarna merahdigoongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999). Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.Pada proses pewarnaan gram, harus gelas obyek yang bersih. Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu. Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di beri satu tetes aquades pada permukaan gelas obyek. Kultur bakteri murni diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas.Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada kaca obyek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram A (methylene blue) sebanyak 1-2 tetes dan dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue.Kemudian ditambahkan larutan gram B yang merupakan iodium. Gram B merupakan larutan yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga pengikatan zat warna oleh bakteri lebih kuat, memperjelas warna dari zat warna tersebut, mempersulit pelarutan zat warna. Pada pewarnaan gram, penambahan larutan mordan menyebabkan terbentuknya persenyawaan kompleks. Tanpa penambahan larutan mordan, zat warna methylene blueakan larut saat penambahan larutan alkohol. Lalu dibiarkan selama 1 menit untuk dibilas kembali dengan aquades. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).Alkohol 95% ditambahkan atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam dinding sel dan melunturkan pewarnaan biru dari komplek methylen blue dan KI pada gram negatif, karena mengandung lipid sedangkan pada gram positif akan tetap mempertahankan warna biru karena mengandung peptidoglikan. Larutan ini juga berfungsiuntuk melarutkan lipida pada membrane bakteri gram negatif yang akan menyebabkan pori-pori sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan methylene blue.Perlakuan ini dilakukan tidak membutuhkan waktu yang lama atau secepat mungkin untuk melakukan pembilasan dengan aquades. Kemudian dilakukan pengeringan.Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin (gram D) sebanyak 2 tetes dan diamkan selama 30 detik. Safranin pada gram D tidak akan menyebabkan perubahan warna pada bakteri positif karena persenyawaan kompleksmethylene blue tetap terikat pada dinding sel. Pada bakteri gram negatif penambahan safranin akan menyebabkan warna bakteri berubah menjadi merah karena warna biru yang dihasilkan oleh methylene blue telah luntur dengan lisisnya membran sel sehingga safranin dapat terikat. Oleh sebab itu, gram D atau zat pewarna kedua berfungsi sebagai pembeda terhadap zat warna kristal violet (Lay, 1994). Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Kemudian preparat dikeringkan dengan cara diangin-anginkan lalu dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.Pemberian methylen blue pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna biru. Perbedaan respon terhadap mekanis pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negative mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna biru. Gozali, Amir, 2009, Pewarnaan Gram, http://www.gozali.blogspot.com/ gram/pewarnaangram-prinsip.html . Diakses pada tanggal 14 April 2012.Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada : Jakarta.Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism, Pearson Education : inc. UnitedState of America.Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill BookCompany: New York.Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar, Jatinangor: FMIPA UNPAD.Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka.Sutedjo, M., 1991, Mikrobiologi Tanah, Rineka Cipta. Jakarta.Tracy,2005, GramStaining, www.tracy.k12.ca.us/ thsadvbio/ pdfs/ gram%20stain.pdf,Diakses pada tanggal 18 April 2014.Umsl, 2008, StainingBacteria, www.umsl.edu /~microbes/pdf/ stainingbacteria.pdf,Diakses pada tanggal 18 April 2014.Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : JakartaWaluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali.Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.Hadioetomo, Ratna Siri. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia : Jakarta.